JPH07258280A - リン酸化アミノ酸誘導体及びリン酸化ペプチド合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 短い工程でしかも高い収率でリン酸化ペプチ
ドを取得する方法及びそのために必要なリン酸化アミノ
酸を提供する。 【構成】 下記の一般式（Ｉ）で表されるリン酸化アミ
ノ酸誘導体又はその塩及びこれらを用いるリン酸化ペプ
チドの合成方法。 【化１】 式中、Ｂｚｌは、ベンジル基を表す。Ａは、−ＣＨ
₂ −、−ＣＨ（ＣＨ₃ ）−又は 【化２】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、下記の一般式（Ｉ）

【０００２】

【化４】

【０００３】（式中、Ｂｚｌは、ベンジル基を表す。Ａ
は、−ＣＨ₂ −、−ＣＨ（ＣＨ₃ ）−又は

【０００４】

【化５】

【０００５】を表す。）で表されるリン酸化Ｌ−アミノ
酸誘導体及びこれらを使用するリン酸化ペプチドの合成
方法に関する。本発明に係るリン酸化ペプチドは、ガン
遺伝子等の生体内蛋白質の部分構造であり、ガンの診
断、薬理作用の検定等の分野に応用できるので、極めて
有用である。

【０００６】

【従来の技術】生体を構成する特定の蛋白質において、
その一次構造上の一定のアミノ酸残基がリン酸化される
ことによって、生体内でのシグナル伝達等の制御が行わ
れることが知られている。

【０００７】例えば、Ｓｒｃ等のある種のガン遺伝子に
はプロテインキナーゼ活性が発見され、その機能が研究
されており（プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第
７５巻、第３０２１頁以下、１９８０年）、また、脳内
蛋白質（タウ蛋白質等）（ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、
第２６７巻、第１０８９７頁以下、１９９２年）を始め
情報伝達系に関与する様々な蛋白質（ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、第２９６巻、第６１３頁以下、１９８２
年）がリン酸化、脱リン酸化の制御下にあることも知ら
れている。

【０００８】上記のことから、生体内蛋白質中のリン酸
化基質となる部分を含むペプチドやその生産物であるリ
ン酸化ペプチドを合成し、これをもとに研究を行うこと
が、当該生体内蛋白質の生理機能を解明するための重要
な手法となっている。上記リン酸化ペプチドを得る方法
としては、（１）ペプチドを酵素を用いてリン酸化する
方法、（２）化学的にリン酸化ペプチドを合成する方法
の２つがある。

【０００９】酵素を用いてリン酸化する方法（インター
ナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プ
ロテイン・リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．）、第３３巻、第４６８頁〜４
７６頁、１９８９年）は、ペプチドが特定のアミノ酸配
列に限られているため適用範囲が狭く、充分な量のペプ
チドを調製することができないという欠点があった。

【００１０】化学的にリン酸化ペプチドを合成する方法
には、固相法で用いられているＢｏｃ法及びＦｍｏｃ法
がある。 Ｂｏｃ法（ケミカル・レターズ（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ
ｔ．）、第１４０１頁以下、１９９３年）においては、
Ｏ−リン酸化ベンジル基等で保護したリン酸化アミノ酸
を含むペプチド鎖を順次Ｎ末端側へ延ばしていくが、伸
長過程でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いるので、ベ
ンジル基等の保護基の脱離が部分的におこり、ペプチド
鎖の延長が阻害される欠点があり、また、樹脂からのペ
プチドの回収には、強酸であるトリフルオロメタンスル
ホン酸（ＴＦＭＡ）を用いなければならず、副反応が起
こりやすく収率よくリン酸化ペプチドを回収することが
できない等の欠点がある。

【００１１】Ｆｍｏｃ法（インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ
（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｓ．）、第４０巻、第１３４頁〜１４０頁、１９９２年
等）においては、ホスホセリン、ホスホスレオニンは、
β脱離が起こるため基本的に合成ができず、そのためリ
ン酸化導入部位だけ無保護にしたペプチドを合成後、ジ
ベンジルホスホロアミダイト等を用いてリン酸基を導入
するという複雑な方法を必要とする欠点がある。また、
この方法では立体的な障害やリン酸化の過程で酸化の工
程が含まれるために目的物を高収率で得ることも困難で
ある。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記現状に鑑み、本発
明は、短い工程でしかも高い収率で、目的とするリン酸
化ペプチドを取得する方法及びそのために必要なリン酸
化アミノ酸を提供することを目的とするものである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、リン酸
化Ｌ−アミノ酸誘導体を先に取得し、これを用いて、以
下に詳述するＮｐｙｓ法を用いて、固相法又は液相法に
よりリン酸化ペプチドを合成するところにある。上記リ
ン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体は、本発明者らにより初めて
見いだされたものであり、従って、本発明の要旨は、こ
のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体そのものにもある。以下
に本発明を詳述する。

【００１４】本発明に係る上記リン酸化Ｌ−アミノ酸誘
導体は、Ｌ−アミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）、スレオ
ニン（Ｔｈｒ）及びチロシン（Ｔｙｒ）の水酸基をリン
酸化し、アミノ基を３−ニトロ−２−ピリジンスルフェ
ニル（本明細書において「Ｎｐｙｓ」ともいう）基で保
護した誘導体であって、上記一般式（Ｉ）で表される。
上記リン酸化アミノ酸誘導体は、下記に示した工程で合
成することができる。

【００１５】

【化６】

【００１６】式中、Ａ、Ｂｚｌは前記と同じ。上記合成
において、出発原料は、Ａが−ＣＨ₂ −の場合はＢｏｃ
−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）、Ａが−ＣＨ（ＣＨ₃ ）−
の場合はＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）、Ａが−Ｃ
Ｈ₂ −Ｃ₆ Ｈ₄ −の場合はＢｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚ
ｌ₂ ）である。これらは、市販のものを用いることがで
きる。上記化合物はギ酸で処理してＢｏｃ基をはずし
（工程ａ）、Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）、Ｔｈｒ（ＰＯ
₃ Ｂｚｌ₂ ）、Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）を得、得られ
た化合物に３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロ
ライドを反応させ、炭酸ナトリウムを加えて（工程
ｂ）、α−アミノ基にＮｐｙｓ基の導入された上記リン
酸化アミノ酸誘導体を得ることができる。上記３つのリ
ン酸化アミノ酸誘導体は、文献未記載の新規化合物であ
り、本発明者らにより初めて取得され、その物性を同定
された物質である。

【００１７】本発明の上記リン酸化アミノ酸誘導体は、
後述するリン酸化ペプチドを合成する原料として極めて
重要な化合物である。上記リン酸化ペプチドを合成する
ためには、上記リン酸化アミノ酸誘導体のほか、これら
の塩も利用することができる。上記リン酸化アミノ酸誘
導体の塩は、通常アミノ酸化学上考えられる塩であれば
特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩、ジシクロヘキシルアミン塩、シクロヘキシルアミン
塩等を挙げることができる。

【００１８】本発明においては、上記リン酸化アミノ酸
誘導体又はその塩を他のアミノ酸とペプチド結合させ
て、リン酸化ペプチドを合成する。上記リン酸化ペプチ
ドの合成は、公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基
礎と実験」、泉屋ら共著、１９８５年、丸善、「蛋白質
の化学」、生化学実験講座（Ｉ）、第４巻、東京化学同
人発行、１９７７年等）に準じて液相法又は固相法によ
り行うことができる。本発明のリン酸化ペプチドの合成
方法としては、固相法が好ましい。

【００１９】上記リン酸化ペプチドを固相法により合成
する場合は、まず、最初に目的とするペプチドのＣ末端
アミノ酸のα−アミノ基を保護した保護アミノ酸を不溶
性樹脂に結合させる。

【００２０】上記アミノ酸のα−アミノ基の保護基は、
Ｎｐｙｓ基である。本明細書においてＮｐｙｓ法とは、
α−アミノ基の保護基としてＮｐｙｓ基を用いてペプチ
ドを合成する手法をいう（松枝ら。インターナショナル
・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・
リサーチ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｒｅｓ．）、第１６巻、第３９２〜４０１頁、１９
８０年）。

【００２１】上記保護アミノ酸とは、官能基が公知の方
法により保護されたアミノ酸であり、各種のものが市販
されている。アルギニンのグアニジル基の保護基として
は、例えば、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベ
ンゼンスルホニル基、２，２，５，７，８−ペンタメチ
ルクロマン−６−スルホニル基等が挙げられる。アスパ
ラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基の保護基と
しては、例えば、ｔ−ブトキシ基等を挙げることができ
る。システインのメルカプト基の保護基としては、例え
ば、トリフェニルメチル基、Ｓ−アセトアミドメチル基
等を挙げることができる。セリン、スレオニン、チロシ
ンの水酸基の保護基としては、例えば、ｔ−ブトキシ基
等を挙げることができる。ヒスチジンのイミダゾリル基
の保護基としては、例えば、トリフェニルメチル基等を
挙げることができる。トリプトファンのインドリル基の
保護基としては、例えば、ホルミル基等を挙げることが
できるが、保護しなくてもよい。

【００２２】上記各保護基は、基本的には、最終脱保護
の際、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で切断できるものが
使用される。システイン残基のＳ−Ｓ結合を結ぶ際は、
合成条件に応じ適切なものを選択することができる。

【００２３】上記α−アミノ基を保護した保護アミノ酸
を結合させる不溶性樹脂としては、アミノ酸との結合が
ＴＦＡ等で切断できる樹脂ならば特に制限されず、例え
ば、パラアルコキシベンジルアルコール樹脂、４−ヒド
ロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酢酸樹脂等を挙
げることができる。

【００２４】上記不溶性樹脂に結合したα−アミノ基を
保護した保護アミノ酸は、α−アミノ基の保護基をはず
した後、ペプチド鎖の一次構造に従い、Ｃ末端側から、
α−アミノ基にＮｐｙｓ基を導入した各種アミノ酸（以
下Ｎｐｙｓ保護アミノ酸ともいう）又は上記リン酸化ア
ミノ酸誘導体を順次結合させる。

【００２５】保護アミノ酸の縮合は、Ｎｐｙｓ法に従っ
て、すべて中性条件で鎖長を延ばすことができる。すな
わち、Ｃ末端アミノ酸を不溶性樹脂に結合後、Ｎｐｙｓ
保護アミノ酸、弱塩基、触媒存在下に縮合剤を用いて鎖
長を伸ばす。上記弱塩基としては、例えば、トリエチル
アミン、Ｎ−メチルモルホリン等を挙げることができ
る。触媒としては、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
等を挙げることができるが、なくてもよい。縮合剤とし
ては、例えば、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤ
Ｉ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス
−ピロリディノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ
ート（ＰｙＢＯＰ）等を挙げることができる。溶媒とし
ては、Ｎｐｙｓアミノ酸、触媒、縮合剤の溶解可能なも
のであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）等を挙げることができる。

【００２６】上記リン酸化ペプチドの合成は、例えば、
島津製作所製のペプチドシンセサイザーＰＳＳＭ８型の
ようなＦｍｏｃ方式の固相ペプチド合成機を使用して行
うこともできる。この方法においては、得られたペプチ
ド鎖と不溶性樹脂の結合、ペプチド鎖Ｎ末端側の保護基
との結合、リン酸基の保護基であるベンジル基との結合
等をＴＦＡ等を用いて切断して目的のリン酸化ペプチド
を得ることができる。

【００２７】本発明においては、その後、溶媒にて洗浄
後Ｎｐｙｓ基の脱保護を行う。脱保護は、トリフェニル
ホスフィン、２−ピリジンチオール−１−オキサイド等
中性条件下で除去できる物質を用いてすることができ
る。洗浄後、弱塩基で中和洗浄し、再び縮合を行う。中
和は、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等によ
りすることができる。

【００２８】目的とする保護基が結合したペプチド樹脂
を得た後、スカベンジャーの入ったＴＦＡにてペプチド
を脱離する。スカベンジャーとしては、例えば、水、エ
タンジチオール、ジエチルサルファイド、チオアニソー
ル、フェノール、アニソール等を挙げることができる。
得られるペプチドの構成アミノ酸に応じて、上記の幾つ
かを組み合わせて使用することができる。

【００２９】得られた粗製ペプチドは、ペプチド製造の
公知の手段、例えば、逆相、ゲル濾過、イオン交換等の
各種クロマトグラフィー、電気泳動等により単離、精製
することができるが、例えば、逆相ＨＰＬＣによる手段
が最適である。

【００３０】本発明により得られるリン酸化ペプチド
は、生理活性物質として利用することができる。ホスホ
セリン含有蛋白質としては、例えば、ヒトとウシのβ−
カゼイン（ムリナックス（Ｍｕｌｌｉｎａｘ），Ｔ．
Ｒ．ら、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙ．）、第２４３巻、第６５５〜６５９頁、
１９８５年）、グリコーゲン合成酵素（フォイル（Ｆｏ
ｉｌ），Ｃ．Ｊ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２
６２巻、第１４０４２〜１４０４８頁、１９８７年）、
Ｎ−ｍｙｃ蛋白質（ルッシャー（Ｌｕｓｈｅｒ），Ｂ．
ら、ジ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ）、第８巻、第１１１１〜１１１９頁、１９
８９年）等を挙げることができる。

【００３１】ホスホスレオニン含有蛋白質としては、例
えば、ｔａｕ蛋白質（Ｋ．イシグロ（Ｉｓｈｉｇｕｒ
ｏ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６７巻、第１
０８９７〜１０９０１頁、１９９２年）、ガン抑制遺伝
子ＲＢ蛋白質（Ｙ．タヤ（Ｔａｙａ）ら、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーショズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１６４巻、第５８
０〜５８６頁、１９８９年）等を挙げることができる。

【００３２】ホスホチロシン含有蛋白質としては、例え
ば、ラウス・ザルコーマ・ウイルスの遺伝子産物である
ｐｐ６０^src （ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ），Ｔ．ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７７巻、第１３１１
〜１３１５頁、１９８０年）、ＥＧＦレセプター（ウシ
ロ（Ｕｓｈｉｒｏ），Ｈ．ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、第２５４巻、第８０８３〜８０８６頁、１９８
０年）等を挙げることができる。

【００３３】本発明により得られるリン酸化ペプチドの
１種であるＬｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
（ｐＳｅｒはホスホセリンを表す）は、Ｎ−ｍｙｃ蛋白
質の部分アミノ酸配列であり、Ｎ−ｍｙｃ蛋白質は、ヒ
トのガンで発現異常がみられる蛋白質である。

【００３４】本発明により得られるリン酸化ペプチドの
１種であるＰｒｏ−Ｇｌｙ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ｐＴｈｒはホスホスレオニンを表
す）は、リン酸化ｔａｕ蛋白質の部分アミノ酸配列であ
り、アルツハイマー病患者の脳中には、ｐａｉｒｅｄ
ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦｓ）と称
される不溶性の繊維が蓄積することが明らかにされてお
り、このＰＨＦｓ中にはリン酸化されたｔａｕ蛋白質が
存在する。

【００３５】本発明により得られるリン酸化ペプチドの
１種であるＧｌｕ−ｐＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ
（ｐＴｙｒはホスホチロシンを表す）は、ｐｐ６０^src
の部分アミノ酸配列であり、ｐｐ６０^src は代表的なレ
トロウイルスであるラウス・ザルコーマ・ウイルスの遺
伝子産物である。

【００３６】本発明により得られるリン酸化ペプチド
は、生体上に発見される上記生理物質又は生理活性物質
の部分アミノ酸配列を構成するので、これらと同じ生理
活性を有する物質又はその物質の構成成分として利用す
ることができる。また、これら物質の同定に利用するこ
とができる。上記同定は、蛋白質から目的とする特定の
アミノ酸配列を検出する方法、例えば、エライザ（ＥＬ
ＩＳＡ）法等の公知の方法を、上記リン酸化ペプチドに
応用することにより、することができる。この方法によ
り、例えば、ヒトのガンの診断及び治療、アルツハイマ
ー病の診断及び治療、ラウス・ザルコーマ・ウイルス感
染の診断及び治療をすることができる。

【００３７】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、Ｎｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ
₃Ｂｚｌ₂ ）、Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）、
Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｂｚｌ₂ ）以外のＮｐｙｓ保
護アミノ酸は、国産化学社製のものを使用した。

【００３８】実施例１Ｎｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）〔Ｎｐｙｓ保護セ
リン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成 Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）１ｇ（２．１ｍｍｏ
ｌ、渡辺化学社製）に０℃下、ギ酸２０ｍｌを加え、１
時間反応後、溶媒を留去し、真空にて乾燥させた。蒸留
水２０ｍｌを加え等電点沈殿を行い沈殿を遠心にて集め
乾燥させ、Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）を得た。収量５４
６ｍｇ、収率７０％。

【００３９】Ｒｆ値＝０．７６（ブタノール：酢酸：水
＝４：１：１） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝３６６［Ｍ＋Ｈ］⁺ （日本電子
社製ＪＭＳ−ＤＸ３０２型質量分析装置を使用） 上記で得たＳｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）５４６ｍｇ（１．
５ｍｍｏｌ）に水３．９ｍｌ、ＤＭＦ４．１ｍｌ、炭酸
ナトリウム２７５ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）を加えて溶解
後、０℃下、Ｎｐｙｓ−Ｃｌを５３０ｍｇ（２．８ｍｍ
ｏｌ）加え、１時間後及び２時間後に再び炭酸ナトリウ
ム３０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）及びＮｐｙｓ−Ｃｌを
５０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）加えた。３時間後、水１
００ｍｌを添加し、エーテル洗浄（１００ｍｌ×２回）
を行い、０．２Ｎクエン酸で酸性化後、酢酸エチルにて
Ｎｐｙｓ−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）を抽出した。硫酸
ナトリウムにて一夜乾燥後、溶媒を留去し、アセトニト
リル−水にて再結晶を行った。収量４００ｍｇ、収率５
０％。 Ｒｆ値＝０．４（クロロホルム：メタノール：酢酸＝９
５：５：３） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５２０［Ｍ＋Ｈ］⁺

【００４０】融点１３４〜１３６℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（δ ＣＤＣｌ₃ ）：３．７（１Ｈ，ｍ，
ＣＨ），４．４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，ＣＨ
₂ Ｏ），５．０（４Ｈ，ｍ（ＯＣＨ₂ ）₂ ），７．４
（１１Ｈ，ｍ，（Ｃ₆ Ｈ₅ ）₂ ，Ｈ−５ ｏｆ ｐｙｒ
ｉｄｉｎｅ），８．６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝
１．７Ｈｚ， Ｈ−４ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ），
８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ
−６ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ） 元素分析値（Ｃ₂₂Ｈ₂₂Ｏ₈ Ｎ₃ ＳＰ） 理論値 Ｃ：５０．８７ Ｈ：４．２４ Ｎ：８．０９ 実測値 Ｃ：５０．６６ Ｈ：４．０８ Ｎ：８．２８

【００４１】実施例２Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）〔Ｎｐｙｓ保護ス
レオニン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成 Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）の代わりにＢｏｃ−
Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）０．５ｇ（２．１ｍｍｏｌ、
渡辺化学社製）を使用したこと以外は、実施例１と同様
にしてＮｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）を合成し
た。Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）は、再結晶で
きなかったので逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍乾品とし
た。 Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ） 収量５４６ｍｇ、収率７０
％。 Ｒｆ値＝０．７（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝３８０［Ｍ＋Ｈ］⁺ Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ） 収量７５ｍｇ、
収率３４％。 Ｒｆ値＝０．２５（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
９５：５：３） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５３４［Ｍ＋Ｈ］⁺

【００４２】融点６４〜６７℃¹ Ｈ−ＮＭＲ（δ ＣＤＣｌ₃ ）：１．５（３Ｈ，ｄ，
Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ₃ ），３．４（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），
５．０（４Ｈ，ｍ，（ＯＣＨ₂ ）₂ ），５．２（１Ｈ，
ｍ，ＣＨ−Ｏ），７．３（１１Ｈ，ｍ，（Ｃ
₆ Ｈ₅ ）₂ ，Ｈ−５ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．
６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−４
ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
４Ｈｚ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−６ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉ
ｎｅ） 元素分析値（Ｃ₂₃Ｈ₂₄Ｏ₈ Ｎ₃ ＳＰ） 理論値 Ｃ：５１．７８ Ｈ：４．５０ Ｎ：７．８８ 実測値 Ｃ：５１．５４ Ｈ：４．４８ Ｎ：７．８４

【００４３】実施例３Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）〔Ｎｐｙｓ保護チ
ロシン−Ｏ−リン酸化ベンジルエステル〕の合成 Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）の代わりにＢｏｃ−
Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）０．３ｇ（０．５５ｍｍｏ
ｌ、渡辺化学社製）を使用したこと以外は、実施例１と
同様にしてＮｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）を合成
した。但し、Ｎｐｙｓ−Ｃｌを反応させる際、Ｔｙｒ
（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）の溶解性が悪いためジメチルスルホ
キサイド（ＤＭＳＯ）１ｍｌを加え反応を行った。ま
た、Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）は、再結晶で
きなかったので逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍乾品とし
た。

【００４４】Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ） 収量１３７ｍ
ｇ、収率５６％。 Ｒｆ値＝０．３９（ブタノール：酢酸：水＝４：１：
１） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝４４２［Ｍ＋Ｈ］⁺ Ｎｐｙｓ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ） 収量６２ｍｇ、
収率３４％。 Ｒｆ値＝０．２９（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
９５：５：３） ＦＡＢ−ＭＳ；ｍ／ｚ＝５９６［Ｍ＋Ｈ］⁺

【００４５】¹Ｈ−ＮＭＲ（δ ＣＤＣｌ₃ ）：２．９
−３．３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂ ），３．８（１Ｈ，ｍ，Ｃ
Ｈ），５．１（４Ｈ，ｍ，（ＯＣＨ₂ ）₂ ），７．３
（１５Ｈ，ｍ，（Ｃ₆ Ｈ₅ ）₂ ，Ｃ₆ Ｈ₄ ，Ｈ−５ ｏ
ｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ），８．５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８
Ｈｚ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｈ−４ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎ
ｅ），８．８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈ
ｚ，Ｈ−６ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ） 元素分析値（Ｃ₂₈Ｈ₂₆Ｏ₈ Ｎ₃ ＳＰ） 理論値 Ｃ：５６．４７ Ｈ：４．３７ Ｎ：７．０６ 実測値 Ｃ：５４．８４ Ｈ：４．３０ Ｎ：６．７６

【００４６】実施例４Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇの合成 （ｐＳｅｒはホスホセリン（リン酸化セリン）を表す） Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）アルコキシベンジルアルコ
ール樹脂を３０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）（１０ｍｌ×２）で２０分間処理後、ＤＭ
Ｆ、メタノール（各１０ｍｌ×２回）で洗浄し、真空下
で乾燥させた。このようにして調製した樹脂２５ｍｇを
ＤＭＦにて膨潤、洗浄後、最初のアミノ酸であるＮｐｙ
ｓ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、及び、Ｎ−メチルモルホリン
（ＮＭＭ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ
ＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ
ス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロフォス
ヘート（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｏｘｙ
−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏ
ｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
（ＰｙＢＯＰ）を、各５当量用い縮合を行った。次いで
ＤＭＦで再度樹脂を洗浄、脱保護は、中性条件の３％ト
リフェニル基ホスフィン（Ｐｈ₃ Ｐ）、１．２％ピリジ
ン・塩酸（Ｐｙｒ・ＨＣｌ）／ＤＭＦ溶液を用いて行っ
た。

【００４７】ＤＭＦで再び樹脂を洗浄後、１０％ＮＭＭ
／ＤＭＦ溶液で中和を行い、最後にＤＭＦで洗浄した
後、次のアミノ酸の縮合に移った。以下、同様の方法で
鎖長を延ばした。

【００４８】各アミノ酸の保護基としては、実施例４〜
６を通して、α−アミノ基の保護基としてはＮｐｙｓ基
を、セリン、スレオニンの水酸基の保護基としてはｔ−
Ｂｕ基を、アルギニンのグアニジノ基の保護基としては
Ｐｍｃ基を、グルタミン酸のカルボキシル基の保護基と
しては、ｔ−Ｂｕ基を用いた。合成機は、島津ＰＳＳＭ
８を使用した。操作条件は表１に示した。

【００４９】

【表１】

【００５０】合成完了後、樹脂をメタノールで洗浄し、
真空にて乾燥した。樹脂１５ｍｇにリージェントＫ（フ
ェノール６２．５ｍｇ、水６２．５μｌ、チオアニソー
ル６２．５μｌ、エタンジチオール（ＥＤＴ）３１．３
μｌ、ＴＦＡ１ｍｌ）を加え、室温８時間で放置した。
これにより樹脂からのペプチドの切断、リン酸基の保護
基であるベンジル基の脱保護、各種保護アミノ酸の脱保
護を行った。フィルターで樹脂を除去後、エーテルを加
え、遠心にてペプチドを集めた。真空にてペプチドを乾
燥後、水１ｍｌに溶解し、以下ＨＰＬＣにて生成物の分
析を行った。

【００５１】ペプチドのＨＰＬＣによる分析は以下のよ
うにして行った。ＨＰＬＣ装置として島津ＬＣ−６Ａシ
ステムを使用し、データ処理は、島津ＣＲ−７Ａを使用
して行った。カラムは、コスモシル（Ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ）５Ｃ₁₈（４．６×１５０ｍｍ）を使用した。溶出
は、４０℃にて、０．０５％ＴＦＡ溶液中のアセトニト
リル濃度を０−５０％（５０分間で）上昇させることに
より行った。移動相の流速は、１ｍｌ／分で、２１４ｎ
ｍの吸収を測定することにより、試料の溶出位置をモニ
ターした。合成反応物をＨＰＬＣで分析したところ、図
１に示したように一本のメインピークが観測された。こ
の分画を回収してアミノ酸分析、ＦＡＢ−ＭＳ分析を行
った。

【００５２】ペプチドの酸加水分解及びアミノ酸組成分
析は、以下のように行った。乾燥試料（ペプチド約２ｎ
ｍｏｌ）の入った試験管を加水分解用バイアルに入れ、
０．１％フェノール含有５．７Ｎ塩酸２００μｌを加
え、減圧密閉後、１１０℃、２４時間加水分解した。試
料を減圧乾燥後、０．０２Ｎ塩酸に溶解し、日立Ｌ−８
５００にてアミノ酸分析を行った。表２にその結果を示
した。なお、表２の実測値は、Ａｒｇとのモル相対比で
表した。

【００５３】

【表２】

【００５４】ＦＡＢ−ＭＳは、日本電子社製ＪＭＳ−Ｄ
Ｘ３０２型質量分析装置を使用し、グリセリン又はｍ−
ニトロベンジルアルコールをマトリックスとし、試料に
混入することにより測定した。理論質量６３８、ｍ／ｚ
＝６３９［Ｍ＋Ｈ］⁺ 。上記の結果から、ＨＰＬＣ溶出
のメインピークの分画として回収されたペプチドが目的
物であることが判明した。なお、アミノ酸分析の結果よ
り、保護ペプチド樹脂１３．８ｍｇから目的ペプチド
は、２５５μｇ得られた。収率は４５％であった。

【００５５】実施例５Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇの合成 （ｐＴｈｒはホスホスレオニン（リン酸化スレオニン）
を表す） 実施例４と同様の手順を用いて合成し、合成完了後、Ｈ
ＰＬＣ分析を行った。図２にそのクロマトグラムを示し
た。

【００５６】主成分として１、２、３の３本のピーク分
画を分取し、各々に対してアミノ酸組成分析、ＦＡＢ−
ＭＳ分析を行った。アミノ酸分析の結果を表３に示し
た。なお、表３の実測値は、Ａｒｇとのモル相対比で表
した。

【００５７】

【表３】

【００５８】表３から目的ペプチドは、ピーク１の分画
に含まれることが判明した。ピーク１の分画のＦＡＢ−
ＭＳ分析は、理論質量７５０、ｍ／ｚ＝７５０［Ｍ＋
Ｈ］⁺であった。アミノ酸分析の結果より、保護ペプチ
ド樹脂１０ｍｇから目的ペプチドは、２１４μｇ（２８
６ｎｍｏｌ）得られた。収率は３６％であった。なお、
アミノ酸分析の結果から、ピーク２はＴｈｒ（ＰＯ₃ Ｂ
ｚｌ₂ ）以降のアミノ酸が縮合せずペプチド鎖の伸長が
止まってしまったペプチドであることがわかった。ピー
ク３は、Ｎｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂ ）だけ縮合
せず、そのまま伸長が進んだペプチドと判断された。Ｎ
ｐｙｓ−Ｔｈｒ（ＰＯ₃ Ｂｚｌ₂）のダブルカップリン
グを行う等すれば、目的ペプチドの収率は、さらに向上
する。

【００５９】実施例６Ｇｌｕ−ｐＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇの合成 （ｐＴｙｒはホスホチロシン（リン酸化チロシン）を表
す） 実施例４と同様の手順で合成し、合成完了後、ＨＰＬＣ
分析を行った。図３にそのクロマトグラムを示した。主
成分として１本のメインピークが観測され、この分画を
分取し、アミノ酸組成分析、ＦＡＢ−ＭＳ分析を行っ
た。アミノ酸分析の結果を表４に示した。なお、表４の
実測値は、Ａｌａとのモル相対比で表した。

【００６０】

【表４】

【００６１】表４から目的ペプチドは、メインピークの
分画に含まれることが判明した。また、この分画のＦＡ
Ｂ−ＭＳ分析では、理論質量７１８に対し、ｍ／ｚ＝７
１９［Ｍ＋Ｈ］⁺ であった。アミノ酸分析の結果より、
保護ペプチド樹脂９．２ｍｇから目的ペプチドは、６３
０μｇ（８７８ｎｍｏｌ）得られた。収率は６９％であ
った。従来、Ｂｏｃ法を使用する方式のペプチド合成機
でしかリン酸化ペプチドを直接合成することができなか
ったが、本発明の方法を使用することにより、Ｆｍｏｃ
法を使用する方式のペプチド合成機でもリン酸化ペプチ
ドの合成が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で得たペプチドのクロマトグラム。縦
軸は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を
表す。

【図２】実施例５で得たペプチドのクロマトグラム。縦
軸は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を
表す。

【図３】実施例６で得たペプチドクロマトグラム。縦軸
は２１４ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（分）を表
す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の一般式（Ｉ）で表されるリン酸化
   Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。 【化１】 式中、Ｂｚｌは、ベンジル基を表す。Ａは、−ＣＨ
   ₂ −、−ＣＨ（ＣＨ₃ ）−又は 【化２】 を表す。
2. 【請求項２】 Ａが−ＣＨ₂ −である請求項１記載のリ
   ン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
3. 【請求項３】 Ａが−ＣＨ（ＣＨ₃ ）−である請求項１
   記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩。
4. 【請求項４】 Ａが 【化３】 である請求項１記載のリン酸化Ｌ−アミノ酸誘導体又は
   その塩。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３又は４記載のリン酸化
   Ｌ−アミノ酸誘導体又はその塩を用いることを特徴とす
   るリン酸化ペプチドの合成方法。
6. 【請求項６】 合成方法が、Ｎｐｙｓ法を用いて、固相
   法又は液相法によりするものである請求項５記載のリン
   酸化ペプチドの合成方法。