FI90780B - Tekohartsi - Google Patents

Description

90780

Tekohartsi

Konstharts

Keksinnön kohteena on uudenlainen tekohartsi käytettäväksi kantoaineena peptidien ja peptidiamidien tunnetun yleisen Merrifield-synteesiperiaatteen mukaisessa kiinteäfaasi-synteesissä. Keksinnön mukainen tekohartsi muodostuu tällaiseen Merrifield-synteesiin käyttökelpoisen polystyree-nin perusrungosta, joka mahdollisesti kopolymeroimalla on ristiinkytketty 0-5 mooliprosentin, mieluimmin 1-2 mooli-prosentin kanssa divinyylibentseeniä ja jolle on tunnusomaista, että se on perusrunkonsa bentseenirenkaissa subs-tituoitu kaavan I mukaisilla ryhmillä RV.

-CHz-O— ζ /—°R (I) jossa X on -O- tai -NH- ja R tarkoittaa Ci-4-alkyyliä. Keksinnön mukaisissa hartseissa X on mieluimmin -O-, symbolin R ollessa mieluimmin lineaarinen Ci_4-alkyyli, ensi sijassa metyyli.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä edellä kuvatun hartsin valmistamiseksi ja sen käyttö peptidien ja peptidiamidien valmistamiseksi, erityisesti sellaisten, joissa N-terminaalinen aminoryhmä ja/tai muut funktionaaliset ryhmät ovat suojatut. Keksinnön kohteena ovat myös vastaavat hartsit, joissa tähde -XH, sen tarkoittaessa -NH2:ta, on suojatussa muodossa, myös hartsit, joihin on kiinnittyneenä mahdollisesti suojattuja aminohappo-, peptidi- ja peptidiamiditähteitä, sekä edellä mainitulla menetelmällä valmistetut vapaat peptidit ja peptidiamidit, erityisesti esimerkeissä kuvatut.

Vuonna 1962 julkaistun peptidiyhdisteiden Merrifield-synteesin periaate on yleisesti tunnettu. Siinä sopivalla 2 tavalla funktionalisoituun peruspolymeeriin (kaikkein yleisimmässä muodossa kloorimetyloituun polystyreeniin) sitoutuu (ankkuroituu) toisessa päässä (yleisimmin N-päässä) suojattu aminohappo. Tämän sidoksen täytyy toisaalta olla tarpeeksi vahva pysyäkseen muuttumattomana peptidisynteesin erilaisissa reaktio-olosuhteissa (erityisesti N-terminaalista aminosuojaryhmää poislohkaistaessa), toisaalta sen tulee tarjota myös mahdollisuus valmiin peptidin liuottamiseen polymeerikantoaineesta tuotetta va-hingoittamattomissa olosuhteissa. Varsinainen synteesi tapahtuu tällöin tässä kantoaineeseen ankkuroituneessa aminohapossa, jolloin tavalliseen tapaan N-terminaalinen suojaryhmä lohkaistaan pois, vapautettu aminoryhmä asyloi-daan sopivalla, N-päässä suojatulla aminohappojohdannaisella (t.s. muodostuu uusi peptidisidos), ja tämä pääteasemassa olevan suojaryhmän poislohkaisu ja asylointi toisella aminohappotähteellä toistetaan niin monta kertaa kunnes saavutetaan halutun pituinen aminohappoketju. Sen jälkeen tämä ketju sopivalla reagenssilla liuotetaan (irrotetaan) valmiina peptidinä kantoaineesta. Tätä ideaalista reaktiokulkua haittaavat käytännön suorituksessa useat haittatekijät ja virhelähteet ja viimeisen 25 vuoden aikana peptidikirjallisuudessa on ahkerasti pohdittu näitä ongelmia. Yksi vaikeuksista on siinä, ettei kantoaineella olevaa syntetisoitua ketjua voida vapauttaa sivutuotteista ja siten jokaisessa uudessa synteesivaiheessa jo muodostunut virherakenne (esim. sivutuote, jolla lyhyempi ketju) reagoi mukana ja kulkee edelleen mukana seuraavissa vaiheissa niin, että lopussa haluttua tuotetta saadaan usein vain vähäisessä määrin samankaltaisen rakenteen omaavien sivutuotteiden ollessa pääasiallinen tuote massassa, josta se täytyy erottaa. Tämä tilanne on erityisen vaikea, käytettyjen aminohappojen sisältäessä sivuketjuissaan muita funktionaalisia ryhmiä, jotka käytännössä aina (asylointi-reaktion suhteellisen energisten olosuhteiden takia) täy- li 3 90780 tyy suojata. Näiden suojaryhmien puolestaan täytyy olla riittävän pysyvät säilyäkseen muuttumattomina vapautettaessa N-terminaalinen aminoryhmä. Ongelmana on vielä pepti-diamidien valmistus, koska niiden sitoutuminen kantoainee-seen (tavanomaisten peptidien esterisitoutumisen vastakohtana) tapahtuu myös peptidisidoksella samoin kuin sitoutuminen koko aminohappoketjun aminohappojen välillä. Vaikeutena on nyt peptidiamidin selektiivinen irrottaminen kan-toaineesta siten että muut peptidisidokset säilyvät. Näistä (ja vielä muista) syistä johtuen kiinteäfaasisynteesiä (Merrifield-synteesiä) käytetään nykyisin ainoastaan menetelmänä, jolla on tiettyjä etuja, valmistettaessa peptidejä, joissa on korkeintaan 30 aminohappoa.

Sen käyttöalueen laajentamiseksi on esitetty, katso esim.

B.E. Atherton et ai., Proceedings of the 7th American Peptide Symposium, sivut 163-195, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA (1981), kokonaisten aminohappo-osasekvenssien, joissa suojatut funktionaaliset ryhmät (mukaan luettuna N-terminaalinen aminoryhmä), liittämistä rakenneosina kantoaineeseen ja muiden suojattujen peptidifrag-menttien liittämistä rakenneosina. Tällöin pitäisi myös olla mahdollista valmistaa nämä tarvittavat rakenneosat (peptidifragmentit) kantoaineeseen kiinteäfaasisynteesil-lä. Tämä muodostaa kuitenkin aivan uuden tilanteen. Tarvitaan hartsi, joka tekee mahdolliseksi synteettisen peptidif ragmentin, joka muodostuu useammasta suojatusta aminohappotähteestä, irrottamisen liitoksesta hartsilta niin lievissä ja/tai selektiivisissä oloissa, että sekä N-terminaalinen suojaryhmä että muiden funktionaalisten ryhmien suojaryhmät (joiden välttämättä täytyy erota ensiksi mainitusta) pysyvät muuttumattomina. Yksityiskohtainen keskustelu erilaisista mahdollisuuksista ja osaratkaisuista on esitetty edellä mainitussa julkaisussa Atherton et ai.; nämä tekijät itse esittävät omana parhaana ratkaisuna 4 polyamidi-perushartsin käyttöä, joka norvaliinin välityksellä on sitoutunut 2-tai 3-metoksi-4-hydroksimetyylife-noksietikkahappoon. Ensimmäisen (suojatun) aminohapon C-pää on siten liittynyt esterisidoksella hydroksimetyyli-ryhmään, tämän sidoksen poislohkaisu (irrottaminen hartsista) synteesin lopussa tapahtuu l%:isella trifluorietik-kahapolla metyleenikloridissä. Mutta tämäkään menetelmä, jota voidaan pitää luultavasti tunnetun tekniikan yhtenä parhaista, ei ole yleisesti käyttökelpoinen, koska tekijät itsekin toteavat, että synteesin lopussa irrottamisolosuh-teissa sivuketjujen ainakin 2 hyvin tärkeätä suojaryhmää, nimittäin lysiinin ξ-aminoryhmän tert.-butoksikarbonyyli-suojaryhmä ja tert.butyyliryhmä, joka on tyrosiinin hyd-roksyyliryhmän suoja, lohkeavat niin helposti, että näiden suojaryhmien käyttö on kyseenalaista. Lisäksi hartsi on sopimaton peptidiamidien suoraan kiinteäfaasisynteesiin. Tämä kaikki on todennäköisesti syynä siihen, ettei tämä menetelmä, huolimatta sen ilmeisistä eduista, tähän mennessä ole saavuttanut mitään laajempaa käyttöä.

Yllättävällä tavalla on nyt todettu, että keksinnön mukainen tekohartsi on vapaa aikaisempien ratkaisujen tunnetuista haitoista ja sitä on siten mahdollista käyttää laajasti suojattujen ja suojaamattomien peptidien ja peptidiamidien kiinteätaasisynteesissä. Polymeeri-perusrunkona sen syntetisoimiseksi käytetään mieluimmin useimmiten käytettyä kantoainepolymeeria, t.s. polystyreeniä.

Peruspolymeerina on käytännössä käyttökelpoinen mikä tahansa tekohartsi, joka sisältää fenyyliryhmiä rungossa. Edullisia ovat styreenin polymeerit, kuten sellaiset, joita jo 20 vuotta on yleisesti käytetty kantoaineena peptidien kiinteäfaasisynteesissä ja ovat saatavissa tähän tarkoitukseen erilaisten kaupallisten valmisteiden muodossa. Kohonneen stabiilisuuden ja orgaanisiin liuottimiin liu-

II

90780 5 kenemattomuutensa takia ovat edullisia polystyreenihart-sit, jotka ovat ristiinkytkettyjä kopolymeroimalla korkeintaan 5:llä, mieluimmin noin l-2:lla mooliprosentilla divinyylibentseeniä. Tällaiset peruspolymeerit ovat subs-tituoituja kloorimetyloinnilla tai bromimetyloinnilla fe-nyyliryhmissään (bentseenirenkaissa) ja siten varsinaisten kiinnitettävien ryhmien liittäminen metyyliryhmään tapahtuu korvaamalla kloori tai bromi. Myös halogeenimetyloi-dut, ennen muuta kloorimetyloidut polystyreenihartsit ovat sopivia kaupallisia tuotteita, joita "Merrifield-hartsin" merkityksessä käytetään laajasti peptidien kiinteäfaasi-synteesissä.

Keksinnön mukainen menetelmä edellä määritellyn uudenlaisen tekohartsin valmistamiseksi perustuu siihen, että sopiva, esim. jokin edellä kuvattu 0-5%:isesti divinyyli-bentseenillä ristiinkytketty ja perusrungon bentseenirenkaissa kloorimetyloitu tai bromimetyloitu polystyreeni saatetaan reagoimaan peräkkäin a) kaavan II mukaisen yhdisteen kanssa R°\-.

M_0_y V-CO— ^ V-OR (II) ·=· jossa M on alkalimetalli ja R tarkoittaa samaa kuin edellä, b) pelkistysaineen kanssa, ja kun X tarkoittaa ryhmää -NHc) aminoryhmän liittävän reagenssin kanssa.

Menetelmävaiheen a) mukainen reaktio suoritetaan korkeapo-laarisessa liuottimessa, joka mieluimmin on hyvin suoloja liuottava, esimerkiksi dipolaarinen aproottinen liuotin, kuten dimetyylisulfoksidi, asetonitriili, heksametyylifosfo-ritriamidi, Ν,Ν'-propyleenikarbamidi tai alifaattinen amidi, kuten erityisesti dimetyyliformamidi, myös mainittujen li 6 uottimien seokset keskenään ja reaktio suoritetaan mieluimmin huolellisesti kosteudelta suojaten. Ennen kaikkea käytetään kaavan II mukaisen alkalimetallisuolan liuosta, tähän tarkoitukseen soveltuu aivan erityisen hyvin cesiumsuola (M on cesium). Reaktio voidaan suorittaa lämpötiloissa, jotka ovat 0-50 °C, mieluimmin suunnilleen huoneen lämpötilassa, jolloin reaktioajat vastaavasti ovat esim. 8-72 tuntia. Tällöin reaktioseosta mielellään mekaanisesti sekoitetaan tai ravistellaan. Lähtöaineina käytetyt 2,4-dialkoksi-4'-hydroksibentsofenonit saadaan sinänsä tunnetulla tavalla, esim. C-asyloimalla vastaava resorsiini-dieetteri p-hydrok-sibentsoyylikloridilla katalysaattorina aluminiumkloridi, tai tämän asyloinnin muunnoksella, haluttu suola saadaan tästä tavanomaisilla reaktioilla vastaavan aikaiimetallihyd-roksidin, kuten cesiumhydroksidin kanssa.

Menetelmävaihe b) suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla reaktiolla pelkistysaineen kanssa, esim. jonkin sellaisen kanssa, joka on käyttökelpoinen oksoryhmien pelkistämiseen hydroksyyliryhmiksi. Sopivia pelkistysaineita ovat esim. diboraani tai kompleksiset hydridit, kuten erityisesti al-kalimetalliboorihydridi (esim. natriumboorihydridi, li-tiumboorihydridi tai kaiiumboorihydridi) sekä myös alkali-metallialuminiumhydridit (esim. natriumaluminiumhydridi tai litiumaluminiumhydridi), jotka lisätään tarkoituksenmukaisiin ei-reaktiokykyisiin orgaanisiin liuottimiin, erityisesti avoketjuisiin tai syklisiin eettereihin (esim. di-isopropyylieetteriin tai 1,2-dimetoksi- tai dietoksi-etaaniin tai dioksaaniin tai tetrahydrofuraani in) lämpötiloissa, jotka ovat 0 °C - aina noin 100 °C, riippuen rea-gensseista. Reaktioajat riippuvat kulloisistakin reagoivista aineista ja reaktio-olosuhteista, yleensä reaktio-ajat ovat 1-48 tuntia, ravistelu tai sekoittaminen helpottaa kiinteiden ja nestemäisten komponenttien kontaktia. Tarvittaessa pelkistysreaktio voidaan toistaa uudella an- 7 90780 noksella pelkistysainetta, reaktion lopussa ylimääräiset reagenssit mieluimmin tuhotaan, esim. ketonilla, kuten asetonilla.

Haluttaessa suoritettava menetelmävaihe c), jota käytetään vaiheen b) mukaisesti saatavan "hydroksyylihartsin" muuttamiseen "aminohartsiksi", tapahtuu esim. ammoniakilla. Tällöin esimerkiksi ammoniakkikaasua johdetaan "hydroksyy-lihartsin" sekoitettuun suspensioon polaarisessa liuotti-messa, joka on esim. jokin menetelmävaiheessa a) tai b) mainittu liuotin, lämpötiloissa, jotka ovat 0 eC - huoneen lämpötila, erityisesti voidaan käyttää myös korkeampaa painetta ja lämpötila voi olla jopa 50 eC työskenneltäessä ravistellen.

Menetelmävaiheeseen c) sopii erityisesti aminoryhmän liittäviksi reagoiviksi aineiksi karbamaatit, joiden alkoholi-osa voidaan lohkaista pois emäskäsittelyllä ja jotka myös happamissa reaktio-oloissa ovat pysyviä. Esimerkkejä tällaisista karbamaateista ovat substituoidut etyylikarbamaa-tit, jotka 3-asemassa sisältävät aktivoituja, erityisesti elektroneja puoleensa vetäviä substituentteja. Sopivia ovat β-(alempi-alkaani tai aryylisulfonyyli)-etyylikarba-maatit, esim. β-(metaanisulfonyyli)-etyylikarbamaatti tai β -(bentseenisulfonyyli)-etyylikarbamaatti, B-(nitro-, syano- tai halogeenifenyyli)-etyylikarbamaatit, esim. B-(p-nitrofenyyli)-etyylikarbamaatti, β-di-(p-nitrofenyy-li)-etyylikarbamaatti tai B-(pentafluorifenyyli)-etyyli-karbamaatti tai erityisesti 9-fluorenyylimetyylikarba-maatti. Reaktioissa edellä mainittujen karbamaattien kanssa "hydroksyylihartsin" suspensiota sekoitetaan inertissä orgaanisessa liuottimessa, esimerkiksi halogeenihiilive-dyssä, kuten metyleenikloridissa, kloroformissa tai 1,2-dikloorietaanissa tai eetterissä, kuten di-isopropyy-lieetterissä, di-isobutyylieetterissä, dimetoksietaanissa, 8 dietoksietaanissa, tetrahydrofuraanissa tai dioksaanissa lämpötiloissa, jotka ovat 20 eC - 80 °C, mieluimmin noin 50 °C, karbamaatin ja vahvan hapon, esimerkiksi orgaanisen sulfonihapon, mieluimmin alempialkaani- tai aryylisulfoni-hapon, esim. metaanisulfonihapon, bentseenisulfonihapon tai p-tolueenisulfonihapon kanssa muutaman tunnin ajan, esim. 2-48 tuntia. Tällä tavalla muodostuu edellä määritellyn rakenteen omaava tekohartsi, joka ryhmän -X-H sijasta sisältää ryhmän -NH-W, jossa W tarkoittaa emäskäsit-telyllä poislohkaistavissa olevaa aminosuojaryhmää, erityisesti substituoitua etoksikarbonyyliryhmää. "Aminohart-sin" vapauttamiseksi suojaryhmä lohkaistaan pois emäksellä, esimerkiksi tertiäärisen tai mieluimmin sekundäärisen avoketjuisen tai syklisen amiinin, esim. trietyyliamiinin, tributyyliamiinin, dietyyliamiinin, piperidiinin, pyrroli-diinin tai morfoliinin liuoksella inertissä orgaanisessa liuottimessa, mieluimmin jossain edellä mainitussa eetterissä tai dialempialkyyliamidissa, esim. dimetyyliformami-dissa tai dimetyyliasetamidissa lämpötiloissa, jotka ovat 0 °C - 50 eC, mieluimmin suunnilleen huoneen lämpötilassa, reaktioaikojen ollessa muutamasta minuutista, esim 1 minuutista aina muutamaan tuntiin, esim. 6 tuntiin. Amiinin sijasta voidaan käyttää myös alkalimetallihydroksidia, esim. natriumhydroksidia tai ammoniumhydroksidia, esim. bentsyylitrimetyyliammmoniumhydroksidia, jolloin lohkaiseminen tapahtuu myös alemmissa lämpötiloissa jo lyhyemmillä reaktioajoilla, esim. alle 1 minuutin.

Kuten edellä jo mainittiin keksintö koskee myös keksinnön mukaisen tekohartsin käyttöä kantoaineena peptidien ja peptidiamidien erityisesti sellaisten, jotka N-terminaali-sessa aminoryhmässä ja/tai sivuketjujen funktionaalisissa ryhmissä ovat suojatut, kiinteäfaasisynteesissä.

Keksinnön mukaisesti nämä peptidiyhdisteet valmistetaan käyttäen edellä määriteltyjä tekohartseja siten, että 9 90780 a) tekohartsi saatetaan reagoimaan kaavan W^-AM^-Y-H mukaisen yhdisteen kanssa, jossa Y on -0- tai -NH-, W^- tarkoittaa N-terminaalista aminosuojaryhmää ja AM^- tarkoittaa 1-25 aminohaposta muodostuvan, funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohappoketjun asyylitähdettä, tai tämän reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen kanssa tähteen wl-AM^·- liittämiseksi hartsin ryhmään -X-, b) N-terminaalinen suojaryhmä W1 lohkaistaan pois, c) vapautettu N-terminaalinen aminoryhmä asyloidaan reaktiolla kaavan W^-aM^-oh mukaisen hapon kanssa, jossa ja AM^ ovat edellä määriteltyjen tähteiden W·*- ja AM^ analogeja, tai tämän reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen kanssa, d) vuorotellen tapahtuva kohdan b) mukainen poislohkaisu ja kohdan c) mukainen asylointi toistetaan mielivaltaisen monta kertaa halutun aminohappoketjun valmistamiseksi ja e) muodostunut peptidi tai peptidiamidi haluttaessa ennen suojaryhmien poislohkaisua tai samanaikaisesti irrotetaan hartsista asidolyysillä.

Liitettäessä C-terminaalinen suojattu aminohappo tai ami-nohappoketju keksinnön mukaiseen hartsiin valitaan olosuhteet aina huomioonottaen kulloinkin reagoivat funktionaaliset ryhmät. Mieluimmin käytetään kantoainehartsina kaavan I mukaista "hydroksyylihartsia", jossa X on -O-, tämä voidaan, silloin kun lopputuote halutaan saada amidimuo-dossa, saattaa reagoimaan suojatun aminohappoamidin tai suojatun aminohappoketjun, joka on amidina, esim. kaavan w!-Am1-NH2 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa ja AM^-tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin hartsin hydroksyy-liryhmät -XH vaihtuvat amidisiin C-terminaalisiin amino-ryhmiin. Liittämisreaktio suoritetaan yleensä happokataly-saattorin, esim. orgaanisen sulfonihapon, mieluimmin alempialkaani- tai aryylisulfonihapon, esim. metaanisulfo-nihapon, bentseenisulfonihapon tai p-tolueenisulfonihapon 10 läsnäollessa inertissä orgaanisessa liuottimessa, kuten klooratuissa alkaaneissa (esim. metyleenikloridissa, kloroformissa tai 1,2-dikloorietaanissa) ja/tai avoketjuisen tai syklisen eetterin (esim. dietyyli-, di-isopropyyli-tai dibutyylieetterin tai 1,2-dimetoksi- tai 1,2-di-etok-sietaanin tai dioksaanin tai tetrahydrofuraanin) läsnäollessa useamman, esim. 2-48 tunnin kuluessa lämpötiloissa, jotka ovat 20 °C - 80 °C, mieluimmin noin 50 °C. Tarvittaessa voidaan liittämisreaktio toistaa. Hartsia, johon on liitetty C-terminaalinen amidi, t.s. sellaista, jonka bentseenirengas on substituoitu kaavan III mukaisilla tähteillä R\ · —· φ —· -CHz-O—( OR (III)

• SI I ISI

NH-AM1 -W1 jossa R, W^· ja AM1 tarkoittavat samaa kuin edellä, käytetään sen jälkeen halutun aminohappoketjun syntetisoimisek-si menetelmävaiheiden b) - d) mukaisesti. Valmiin peptidi-amidin irrottaminen (menetelmävaihe e) voidaan tehdä fluo-rivedyllä, mieluimmin kuitenkin lievemmillä happamilla aineilla, kuten trifluorietikkahapolla, mieluimmin inertissä orgaanisessa laimennusaineessa, kuten halogeenial-kaanissa tai vedessä. Esimerkiksi vapauttaminen tehdään seoksella, jossa on trifluorietikkahappo ja metyleeniklo-ridi tai 1,2-dikloorietaani, esim. tilavuussuhteissa 1:1. Näissä olosuhteissa eivät kuitenkaan kaikki tavallisesti käytetyt asidolyyttisesti poislohkaistavat suojaryhmät ole pysyviä. Riippuen aina reaktion suorittamistavasta samanaikaisesti hartsista irrottamisen kanssa lohkaistaan myös vastaavat suojaryhmät ja tuloksena on peptidiamidi, jossa on vapaat funktionaaliset ryhmät.

Jos peptidin synteesin lopussa tulee olla vapaan hapon muodossa (haluttaessa N-terminaalisen suojaryhmän ja/tai mui 90780 11 ta suojaryhmiä sisältäen), niin kantoainehartsina käytetään puolestaan kaavan I mukaista "hydroksyylihartsia", jossa X on -0-. Sen jälkeen tämä saatetaan reagoimaan suojatun aminohapon tai suojatun aminohappoketjun kanssa vapaan hapon muodossa tai hapon reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen muodossa, esim. kaavan wl-AM^-OH mukaisen yhdisteen kanssa, jossa Vfl ja AM^- tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin tapahtuu hartsin hydroksyyliryhmän esteröityminen. Liittymisreaktio suoritetaan peptidisyn-teesien asyloinnissa tavallisesti käytetyissä olosuhteissa. Reaktiokykyisenä funktionaalisena johdannaisena käytetään esim. liitettävän hapon anhydridiä, erityisesti symmetristä anhydridiä, mieluimmin orgaanisten tertiääris-ten emästen, kuten jäljempänä mainittujen läsnäollessa.

Sopiva funktionaalinen johdannainen on myös liitettävän hapon aktiiviesteri, joka myös saatetaan reagoimaan jäljempänä mainittujen orgaanisten tertiääristen emästen läsnäollessa. Sopivia aktiiviestereitä ovat erityisesti fenolien esterit, joissa on elektroneja puoleensa vetäviä substituentteja, ja N-hydroksi-imidien esterit. Mieluimmin liitettävää yhdistettä käytetään kuitenkin vapaana happona ja asyloidaan karbodi-imidien, esim. di-isopropyyli-karbo-di-imidin tai erityisesti disykloheksyylikarbodi-imidin avulla, joka toimii kondensaatioaineena. Reaktio suoritetaan orgaanisten emästen, erityisesti tertiääristen emästen (kuten pyridiinin, kinoliinin, 4-dimetyyliaminopyri-diinin, N-metyylipiperidiinin, N-metyylimorfoliinin, Ν,Ν'-dimetyylipiperatsiinin tai trietyyliamiinin tai di-isopropyylietyyliamiinin) läsnäollessa ja inerteissä orgaanisissa liuottimissa, kuten klooratuissa alkaaneissa (esim. metyleenikloridissa tai kloroformissa) ja/tai avo-ketjuisissa tai syklisissä eettereissä (esim. dietyyli-, di-isopropyyli- tai dibutyylieetterissä tai 1,2-dimetoksi-tai 1,2-dietoksietaanissa tai dioksaanissa tai tetrahydro-furaanissa). Mieluimmin lisätään aktivoitua N-hydroksi- 12 yhdistettä, esim. 1-hydroksibentstriatsolia. Reaktioaika nousee yleensä useampaan, kuten 2-48 tuntiin lämpötiloissa, jotka ovat 0 °C - 40 °C; haluttaessa asylointireaktio voidaan toistaa. Toimenpiteenä ei-toivottujen sivutuotteiden välttämiseksi on edullista, että saatu hartsi käsitellään bentsoyylikloridilla (tai samankaltaisella yksinkertaisella happojohdannaisella) emäksen, kuten jonkin edellä mainitun läsnäollessa, ja tällä tavalla hartsin mahdollisesti vielä vapaana olevat hydroksyyliryhmät suojataan. Hartsia, johon on liitetty C-terminaalinen esteri, t.s. sellainen, jonka bentseenirengas on substituoitu kaavan IV mukaisilla tähteillä R°\-.

—CHz-O— ζ CH—^ OR (IV) • S· I · S · O—AM1—W1 jossa R, ja AM^· tarkoittavat samaa kuin edellä, käytetään sen jälkeen halutun aminohappoketjun syntetisoimisek-si menetelmävaiheiden b) - d) mukaisesti. Valmiin peptidi-hapon irrottaminen (menetelmävaihe e) voidaan suorittaa, silloin kun lopputuote halutaan saada ilman suojaryhmiä, erityisesti ilman happolabiileja suojaryhmiä, fluorivedyl-lä, mieluimmin kuitenkin lievemmillä, happoisilla aineilla, kuten trifluorietikkahapolla, joka mieluimmin laimennetaan inertillä orgaanisella liuottimena, kuten halogee-nialkaanilla. Haluttaessa saada peptidi (aminohappoketju), jossa N-terminaalinen aminoryhmä ja/tai muut funktionaaliset ryhmät ovat suojatussa muodossa, kuten on kaikkein toivotuinta peptidifragmenteissa seuraavia synteesejä ajatellen, suoritetaan lopputuotteen irrottaminen hartsista erityisen lievissä asidolyyttisissä olosuhteissa, esim. orgaanisella hapolla, erityisesti alempialkaanikarboksyy-lihapolla, mieluimmin muurahais- tai propionihapolla ja ennen kaikkea etikkahapolla, joka voidaan laimentaa neut- li 90780 13 raaleilla orgaanisilla liuottimilla, esim. klooratuilla alkaaneilla tai alifaattisilla tai syklisillä eettereillä, erityisen edullisena voidaan mainita esimerkiksi etik-kahapon ja metyleenikloridin tai kloroformin seos, jossa tilavuussuhteet noin 1:1 - noin 1:19, erityisesti 1:9. Sopivia ovat myös voimakkaasti laimennetut trifluorietikka-hapot, esim. 0,1 - 2%:isena liuoksena metyleenikloridissa tai kloroformissa tai pyridiniumsuola, esim. pyridinium-hydrokloridi polaarisessa suolaa ja peptidiä liuottavassa liuottimessa, esim. dimetyyliasetamidissa tai dimetyyli-formamidissa. Irrottaminen tapahtuu tavallisesti lämpötiloissa, jotka ovat 0-50 eC, mieluimmin suunnilleen huoneenlämpötilassa, jolloin reaktioaika voi pidentyä muutamasta minuutista aina useampaan (esim. 2-8) tuntiin.

Peptidiamideja saadaan myös, kun kantoainehartsina kaavan I mukainen "aminohartsi", jossa X on -NH-, saatetaan reagoimaan suojatun aminohapon tai suojatun aminohappoketjun kanssa vapaan hapon muodossa tai hapon reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen muodossa, esim. kaavan W^-AM^-OH mukaisen yhdisteen kanssa, jossa W^- ja AM^- tarkoittavat samaa kuin edellä. Tällöin muodostuu hartsi, johon on liitetty C-terminaalinen amidi, t.s. sellainen, jonka bentseenirenkaat on substituoitu kaavan III mukaisilla tähteillä. Reaktio tapahtuu mieluimmin kuten edellä on esitetty "hydroksyylihartsin" esteröimiseksi vapaalla hapolla tai sen reaktiokykyisellä funktionaalisella johdannaisella mainituissa reaktio-olosuhteissa. Halutun aminohappoket jun rakentaminen menetelmävaiheiden b) - d) mukaan ja valmiin peptidiamidin irrottaminen menetelmävai-heen e) mukaan tapahtuu sen jälkeen täsmälleen jo edellä kuvatulla tavalla.

Aminohappoketjun suhteellisen helppo lohkeavuus hartsista riippuu erityisesti N-terminaalisten aminosuojaryhmien va 14 linnasta, joiden täytyy olla ehdottoman selektiiviset, jotta ketju pysyy .hartsissa (ja myös muut suojaryhmät säilyvät) mutta kuitenkin niiden täytyy olla kvantitatiivisesti poislohkaistavia. Nämä N-terminaaliset aminosuoja-ryhmät ja ovat mieluimmin emäksinen poislohkaista-vissa oleva ryhmä, erityisesti oksikarbonyyli-tyyppiä oleva. Edullisia N-terminaalisia aminosuojaryhmiä ja ovat substituoidut etoksikarbonyyliryhmät, joilla 3-asemassa on aktivoidut, erityisesti elektroneja puoleensa vetävät substituentit, kuten jo edellä vastaavien kar-bamaattien yhteydessä mainittiin. Ensi sijassa kysymykseen tulevat 0-(metaanisulfonyyli)-etoksikarbonyyliryhmä, 3-(p-nitrofenyyli)-etoksikarbonyyliryhmä ja 3-di-(p-nitro-fenyyli)-etoksikarbonyyliryhmä, ennen kaikkea kuitenkin 9-fluorenyylimetoksikarbonyyliryhmä (Fmoc). Nämä suojaryhmät voidaan lohkaista pois epäorgaanisilla tai orgaanisilla emäksillä, erityisesti tertiäärisillä tai sekundäärisillä amiineilla, kuten jo edellä "aminohartsin" valmistuksen yhteydessä on mainittu. N-terminaalisen aminosuoja-ryhmän poislohkaisuolosuhteet menetelmävaiheen b) mukaan, erityisesti Fmoc-ryhmän on myös kuvattu edellä "aminohartsin" valmistuksessa ja ovat yleisesti tunnetut.

Vapautetun N-terminaalisen aminoryhmän asylointi menetelmävaiheen c) mukaan tapahtuu yleisissä tavallisissa olosuhteissa, jotka sopivat kiinteäfaasisynteesille, erityisesti Merrifield-kantoaineella. Lukuisista tunnetuista muunnoksista on edullinen sellainen, jossa asyloidaan N-päässä Fmoc- tai ekvivalentilla emäslabiililla suojaryh-mällä suojatulla aminohapolla (tai aminohappoketjulla), jossa sivuketjun kaikki funktionaaliset ryhmät ovat suojatussa muodossa, tai tämän hapon reaktiokykyisellä funktionaalisella johdannaisella, esim. symmetrisellä anhydridil-lä tai aktiiviesterillä. Käytettäessä vapaata happoa, on kondensaatioaineena disykloheksyylikarbodi-imidi (tai vas 90780 15 taava reagenssi), mieluimmin yhdessä 1-hydroksibentsotri-atsolin kanssa ja tertiääristen orgaanisten emästen, esim. tertiääristen alifaattisten tai syklisten amiinien tai he-teroaromaattisten emästen, kuten trietyyliamiinin, di-iso-propyylietyyliamiinin, Ν,Ν-dimetyylianiliinin, N-metyyli-piperidiinin, N-etyylipiperidiinin, N-metyylimorfoliinin, Ν,Ν'-dimetyylipiperatsiinin tai pyridiinin ja näiden homologien, kinoliinin tai 4-dimetyyliaminopyridiinin läsnäollessa. Myös asylointi symmetrisellä anhydridillä tai aktiiviesterillä tapahtuu mainittujen tertiääristen emästen ja mieluimmin myös 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa. Aktiiviestereinä kysymykseen tulevat esterit elektroneja puoleensa vetäviä substituentteja sisältävien fenolien, esim. p-nitrofenolin, pentafluorifenolin tai 2,4,5-trikloorifenolin kanssa tai N-hydroksi-imidien, esim. N-hydroksisukkinimidin tai N-hydroksinorhornaani-tai -5-norborneeni-2,3-dikarboksyylihappoimidin kanssa. Mainittujen muunnosten asylointiolosuhteet ovat yleisesti tunnetut; asylointireaktio voidaan haluttaessa toistaa ja/tai väärien sekvenssien muodostumisen estämiseksi, jäljellä oleva asyloimaton lähtöaine asyloidaan yksinkertaisella karboksyylihappojohdannaisella, kuten etikkahap-poanhydridillä tai -kloridilla tavanomaiseen tapaan ja täten aminohappotähteet suojataan muilta ei-toivotuilta asy-loitumisilta myöhemmissä synteesivaiheissa.

Keksinnön mukaisissa synteeseissä aminohappotähteinä kysymykseen tulevat ensi sijassa sellaiset, jotka johdetaan luonnossa erityisesti peptidirakenneosina esiintyvistä L-sarjan a-aminohapoista ja niiden läheistä sukua olevista analogeista, kuten erityisesti "ei-luonnollisen" D-sarjan enantiomeereista. Edullisia α-aminohappoja ovat esimerkiksi glysiini, alaniini, väliini, leusiini, isoleusiini, fe-nyylialaniini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, arginii-ni, histidiini ja lysiini, myös ot-aminovoihappo, norvalii- 16 ni, isovaliini, norleusiini, ornitiini ja sitrulliini sekä myös asparagiini, glutamiini, tyrosiini, tryptofaani, me-tioniini, treoniini, seriini mutta myös proliini ja hyd-roksiproliini (joissa α-aminoryhmä on suljettu alkyyli-tähteellä renkaaksi), sekä kysteiini ja kystiini (jolloin tämä esiintyy kahden yhteensitoutuneen kysteiinitähteen, jotka voivat olla myös sekvenssin toisistaan erotetuissa asemissa, parina). Edelleen kysymykseen tulevat myös muiden aminohappojen tähteet, jotka johdetaan Ci-7-alkaani-karboksyylihapoista, erityisesti lineaarisista ja amino-ryhmä on ketjussa mielivaltaisessa asemassa, esimerkiksi pääteasemassa olevassa C-atomissa (kuten B-alaniinissa, γ-aminovoihapossa tai δ-aminovaleriaanahapossa); lisäksi niissä voi olla muita primäärisiä aminohappoja (kuten “,Ύ-diaminovoihapossa) tai ne voivat olla substituoituja muilla funktionaalisilla ryhmillä, kuten hydroksyyli-, merkapto-, disulfido-, guanidino-, karboksyyli- tai kar-boksamidoryhmillä tai syklisillä bydrokarbyyli- tai hete-rosyklyylitähteillä, kuten fenyylillä, p-hydroksifenyy-lillä, indolyylillä tai imidatsolyylillä. Näitä aminohappoja, mikäli ne sisältävät asymmetrisiä C-atomeja, voidaan käyttää raseemisessa tai mieluimmin optisesti aktiivisessa muodossa.

Kiinteäfaasisynteesin spesifisenä piirteenä on, että käytetyissä aminohappotähteissä reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät (ja myös sellaiset, jotka synteesissä voivat pysyä vapaana nestemäisessä faasissa) ovat yleensä suojatussa muodossa.

Suojaryhmien valinta noudattaa synteesiolosuhteita ja valmistettavan lopputuotteen käyttöä. Useamman suojattavan funktionaalisen ryhmän ollessa kyseessä täytyy valita tarkoituksenmukainen kombinaatio. Erityisesti silloin on huomioitava, että aminohapposivuketjujen funktionaaliset suo- li 90780 17 jaryhmät ovat pysyviä N-terminaalisen suojaryhmän, kuten Fmoc-ryhmän poislohkaisussa ja että siinä tapauksessa, kun lopputuotteeksi halutaan suojattu peptidirakenne myöhempää synteesiä varten, ne ovat stabiileja lievissä happamissa olosuhteissa, jotka vallitsevat synteesin lopussa irrotettaessa hartsista.

Muiden esiintyvien aminoryhmien, kuten lysiinitähteen ζ-aminoryhmän suojaamiseksi, voidaan käyttää kaikkia pep-tidikemiassa tavallisesti käytettyjä aminosuojaryhmiä, jotka ovat stabiileja heikosti emäksisissä olosuhteissa. Sopivia ryhmiä ovat tunnetuissa hakuteoksissa kuvatut, esim. Houben-Weyl; Methoden der organischen Chemie, 4.Painos, Osa 15/1, E.Wunsch (Toim.), Synthese von Pepti-den (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974).

Niinpä voidaan esim. pelkistäen tai energisissä emäksisissä olosuhteissa poislohkaistavina aminosuojaryhminä käyttää esim. erityisesti bentsoyylioksikarbonyyliryhmää ja bentsoyylioksikarbonyyliryhmiä, jotka ovat substituoituja aromaattisessa osassa halogeeniatomeilla, nitroryhmillä, alempialkoksiryhmillä ja/tai alempialkyylitähteillä, kuten p-kloori-tai p-bromibentsoyylioksikarbonyyli-, p-nit-robentsoyylioksikarbonyyli-, p-metoksibentsoyylioksikar-bonyyli- tai p-tolyylioksikarbonyyliryhmää, myös isoniko-tinyylioksikarbonyyliryhmää, edelleen myös sulfonyyliryh-miä, kuten p-tolueenisulfonyyliä, bentseenisulfonyyliä, o-nitrobentseenisulfonyyliä ja muita substituoituja bent-seenisulfonyyliryhmiä tai myös asyyliryhmiä, kuten formyy-liä, trifluoriasetyyliä tai ftaloyyliä. Edullinen aminosuo jaryhmä on etoksikarbonyyliryhmä, jonka β-asemassa on kolmella hiilivetytähteellä substituoitu silyyliryhmä, kuten trifenyylisilyyli-, dimetyyli-tert.-butyylisilyyli-tai ennen kaikkea trimetyylisilyyliryhmä. Tällainen 8-(trihydrokarbyy1isilyy1i)-etoksikarbonyyliryhmä, kuten 18 β-(trialempialkyylisilyyli)-etoksikarbonyyli-, esim. erityisesti g-(trimetyylisilyyli)-etoksikarbonyyliryhmä on pysyvä happamen hydrolyysin ja hydrauksen olosuhteissa, mutta voidaan lohkaista pois aivan spesifisissä, hyvin lievissä olosuhteissa fluoridi-ionien vaikutuksella.

Tässä suhteessa ne käyttäytyvät vastaavasti kuin muut karboksyylisuojaryhminä kuvatut β-silyylietyyliesteriryh-mät.

Aivan erityisen edullisia ovat asidolyyttisesti poisloh-kaistavat ryhmät, kuten ensi sijassa tert.-butoksikarbo-nyyliryhmä ja vastaavat ryhmät, esim. tert,-amyylioksi-karbonyyli-, isopropyylioksikarbonyyli-, di-isopropyyli-metoksikarbonyyli-, allyylioksikarbonyyli-, syklopentyyli-oksikarbonyyli-, sykloheksyylioksikarbonyyli-, di-isobor-nyylioksikarbonyyli- ja adamantyylioksikarbonyyliryhmät sekä myös aralkyylityyppiset ryhmät, kuten bentshydryyli ja trifenyylimetyyli (trityyli), myös 2-aryyli-2-propyyli-oksikarbonyylityyppiset aralkoksikarbonyyliryhmät, esim.

2-fenyyli- tai 2-p-bifenylyyli-2-propyylioksikarbonyyli-ryhmät.

Guanidino-funktion, jollainen esiintyy esimerkiksi luonnollisessa aminohapossa arginiinissa, suojaryhmänä voidaan käyttää jotain edellä mainituista aminosuojaryhmistä. Erityisen sopivia ovat sulfonyyliryhmät, erityisesti alempi-alkaani-, esim. metaani-, etaani- tai isopropaanisulfonyy-liryhmät tai aryyli-, esim. substituoidut bentseenisulfo-nyyliryhmät, jolloin substituentteina tulevat kysymykseen alempialkyyli, esim. metyyli, alempialkoksi, esim. metok-si, anelloitu alempialkoksi, esim. 1-oksa-l,4-butyleeni, nitro tai halogeeni, esim. kloori tai bromi. Erityisen edullinen on 2,3,5-trimetyyli-4-metoksibentseenisulfonyy-liryhmä ja 2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfonyyli-ryhmä.

li 19 90780

Hydroksyylisuojaryhminä voidaan käyttää kaikkia tähän tarkoitukseen peptidikemiassa käyttökelpoisia ryhmiä, vrt. edellä mainitut katsausartikkelit julkaisussa Houben-Weyl. Edullisia ovat asidolyyttisesti poislohkaistavat ryhmät, kuten 2-tetrahydropyranyyli ja aivan erityisesti tert.-butyyli sekä myös tert.-butoksikarbonyyli. Voidaan käyttää myöskin pelkistäen tai emäksisesti poislohkaistavissa olevia hydroksyylisuojaryhmiä, esim. bentsyyli- tai bent-syylioksikarbonyyliryhmiä, jotka aromaattisessa osassa voivat olla substituoituja halogeenilla, nitrolla ja/tai alempialkoksilla, alempialkanoyylitähteitä, kuten asetyy-liä tai aroyylitähteitä, kuten bentsoyyliä.

Karboksyylisuojaryhminä voidaan käyttää jokaista tavallisesti tähän tarkoitukseen käyttökelpoista ryhmää, vrt. edellä mainitut otsikot julkaisussa Houben-Weyl. Niinpä karboksyyliryhmät suojataan esimerkiksi hydratsidimuodos-tuksella tai esteröimällä. Esteröintiin sopivat esim. alemmat, mahdollisesti substituoidut alkanolit, kuten me-tanoli, etanoli, syaanimetyylialkoholi, 2,2,2-trikloori-etanoli, bentsoyylimetyylialkoholi tai erityisesti tert.-butyylialkoholi mutta myös mahdollisesti substituoitu bentsyylialkoholi. Erityisen edullinen ryhmä substituoitu-ja alkanoleja ovat etyylialkoholit, joissa β-asemassa on trisubstituoitu silyyliryhmä, kuten trifenyylisilyyli-, dimetyyli-tert,-butyylisilyyli- tai ennen kaikkea trime-tyylisilyyliryhmä. Nämä alkoholit sopivat karboksyyliryh-mien suojaamiseksi sen vuoksi erityisen hyvin, koska vastaavat B-silyylietyyliesterit, esim. β-(trimetyylisilyyli) etyyliesteri, jolla on tavallisen alkyyliesterin stabiilisuus, on kuitenkin kaikkien muiden suojaryhmien säilyessä lohkaistavissa pois selektiivisesti fluoridi-ioneilla.

Merkaptosuojaryhminä voidaan käyttää kaikkia tähän tarkoitukseen peptidikemiassa käyttökelpoisia ryhmiä. Merkapto- 20 ryhmät suojataan erityisesti sopivalla asyloinnilla tai alkyloinnilla. Asylointiin sopii esim. asetyyli- tai bent-soyylitähde alempialkyyli- (esim. etyyli-) karbamoyyli-tai mahdollisesti, kuten jo edellä mainittiin substituoi-dulle bentsyylioksikarbonyyliryhmä. Alkylointiin sopii esim. tert.-butyyli-, isobutyylioksimetyyli-, bentsyyli-tiometyyli- tai tetrahydro-pyranyylitähde tai mahdollisesti halogeenilla, alempialkoksilla tai nitrolla subsituoitu aryylimetyylitähde, kuten bentsyyli, p-metoksibentsyyli, difenyylimetyyli, dimetoksibentshydryyli tai aivan erityisesti trityyli sekä myös fenyylisykloheksyyli, p-metoksi-fenyylisykloheksyyli tai 2-tienyylisykloheksyyli. Hyvin edullinen on myös asyyliaminometyylitähde, jossa asyyli on esim. asetyyli tai myös bentsoyyli. Erityisen edullinen on asetyyliaminometyyliryhmä.

Mieluimmin sivuketjujen suojaryhmät valitaan siten, että ne kaikki ovat poislohkaistavissa samanlaisissa olosuhteissa, erityisesti tällöin ovat edullisia jo edellä mainitut asidolyyttisesti poislohkaistavat ryhmät, ennen kaikkea tert.-butyylistä johdetut. Kaikkien näiden suoja-ryhmien poislohkaiseminen voidaan tehdä edullisesti yhdessä ainoassa vaiheessa.

Suojaryhmien poislohkaiseminen tapahtuu yleisesti tunnetulla tavalla. Asidolyysi tai hapan hydrolyysi suoritetaan esim. trifluorietikkahapolla, suolahapolla tai fluorive-dyllä, helposti poislohkaistavilla suojaryhmillä myös alempialifaattisella karboksyylihapolla, kuten muurahaishapolla ja/tai etikkahapolla halogenoidun hiilivedyn, esim. metyleenikloridin tai veden ja mahdollisesti polyha-logenoidun alempialkanolin tai alempialkanonin, kuten l,l,l,3,3,3-heksafluoripropan-2-olin tai heksafluoriaseto-nin läsnäollessa. Pelkistäen poislohkaistavat ryhmät, erityisesti sellaiset, jotka sisältävät bentsyylitähteitä, li 90780 21 poistetaan mieluimmin hydraamalla, esim. käyttäen katalysaattorina palladiumia. Isonikotinyylioksikarbonyyliryhmä lohkaistaan pois mieluimmin sinkkipelkistyksellä. β-silyy-lietyylioksikarbonyyliryhmä lohkaistaan fluori-di-ioneil-la.

Keksintö koskee myös synteettisen menetelmän välituotteita ja lopputuotteita käytettäväksi keksinnön mukaisessa hartsissa. Erityisesti keksintö koskee alussa määritellyn rakenteen omaavaa tekohartsia, jossa ryhmän -X-H sijasta on ryhmä -NH-W, -X-AM-W tai X-AM-H, joissa X on -0- tai -NH-, W tarkoittaa N-terminaalista aminosuojaryhmää ja AM tarkoittaa 1-180 aminohappotähteestä rakentuvan, funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohappoketjun asyylitähdettä, ennen kaikkea jotain jäljempänä esimerkeissä kuvattua yhdistettä. Keksintö koskee myös kaavan W-AM°-XH mukaista peptidiä tai peptidiamidia, jossa kaavassa -X- on -0- tai -NH-, W tarkoittaa pääteasemassa olevaa aminosuojaryhmää ja AM° tarkoittaa 2-180 aminohappotähteestä rakentuvan funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohappoketjun asyylitähdettä, sekä analogisia yhdisteitä, joissa kaavan H-AM°-XH mukainen vapaa N-terminaalinen aminoryhmä, mikäli ne ovat valmistettavissa keksinnön mukaisella synteesimenetelmällä, erityisesti jäljempänä esimerkeissä kuvattuja peptidejä ja peptidiami-deja.

Lyhenteinä, esim. aminohappojen, peptidien, suojaryhmien jne. kuvaamiseksi, käytetään tavallisia, esim. edellä mainituissa julkaisun Houben-Weyl katsausartikkeleissa koottuina esitettyjä lyhenteitä. Ellei toisin mainita, tarkoittavat aminohappotähteiden nimet ja lyhenteet luonnossa esiintyvän L-sarjän a-aminohappojen tähteitä. Ellei toisin mainita tarkoitetaan termillä "alempi", missä tahansa se esiintyy orgaanisen tähteen tai yhdisteen yhteydessä, 22 sellaista tähdettä tai yhdistettä, jossa on korkeintaan 7, mieluimmin kuitenkin korkeintaan 4 hiiliatomia.

Seuraavat esimerkit kuvaavat myös keksintöä, rajoittamatta millään tavoin keksinnön piiriä. Käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset:

Boc - tert.-butoksikarbonyyli

But - tert.-butyyli (eetterissä) DC - ohutkerroskromatografia DCCI - disykloheksyylikarbodi-imidi DMA - dimetyyliasetamidi DMF - dimetyyliformamidi DMSO - dimetyylisulfoksidi EDC - 1,2-etaanidikloridi FAB-MS - Fast Atom Bombardment massaspektri

Fmoc - 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli HOBt - 1-hydroksibentsotriatsoli HPLC - korkeapainenestekromatografia = high pressure liquid chroomatography IGF-2 - Insulin-like Growth Factor-2 MIF - Macrophage migration inhibition Factor

Mtr - 2,3,5-trimetyyli-4-metoksibentseenisulfonyyli OBut - tert.-butyyli (esterissä) TFA - trifluorietikkahappo THF - tetrahydrofuraani

Trt - trityyli

Esimerkki 1: 2,4-dimetoksi-4'-hydroksibentsofenoni (1)

Otsikossa mainittu yhdiste valmistetaan samalla tavalla kuin 2,4'-dihydroksi-4-metoksibentsofenoni, katso Ray, S,. Gröver, P.K. ja Anand Nitya: Indian Journal of Chemistry 9, 619-623 (1971), syntetisoimalla resorsiinidimetyyli-eetteristä ja 4-hydroksibetsoehaposta. Alkuaineanalyysi, l-H-NMR- ja IR-spektrit vahvistavat yhdisteen 1 rakenteen.

Il 90780 23

Esimerkki 2; 2,4-dimetoksi-41 -hydroksibentsofenonin cesium-suola (IA) 5.00 g yhdistettä (1) (19,3 mmoolia) lietetään 40 ml:aan etanolia ja 16 mitään vettä ja lisätään liuos, jossa on 3,25 g (19 mmoolia) cesiumhydroksidimonohydraattia 4,5 mltssa vettä. Liuos konsentroidaan tyhjössä, otetaan talteen 40 mitään veden ja tert.-butyylialkoholin l:l-seosta ja lyofilisoidaan. Vaalean kellertävä lyofilisaatti kiteytetään 20 mltsta tert.-butyylialkoholia, saadaan suola (IA) valkoisena jauheena.

Esimerkki 3t 4-(2,4-dimetoksibentsoyyli)-fenoksimetyyli-polystyreeni (ristiinkytketty 1 %tlla DVBttä) (2) 20.0 g kloorimetyylipolystyreeni-l%-divinyylibentseeniä (DVB) (=Merrifield Polymer Fluka, Sveitsi; 0,67 mmoolia Cl/g) (13,4 mmoolia) kuivataan 1 tunti 50 eC:ssa suurtyh-jössä. 26,1 g yhdistettä (1) (67 mmoolia) lietetään kolme kertaa, joka kerta noin 500 ml tila pyridiiniä ja haihdutetaan suurtyhjössä, jäännös liuotetaan noin 700 mitään kuivaa DMFtää ja haihdutetaan suurtyhjössä noin 400 mitään. Hartsi lisätään ja reaktioseosta ravistellaan kosteudelta suojaten 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Hartsi suodatetaan ja pestään 100 ml tn annoksilla seuraavia liuottimia: 3x isopropyylialkoholi, 3x DMF, 3x vesi, 3x DMF, 5x vesi, 4x isopropyylialkoholi. Hartsi kuivataan suurtyhjössä 40-45 °C:ssa vakiopainoon. IR-spektrissä havaitaan odotetut C=0-vyöhykkeet.

Esimerkki 4t 4-(2,4-dimetoksifenyylihydroksimetyyli)-fenoksimetyylipolystyreeni [dimetoksibentshydryylioksi-metyylipoly-styreeni, "hydroksyylihartsi"] (3)

Lietteeseen, jossa on 7,07 g yhdistettä (2) (noin 4,8 mmoolia ketonifunktiota) 50 mltssa kuivattua tetrahydrofu-raania (THF), lisätään 14,5 ml 1 M litiumboorihydridiä THFtssä ja reaktioseosta keitetään palautusjäähdyttäen 24 1 tunti samalla kosteudelta suojaten. Jäähdytetään noin 0-5 °C:seen, jonka jälkeen seokseen lisätään 24 ml metano-lia ja tipoittain samalla hyvin sekoittaen noin 6 ml asetonia. Poissuodatettu hartsi pestään seuraavalla tavalla, käyttäen joka kerta 30 ml:n annosta liuotinta: 3x metano-li, lx vesi, lx vesipitoinen suolahappo, jonka pH noin 3,0, 2x vesi, 4x metanoli. Hartsi kuivataan suurtyhjössä 40-45 °C:ssa vakiopainoon. Alkuaineanalyysi: 3,67 % O = 2,31 mmoolia O/g, IR-spektri: ei yhtään C=0-vyöhykettä.

Esimerkki 5: N-[Fmoc-Pro]-4-(2,4-dimetoksifenyyliamino- metyyli)-fenoksimetyylipolystyreeni [Fmoc-Pro-aminohart-si ] (4)

Seosta, jossa on 0,46 g yhdistettä (3) (noin 0,26 mmoolia), 0,31 g yhdistettä Fmoc-Pro-NH2 (0,92 mmoolia), 76,5 /ui bentseenisulfonihappoliuosta dikloorimetaanissa (76,5 /umoolia) ja 10 mlsssa dioksaania, sekoitetaan 3 tuntia ja sen jälkeen, kun on edelleen lisätty 76,5 /ui 1 M bentseenisulfonihappoliuosta, sekoitetaan vielä 20 tuntia 50 °C:ssa. Hartsi suodatetaan ja käyttäen aina 5 ml:n annosta liuotinta, pestään seuraavalla tavalla: 5x metanoli, 12x dikloorimetaani, 3x metanoli, 3x dikloorimetääni. Hartsi kuivataan suurtyh-jössä 40-45 °C:ssa vakiopainoon.

Punnitusta näytteestä, jossa on noin 20 mg yhdistettä, Fmocryhmä lohkaistaan pois suorittamalla 4x2 minuutin käsittelyt, käyttäen aina 300 /ui 20%:ista piperidiiniä ja pesemällä 6x dimetyyliasetamidilla (DMA). Spektrofotomet-rinen määritys (300 nm) antoi spesifisenä tuloksena 0,23 mmoolia Fmoc/hartsigramma.

Esimerkki 6: N-[Boc Pro lu(OBut)-Ile-Pro]-aminohart- si (5)

Automaattisessa peptidisyntetisaattorissa 0,42 g yhdistettä (4) (0,97 /umoolia) saatetaan reagoimaan seuraavan pro- li 90780 25 sessin mukaisesti, jossa toisiaan seuraavat vuorotellen Fmoc-ryhmän poislohkaisu ja Fmoc-Ile-, Fmoc-Glu(OBut)- ja Boc-Pro-ryhmän liittäminen (kytkeminen), sekä reagoimattomien aminoryhmien kulloinkin tapahtuva suojaaminen asety-loimalla, yhdisteen (5) valmistamiseksi.

Yksittäiset vaiheet;

Fmoc:n peseminen ja poislohkaisu (suojauksen poistaminen) huoneen lämpötilassa käyttäen joka kerta noin 10 ml liuosta: lx isopropyylialkoholi (1 min), 4x DMA kaasuton (0,5 min), lx isopropyylialkoholi (1 min), 3x DMA kaasuton (0,5 min), 4x 20%:inen piperidiini DMA:ssa (2 min), 2x vesi-dioksaani (1:1) (1 min), 5x DMA kaasuton (0,5 min), 3x DMA tisl. (0,5 min).

Kytkentä: 0,39 mmoolia N-suojattua aminohappoa, 0,68 ml 0,57 M 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt) DMA:ssa (0,39 mmoolia) ja 0,18 ml 2,4 M disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCCI) DMA:ssa lisäten 0,20 ml DMA:ta (20 min huoneen lämpötilassa, 2 tuntia 40 °C:ssa).

Jäljellä olevien vapaiden aminoryhmien peseminen ja asety-loiminen: lx asetanhydridipyridiini-DMA (1:1:8, til.) (5 min), 3x DMA kaasuton, lx isopropyylialkoholi (1 min), 3x DMA kaasuton (0,5 min.)

Hartsi pestään isopropyylialkoholilla (3x5 ml) ja kuivataan suurtyhjössä huoneen lämpötilassa.

Esimerkki 7: H-Pro-Glu-Ile-Pro-NH2 0,46 g yhdistettä (5) (noin 90 /umoolia) trifluorietikka-happo-dikloorimetaani-seoksessa (1:1, til.) sekoitetaan 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja hartsi suodatetaan ja pestään 3x, joka kerta noin 10 ml:11a dikloorimetaania.

Suodos konsentroidaan tyhjössä noin 2 ml:ksi ja lisätään tipoittain, samalla sekoittaen 10 ml:aan eetteriä. Saostuma suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Näin saatu väritön jauhe on identtinen liuokseen valmistetun tetrapeptidiami-din kanssa ohutkerroskromatografiässä ja HPLC:llä.

26

Esimerkki 8; 0-[Fmoc-Gly3-hydroksyylihartsi (6) 2,0 g yhdistettä (3) (noin 1 mmoolia), 1,19 g yhdistettä Fmoc-Gly-OH (4 mmoolia) ja 0,87 g DCCI:tä (4,2 mmoolia) 20 ml:ssa 1,2-etaanidikloridia (EDO sekoitetaan 5 minuuttia 0-5 °C:ssa, lisätään 24 mg 4-dimetyyliaminopyridiiniä (DMAP) (0,2 mmoolia) ja taas 20 minuutin kuluttua noin 5 °C:ssa 110 /ui N-metyylimofroliinia (1 mmoolia). Seosta sekoitetaan 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Suodatettu hartsi pestään peptidisyntetisaattorissa aina 20 ml :11a seuraavia liuottimia: 3x metanoli, 3x EDC, 3x DMA, aina 0,5 minuuttia. Hartsissa vielä esiintyvien hydroksyyliryh-mien suojaamiseksi tätä yhdistettä sekoitetaan 1,23 g:n kanssa bentsoehappoanhydridiä (5,4 mmoolia) 1,2 ml:ssa pyridiiniä ja 6 mlrssa DMA:ta 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen pestään käyttäen joka kerta 20 ml liuotinta: 2x isopropyylialkoholi, 3x DMA kaasuton, 2x isopropyylialkoholi, 6x EDC, 2x isopropyylialkoholi, 3x DMA kaasuton, 3x isopropyylialkoholi, joka kerta 0,5 minuuttia. Suurtyhjössä 45 °C:ssa kuivatun, otsikossa mainitun yhdisteen (6) sisältämä Fmoc-pitoisuus on 0,26 mmoo-lia/g.

Esimerkki 9: 0-[Fmoc-6-Ala]-hydroksyylihartsi (7)

Otsikossa mainittu yhdiste (7) valmistetaan samalla tavalla kuin yhdiste (6) ja sen sisältämä Fmoc-pitoisuus on 0,33 mmoolia/g.

Esimerkki 10; O -[Fmoc-Leu-Pro-Glu(OBut)-Gly-Ser(But)-Pro-Val-Thr(But)-Leu-Asp(OBut)-Leu-Aqr(Mtr)-Tyr(But)-Asn-Arg(Mtr)-Val-Arq(Mtr)-Vai-8-Ala1-hydroksyylihartsi (sivu-ketjusuojattu egliini-fragmentti-[β-Ala55]-egliini C(37-55)-nonadekapeptidi sitoutuneena hydroksyylihartsiin (8) 1,10 g yhdistettä (7) (0,36 mmoolia) esimerkistä 9 saatetaan reagoimaan peptidisyntetisaattorissa käyttäen pesu-menetelmää ja Fmoc-poislohkaisumenetelmää esimerkin 6 mu- 90780 27 kaisesti. Aminohapot 10-18 (t.s. egliini C:n 46-54) kytketään 2,4,5-trikloorifenyyliestereinä (1,08 mmoolia) 1,8 ml:ssa DMA:ta, samalla lisätään 1,89 ml 0,57 M HOBt:tä (1,08 mmoolia) ja 0,285 M di-isopropyylietyyliamiinia (0,54 mmoolia) DMA:ssa 2 tunnin kuluessa huoneen lämpötilassa. Aminohapoilla 11, 12, 16 ja 18 (t.s. egliini C:n 47:llä, 48:11a, 52:11a ja 54:llä) tämä menetelmä toistetaan. Aminohappoja 1-9 (t.s. egliini C:n 37-45) käytetään symmetrisinä anhydrideinä (1,08 mmoolia) kykentään: 2,16 mmoolia Fmoc-aminohappoa liuotetaan 10 ml: aan dikloorime-taania (Fmoc-Gly-OH:n ollessa kyseessä lisätään 1 ml DMA:ta) huoneen lämpötilassa ja lisätään 245 mg DCCI:tä (1,12 mmoolia) samalla sekoittaen, pidetään 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, saostunut disykloheksyylikarbamidi suodatetaan pois, suodokseen lisätään 2,5 ml DMA:ta (tisl.) ja dikloorimetääni poistetaan tyhjössä. Tämä seos lisätään kulloiseenkiin tekohartsiin ja sen jälkeen, kun on lisätty 58 /ui di-isopropyylietyyliamiinia (0,36 mmoolia), pidetään 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Synteesin loputtua ja pääteasemassa olevan Fmoc-ryhmän poistamisen jälkeen esimerkin 5 mukaisesti hartsi pestään 3x joka kerta 5 ml:11a isopropyylialkoholia ja kuivataan suurtyh-jössä.

Esimerkki 11; Sivuketjusuojattu [g-Ala^^]-eqliini C(37-55) nonapeptidi 1,55 g esimerkin 10 yhdistettä (8) (noin 83 /umoolia) sekoitetaan 20 ml:n kanssa dikloorimetaani-etikkahapposeosta (9:1, til.) 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa, hartsi suodatetaan ja pestään käyttäen joka kerta 10 ml liuotinta seu-raavalla tavalla: 3x dikloorimetaani, 4x metanoii, 4x dikloorimetaani. Alkuperäinen suodos yhdistetään pesu-liuoksiin ja konsentroidaan tyhjössä, lisätään noin 5 ml etikkahappoa ja lyofilisoidaan kuivaksi, jolloin otsikossa mainittu yhdiste jää jäljelle värittömänä jauheena.

28 HPLC Nucleosil 5Cig/ 25x4,6 mm, gradientti: 100 % A/0 % B -> 0 % A/100 % B 60 minuutin kuluessa; A = vesi 0,1 % TFA:ta, B = asetonitriili 0,1 % TFA:ta, retentioaika 52 minuuttia.

Preparatiivinen HPLC; 10 mg yhdistettä liuotetaan 500 /uljaan trifluorietanolia-asetonitriiliseosta (1:1), erotetaan edellä esitetyllä gradientilla ja pylväällä ja kerätään pääfraktiot ja haihdutetaan. Tällä tavalla saadaan 6,8 mg tuotetta, joka HPLCsn mukaan sisältää yli 90 % otsikossa mainittua yhdistettä.

Esimerkki 12: 0-[Fmoc-Asp(OBut)-Arq(Mtr)-Gly-Phe-Tyr (But)-Phe-Ser(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ala-Ser(But)-Arg(Mtr)-Val-Ser(But)-Arg (Mtr)-Arq(Mtr)-Ser(But)-Arg(Mtr)-Gly]-hydrok-syylihartsi(sivuketjusuojattu IGF-2 (23-41)-nonadekapepti-di sitoutuneena hydroksyylihartsiin (9) 1,20 g esimerkin 8 yhdistettä (6) (0,31 mmoolia) saatetaan reagoimaan peptidisyntetisaattorissa käyttäen esimerkin 6 pesumenetelmää ja Fmoc-poislohkaisumenetelmää. Kaikki aminohapot lisätään kytkettäväksi (1 tunti) symmetrisinä an-hydrideinä (3 ekv., valmistus kuten esimerkissä 10). Aminohapoilla 14, 17 ja 18 (t.s. IGF-2:den 36:11a, 39:llä ja 40:llä) kytkentäprosessi toistetaan (1 tunti). Synteesin päätyttyä hartsi pestään 3x joka kerta 5 ml:11a isopropyy-lialkoholia ja kuivataan suurtyhjössä.

Esimerkki 13: Fmoc-Asp(OBut)-Arq(Mtr)-Gly-Phe-Tyr(But)-

Phe-Ser(But)-Arq(Mtr)-Pro-Ala-Ser(But)-Arq(Mtr)-Val-Ser (But)-Arg(Mtr)-Arq(Mtr)-Ser(But)-Arq(Mtr)-Gly-OH [Fmoc-suoiattu IGF-2(23-41)-nonadekapeptidi] 1,65 g esimerkin 12 yhdistettä (9) (noin 154 /umoolia) lohkaistaan 33 ml:11a dikloorimetaani-etikkahappoa (9:1, til.) esimerkin 11 mukaisesti ja pestään. Lyofilisaation jälkeen saadaan väritön jauhe. Tuotteen puhdistamiseksi se jaetaan 1050 vaiheen yli automaattisessa vastavirtajakaan- 90780 29 tumislaitteessa (5 ml/faasi) seoksella, jossa on metano-lia, vettä, kloroformia ja hiilitetrakloridia (2700:675: 900:1575). Fraktiot 46-75 sisältävät puhtaan otsikossa mainitun yhdisteen (DC, HPLC) ja ne haihdutetaan yhdessä, jäännös hierretään eetterin kanssa ja suodatetaan. Näin saatu väritön jauhe on yhtenäinen DC:n mukaan (4 systeemiä piihappogeelillä) ja HPCL:n mukaan (systeemi kuten esimerkissä 11; retentioaika 57 min). FAB-MS (Fast Atom Bombard-ment-Massenspektrum): oikea massapiikki (2480).

Esimerkki 14: Fmoc-Aminohartsi (10) ja aminohartsi [4- (2,4-dimetoksifenyyliaminometyyli)-fenoksimetyylipolysty-reeni] 4,1 g hydroksyylihartsia (3) (noin 1,89 mmoolia) lietetään 80 ml:aan dioksaania. 1,35 g 9-fluorenyylimetyylikarba-maattia (5,65 mmoolia) (valmistettu kuten esittävät Carpi-no, L.A. et ai., J.Org.Chem. £8, 661 (1983)) ja 0,47 ml 1 M bentseenisulfonihappoa 1,2-etaanidikloridissa (EDC) (0,47 mmoolia) lisätään ja seosta pidetään 3 tuntia 50 °C:ssa. Lisätään edelleen 0,47 ml 1 N bentseenisulfonihappoa, jonka jälkeen annetaan reagoida vielä 17 tuntia 50 eC:ssa. Hartsi suodatetaan ja pestään 30 ml:n annoksilla seuraavia liuottimia: 3x isopropyylialkoholi, 3x EDC, lx dimetyyliasetamidi (DMA), 6x isopropyylialkoholi, 3x DMA.

Sen jälkeen reagoimattomien hydroksyyliryhmien suojaamiseksi hartsia pidetään 5,0 g:n kanssa bentsoehappoanhyd-ridiä 25 ml:ssa DMA:ta ja 5 ml:ssa pyridiiniä 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja pestään kuten edellä. Viimeinen pesu tapahtuu 6x isopropyylialkoholilla. Näin saatu Fmoc-aminohartsi (10) kuivataan sen jälkeen suurtyhjössä vakiopainoon. Fmoc:n spektrofotometrinen määritys näytteestä esimerkin 5 mukaisesti suoritetun lohkaisun jälkeen antaa tulokseksi spesifisen kuormituksen, joka on noin 0,35 mmoolia Fmoc/hartsigramma.

30

Vapaan aminohartsin valmistamiseksi sekoitetaan 2,0 g Fmoc-aminohartsia (10) 30 ml:ssa 20%:ista piperidiiniä dimetyyliasetamidissa (DMA) 1 tunti huoneen lämpötilassa, suodatetaan, käsitellään edelleen 30 ml:11a 20%:ista piperidiiniä DMA:ssa 1 tunti ja pestään seuraavasti 30 ml:n annnoksilla: 3x DMA, 3x iso-propyylialkoholi, 3x DMA, 6x isopropyylialkoholi. Hartsi kuivataan suurtyhjössä vakio-painoon .

Esimerkki 15: N-[Met-His(Trt)-Glu(0But)-Gly-Asp(OBut)-

Glu(OBut)-Gly-Pro-Gly]-aminohartsi (11)

Automaattisessa peptidisyntetisaattorissa asetyloimalla seuraavan prosessin mukaisesti, jossa toisiaan seuraavat vuorotellen Fmoc-ryhmän poislohkaisu ja Fmoc-Gly-, Fmoc-Pro-, Fmoc-Gly-, Fmoc-Glu(OBut)-, Fmoc-Asp(OBut)-, Fmoc-Gly-, Fmoc-Glu(OBut)-, Fmoc-His(Trt)- ja Fmoc-Met-ryhmän kytkentä, 0,50 g esimerkin 14 Fmoc-aminohartsia (10) (noin 175 /ummoolia) saatetaan reagoimaan vielä reagoimattomien aminoryhmien suojaamiseksi:

Fmocsn peseminen ja poislohkaisu (suojauksen poistaminen) tapahtuu huoneen lämpötilassa aina noin 10 ml:11a liuotinta: lx isopropyylialkoholi (1 min), 4x DMA kaasuton (0,5 min), 6x 20%:inen piperidiini DMA:ssa (2 min), 2x DMA kaasuton (0,5 min), lx isopropyylialkoholi (1 min), 4x DMA kaasuton (0,5 min), 3x DMA tisl. (0,5 min).

Kytkentä: 0,52 mmoolia suojattua aminohappo-2,4,5-trikloo-rifenyyliesteriä ja 0,92 ml 0,57 M 1-hydroksibentsotriat-solia (HOBt)/0,57 M di-isopropyylietyyliamiini DMA:ssa (0,52 mmoolia), samalla lisätään 0,88 ml DMA:ta (30 min huoneen lämpötilassa).

Jäljellä olevien vapaiden aminoryhmien pesu ja asetyloimi-nen: lx asetanhydridipyridiini-DMA (1:1:8, til.) (5 min), 3x DMA kaasuton (0,5 min), lx isopropyylialkoholi (1 min), 3x DMA kaasuton (0,5 min). Pääteasemassa oleva Fmoc-ryhmä 90780 31 lohkaistaan pois edellä kuvatulla tavalla. Hartsi pestään isopropyylialkoholilla ja kuivataan suurtyhjössä huoneen lämpötilassa.

Esimerkki 16: Met-His-Glu-Gly-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-NH2 (MIF-sukuinen proteiini 14 (94-102)-aminidi) 0,65 g yhdistettä 11 (noin 150 mmoolia) esimerkistä 15 pestään pylväässä 60 minuutin ajan noin 30 ml :11a 2%:ista trifluorietikkahappoa (TFA) dikloorimetaanissa, eluaatti konsentroidaan tyhjössä noin 0,3 ml:ksi, lisätään 1 ml TFA-vettä (95:5, til.) ja suojaryhmien täydelliseksi pois-lohkaisemiseksi annetaan olla 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Peptidiamidi saostetaan lisäämällä 5 ml di-isopropyylieetteriä. Saostuma suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Tuote liuotetaan 5 ml:aan vettä, samentuma sent-rifugoidaan ja yllä oleva liuos lyofi.lisoidaan. Saadaan väritön jauhe, joka HPLC:n mukaan sisältää yli 90 % otsikossa mainittua yhdistettä. HPLC: retentioaika 6,8 min, pylväs Nucleosil 7Ci8» 120x4,6 mm, gradientti: 100 % A/0% B -> 10 % A/90 % B 30 minuutissa, jossa A * 0,1 % TFA/ vesi, B s 0,1 % TFA/asetonitriili, 1,5 min/ml, osoitus 215 nm. FAB-MS: massapiikki 927 (M+H+).

Esimerkki 17: Q-[Fmoc-Ala-Tyr(But)-Arg(Mtr)-Pro-Ser(But)-

Glu(OBut ?-Thr(But)-Leu-Cys(Trt >-Gly-Gly-Glu(OBut)-Leu-Val-Asp(OBut)-Thr(But)-Leu-Gln-Phe-Val-Cys(SBut)-Gly]-hydrok-syylihartsi (sivuketjusuojattu IGF-2 (l-22)-dokosapeptidi si-toutuneena hydroksyylihartsiin) (12) 1,00 g 0-[Fmoc-Gly]-hydroksyylihartsia (6) (noin 0,36 mmoolia) saatetaan reagoimaan peptidisyntetisaattorissa esimerkin 15 mukaisten pesumenetelmien ja Fmoc-poislohkai-sumenetelmien mukaisesti.

Kytkentä: Vai, Gin, Gly, Leu ja Arg kytketään Ftnoc-amino-happo-2,4,5-trikloorifenyyliestereinä (0,72 mmoolia) 1,20 ml:ssa DMA:ta yhdessä 1,44 ml:n kanssa 0,5 M HOBt/0,5 M

32 di-isopropyylietyyliamiinia DMA:ssa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Muut aminohappojohdannaiset kytketään symmetrisinä anhydrideinä (1,08 mmoolia) (valmistus esimerkin 10 mukaisesti) 1 tunti huoneen lämpötilassa. Aminohapoilla nro 3, 8, 10, 11, 18, 20 ja 21 menetelmä toistetaan (lisä-kytkentä). Synteesin päätyttyä hartsi pestään, samalla kun pääteasemassa oleva Fmoc-ryhmä jätetään sillensä, 5x isop-ropyylialkoholilla ja kuivataan suurtyhjössä.

Esimerkki 18: Fmoc-Ala-Tyr(But)-Arq(Mtr)-Pro-Ser(But)-

Glu(OBut)-Thr(But)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Gly-Glu(OBut)-Leu-Val-Asp(OBut)-Thr(But)-Leu-Gln-Phe-Val-Cys(SBut)-Gly-OH (sivu-ketjusuojattu IGF-2 (1-22)-dokosapeptidi 1,80 g esimerkin 17 yhdistettä (12) (noin 0,19 mmoolia) sekoitetaan 35 ml:n kanssa dikloorimetaani-etikkahappoa (9:1, til.) 1,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Hartsi suodatetaan pois ja vaikeasti liukeneva fragmentti uutetaan 60 °C: ssa seuraavalla tavalla: 3x 50 ml dimetyyli-sulfoksidia (DMSO), 3x trifluorietanoli-dikloorimetaani (1:1, til.), lx N-metyylipyrrolidoni-DMSO (8:2, til.). Yhdistetyt suodokset haihdutetaan suurtyhjössä ja jäännöstä sekoitetaan 5 ml:n kanssa vesi-metanoli-seosta (5:95, til.) 50 °C:ssa 1 tunti. Liukenematon aine suodatetaan ja kuivataan suurtyhjössä huoneen lämpötilassa. Erittäin vaikealiukoista fragmenttia ei voida analysoida HPLC-tekniikalla. DC (2 systeemiä): Tuotetta on yli 90 % (liuotettu DMSO-N-metyylipyrrolidoniin (2:8)). FAB-MS: massa-piikki 3539 (M+Na+).

Esimerkki 19: 0-[Fmoc-Ala-Tyr(But)-Arq(Mtr)-Pro-Ser(But)-

Glu(OBut)-Thr(But)-Leu-Cys(Trt)-Gly]-hydroksyyliharts i (sivu-ketjusuojattu IGF-2 (1-10)-undekapeptidi sitoutuneena hydroksyylihartsiin) (13) 1,00 g O-[Fmoc-Gly]-hydroksyylihartsia (6) (noin 0,36 mmoolia) saatetaan reagoimaan peptidisyntetisaattorissa 33 90780 esimerkin 15 mukaisten pesumenetelmien ja Fmoc-poislohkai-sumenetelmien mukaisesti.

Kytkentä; Aminohappojohdannaiset kytketään symmetrisinä anhydrideinä (1,08 mmoolia) (valmistus esimerkin 10 mukaisesti) 1 tunti huoneen lämpötilassa. Aminohapoilla nro 3, 8 ja 9 kytkentämenetelmä toistetaan 2 ekvivalentilla 2,4,5-trikloorifenyyliesteriä. Synteesin päätyttyä hartsi pestään, samalla pääteasemassa oleva Fmoc-ryhmä säilyttäen, 5x iso propyylialkoholilla ja kuivataan suurtyhjössä.

Esimerkki 20: Fmoc-Ala-Tyr(But)-Arq(Mtr)-Pro-Ser(But)-

Glu(OBut)-Thr(But)-Leu-Cys(Trt)-Gly (sivuketjusuo jättu IGF-2(1-10)-undekapeptidi) 1,50 g esimerkin 19 yhdistettä (13) (noin 0,19 mmoolia) sekoitetaan 30 ml:n kanssa dikloorimetaani-etikkahappoa (9:1, til.) 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Hartsi suodatetaan , suodos konsentroidaan tyhjössä ja lyofilisoidaan suurtyhjössä. Yhdisteen puhdistamiseksi nain saatu väritön jauhe jaetaan automaattisessa vastavirtajakaantumis-laitteessa (5 ml/ faasi) esimerkissä 13 esitetyllä seoksella 1330 vaiheen yli. Fraktiot 65-111 sisältävät puhtaan otsikossa mainitun yhdisteen (DC, HPLC) ja ne haihdutetaan yhdessä. Jäännös hierretään eetterin kanssa ja suodatetaan. Väritön jauhe on yhtenäinen DC:n mukaan (5 systeemiä piihappogeelillä) ja HPLCsn mukaan. Retentioaika 24,1 min, pylväs Nucleosil 5C]_8/ 4,6x 250 mm, gradientti: 50 % A/50 % B ->0 % A/100% B 30 minuutissa, jossa A - 0,1 % TFA/ vesi, B = 0,1 % TFA/asetonitrii-li, 1,0 ml/min, osoitus 215 nm.

34

Esimerkki 21: Q-[Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-

Gaba]-hydroksyylihartsi (sivuketjusuojattu somatostatiini-D-Trp(8)-4-aminovoihappo(12)-(5-12)-oktapeptidi sitoutuneena hydroksyylihartsiin (14) 1,00 g 0-[Fmoc-Gaba]-hydroksyylihartsia (valmistetaan esi-merkin 8 mukaisesti käyttäen glysiinin sijasta 4-aminovoi-happoa) (noin 0,31 mmoolia) saatetaan reagoimaan peptidi-synterisaattorissa esimerkin 15 mukaisten pesumenetelmien ja Fmoc-poislohkaisumenetelmien mukaisesti. Kytkentä: Ami-nohappojohdannaiset kytketään symmetrisinä anhydrideinä (0,93 mmoolia) (valmistus esimerkin 10 mukaan) 1 tunti huoneen lämpötilassa. Phe ja Asn kytketään 2,4,5-trikloo-rifenyyliestereinä (2 ekvivalenttia). Aminohapolla 1 (Asn) suoritetaan lisäkytkentä. Kun synteesi on päättynyt ja pääteasemassa oleva Fmoc-ryhmä on lohkaistu pois, hartsi pestään 5x isopropyylialkoholilla ja kuivataan suurtyhjös-sä.

Esimerkki 22: H-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-

Gaba-OH (sivuketjusuojattu somatostatiini-D-Trp(8)-4-ami-novoihappo(12)-(5-12)-oktapeptidi 1,38 g esimerkin 21 yhdistettä (14) (noin 0,26 mmoolia) sekoitetaan 5 ml:n kanssa 5 %:ista pyridiinihydrokloridia DMA:ssa 1 tunti 50 °C:ssa. Hartsi suodatetaan ja pestään DMSO:lla, suodos konsentroidaan suurtyhjössä ja lyofili-soidaan lx DMSO:sta ja 2X tert.-butyylialkoholista. Näin saatu väritön jauhe on HPLC:n mukaan yli 95 %:isesti puhdasta ja on HPLC:ssä ja DC:ssä identtinen alkuperäisen näytteen kanssa, joka valmistetaan synteesillä liuoksessa. HPLC: retentioaika 20,6 min, pylväs Nucleosil 5Ci8' 4,6x250 mm, gradientti 100 % A/0 % B -> 10 % A/90 % B 30 minuutissa, jossa A = 0,1 % TFA/vesi, B = 0,1 % TFA/ase-tonitriili, 1,0 ml/min, osoitus 215 nm.

Claims (10)

90780 35

1. Tekohartsi, joka perustuu kiinteäfaasisen peptidisyn-teesin kantoaineena käyttökelpoiseen 0-5 mooliprosentilla divinyylibentseeniä ristiinkytkettyyn polystyreeniin, tunnettu siitä, että se perusrunkonsa bentseeni-renkaissa on substituoitu ryhmillä, joilla on kaava I RV. -CH;-0— ^ OR (!) jossa X on -0- tai -NH- ja R tarkoittaa Ci_4~alkyyliä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tekohartsi, tunnettu siitä, että polystyreeni on kopolymeerina yhdessä 1-2 %:n kanssa divinyylibentseeniä ja kaavassa I R tarkoittaa metyyliä.

3. Menetelmä kiinteäfaasisen peptidisynteesin kantoaineena käyttökelpoiseen, 0-5 mooliprosentilla divinyylibentseeniä ristiinkytkettyyn polystyreeniin perustuvan teko-hartsin valmistamiseksi, joka perusrunkonsa bentseeniren-kaissa on substituoitu ryhmillä, joilla on kaava I R°\_. -CHz-O-·^ )-CH— ζ y~QK (I) jossa X on -0- tai -NH- ja R tarkoittaa Ci_4-alkyyliä, tunnettu siitä, että kiinteäfaasisen peptidisyn- 36 teesin kantoaineena käyttökelpoinen, 0-5 %:lla divinyyli-bentseeniä ristiinkytketty ja perusrunkonsa bentseeniren-kaissa kloorimetyloitu tai bromimetyloitu polystyreeni saatetaan peräkkäin reagoimaan a) kaavan II mukaisen yhdisteen kanssa ROx * —* ·«· M-0— ' \-c0—^ OR (II) • S* «s· jossa M tarkoittaa aikaiimetallia ja R tarkoittaa samaa kuin edellä, b) pelkistysaineen kanssa, ja kun X on -NH-, c) aminoryhmän liittävän reagenssin kanssa.

4. Menetelmä peptidien ja peptidiamidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä tekohartsia käytetään kantoaineena kiinteäfaa-sisynteesissä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidi tai peptidia-midi, jonka N-pää ja/tai muut funktionaaliset ryhmät ovat suojatut.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) tekohartsi saatetaan reagoimaan kaavan wl-AM^-Y-H mukaisen yhdisteen kanssa, jossa Y on -O- tai -NH-, wl tarkoittaa N-terminaalista aminosuojaryhmää ja AM^ tarkoittaa funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohap-poketjun, joka muodostuu 1-25 aminohappotähteestä, asyyli-tähdettä, tai sen reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen kanssa tähteen W^-AM^ kytkemiseksi hartsin ryhmään II 90780 37 -χ-, b) N-terminaalinen suojaryhmä vA lohkaistaan pois, c) vapautettu N-terminaalinen aminoryhmä asyloidaan reaktiolla kaavan W2-AM2-OH mukaisen hapon kanssa, jossa W2 ja AM2 tarkoittavat samaa kuin edellä määritellyt tähteet ja am!, tai sen reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen kanssa, d) edellä esitetty vuorottain tapahtuva poislohkaisu vaiheen b) ja asylointi vaiheen c) mukaan toistetaan niin monta kertaa kunnes saavutetaan haluttu aminohappoketju ja e) muodostunut peptidi tai peptidiamidi irrotetaan hartsista haluttaessa ennen tai samanaikaisesti suojaryhmien poislohkaisun kanssa asidolyysillä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäksisesti poislohkaistavina aminosuojaryhminä W^· ja W2 käytetään 9-fluorenyylimetoksi-karbonyyliryhmää (Fmoc).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen tekohartsin käyttö kan-toaineena peptidin ja peptidiamidin kiinteäfaasisyntee-sissä.

9. Tekohartsi, jolla on patenttivaatimuksessa 1 määritelty rakenne, jossa ryhmän X-H sijasta on ryhmä -NH-W, -X-AM-W tai -X-AM-H, joissa X on -O- tai -NH-, W tarkoittaa N-terminaalista aminosuojaryhmää ja AM tarkoittaa funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohappoketjun jossa 1-180 aminohappotähdettä, asyylitähdettä.

10. Patenttivaatimuksen 6 menetelmän mukaisesti saatava peptidi tai peptidiamidi, jonka kaava W-AM°-XH tai H-AM°“ -XH, jossa X on -0- tai -NH-, W tarkoittaa N-terminaalista aminosuojaryhmää ja AMo tarkoittaa funktionaalisissa ryhmissä haluttaessa suojatun aminohappoketjun, jossa on 2-180 aminohappotähdettä, asyylitähdettä. 38