KR100241948B1 - N알파-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따라, 다음 일반구조식 (I)의 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산 유도체 및 그 제조방법, 및 이 유도체를 이용하여 고체상 펩티드를 합성하는 방법이 제공된다.
Figure kpo00014
식중, R1은 수소원자, R2는 수소, 메틸, 이소프로필, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, tert-부톡시메틸, 1-tert-부톡시에틸, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, tert-부톡시카르보닐메틸, 2-(tert-부톡시카르보닐)에틸, 4-(tert-부톡시카르바미도)부틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.

Description

[발명의 명칭]
Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류
[발명의 상세한 설명]
이 발명은 고체상 펩티드 합성을 위한 보호된 아미노산 유도체류, 즉 고체상 펩티드 합성에 있어서 Nα-보호된 아미노산(Nα-protected amino acid)으로서 사용되는 다음 일반구조식(I)의 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류에 관한 것이다.
Figure kpo00001
식중, R1은 수소원자, R2는 수소, 메틸, 이소프로필, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, tert-부톡시메틸, 1-tert-부톡시에틸, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, tert-부톡시카르보닐메틸, 2-(tert-부톡시카르보닐)에틸, 4-(tert-부톡시카르바미도)부틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
고체상 펩티드 합성은 의학과 생물학 연구에 사용되는 생물학적 활성 펩티드의 제조에 그리고 또한 약학, 수의학과 진단에서 활성 물질로서 광범위하게 사용된다. 고체상 펩티드 합성의 본질은 불용성 지지체(unsoluble carrier)에 부착되어 있는 최초의 C-말단 아미노산으로부터 시작하여, 화학반응의 반복에 의한 펩티드 사슬의 단계적 연장(elongation)으로 요약된다. 합성과정중 모든 반응의 목적물질은 지지체에 결합되어 남아 있고, 반면 과량의 반응물들과 부산물들은 지지체의 여과와 세척에 의해서 제거된다.
펩티드의 고체상 합성을 수행하기 위하여, 보호된 α-아미노기를 갖는 최초 아미노산(목적 아미노산 서열의 C-말단)은 유리(free) 카르복실기를 통하여 에스테르 또는 아미드 결합을 형성함으로써 불용성 폴리머 지지체에 공유결합된다. 그 다음 그렇게 얻은 Nα-보호 아미노아실-폴리머로부터 Nα-보호기를 선택으로 분절(cleave)시켜서 유리 α-아미노기를 갖는 아미노아실-폴리머를 형성시킨다. 이어서 이 폴리머를 그 다음 순서의 Nα-보호된 아미노산으로 아실화시킴으로써 Nα-보호된 디펩티드-폴리머를 얻는다. Nα-보호기 제거와 이어서 그 다음의 Nα-보호된 아미노산으로 유리 아미노기를 아실화시키는 것으로 이루어지는 이러한 합성주기를 목적 아미노산 서열의 조합이 완성될 때까지 반복된다.
실제 고체상 합성에 있어서 일반적으로 완전한 전환반응(conversion)을 위해 과도한 물량(2-10배)의 아실화 시약을 사용하므로, 아미노산의 곁가지의 모든 반응성 기, 예를 들어, 아미노, 카르복실, 하이드록실, 티올, 구아니디노기와 같은 기들을 적당한 보호기로 차단(blocking)해야 한다. 이런 목적을 위한 보호기는 일시적인 Nα-보호기의 제거중에 그리고 펩티드-폴리머 아실화 조건하에 곁가지를 확실하고 영구적으로 보호할 수 있도록 신중히 선택해야 한다. 한편, 이 곁가지 보호기는 정량적으로 한, 두 단계로써 합성된 펩티드로부터 탈보호될 수 있어야 하고 그 구조에 손상을 주지 말아야 한다. 대부분의 경우 펩티드-고분자 결합(linkage)도 또한 동시에 분절되어야 한다. 아미노산 곁가지의 영구적인 보호기의 구조와 화학적 특성은 보호기가 도입된 작용기의 성질 뿐만 아니라 사용한 일시적인 Nα-보호기의 구조와 화학적 성질에 의해서도 상당한 정도로 결정되어 지는 것은 분명하다. 그러므로, 일시적인 Nα-보호가 고체상 펩티드 합성의 전체 전략의 주요한 요소가 된다.
고체상 펩티드 합성에서 널리 알려져 있고 광범위하게 사용하는 것으로 Nα-tert-부톡시카르보닐 아미노산류(Boc-아미노산류)가 문헌에 기술되어 있다(R.B.Merrifield in Biochemistry, 1964, V. 3, P. 1385). tert-부톡시카르보닐(Boc)기는 중간 세기의 산성 시약들, 예를 들어, 트리플루오로아세트산 및 그것의 염소화 탄화소수 용액, 유기용매중의 염화수소 용액, 보론트리플루오라이드/다이에틸에테르 복합체 및 몇몇 다른 산들의 작용에 의해 이소부틸렌과 이산화탄소의 형성함으로써 분리될 수 있다.
일시적인 Nα-Boc-보호와 함께, 곁가지의 영구적인 차단을 위하여 Nα-Boc 분절시 안정하지만 더 강한 산성 시약에 의해 펩티드-폴리머 결합의 동시 분열로써 분절될 수 있는 보호기가 도입된다. 이 목적을 위해서 사용되는 공지 시약은 액체 불화수소, 트리플루오로메탄설폰산과, 그것들의 아니솔, 티오아니솔, 디메틸설파이드와의 혼합물들이 있다. 일시적인 Nα-Boc-보호법을 사용하는 합성전략의 주요 단점은 일시적인 그리고 영구적인 보호기의 분절을 위해 산가수분해를 적용하는 것으로, 이 방법은 영구적인 보호의 완전한 안정성을 제공할 수 없다. 합성하는 펩티드의 길이가 길어짐에 따라, Boc의 분절단계동안 영구적인 보호기들은 산성 시약들의 거듭되는 작용을 받게 되고, 이에 따라 이 기들의 부분적인 손실과 부산물의 축적을 초래한다. 이와는 달리, 조합된 펩티드-폴리머를 초강산성 시약으로 최종 처리하는 것은 목적 펩티드의 부분적인 파손을 일으킬 수 있다. 초강산의 극히 위험한 특성은 또한 그것을 다룰 때 특별한 장비와 적당한 안전 장치를 필요로 하는 것도 유의해야 한다.
최종 펩티드 탈보호 반응에서 초강산 시약들의 사용을 피하기 위해, 일시적인 Nα-보호기로서 최근에 제안된 몇가지 산-감수성 기들은, 중간 세기의 산성 시약들에 의해 분절될 수 있는 소위 tert-부틸 형태의 영구적인 곁가지 보호에 적합하다고 간주되고 있다. 그러한 Nα-보호기의 예로 1-(3,5-디-tert-부틸페닐)-1-메틸-에톡시카르보닐(t-Bumeoc)기가 문헌(Collet. Czech. Chem. Commun. 1992, V. 57, p.1707)에 기술되어 있다. Nα-tert-Bumeoc-기는 디클로로메탄으로 녹인 1% 트리플루오로초산에 의해서 분절되고, 순수(neat) 트리플루오로초산 또는 그것의 진한 용액들에 의해 분절될 수 있는 tert-부틸 형태의 영구적인 보호기와 함께 사용될 수 있다. 이 경우에 초강산의 사용은 피하지만 달라진 산가수분해의 일반적인 원칙은 변하지 않았다.
고체상 펩티드 합성 전략의 다른 접근은 페리필드(R. B. Merrifield in Science, 1986, V. 232, p. 314)에 의해 기초가 잡혔다. 소위, “직교론(orthogonality principle)”이라 알려진 이 접근 방법은 전체적으로 별개의 화학적 메카니즘에 따르는 전체적으로 별개의 시약들에 의해 일시적인 그리고 영구적인 보호기들이 제거될 수 있다는 가정을 기본으로 함으로써, 일시적인 Nα-보호기는 영구적인 보호기의 완전한 보존을 확보할 수 있도록 절대적인 선택성을 가지고 분절될 수 있으며, 그 반대경우도 마찬가지이다. 현재, “직교론”은 일반적으로 고체상 펩티드 합성을 효과적으로 발전시키기 위한 지침으로서 받아들여지고 있다.
“직교론”의 실행의 예로서 고체상 합성에서 Nα-디티아석시닐아미노산(Dts-아미노산)의 도입이 문헌(Int. J. Peptide and Protein Res., 1987, V. 30, p. 740)에 기술되어 있다. Nα-디티아석시닐(Dts) 보호기는 중간 세기의 산성 시약들에 상당한 저항성을 가지며 중성 매체에서 티올 시약에 의해 아미노기의 유리(liberation)와 카본 티오옥사이드를 형성함으로써 온화하게 분절된다. 실제 합성에 있어서는 Dts-아미노산들의 적용은 그것들을 제조하는 효과적인 방법이 부족하기 때문에 아직 제한적이다.
“직교론”에 따라 가장 널리 알려져 있고 많이 사용되고 있는 고체상 합성은 Nα-9-플루오레닐메톡시카르보닐아미노산들(Fmoc-아미노산들)을 기본적으로 한다(C. D. Chang and J. Meienhofor in Int. J. Peptide and Protein Res., 1975, V. 11, p. 246.). Nα-9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기는 산성 시약에 저항성이 있고, 비양성자성(aprotic) 용맹에서 유기 염기들, 예를 들면, 모르폴린, 디에틸아민, 피페라진, 또는 디메틸포름아마이드(DMF) 또는 디클로로메탄에 녹인 피페라딘과 같은 유기 염기들에 의해 β-제거 기작(βelimination mechanism)에 따라 분리되고, 아미노기는 유리되고(liberated), 이산화탄소와 함께 디벤조풀벤(dibenzofulvene)이 형성된다. 고체상 합성에서 바람직하게는 Fmoc기의 분리는 10-30분 동안 DMF중의 20-50% 피페리딘 용액으로 Nα-보호된 펩티드-고분자를 처리함으로써 수행된다. 위에서 말한 조건들은 일시적인 Nα-Fmoc-보호와 함께 tert-부틸 형태의 영구적으로 산-감수성 보호법을 이용할 수 있게 하며, 그리하여 합성 전략의 “직교성(orthogonality)”을 제공한다.
Nα-Fmoc-아미노산들은 수동 고체상 펩티드 합성에서 뿐만 아니라 모든 유형의 자동과 반자동 합성기에서 널리 사용된다. 그러나, Nα-Fmoc-보호기의 극도의 염기 민감도와 중성 비양성자성 용매에서의 불안정성 때문에 신중한 아실화 조건 및 사용하는 용매의 순도를 요구한다. Nα-Fmoc-아미노산들을 30잔기를 초과하는 펩티드 합성을 위해서 사용될 때는 특별히 주의해야 한다. 그외에도 대량의 펩티드 제조에 있어서 높은 생산비용도 Fmoc 유도체의 사용을 제한하고 있다.
[발명의 요약]
그러므로, 고체상 펩티드 합성에서 효과적인 전략을 위해 유용한 새로운 Nα-보호된 아미노산 유도체의 개발이 요구된다. 본 발명의 목적은 새로운 아미노산 유도체를 제공하는 것으로, 더 구체적으로는 고체상 펩티드 합성에서 Nα-보호된 아미노산 유도체로서 사용될 수 있는 다음 일반구조식(I)을 갖는 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산류(Nα-Nsc-아미노산류)를 제공하는 것이다.
Figure kpo00002
식중, R1은 수소원자, R2는 수소, 메틸, 이소프로필, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, tert-부톡시메틸, 1-tert-부톡시에틸, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, tert-부톡시카르보닐메틸, 2-(tert-부톡시카르보닐)에틸, 4-(tert-부톡시카르바미도)부틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 Nα-Nsc-아미노산류의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 Nα-Nsc-아미노산류를 사용한 고체상 펩티드 합성의 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 이러한 목적들을 다음 설명으로써 분명히 한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 Nα-Nsc-아미노산류(I)는 염기 존재하 0-40℃의 온도, 바람직하게는 0-20℃에서 물/유기용매 혼합용매중에서 다음 일반구조식(II)의 아미노산을 2-(나이트로페닐설포닐)클로로포르메이트(III)로 처리하여 제조할 수 있다.(스킴 1)
[스킴 1]
Figure kpo00003
식중, R1과 R2는 일반구조식(I)에서 정의한 바와 같다.
클로로포르메이트(III)는 아미노산에 대하여 0.5에서 1.5몰당량, 바람직하게는 0.7에서 0.9몰당량을 반응에 도입한다. 용매의 유기 성분으로서 아실화 시약을 녹일 수 있고 물과 혼합될 수 있는 여하한 비양성자성 유기 용매, 예를 들어 아세토니트릴, DMF, 테트라하이드로퓨란 또는 디옥산을 사용할 수 있다. 염기는 유기 또는 무기 염기를 사용할 수 있는데 예를 들면, 소디움 또는 포타시움 카보네이트, 마그네시움 또는 칼시움 옥사이드, 트리에틸아민, N-메틸오르폴린이다.
본 발명의 다른 방법에 따르면, 일반구조식(II)의 아미노산들은 먼저, 이미 알려진 방법에 의하여, N,O-비스-트리메틸실릴 유도체(IV)로 전환되고 무수 유기 용매, 예를 들면, 디클로로메탄에서 클로로포르메이트(III)로 처리한다. 중간체 트리메틸실릴 유도체의 수성 가수분해 후에 원하는 Nα-Nsc-아미노산류를 유리 형태로 얻을 수 있다.(스킴 2)
[스킴 2]
Figure kpo00004
R1은 수소, R2는 N-잔틸카르복사미도메틸 또는 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸을 나타내는 경우의 일반구조식(I)의 유도체는 R1이 수소, R2가 카르복사미도메틸 또는 2-(카르복사미도)에틸을 나타내는 일반구조식(I)의 유도체를 산 존재하 비양성자성 유기 용매에서 잔티드롤(xanthyldrol)과 반응시켜서 제조할 수 있다. 용매로서 DMF가 사용될 수 있고, 바람직한 산은 유기산, 예를 들면 트리플루오로아세트산, 메탄설폰산 또는 p-톨루엔설폰산이다.
분자식으로부터 볼 수 있듯이 화합물(I)은 비대칭 α-탄소(R1=R2=수소인 화합물은 제외)를 가지고 있다. α-탄소 원자는 화합물(I)을 제조하는 반응에 첨가하지 않으므로, 출발 아미노산(II)에 존재하는 키랄 중심(chiral center)의 배열은 Nα-Nsc-유도체(I)에 유지되어 남는다. 그러므로 본 발명의 방법은 출발 화합물(II)의 배열에 의존하여, 라세믹 화합물들은 물론 어떠한 키랄 형태(L 또는 D)의 Nα-Nsc-아미노산류의 제조에도 사용될 수 있음이 자명하다.
일반구조식(I)의 유도체에서 R1그리고 R2치환체의 의미는, 기존에 알려진 보호기, 즉 대개는 분질 조건과 관련하여 tert-부틸형태의 기나 그 유사한 보호기를 포함하거나 포함하지 않는 자연적으로 발생하는 아미노산의 곁가지 구조에 상응한다.(표 1)
[표 1]
Figure kpo00005
표 1에 나타난 구조식(I)의 화합물들은 여하한 아미노산 조성의 펩티드 합성에 필요한 보호된 단백질생성(proteogenic) 아미노산 유도체들의 모든 종류를 나타냄을 명확히 알 수 있다. 또한, 다른 골격 보호 유형을 갖는 아미노산의 Nα-Nsc-유도체는 물론 비-단백질생성 또는 특이 아미노산의 Nα-Nsc-유도체들도 앞에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있음은 물론이다.
Nα-Nsc-아미노산류(I)는 물에서는 불용 또는 약간 녹고 극성 유기용매에서는 용해되는 결정성 화합물들이고, -10℃ 내지 25℃에서 장기간 저장에 안정하다.
본 발명에 따르면 구조식(I)의 Nα-Nsc-아미노산류를 사용하는 고체상 펩티드 합성을 위한 공정은 아래와 같다.
이 공정에 따라, 최초의 Nα-Nsc-아미노산(목적 아미노산 서열의 C-말단)이 유리α-카르복실기를 통하여 에스테르 또는 아미드 결합을 형성하여 불용성 폴리머 지지체에 공유결합됨으로써, Nα-Nsc-아미노아실-폴리머를 얻는다. 여러 폴리머가 폴리머-지지체로서 사용될 수 있는데, 예를 들면, 교차결합된(cross-linked) 또는 다공성 폴리스티렌, 그래뉼형태의 또는 키젤겔(kieselgel)과의 혼성물로서의 교차 결합된 폴리-N,N-디메틸아크릴아미드, 교차결합된 덱스트란, 셀룰로오스, 종이, 그리고 이미 알려진 다른 폴리머들이 이 목적을 위해 사용되어 진다.
최초 Nα-Nsc-아미노산의 부착을 위해, 폴리머 지지체는 적당한 앵커기(anchor group)을 포함해야 한다. 대부분의 경우 앵커기는 유기 용매에서 트리플루오로아세트산 및 그 용액, 또는 염화수소 용액과 같은 산성 시약으로 펩티드-폴리머를 처리하는 동안 C-말단의 카르복실기 또는 카르복사미드기의 유리(liberation)와 함께 폴리머 지지체로부터 합성 펩티드의 분절을 제공하는 것이 필요하다. 에스테르 형태의 부착(attachment)을 위한 그러한 앵커기는 4-하이드록시메틸페녹시알킬, 4-클로로 또는 4-브로모메틸페녹시알킬, α-하이드록시디페닐메틸 그리고 기존의 알려진 다른 그룹이 될 수 있으며, 카르복사미도 형태의 부착을 위한 것으로는 알려진 다이- 및 트리알콕시벤즈하이드릴아민기, 4-아미노메틸-3,5-디메톡시페녹시알킬기 및 다른 공지의 기들이 이 목적을 위해 사용될 수 있다.
폴리머 지지체의 앵커기에 대한 C-말단 Nα-Nsc-아미노산의 부착은 이 분야에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
제조된 Nα-Nsc-아미노아실-폴리머로부터 Nα-보호기를 분절하기 위하여, 상기 보호된 아미노아실-폴리머를 염기 시약으로 처리한다. 이 목적에 바람직한 염기 시약은 질소 염기들, 예를 들면, 암모니아, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 디에틸아민, 1,8-디아자비사이클로[5,4,0]운데스-7-엔, 1,1,3,3,-테트라메틸구아니딘 및 그들의 비양성자성 유기 용매중의 용액들이다. 더 바람직한 염기 시약은 DMF중의 피페리딘 20-50% 용액이다. 이 경우에 있어서 Nsc-기는 N-[2-(나이트로페닐설포닐)에틸]피페리딘 및 이산화탄소 형성으로 분절되고, α-아미노기가 유리된다. 이어 유리 α-아미노기를 갖는 아미노아실-폴리머는 다음의 Nα-Nsc-아미노산으로 아실화되어 Nα-Nsc-디펩티드-폴리머를 생성한다. 이 목적에 사용되는 방법은 기존에 알려져서 이러한 목적에 사용되는 방법이다. 아실화 시약으로서 예를 들어, Nα-Nsc-아미노산류의 4-나이트로페닐, 펜타클로로페닐, 펜타플루오로페닐, 1-하이드록시벤조트리아졸릴 에스테르와 고체상 펩티드 합성에 사용되는 활성 에스테르의 기존의 다른 형태; 또는 Nα-Nsc-아미노산류의 유사 무수물들의 것들이 사용될 수 있다. 아실화는 또는 기존의 알려진 커플링시약, 예를 들면 디사이클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 벤조트리어졸릴-1-옥시-(트리스-디메틸아미노)포스포니움 헥사플루오로포스페이트와 같은 커플링시약의 존재하에서 Nα-Nsc-아미노산류를 가지고 수행될 수 있다.
Nα-Nsc-기 분절과 이어서 다음 Nα-Nsc-아미노산으로 유기 아미노기를 아실화 하는 것으로 이루어지는 합성주기는 목적 아미노산 서열의 조합이 완결될 때까지 반복된다.
원하는 Nα-Nsc-펩티드-폴리머 조합 형성후, Nα-말단 보호기는 위에서 기술한 방법으로 분절시키고, 그 다음 대부분의 경우 목적 펩티드가 아미노산들의 곁가지로부터 영구 보호의 동시적인 분절과 함께 지지체의 앵커기로부터 이탈된다.
이 목적을 위한 산성 시약들은 tert-부틸 형태의 보호기의 분절에 사용되는 이미 알려진 것이 사용되는데, 예를 들면, 발생되는 카르보니움 이온을 포획하는 공지의 첨가제, 예를 들어, 물, 아니솔, 티오아니솔, 디메틸설파이드, 에탄디티올-1,2-트리이소프로필실란 등을 포함하거나 포함하지 않는 트리플루오로아세트산, 메탄설폰산 또는 파라톨루엔설폰산의 용액 등이 사용될 수 있다.
선택적으로, 목적 펩티드는 폴리머 지지체로부터 분절됨 없이 탈보호(deblocking)될 수 있다. 이러한 경우 산-저항성 펩티드-폴리머 결합을 제공할 수 있는 공지의 앵커기를 사용할 수 있다. Fmoc과 비교하여, Nsc-기는 염기 시약에 더 저항성이 있으며, 그의 분절 속도는 비슷한 조건에서 두드러지게 느리지만, 고체상 합성의 공정법(protocol)에 따라 Nα-보호의 분절에 대해 일반적으로 할당된 시간(15-20분)은 DMF중의 피페리딘 20-50% 용액과 같은 염기 시약에 의해 보호된 펩티드-폴리머로부터 Nα-Nsc-기를 정량적으로 분절하는데 충분하다. 다른 부분에 있어서, 염기 시약에 대한 Nsc-기의 증가된 저항성은 아실화 단계를 수행하는데 바람직하게 사용되는 중성의 약 염기 매체에서 두드러진 안정성을 제공한다.
위에 언급한 바와 같이, Nsc-기는 tert-부틸 형태의 보호기의 존재하에서 염기 시약에 의해 정량적으로 분절될 수 있으며, 이것들은 유기 염기에 저항성이 있다. 다른 한편 Nsc-기는 일반적으로 tert-부틸 형태의 보호기의 분절에 사용하는 산성 시약들의 작용에 완전한 저항성을 갖는다. 그래서 분절 조건과 관련하여 tert-부틸 형태 또는 그것에 유사한 곁가지 보호기를 갖는 일반 구조식(I)의 Nα-Nsc-아미노산류의 사용은 “직교론”에 따른 고체상 펩티드 합성의 새로운 전략의 개발을 가능케 한다.
본 발명은 이하 실시예들을 통하여 상세히 설명하지만 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다. 이하 설명중의 모든 아미노산은 특별한 지시가 없는 한 L-배위를 갖는다.
[실시예 1]
[Nα-Nsc-아스파라긴(I-10)]
3.95그램의 아스파라긴과 7.7그램의 포타시움 카보네이트를 물-디옥산 혼합물(3:1, v/v) 100밀리리터에 녹인 후 얼음욕(ice bath)에서 냉각시키고, 이어 70밀리리터의 디옥산에 녹인 7.5그램의 2-(4-나이트로페닐설포닐)에틸 클로로포메이트(III) 용액을 15분동안 교반하면서 적가하였다. 냉각욕(cooling bath)을 제거하고 혼합물을 20분간 더 교반하면서 감압하에서 10밀리리터가 될 때까지 증류하고 분액깔대기로 옮겼다. 100밀리리터의 물을 가하고 그 용액을 에틸 아세테이트 50밀리리터씩으로 2번 추출한다. 수용액층을 분리해내고 40% 황산 용액으로 pH 2로 산성화한 다음 얼음욕에서 냉각시켰다. 30분 뒤 형성된 침전물을 여과하고 냉수로 세척해 내고 공기중에서 건조하여 하얀 결정 분말로서 목적 화합물(I-10)을 얻었다(71%). 특성은 표 2에 나타냈다(실시예 5)
[실시예 2]
[Nα-Nsc-류신(I-5)]
4.92그램의 류신과 90밀리리터 무수 디클로로메탄을 환류냉각기와 적하깔대기가 장치된 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 이 현탁액에 9.5밀리리터의 클로로트리메틸실란을 격결하게 교반하면서 첨가하고, 그 혼합물을 1시간 동안 가열하여 끓였다. 생성된 용액을 얼음욕으로 냉각한 다음 9.1밀리리터 트리에틸아민과 9.0그람의 클로로포르메이트(III)을 교반하면서 첨가하였다. 그 혼합물을 얼음욕에서 20분간 교반하고 실온에서 1.5시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 증류해 내고 잔류물을 200밀리리터 에틸아세테이트와 250밀리리터의 2.5% 소디움 바이카르보네이트 수용액으로 분배하였다. 수용액층을 분리하고, 50밀리리터의 에테르로 세척해내고 1N 염산으로 pH 2로 산성화한 다음 에틸아세테이트 70밀리리터씩으로 3회 추출했다. 합친 추출액을 무수 소디움 설페이트로 건조하고 감압 증류하였다. 헥산-에틸아세테이트로부터 잔류물의 재결정화하여 하얀 결정 분말의 형태로 목적 물질(I-5)을 얻었다.(80%) 특성은 표 2에 나타내었다(실시예 5).
[실시예 3]
[Nα-Nsc-아스파틱 애시드 β-tert-부틸 에스테르(I-12)]
7.09그램의 아스파틱 애시드 β-tert-부틸 에스테르와 90밀리리터의 무수 디클로로메탄을 환류냉각기와 적하 깔대기를 장치한 250밀리리터의 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 그 혼합물에 12.7밀리리터의 디이소프로필에틸아민과 9.5밀리리터의 클로로트리메틸실란을 격렬하게 교반하면서 첨가하고, 그 혼합물을 1.5시간 동안 가열하여 끓였다. 그 반응 혼합물을 얼음욕으로 냉각시키고 9.0그램의 클로로포르메이트(III)을 한 번에 넣고 실온에서 1.5시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 증류해내고 잔류물을 200밀리리터의 에틸아세테이트와 250밀리리터의 2.5% 소디움 바이카보네이트 수용액으로 분배하였다. 수용액층을 분리해내고 에테르 50밀리리터로 세척하고 1N 염산으로 pH 2로 산성화한 다음 에틸아세테이트 70밀리리터씩으로 3회 추출하였다. 합친 추출물을 무수 소디움 설페이트로 건조하고 감압하에서 증류하였다. 헥산-에틸아세테이트로부터 잔류물을 재결정하여 하얀 결정 분말 형태로 목적 물질(I-2)을 얻었다.(86%) 특성은 표 2에 나타냈다.(실시예 5)
[실시예 4]
[Nα-Nsc-N-잔틸-아스파라킨(I-20)]
3.89그램의 Nα-Nsc-아스파라긴(I-10)과 2.6그램의 잔티드롤을 20밀리리터의 무수 DMF에 녹였다. 그 용액에 0.4밀리리터의 메탄설폰산을 가하고 그 혼합물을 상온에서 2일간 방치하였다. 생성 혼합물을 100밀리리터의 얼음 냉수에 부어 섞어 형성된 침전물을 여과하고 물, 에틸 아세테이트, 그리고 에테르로 세척하였다. 조생성물을 따뜻한 10밀리리터의 DMF에 녹이고 에테르로 여과하고 재침전시켰다. 침전물을 여과하여 수집하고 에테르로 세척한 후 진공에서 건조하여 목적 물질(I-20)의 결정성 분말을 얻었다.(74%) 특성은 표 2에 나타내었다(실시예 5).
[실시예 5]
[Nα-Nsc-아미노산(I)의 특성]
표 2는 실시예 1-4에 상세히 기술된 방법을 이용해 제조한 일반구조식(I)의 화합물들을 보여준다. “방법”란에 기입된 숫자는 구체적 방법을 기술하고 있는 실시예 번호이다. 광회절도[α]D 25는 DIP-320 폴라리메터(JASCO, 일본)의 1센티미터 규벳을 이용하여 측정하였다. 녹는점은 열린(open) 모세관을 이용하여 측정하였으며 보정은 하지 않았다. 크로마토그라피 이동상수 Rf는 Alufolien Kieselgel 60ΓF254(Merck, Darmstadt, Germany) 박층크로마토그라피를 이용하였으며, 전개액으로서는 (A) 클로로포름/메탄올/아세트산(95:5:3)과 (B) 벤젠/아세톤/아세트산(100:50:3)을 이용하였으며, 점적(spot)은 UV-흡수법 또는 닌하이드린 반응을 이용하여 검출하였다. 분자이온질량(molecular ion mass: (M+H+)은 MS-BC-1 시간-비상거리(time of flight) 질량스펙트로메터(Electron SPA, Sumy, Ukraine)를 사용하여 Cf252방사선유도 탈착(radiation-promoted desorption)으로 측정하였다.
[표 2]
Figure kpo00006
[실시예 6]
[도데카펩타이드 Ala-Ser-Ser-Thr-Ile-Ile-Lys-Phe-Gly-Ile-Asp-Lys의 고체상 합성]
a) 폴리머 지지체로의 앵커기의 삽입
3밀리리터의 DMF중의 아미노메틸화된 스티렌-1% 디비닐벤젠 공중합체(1.0meg, NH2/g) 250밀리그램에 0.75밀리몰의 2,4,5-트리클로로페닐 4-하이드록시메틸페녹시프로피오네이트와 0.75밀리몰의 1-하이드록시벤조트리아졸을 가하고, rm 현탁액을 상온에서 24시간 진탕하였다. 폴리머를 여과하고 DMF, 에탄올, 에테르, 및 마지막으로 헥산으로 세척한 뒤 오산화인을 흡습제로 하여 감압건조하였다.
b) 앵커기에 대한 NSC-Lys(Boc)-OH의 부착(attachment)
상기의 폴리머를 4밀리리터의 1,2-디클로로에탄/N-메틸피롤리딘(3:1) 혼합물에 녹여 팽윤시키고 0.7밀리몰의 Nsc-Lys(Boc)-OH(I-14), 0.1밀리몰의 4-디메틸아미노피리딘과 0.75밀리몰의 디사이클로헥실카르보디이미드를 가하였다. 그 현탁액을 실온에서 24시간 진탕하였다. 폴리머를 여과하고 클로로포름, 클로로포름/메탄올(1:1) 혼합물, 에탄올, 에테르 그리고 최종적으로 헥산으로 완전히 세척한 뒤 건조하여 Nsc-Lys(Boc)-폴리머 400밀리그램을 얻었다.
c) 펩티드 조립(assembly)
Nsc-Lys(Boc)-폴리머(200밀리그램)를 바닥에 폴리프로필렌 프릿(frit)이 장치된 10밀리리터 폴리프로필렌 시린지에 넣었다. 시린지의 폴리머를 DMF로 세척하고 다음의 조작공정법에 따라 이후의 합성공정을 수행하였다.
1. 전세척 : 33% 피페리딘/DMF, 4밀리리터; 0.5분
2. 탈보호 : 33% 피페리딘/DMF, 4밀리리터; 15분
3. 세척 : DMF, 6x(4밀리리터; 1분)
4. 아실화 : Nα-Nsc-아미노산(I), 0.5밀리몰;
벤조트리아졸-1-옥소-(트리스-다이메틸아미노)포스포니움
헥사플루오로포스페이트, 0.5밀리몰;
1-하이드록시벤조트리아졸, 0.5밀리몰;
N-메틸모폴린, 0.75밀리몰;
DMF, 2밀리리터; 60분(Nsc-Ile-OH의 경우 90분)
5. 세척 : DMF, 5x(4밀리리터; 1분)
Nα-Nsc-아미노산들은 다음 순서로 합성공정에 도입되었다:
Nsc-Asp(OtBu)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Phe-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ala-OH.
목적 아미노산 서열의 조립후 펩티드-폴리머를 20분동안 33% 피페리딘/DMF(4밀리리터)로 처리하고 그 다음 DMF와 디클로로메탄, 에탄올, 에테르, 마지막으로 헥산으로 세척하였다.
d) 탈보호(deblocking) 및 정제
펩티드-고분자를 실온에서 60분동안 1,2-다이클로로에탄중의 50% 트리플루오로아세트산 5밀리리터와 진탕하였다. 폴리머를 여과하고, 1,2-디클로로에탄중의 50% 트리플루오로아세트산 5밀리리터로 세척하고 합한 세척물(combined washings)을 얼음-냉각무수 에테르 100밀리리터로 묽게 하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 후 진공에서 건조하여, 조(crude) 도데카펩티드 170밀리그램을 얻었다(역상 HPLC 분석에 의한 순도 70%).
조 도데카펩티드를 1몰 아세트산 수용액에 3밀리리터에 녹이고 TSK HW-40F(Mreck, Darmstsdt, Germany)로 채워진 1,5×70센티미터 칼럼상에서 크로마토그라피하였고, 같은 완충용액으로 평형 및 전개하였다. 순수한 펩티드를 포함하는 분획들을 모아 동결건조하였다. 목적 도데카펩티드의 최종 수율은 104밀리그램(41%)이고 역상 HLPC 분석에 의해 순도는 95% 이상이었다. 아미노산의 조성(6N 염산 가수분해후, 110℃, 24 및 48시간): Asp 1.02(1); Ser 1.84(2); Thr 0.93(1); Glu 0.94(1); Gly 1.03(1); Ala 1.00(1); Ile 2.78(3); Lys 2.04(2).

Claims (7)

  1. 다음 일반구조식(I)의 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산 유도체
    Figure kpo00007
    식중, R1은 수소원자, R2는 이소프로필, 2-메틸프로필, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
  2. 다음 구조식(II)의 아미노산을 염기 존재하 물-유기용매 혼합용매중에서 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐 클로로포메이트와 반응시키는 것으로 이루어지는 다음 일반구조식(I)의 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산 유도체를 제조하는 방법.
    Figure kpo00008
    Figure kpo00009
    식중, R1은 수소원자, R2는 이소프로필, 2-메틸프로필, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
  3. a) 다음 구조식(II)의 아미노산을 O,N-트리메틸실릴화된 유도체로 전환시키기; b) 상기 O,N-트리메틸실릴화된 유도체를 염기 존재하 비양성자성 용매중에서 2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐 클로로포메이트와 반응시키는 것으로 이루어지는 다음 일반구조식(I)의 Nα-2-(4-나이트로페닐설포닐)에톡시카르보닐-아미노산 유도체를 제조하는 방법.
    Figure kpo00010
    Figure kpo00011
    식중, R1은 수소원자, R2는 이소프로필, 2-메틸프로필, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
  4. 다음 일반구조식(I)의 아미노산 유도체중 R1이 수소원자이고 R2가 카르복사미도메틸 또는 2-(카르복사미도)에틸인 경우의 화합물을 산 존재하 유기 용매중에서 잔티드롤과 반응시키는 것으로 이루어지는 일반구조식(I)의 화합물중 R1이 수소 원자이고 R2가 N-잔틸카르복사미도에틸 또는 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸인 경우의 화합물을 제조하는 방법.
    Figure kpo00012
  5. 보호된 아미노산 모노머를 불용성 폴리머 지지체에 부착된 성장 펩티드 사슬에 서열부기(sequential addition)에 의해 펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 보호된 아미노산 모노머가 다음 일반구조식(I)의 아미노산 유도체이고, 상기 방법이 a) 상기 보호된 모노머의 유리 카르복실기를 통하여 상기 폴리머 지지체에 결합된 앵커기의 아미노 또는 하이드록실 관능기에 C-말단 보호된 모노머를 커플링시켜 보호된 아미노아실-폴리머를 형성하기; b) 상기 보호된 아미노아실-폴리머를 염기성 시약으로 처리하여 탈보호함(deblocking)으로써 유리 알파-아미노기를 갖는 아미노아실-폴리머를 형성하기; c) 상기 아미노아실-폴리머의 유리 알파-아미노기에 다음 순서의 보호된 아미노산 모노머를 커플링시킴으로써 보호된 펩티드-폴리머를 형성하기; d) 목적 펩티드 서열의 마지막 모노머가 커플링될 때까지 상기 b) 및 c)단계를 반복하고, 그 다음 b)단계를 수행하기;로 이루어지는 펩티드의 제조방법.
    Figure kpo00013
    식중, R1은 수소원자, R2는 이소프로필, 2-메틸프로필, 2-메틸티오에틸, 벤질, 카르복사미도메틸, 2-카르복사미도에틸, 4-tert-부톡시벤질, 인돌릴-3-메틸, S-(트리페닐메틸)티오메틸, 1-(트리페닐메틸)이미다졸릴-4-메틸, 3-(NG-메시틸렌설포닐)구아니디노프로필, N-잔틸카르복사미도메틸, 2-(N-잔틸카르복사미도)에틸 또는 S-(아세타미도메틸)티오메틸을 나타내고, 또는 R1과 R2가 함께 프로필렌기를 형성한다.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염기성 시약이 암모니아, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 디에틸아민, 1,8-디아자비사이클로[5,4,0]운덱-7-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘 및 그것들의 비양성자성 유기 용매중의 용액들로 이루어지는 군에서 선택되는 질소 염기인 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 질소 염기가 피페리딘이고, 유기 용매가 디메틸포름아미드인 제조방법.
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