NO309142B1 - N<alfa>-2-(4-nitrofenylsulfonyl)etoksykarbonylaminosyrer og fremgangsmåter derfor - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Oppfinnelsens område angår beskyttede aminosyrederivater for fastfasepeptidsyntese, nemlig Na-2-(4-nitrofenylsulfonyl)etoksykarbonylaminosyrer anvendt som Na-beskyttede aminosyrederivater for f astf asepeptidsyntese.

Fastfasepeptidsyntese er vidt anvendt for fremstilling av biologisk aktive peptider som anvendes innen medisinsk og biologisk forskning, og også som aktive substanser innen farmasi, veterinærmedisin og diagnose.

Det karakteristiske trekk ved fastfasepeptidsyntese kan angis som en trinnvis forlengelse av en peptidkjede ved hjelp av gjentatte sykluser av kjemiske reaksjoner som begyn-ner fra den første C-terminale aminosyre bundet til en uløse-lig bærer. Under forløpet av syntesen forblir målproduktene ved alle reaksjoner bundet til bæreren, mens overskytende reagenser og biprodukter fjernes ved filtrering og vasking av bæreren.

For å utføre fastfasesyntese av et peptid kjedes den første aminosyre (C-ende av målaminosyresekvensen) med den beskyttede a-aminogruppe kovalent til en uløselig polymer bærer via den frie a-karboksylgruppe ved ester- eller amidbindingsdannelse. Den Na-beskyttende gruppe spaltes deretter selektivt fra den således erholdte Na-beskyttede aminoacylpoly-raer, og aminoacylpolymeren med den frie a-aminogruppe dannes. Denne polymer acyleres ytterligere med den neste Na-beskyttede aminosyre under dannelse av Na-beskyttet dipeptidylpolymer. Slike syntesesykluser som består av Na-beskyttelsesspaltning og av etterfølgende acylering av fri aminogruppe med den etter-følgende Na-beskyttede aminosyre, gjentas inntil sammensetningen av målaminosyresekvensen er fullført.

I praktisk fastfasesyntese anvendes vanligvis store molare overskudd (2- til 10-dobbelte) av acylerende reagenser for å sikre fullstendig omdannelse, og derfor må alle reaktive grupper i sidekjeder av aminosyrene slik som amino-, karbok-syl-, hydroksyl-, tiol-, guanidinogrupper, blokkeres med egnede beskyttende grupper. De beskyttende grupper for dette formål må velges omhyggelig for å gi pålitelig og permanent beskyttelse av sidekjedene under betingelser for peptidylpolymer-acyleringer og under spaltningen av den temporære, ^-beskyttelse. På den annen side må disse sidekjedebeskyttende grupper gi mulighet til å avbeskytte det syntetiserte peptid i ett eller to trinn kvantitativt og uten skade på dets struktur. I de fleste tilfeller skal peptidylpolymerbindingen også spaltes samtidig. Det er klart at strukturen og de kjemiske egenskaper av permanente beskyttende grupper for sidekjedene av aminosyrene bestemmes ikke bare av arten av den reaktive funksjon som skal beskyttes, men i stor grad av strukturen og de kjemiske egenskaper av den anvendte, temporære Na-beskyttende gruppe. Temporær Na-beskyttelse er derfor nøkkelelementet for hele strategien ved fastfasepeptidsyntese.

Velkjent og vidt anvendt i fastfasepeptidsyntese er Na-tert.-butoksykarbonylaminosyrer (Boe-aminosyrer) beskrevet for dette formål, av R.B. Merrifield i Biochemistry, 1964, v. 3, s. 1385. Tert.-butoksykarbonyl(Boe)gruppen kan spaltes ved virkningen av sure reagenser av middels styrke, slik som f.eks. trifluoreddiksyre og dens løsninger i klorerte hydro-karboner, løsninger av hydrogenklorid i organiske løsningsmid-ler, bortrifluorid/dietyleterkompleks og enkelte andre syrer, med dannelse av isobutylen og karbondioksid.

Sammen med temporær Na-Boc-beskyttelse for den permanente blokkering av sidekjeder anvendes beskyttende grupper som er stabile under Na-Boc-spaltningen, men som kan spaltes med sterkere sure reagenser med samtidig spaltning av peptidylpolymerbindingen. Kjente reagenser anvendt for dette formål, er væskeformig hydrogenfluorid, trifluormetansulfonsyre og deres blandinger med anisol, tioanisol, dimetylsulfid. Hovedulempen ved syntesestrategien ved anvendelse av temporær Na-Boc-beskyttelse er anvendelse av acidolyse for spaltning av både temporære og permanente, beskyttende grupper som ikke kan tilveiebringe fullstendig stabilitet av den permanente beskyttelse. Ettersom lengden av det syntetiserte peptid vokser, gjennomgår de permanente, beskyttende grupper kumulativ virk-ning av sure reagenser under Boc-spaltningstrinnene som kan resultere i delvis tap av disse grupper og akkumulering av biprodukter. Bortsett fra dette kan den sluttelige behandling av den sammensatte peptidylpolymer med supersure reagenser forårsake delvis destruksjon av målpeptidet. Det må også nev-nes at de ekstremt farlige egenskaper av supersyrer krever spesialutstyr og egnede sikkerhetsforanstaltninger under hånd-tering .

For å unngå anvendelse av supersure reagenser for den sluttelige peptidavbeskyttelse er flere sterkt syresensitive grupper nylig foreslått som en temporær Na-beskyttelse som betraktes å være forenlig med permanent sidekjedebeskyttelse av såkalt tert.-butyltype som er spaltbar med sure reagenser av middels styrke. Et eksempel på en slik Na-beskyttende gruppe er l-(3,5-di-tert.-butylfenyl)-l-metyletoksykarbonyl(t-Bumeoc)gruppen som er beskrevet i Collect. Czech. Chem. Com-mun., 1992, v. 57, s. 1707. Na-t-Bumeoc-gruppen spaltes med 1% trifluoreddiksyre i diklormetan og kan anvendes sammen med permanente, beskyttende grupper av t-butyltype som er spalt-bare med ren trifluoreddiksyre eller dens konsentrerte løs-ninger, i dette tilfelle utelukkes anvendelse av supersyrer, men det generelle prinsipp med differensiell acidolyse forblir uforandret fremdeles.

En annen angrepsvinkel til strategien for fastfasepeptidsyntese er beskrevet av R.B. Merrifield i Science, 1986, v. 232, s. 341. Denne angrepsvinkel, kalt "ortogonalitetsprinsippet", er basert på den antakelse at temporære og permanente, beskyttende grupper skal være fjernbare med totalt distinkte reagenser i henhold til totalt distinkte, kjemiske mekanismer, slik at temporær Na-beskyttelse kan spaltes med absolutt selektivitet som gir full konservering av den permanente beskyttelse og vice versa. For tiden er "ortogonalitetsprinsippet" allment akseptert som en retningslinje for utvikling av effektive strategier for fastfasepeptidsyntese.

Som et eksempel på realisering av "ortogonalitetsprinsippet" er anvendelse av Na-ditiasuccinylaminosyrer (Dts-aminosyrer) i fastfasesyntese beskrevet i Int. J. Peptide and Protein Res., 1987, v. 30, s. 740. Den Na-ditiasuccinyl(Dts)-beskyttende gruppe er relativt resistent overfor sure reagenser av middels styrke og spaltes glatt av tiolreagenser i nøytrale medier med frigivelse av aminogruppen og dannelse av karbontiooksid. Anvendelse av Dts-aminosyrer i praktisk syntese er fremdeles begrenset på grunn av mangel på effektive metoder for deres fremstilling.

Den mest kjente og vidt anvendte strategi for fastfasesyntese som svarer til "ortogonalitetsprinsippet", er basert på anvendelse av Na-9-fluorenylmetoksykarbonylaminosyrer (Fmoc-aminosyrer) som beskrevet av CD. Chang og J. Meienhofer i Int. J. Peptide and Protein Res., 1975, v. 11, s. 246. Na-9-fluorenylmetoksykarbonyl(Fmoc)gruppen er resistent overfor sure reagenser og spaltes i henhold til (3-elimineringsmekanis-men av organiske baser i aprotiske løsningsmidler, f.eks. med morfolindietylamin, piperazin eller piperidin i dimetylformamid (DMF) eller diklormetan, aminogruppen frigis, og diben-zofulven sammen med C02 dannes. I fastfasesyntese utføres fortrinnsvis spaltningen av Fmoc-gruppen ved behandling av den Na-beskyttede peptidylpolymer med 20 til 50% piperidin i DMF i løpet av 10 til 30 minutter. Angitte betingelser tillater anvendelse av permanent, syresensitiv beskyttelse av t-butyltype sammen med temporær Na-Fmoc-beskyttelse som således tilveie-bringer "ortogonaliteten" av syntesestrategien.

Na-Fmoc-syrer er vidt anvendt i manuell fastfasepeptidsyntese, så vel som i automatiske og halvautomatiske syn-tesemaskiner av alle typer. Det skal imidlertid bemerkes at den ekstreme basesensibilitet av Na-Fmoc-beskyttelsen og dens noe ustabilitet i nøytrale, aprotiske løsningsmidler krever omhyggelig kontroll av acyleringsbetingelsene og også av ren-heten av de anvendte løsningsmidler. Spesiell aktpågivenhet må utvises når Na-Fmoc-aminosyrer anvendes for syntese av peptider utover 30 rester i lengde. Den relativt høye produksjonskost-nad forhindrer dessuten anvendelse av Fmoc-derivater ved pep-tidfremstillinger i stor målestokk.

Sammendrag av oppfinnelsen

Det er derfor ønskelig å utvikle Na-beskyttede aminosyrederivater som kan være anvendbare for utvikling av effektive strategier i fastfasepeptidsyntese.

Oppfinnelsen angår således Na-2-(4-nitrofenylsulfonyl )etoksykarbonylaminosyrer (Na-Nsc-aminosyrer) som er kjennetegnet ved generell formel:

hvori

Rx betegner hydrogenatom, og

R2 betegner isopropyl, 2-metylpropyl, 2-metyltioetyl,

benzyl, karboksamidometyl, 2-karboksamidoetyl, 4-tert.-butoksybenzyl, indolyl-3-metyl, S-(trifenyl-metyl)tiometyl, l-(trifenylmetyl)imidazolyl-4-metyl, 3-(N°-mesitylensulfonyl)guanidinopropyl, N-xantylkarboksamidometyl, 2-(N-xantylkarboksamido)etyl eller S-(acetamidometyl)tiomety1;

eller Rx og R2 sammen betegner propylenradikal.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av angitte Na-Nsc-aminosyrer, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter omsetning av aminosyre av generell formel

hvori Rx og R2 betegner radikaler ifølge krav 1,

med 2-(4-nitrofenylsulfonyl)etoksykarbonylklorformiat i blandet, vandig-organisk løsningsmiddel i nærvær av base og ved en temperatur på fra 0 til 40°C.

Sluttelig angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fastfasepeptidsyntese under anvendelse av Na-Nsc-aminosyrene, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter: a) kopling av C-terminal, beskyttet monomer til en amino- eller hydroksylfunksjon av forankringsgruppe bundet til angitte, polymere bærer via en fri karboksylgruppe av angitte, beskyttede monomer for å gi en beskyttet aminoacylpolymer, b) avblokkering av angitte, beskyttede aminoacylpolymer ved behandling med basisk reagens for å gi aminoacylpolymer med fri a-aminogruppe; c) kopling av etterfølgende beskyttede aminosyremono-

mer til en fri a-aminogruppe av angitte aminoacylpolymer for å gi béskyttet peptidylpolymer,

d) gjentakelse av trinn b) og c) inntil den sluttelige beskyttede aminosyremonomer er koblet, hvoretter trinn b)

utføres.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Na-Nsc-aminosyrer ifølge foreliggende oppfinnelse (I) kan fremstilles ved behandling av aminosyrer av generell formel II hvori Rx og R2 har de samme betydninger som for formel I, med 2-(nitrofenylsulfonyl)klorformiat III i et blandet, vandig/organisk løsningsmiddel i nærvær av base og ved en temperatur på fra 0 til 40 °C, fortrinnsvis fra 0 til 20 °C (reaksjonsskjerna 1).

Reaksionsskiema 1

Klorformiat III innføres i reaksjonen i mengder på fra 0,5 til 1,5 molar ekvivalenter, fortrinnsvis fra 0,7 til 0,9, i forhold til aminosyren. Som organisk komponent av løs-ningsmidlet kan ethvert aprotisk, organisk løsningsmiddel anvendes som er i stand til å oppløse acyleringsreagenset og er blandbart med vann, f.eks. acetonitril, DMF, tetrahydrofuran eller dioksan. En base kan være organisk eller uorganisk base, f.eks. natrium- eller kaliumkarbonat, magnesium- eller kalsiumoksid, trietylamin, N-metylmorfolin.

Ifølge en annen metode ifølge foreliggende oppfinnelse omdannes først aminosyrer av generell formel II til N,0-bis-trimetylsilylderivater IV under anvendelse av metoder kjent innen faget, og behandles deretter med klorformiat III i vannfritt, organisk løsningsmiddel, f.eks. diklormetan. Etter vandig hydrolyse av de intermediære trimetylsilylderivater erholdes de ønskede Na-Nsc-aminosyrer I i fri form (reaksjons-sk j erna 2).

Reaksjonsskjema 2

-Derivater av formel I hvori Rx er hydrogen og R2 betegner N-xantylkarboksamidometyl eller 2-(N-xantylkarboks-amido)etyl, kan fremstilles ved omsetning av derivatene av formel I hvori Rx er hydrogen og R2 betegner karboksamidometyl eller 2-(karboksamido)etyl, med xanthydrol i aprotisk, organisk løsningsmiddel i nærvær av syre. Som løsningsmiddel kan DMF anvendes, og som foretrukket syre anvendes organisk syre, f.eks. trifluoreddiksyre, metansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre.

Det ses fra molekyl formelen at forbindelsene I har et asymmetrisk a-karbonatom (bortsett fra forbindelsen hvor Rx = R2 = H). Fordi a-karbonatomet ikke deltar i reaksjonene anvendt for fremstilling av forbindelsene I, bibeholdes således konfigurasjonen av dette kirale senter som eksisterer i utgangs-aminosyrene II i de resulterende Na-Nsc-derivater I. Det er derfor selvsagt at metodene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for fremstilling av Na-Nsc-aminosyrer I i enhver kiral form (L eller D), så vel som racemiske forbindelser, avhengig av konfigurasjonen av utgangsforbindelsen II.

Betydningene av Rx- og R2-substituentene i derivatene av formel I ifølge foreliggende oppfinnelse svarer til struk-turer av sidekjeder av naturlig forekommende aminosyrer inneholdende eller ikke inneholdende beskyttende grupper kjent innen faget, for det meste grupper av tert.-butyltype eller lignende med disse i relasjon til spaltningsbetingelsene (tabell 1).

Åpenbart representerer forbindelsene av formel I vist i tabell I, et fullt sett av beskyttede proteogeniske aminosyrederivater som er nødvendig for syntesen av et peptid med enhver aminosyresammensetning. Det er også klart at Na-Nsc-derivater av aminosyrer som bærer andre typer av ryggradsbes-kyttelse, så vel som Na-Nsc-derivater av ikke-proteogeniske eller uvanlige aminosyrer, kan syntetiseres ved den tilveie-brakte metode.

Na-Nsc-aminosyrer I er krystallinske forbindelser som er uløselige eller svakt løselige i vann og løselige i polare, organiske løsningsmidler, og som er stabile ved langtidslag-ring ved -10 <0> til 25 °C.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fastfasepeptidsyntese under anvendelse av Na-Nsc-aminosyrene av formel I.

Ved denne fremgangsmåte kjedes den første Na-Nsc-aminosyre (C-ende av målaminosekvensen) kovalent til en uløse-lig polymer bærer via den frie a-karboksylgruppe ved ester-eller amidbindingsdannelse under dannelse av Na-Nsc-aminoacylpolymer. Et utall polymerer kan anvendes som en polymer bærer, slik som tverrbundet eller makroporøst polystyren, tverrbundet poly-N,N-dimetylakrylamid i granulær form eller som en sammensetning med kiselgur, tverrbundet dekstran, celluloser, papir og andre polymerer kjent innen faget og anvendt for dette formål .

For binding av den første Na-Nsc-aminosyre skal den polymere bærer inneholde egnede forankringsgrupper. I de fleste tilfeller foretrekkes de forankringsgrupper som til-veiebringer spaltningen av det syntetiserte peptid fra den polymere bærer med frigivelse av den C-terminale karboksyl-eller karboksamidgruppe under behandlingen av peptidylpolymeren med sure reagenser, slik som trif luoreddiksyre og dens løsninger eller hydrogenkloridløsninger i organisk løsnings-middel. Slike forankringsgrupper for estertypebinding kan være 4-hydroksymetylfenoksyalkyl, 4-klor- eller 4-brommetylfenok-syalkyl, a-hydroksydifenylmetyl og andre grupper kjent innen faget; for karboksamidtype binding kan det anvendes kjente di-og trialkoksybenzhydrylamingrupper, 4-aminometyl-3,5-dimetok-syfenoksyalkylgruppen og også andre kjente grupper for dette

formål.

Binding av den C-terminale Na-Nsc-aminosyre til forankringsgrupper av den polymere bærer kan utføres ved metoder kjent innen faget.

For å spalte den Na-beskyttende gruppe fra den erholdte Na-Nsc-aminoacylpolymer behandles angitte, beskyttede aminoacylpolymer med basisk reagens. Foretrukne, basiske reagenser for dette formål er nitrogenbaser, f.eks. ammoniakk, morfolin, piperidin, piperazin, dietylamin, 1,8-diazabisyklo-[5,4,0]undec-7-en, 1,1,3,3-tetrametylguanidin og deres løs-ninger i aprotiske, organiske løsningsmidler. Et mer foretrukket basisk reagens er 20 til 50% løsning av piperidin i DMF. I dette tilfelle spaltes Nsc-gruppen med dannelse av N-[2-(4-nitrofenylsulfonyl)etyl]piperidin og karbondioksid, idet cc-aminogruppen frigis.

Aminoacylpolymeren med den frie a-aminogruppe acyleres deretter med den neste Na-Nsc-aminosyre som gir Na-Nsc-dipeptidylpolymer. For dette formål anvendes metoder kjent innen faget og som vanligvis anvendes for dette formål. Som acyleringsmidler kan det f.eks. anvendes estere av 4-nitrofen-yl-, pentaklorfenyl-, pentafluorfenyl-, 1-hydroksybenzotria-zolyl-Na-Nsc-aminosyrer og andre kjente typer av aktive estere anvendt i fastfasepeptidsyntese; symmetriske anhydrider av Na-Nsc-aminosyrer. Acylering kan også utføres med Na-Nsc-aminosyrer i nærvær av kjente koplingsreagenser, f.eks. disykloheksylkarbodiimid, diisopropylkarbodiimid, benzotriazolyl-l-oksy-(tris-dimetylamino)fosfoniumheksafluorfosfat.

Syntesesykluser som består av Na-Nsc-gruppespaltning og av etterfølgende acylering av den frie aminogruppe med den etterfølgende Na-Nsc-aminosyre, gjentas inntil sammensetningen av målaminosyresekvensen er fullført.

Etter sammensetning av den ønskede Na-Nsc-peptidylpolymer spaltes den Na-terminale, beskyttende gruppe under anvendelse av metoder beskrevet ovenfor, hvorpå målpeptidet i de fleste tilfeller løsnes fra forankringsgruppen av bæreren med samtidig spaltning av den permanente beskyttelse fra side-kj eden av aminosyrene. For dette formål kan sure reagenser anvendes som kjent innen faget, for spaltning av tert.-butyltype beskyttende grupper, f.eks. trifluoreddiksyre, løsninger av metansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre, inneholdende eller ikke inneholdende kjente additiver for oppfanging av utviklede karboniumioner, f.eks. vann, anisol, tioanisol, dimetylsulfid, etanditiol-1,2-triisopropylsilan.

Eventuelt kan målpeptidet avblokkeres uten spaltning fra den polymere bærer. I slike tilfeller skal kjente forankringsgrupper anvendes som kan tilveiebringe en syreresis-tent peptidylpolymerbinding.

Sammenlignet med Fmoc, er Nsc-gruppen mer resistent overfor basiske reagenser, og dens spaltningshastigheter er markert langsommere under lignende betingelser, men det tids-rom som vanligvis gis for spaltning av Na-beskyttelse i henhold til protokoller for fastfasesyntese (15-20 minutter), er til-strekkelig for kvantitativ spaltning av Na-Nsc-gruppen fra den beskyttede peptidylpolymer med et slikt basisk reagens som 20 til 50% løsning av piperidin i DMF. På den annen side gir den forøkte resistens av Nsc-gruppen overfor basiske reagenser en mer uttalt stabilitet i nøytrale og svakt basiske medier som fortrinnsvis anvendes for utførelse av acyleringstrinnene.

Som beskrevet ovenfor, kan Nsc-gruppen spaltes kvantitativt med basiske reagenser i nærvær av tert.-butyltype beskyttende grupper som er resistente mot organiske baser. På den annen side er Nsc-gruppen fullkomment resistent overfor virkningen av sure reagenser som vanligvis anvendes for spaltning av beskyttende grupper av tert.-butyltype. Anvendelse av Na-Nsc-aminosyrer av generell formel I som i sidekjedene inne-holder beskyttende grupper, fortrinnsvis av tert.-butyltype eller lignende i relasjon til spaltningsbetingelsene, gjør det således mulig å utvikle nye strategier for fastfasepeptidsyntese i henhold til "ortogonalitetsprinsippet".

Oppfinnelsen vil i det etterfølgende beskrives ved hjelp av eksempler som er angitt av illustrative formål. Alle aminosyrene i den etterfølgende beskrivelse har L-konfigura-sjon med mindre annet er angitt.

Eksempel 1

N^- Nsc- asparagin ( 1- 10)

3,95 g asparagin og 7,7 g kaliumkarbonat ble oppløst

i 100 ml av en vann-dioksanblanding (3:1, v/v) og ble avkjølt i et isbad, hvorpå en løsning av 7,5 g 2-(4-nitrofenylsulfonyl)etylklorformiat III i 70 ml dioksan dråpevis ble tilsatt i løpet av 15 minutter under omrøring. Kjølebadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt i ytterligere 20 minutter og ble deretter fordampet til ca. 100 ml under redusert trykk og over-ført til en skilletrakt. 100 ml vann ble tilsatt, og den resulterende løsning ble ekstrahert med 2 x 50 ml etylacetat. Det vandige lag ble fraskilt, ble surgjort til pH 2 med 40% svovelsyre og ble avkjølt i isbad. Etter 30 minutter ble det dannede bunnfall filtrert fra, ble vasket grundig med iskaldt vann og lufttørket under dannelse av den ønskede forbindelse 1-10 som et hvitt, krystallinsk pulver (71%). For karakterisering, se tabell 2 (eksempel 5).

Eksempel 2

N g- Nsc- leucin ( 1- 5)

4,92 g leucin og 90 ml vannfritt diklormetan ble anbrakt i en 250 ml rundkolbe utstyrt med tilbakeløpskjøler og dråpetrakt. Til suspensjonen ble det tilsatt 9,5 ml klortrimetylsilan under kraftig omrøring, og blandingen ble oppvarmet til koking i 1 time. Den resulterende løsning ble avkjølt i isbad, hvorpå 9,1 ml trietylamin og 9,0 g klorformiat III ble tilsatt under omrøring. Blandingen ble omrørt i 20 minutter i isbadet og deretter i ytterligere 1,5 time ved romtemperatur. Løsningsmidlet ble fordampet ved redusert trykk, og residuet ble fordelt mellom 200 ml etylacetat og 250 ml 2,5% vandig natriumbikarbonat. Det vandige lag ble fraskilt, ble vasket med 50 ml eter, surgjort til pH 2 med 1 N saltsyre og ble deretter ekstrahert med 3 x 70 ml etylacetat. De kombinerte ekstrakter ble tørket med vannfritt natriumsulfat og fordampet ved redusert trykk. Omkrystallisering av residuet fra heksan-etylacetat ga det ønskede produkt 1-5 i form av hvitt, krystallinsk pulver (80%). For karakterisering, se tabell 2 (eksempel 5).

Eksempel 3

N g- Nsc- asparaginsvre- p- tert.- butvlester ( 1- 12)

7,09 g asparaginsyre-p-tert.-butylester og 90 ml

vannfritt diklormetan ble anbrakt i en 250 ral rundkolbe utstyrt med tilbakeløpskjøler og dråpetrakt. Til blandingen ble det tilsatt 12,7 ml diisopropyletylamin og deretter 9,5 ml klortrimetylsilan under kraftig omrøring, og blandingen ble oppvarmet til koking i 1,5 time. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt i isbad, 9,0 g klorformiat III ble tilsatt, og omrøringen ble fortsatt i 1,5 time ved romtemperatur. Løs-ningsmidlet ble fordampet ved redusert trykk, og residuet ble fordelt mellom 200 ml etylacetat og 250 ml 2,5% vandig natriumbikarbonat. Det vandige lag ble fraskilt, ble vasket med 50 ml eter, surgjort til pH 2 med 1 N saltsyre og ble deretter ekstrahert med 3 x 70 ml etylacetat. De kombinerte ekstrakter ble tørket med vannfritt natriumsulfat og fordampet ved redusert trykk. Omkrystallisering av residuet fra heksan-etylacetat ga det ønskede produkt 1-12 i form av krystallinsk pulver (86%). For karakterisering, se tabell 2 (eksempel 5).

Eksempel 4

Na- Nsc- N- xantvl- asparagin ( 1- 20)

3,89 g Na-Nsc-asparagin (1-10) og 2,6 g xanthydrol ble oppløst i 20 ml tørt DMF. Til løsningen ble det tilsatt 0,4 ml metansulfonsyre, og blandingen fikk stå i 2 dager ved romtemperatur. Den resulterende blanding ble deretter helt over i 100 ml iskaldt vann under omrøring, det dannede bunnfall ble filtrert fra, ble vasket med vann og deretter med etylacetat og eter. Det urene produkt ble oppløst i 10 ml varmt DMF, ble filtrert og utfelt på nytt med eter. Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering, ble vasket med eter og tørket i vakuum under dannelse av den ønskede forbindelse 1-20 som et krystallinsk pulver (74%). For karakterisering, se tabell 2 (eksempel 5).

Eksempel 5

Egenskaper av N^- Nsc- aminosyrer I

I tabell 2 er forbindelsene av formel I som ble frem-stilt under anvendelse av de angitte metoder beskrevet i detalj i eksempel 1-4, vist. Tallene i kolonnen "Metode" svarer til numrene på eksempler hvor de bestemte metoder er beskrevet. Spesifikk, optisk rotasjon [a]D<25> ble målt på DIP-320-polarimeter (JASCO, Japan) i 10 cm kyvetter. Smeltepunkter ble-bestemt i åpne kapillarer og ble ikke korrigert. Kromato-grafiske mobilitetsverdier Rf er vist for tynnsjiktskromato-grafiark "Alufolien Kieselgel 60 F254" (Merck, Darmstadt, Tyskland); kloroform/metanol/eddiksyre, 95:5:3, (A) og benzen/ace-ton/eddiksyre. 100:50:3, (B), ble anvendt som fremkallende løsningsmidler, flekker ble påvist ved UV-absorbans og/eller ved ninhydrinreaksjon. Molekylærionmasser (M + H)<+> ble målt under anvendelse av MS-BC-1 "time-of-flight"-massespektrometer med Cf<252->strålingsaktivert desorpsjon (Electron SPA, Sumy, Ukrania).

Eksempel 6

Fastfasesyntese av dodekapeptid

Ala- Ser- Ser- Thr- Ile- Ile- Lys- Phe- Gly- Ile- Asp- Lys

a) Innføring av forankrinqsgruppe i polymer bærer

Til 250 mg aminometylert styren-1% divinylbenzen-kopolymer (1,0 mekv. NH2/g) i 3 ml DMF ble det tilsatt 0,75 mmol 2,4, 5-triklorfenyl-4-hydroksymetylfenoksypropionat og 0,75 mmol 1-hydroksybenzotriazol, og suspensjonen ble ristet i 24 timer ved romtemperatur. Polymeren ble filtrert fra, ble vasket med DMF, etanol, eter og sluttelig med heksan, og ble tørket i vakuum over fosforpentoksid i 24 timer.

b) Binding av Nsc- Lys( Boc)- OH til forankringsgruppe

Den erholdte polymer ble svellet i 4 ml 1,2-dikloretan/N-metylpyrrolidinblanding (3:1), hvorpå 0,75 mmol Nsc-Lys(Boc)-OH (1-14), 0,1 mmol 4-dimetylaminopyridin og

0,75 mmol disykloheksylkarbodiimid ble tilsatt. Suspensjonen ble ristet i 24 timer ved romtemperatur. Polymeren ble filtrert fra, ble grundig vasket med kloroform, kloroform/metan-olblanding (1:1), etanol, eter og sluttelig med heksan, og ble tørket under dannelse av 400 mg Nsc-Lys(Boe)-polymer.

c) Peptidsammensetning

200 mg Nsc-Lys(Boe)-polymer ble anbrakt i en 10 ml

polypropylensprøyte utstyrt i bunnen med en polypropylen-fritte. Polymeren i sprøyten ble vasket med DMF, og syntesesykluser ble deretter utført i henhold til følgende drifts-protokoll:

Na-Nsc-aminosyrer ble innført i syntesesyklusene i følgende rekkefølge. Nsc-Asp(OtBu)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Gly-OH, Nsc-Phe-OH, Nsc-Lys(Boc)-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Ile-OH, Nsc-Thr(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ser(tBu)-OH, Nsc-Ala-OH.

Etter sammensetning av målaminosyresekvensen ble peptidylpolymeren behandlet med 33% piperidin/DMF (4 ml) i 20 minutter og ble deretter vasket med DMF, diklormetan, etanol, eter og sluttelig med heksan.

d) Avblokkerinq og rensing

Peptidylpolymeren ble ristet med 5 ml 50% trifluoreddiksyre i 1,2-dikloretan i 60 minutter ved romtemperatur. Polymeren ble filtrert fra, vasket med 5 ml 50% trifluoreddiksyre i 1,2-dikloretan, og de kombinerte vaskeløsninger ble fortynnet med 100 ml iskald, vannfri eter. Bunnfallet ble filtrert fra, vasket med eter og tørket i vakuum under dannelse av 170 mg urent dodekapeptid (renhet 70% ved analytisk reversfasevæskekromatografi med høy ytelse).

Urent dodekapeptid ble oppløst i 3 ml 1 M vandig ed-diksyre og ble kromatografert på en 1,5 x 70 cm kolonne pakket med "TSK HW-40F" (Merck, Darmstadt, Tyskland), ekvilibrert og eluert med samme buffer. Fraksjoner inneholdende rent peptid, ble samlet og lyofilisert. Det sluttelige utbytte av mål-dodekapeptid var 104 mg (41%) og med en renhet på mer enn 95% som bestemt ved analytisk reversfasevæskekromatografi med høy ytelse. Aminosyresammensetning (etter 6 N HC1-hydrolyse,

110 °C, 24 og 48 timer): Asp 1,02 (1); Ser 1,84 (2); Thr 0,93 (1); Glu 0,94 (1); Gly 1,03 (1); Ala 1,00 (1); Ile 2,78 (3); Lys 2,04 (2).

Claims (7)

1. Na-2-( 4-nitrofenylsulfonyl )etoksykarbonylaminosyrer, karakterisert ved generell formel: hvori Rx betegner hydrogenatom, og R2 betegner isopropyl, 2-metylpropyl, 2-metyltioetyl, benzyl, karboksamidometyl, 2-karboksamidoetyl, 4-tert.-butoksybenzyl, indolyl-3-metyl, S-(trifenyl-metyl)tiometyl, l-(trifenylmetyl)imidazolyl-4-metyl, 3-(N°-mesitylensulfonyl)guanidinopropyl, N-xantylkarboksamidometyl, 2-(N-xantylkarboksamido)etyl eller S-(acetamidometyl)tiometyl; eller Rx og R2 sammen betegner propylenradikal.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter omsetning av aminosyre av generell formel hvori R1 og R2 betegner radikaler ifølge krav 1, med 2-(4-nitrofenylsulfonyl)etoksykarbonylklorformiat i blandet, vandig-organisk løsningsmiddel i nærvær av base og ved en temperatur på fra 0 til 40°C.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: a) omdannelse av aminosyre av generell formel HNRi-CHRj-COOH hvori Rx og R2 betegner radikaler ifølge krav 1, til 0,N-trimetylsilylerte derivater; b) omsetning av angitte 0,N-trimetylsilylerte derivater med 2-(4-nitrofenylsulfonyl )etoksykarbonylklorformiat i aprotisk løsningsmiddel i nærvær av base, og med etterfølgende hydrolyse.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge krav 1, hvori Rx betegner hydrogenatom, og R2 betegner N-xantylkarboksamidometyl eller 2-(N-xantylkarboksamido)etyl, karakterisert ved at forbindelser ifølge krav 1, hvori Rx betegner hydrogenatom, og R2 betegner karboksamidometyl eller 2-(karboksamido)etyl, omsettes med xanthydrol i organisk løsningsmiddel i nærvær av syre.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av peptider ved hjelp av sekvensvis tilsetning av beskyttede aminosyremonomerer til en voksende peptidkjede bundet til en uløselig polymer bærer, hvori angitte, beskyttede aminosyremonomerer er forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: a) kopling av C-terminal, beskyttet monomer til en amino- eller hydroksylfunksjon av forankringsgruppe bundet til angitte, polymere bærer via en fri karboksylgruppe av angitte, beskyttede monomer for å gi en beskyttet aminoacylpolymer, b) avblokkering av angitte, beskyttede aminoacylpolymer ved behandling med basisk reagens for å gi aminoacylpolymer med fri a-aminogruppe; c) kopling av etterfølgende beskyttede aminosyremonomer til en fri a-aminogruppe av angitte aminoacylpolymer for å gi beskyttet peptidylpolymer, d) gjentakelse av trinn b) og c) inntil den sluttelige beskyttede aminosyremonomer er koblet, hvoretter trinn b) utføres.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at angitte, basiske reagens er nitrogenbase valgt fra gruppen bestående av ammoniakk, morfolin, piperidin, piperazin, dietylamin, 1,8-diazabisyklo-[5,4,0]undec-7-en, 1,1,3,3-tetrametylguanidin og deres løsnin-ger i aprotiske, organiske løsningsmidler.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at angitte nitrogenbase er piperidin, og det organiske løsningsmiddel er dimetylformamid.