NO148373B

NO148373B - Fremgangsmaate ved fremstilling av et harpikspeptid

Info

Publication number: NO148373B
Application number: NO812168A
Authority: NO
Inventors: Robert L Colescott; Emil Kaiser; Charles D Bossinger; Paul I Cook
Original assignee: Armour Pharma
Priority date: 1974-02-12
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1983-06-20
Also published as: DK51675A; GB1508682A; NO148373C; JPS50129557A; FR2260565A1; ES434673A1; SE7501342L; DE2505712A1; NO812168L; NO148332B; ZA75880B; US3915949A; NO148332C; AU503998B2; GB1508681A; CA1062249A; AU7796775A; BE825397A; FR2260565B1; JPS5850982B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et harpikspeptid

som er nyttig for fremstilling av peptider med biologisk aktivi-

tet.

Det har lenge vært kjent at visse naturlig biologisk aktive stoffer kan erholdes fra dyrekjertler og at de således erholdte stoffer kan anvendes ved behandling av mangeltilstander i det menneskelige legeme. Et slikt stoff er det adrenocorticotrope hormon, vanligvis kalt ACTH, som i mange år har vært erholdt fra hypofysen hos dyr, særlig pinnsvin- og hornkveghypofyser.

Besværet ved å måtte oppsamle de relativt små hypofyser

fra dyr på det tidspunkt da dyrene slaktes, de begrensede mengder av slike kjertler som kan oppsamles, og de tidkrevende rensemetoder som må utføres for å fremstille peptider som kan administreres til mennesker, er i virkeligheten store ulemper ved fremstillingen av naturlige peptidhormoner fra dyrekjertler. I mange år har man spent ventet på oppdagelsen av praktiske metoder og forbindelser som muliggjør kommersiell fremstilling av slike peptider som ACTH på annen måte enn ved å erholde dem fra dyrekilder. Såvidt

vites, har der ikke vært noen slike forbindelser eller metoder før foreliggende oppfinnelse.

Et viktig, biologisk aktivt adrenocorticotropt hormon

(ACTH) er blitt påvist å ha følgende struktur:

hvor forkortelsene Phe, Glu, Leu etc. betegner de forskjellige aminosyregrupper i peptidkjeden og tallene angir stillingene av aminosyregruppene i kjeden i henhold til godtatt nomenklatur. Se artikkelen av Riniker et al, i Nature New Biology, 235, 114 - 115

(1972) .

Oppgaven som søkes løst ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse, er å fremstille et harpikspeptid .fra hvilket biologisk aktive peptider kan avledes, særlig peptider med adrenocorticotrop hor-monaktivitet.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes det således en fremgangsmåte ved fremstilling av et harpikspeptid med strukturen:

hvor Bz er benzyl, p-methoxybenzyl, p-klorbenzyl, p-nitro-

benzyl eller benzylhydrid,(r) er divinylbenzen-tverrbundet polystyrenharpiks, Y er Bz eller hydrogen, V er 2-klorcarbo-benzyloxy, carbobenzyloxy, 2-bromcarbobenzyloxy,2,4-diklorcarbo-benzylcxy eller trifluoracetyl, T er tosyl eller nitro, og W er carbobenzyloxy, tosyl, dinitrofenyl, en gruppe Bz eller hydrogen.

Fremgangsmåten er karakteristisk ved at P-Bz-l-serin, hvor P er tert.-butyloxycarbonyl, amyloxycarbonyl eller o-nitrofenylsulfenyl, eller en aktiv ester eller et azid av dette serin, kobles til et harpikspeptid av strukturen:

hvor Bz,(j*), Y, V, T og W har de ovenfor angitte betydninger, idet koblingen utføres i nærvær at et diimid, med mindre det' benyttes en aktiv ester eller et azid av reaktanten P-Bz-1-serin.

Den fremstilte forbindelse (Forbindelse nr. 39) kan anvendes for fremstilling av det ovenfor angitte adrenocorticotrope hormon (Forbindelse 41) ved en fremgangsmåte som vil bli beskrevet nedenfor.

Harpikspeptidet (Forbindelse 38) som anvendes som utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles etter en flertrinns syntese ved hvilken mange nye, stadig mer påbyggede harpikspeptider fremstilles. Syntesen vil nedenfor bli beskrevet trinn for trinn.

Man er oppmerksom på publikasjoner av visse laboratorie-metoder for syntesen av visse peptider med relativt korte amino-kjedelengder. Disse innbefatter en artikkel av R.B. Merrifield med titelen "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide" på side 2149 - 2154 i bind 85 av Journal of the • American Chemical Society (1963) og en bok med tittelen "Solid Phase Peptide Synthesis" av John VJ. Stewart og Janis D. Young ut-gitt av W.H. Freeman and Company i San Francisco, California, men der finnes i disse publikasjoner ingen angivelse av harpikspeptider med aminosyregrupper av den type og i den rekkefølge som forekommer i den nedenfor beskrevne syntese.

Generelt anvendes en fastfasesyntese i hvilken en uopp-løselig polystyrenharpiks klormethyleres. Til harpiksen kobles først fenylalanin, derpå glutamsyre og de andre aminosyrer i kjeden, i foreskrevet rekkefølge, under anvendelse av et system for beskyttelse og avbeskyttelse av de aktive amin- og carboxyl-grupper.

Fremstilling av en uoppløselig harpiks

Klormethylering av en harpiks beskrives av følgende s.trukturf ormel:

(r) i ovenstående formel er .en uoppløselig polystyrenharpiks som fremstilles i perleform ved en katalytisk polymerisasjon av styren og divinylbenzen. Denne harpiks klormethyleres under anvendelse av klormethyl-methylether og stannikloridkatalysator•

Reaksjonen illustreres som følger:

Fremstilling A

1 kg 2 %-ig divinylbenzen-tverrbundet polystyrenharpiks 200 - 400 mesh ble vasket med 3x2 liter methylenklorid. Fine partikler ble fjernet ved å trekke av methylenkloridet fra bunnen hver gang. Harpiksen ble vasket med 2 liter av de følgende opp-løsningsmidler ved suspensjon, omrøring i 10 minutter og filtrering på en sintret glassnutsch: To porsjoner tetrahydrofuran, 2 porsjoner vann, 1 porsjon IN natriumhydroxyd., 2 porsjoner vann, 2 porsjoner dimethylformamid, 2 porsjoner dioxan og 3 porsjoner methanol. Denne vaskede harpiks ble tørret under vakuum ved 60° C.

500 g av denne vaskede polystyrenharpiks ble omrørt med

5 liter klormethyl-methylether ved værelsetemperatur, og derpå ble uemperaturen senket til 0 - 5°C med et. bad av is og vann. 75 g vannfritt stanniklorid i 925 ml iskold klormethyl-methylether ble tilsatt og blandingen omrørt i isbadet i 2 timer. Harpiksen ble filtrert på en sintret glassnutsch og derpå vasket med 2 liter porsjoner av de følgende oppløsningsmidler: 25 % vann i dioxan, 25 % 2N saltsyre i dioxan, vann og to ganger med methanol. Den vaskede harpiks ble tørret under vakuum ved 45 - 50° C. Ved denne metode er det vanlige kloridinnhold mellom 0,7 og 1,0 milliekvivalent pr. gram.

Fenylalaninforestring til polystyrenharpiksen

Ved foreliggende syntese bindes først fenylalanin til polystyrenharpiksen. Dette fremgår av følgende ligning:

hvor (r) er polystyrenharpiks, BA er en passende base som triethylamin, diisopropylamin, diisopropylethylamin, eller alkali-metallsalt, og P er en aminobeskyttende gruppe som fortrinnsvis er t-butyloxycarbonyl (BOC), men kan være amyloxycarbonyl (AMOC) eller o-nitrofenylsulfenyl (NPS).

Som det fremgår av den ovenstående formel bindes t-butyloxy-£-fenylalaninet til den klormethylerte harpiks i nærvær av en syreakseptor. Denne reaksjon kan illustreres som følger:

Fremstilling B

50 g klormethylert polystyrenharpiks fremstilt som beskrevet ovenfor, med et klorinnhold på 0,74 milliekvivalent (mekv) pr. gram (37 mekv klor) og 19,6 g BOC-Jl-fenylalanin (74 mekv) ble omryrt i 150 ml absolutt ethylalkohol og derpå ble 9,77 ml triethylamin (72 mekv) tilsatt og blandingen kokt under tilbakeløp og omrøring i 24 timer. Blandingen ble avkjølt, fiTtrert gjennom en sintret glassnutsch og vasket på nytt med 500 ml porsjoner av de følgende oppløsningsmidler: To ganger med 3A denaturert alkohol, to ganger med dioxan, to ganger med 3A denaturert alkohol, to ganger med vann, to ganger med methanol. Harpiksen ble tørret under vakuum ved 40 - 4 5° C. Nitrogenanalyse viste verdier varierende fra ca. 0,50 til 0,70 mekv pr. gram. Da Den BOC-beskyttende gruppe ble fjernet med trifluoreddiksyre som beskrevet nedenfor, og harpiksen ble titrert for å bestemme den tilgjengelige ende-amingruppe, viste denne prøve seg å tilsvare ca. 0,38 mekv pr. gram.

Avbeskyttelse

Dette dannede harpikspeptid betegnes som forbindelse nr. 1.

Avbeskyttelsen av fenylalaninets aminfunksjon utføres ved at den beskyttende gruppe fjernes under anvendelse av en passende syre som trifluoreddiksyre eller saltsyre. Det dannede aminsalt nøytraliseres så ved behandling med en sterk organisk base. Denne prosess illustreres som følger:

Fremstilling C

En 25 g prøve av BOC-fenylalaninharpiks^n fremstilt i henhold til Fremstilling B, ble anbragt i reaksjonskaret av et peptid-synteseapparat. Prøven ble vasket med 2 x 125 ml porsjoner methylenklorid i 2 minutter hver. 125 ml 50% trifluoreddiksyre i methylenklorid ble tilsatt og blandingen omsatt i 30 minutter. Etter filtrering ble harpiksen vasket med 3 x 125 ml methylenklorid, to porsjoner methanol og tre porsjoner kloroform, hver av 2 minutters varighet. Nøytralisasjonen ble utført ved en 5 minutters omsetning med 125 ml 10%-ig oppløsning av triethylamin og kloroform. Harpiksen ble så vasket tre ganger med 125 ml k]:ro-form og tre ganger med 125 ml methylenklorid.

Tilkobling av glutamsyre

I ovenstående formel er CA et koblingsmiddel som fortrinnsvis er dicyclohexylcarbodiimid (DCC), men kan være et hvilket som helst koblingsmiddel som danner peptidbindinger, som diimider, azider og aktive estere. Betegnelsen Bz er benzyl, p-methoxybenzyl, p-klorbenzyl, p-nitrobenzyl

eller benzhydryl. Symbolene (r), BA, P, CA og Bz har de ovenfor angitte betydninger.

Da formelen som angitt ovenfor begynner å bli tungvin, kan formelen for reaksjonsproduktet skrives på følgende måte:

hvor Phe betegner fenylalaninresten, Glu betegner glutamsyreresten og P og Bz er som tidligere angitt. Denne forenklede nomenklatur vil bli anvendt ved beskrivelsen av de etterfølgende reaksjoner.

Ved utførelse av reaksjonen kan P, Bz og glutamsyre være forenet som i BOC-£.-Y-benzylglutamat og dette tilsettes til den av~ beskyttede fenylalaninharpiks og koblingen fremmes ved tilsetning av DCC. Denne kobling følges så av avbeskyttelse som forklart i forbindelse med fenylalaninharpikspeptidet. Det dannede produkt har, etter avbeskyttelse, formelen:

Det antas at dette harpikspeptid ble fremstilt første gang ved foreliggende syntese, og at dette er et yiktig ledd i syntesen av hormonet, ACTH.

Videre menes det å være viktig at koblingsreaksjonen er fullstendig, og det menes at ninhydrinprøven beskrevet av E. Kaiser, R. Colescott, C, Bossinger og P. Cook, oppfinnerne i denne sak, i Anal. Biochem. 34_, 595 - 598 (1970) er anvendbar til å bestemme når koblingsreaksjonen er tilstrekkelig fullstendig. Hvis ninhyd-rinprøven er negativ, kan man foreta avbeskyttelsen av harpikspeptidet og fortsette til den følgende koblingsreaksjon. Hvis denne prøve er positiv, kan man gjenta koblingstrinnet inntil ninhydrinprøven tilslutt er negativ.

Nedenfor illustreres tilkoblingen av glutamsyre.

Fremstilling Dl

Til den avbeskyttede fenylalaninharpiks med 10,7. mekv amingrupper ble tilsatt en oppløsning av 15 mmol (ca. 50 % overskudd) BOC-Å-Y-benzylglutamat i 100 ml methylenklorid. Etter 2 minutter ble en oppløsning av 15 mekv dicyclohexylcarbodiimid (DCC) tilsatt og blandingen ble omrørt i 45 minutter. Produktet ble fra-filtrert og vasket med 2 x 125 ml kloroform og 2 x 125 ml methylenklorid. Ninhydrinprøven ble utført på en 3 - 5 mg prøve av harpikspeptid-reaksjonsproduktet og viste seg å være negativ. Denne harpiks ble så avbeskyttet som beskrevet for Fremstilling C.

Fremstilling D2

2 g fenylalaninharpiks ble avbeskyttet og nøytralisert som tidligere beskrevet. 3 mmol NPS-Ji-y-benzylglutamat oppløst i 25 ml methylenklorid ble tilsatt,fulgt av 3 mmol dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen ble omrørt i 1 time, filtrert og vasket med to porsjoner methylenklorid, to porsjoner methanol og ere porsjoner methylenklorid.

Den følgende tabell 1 angir i rekkefølge aminosyrene som tilkobles reaksjonene 2 til 38, med angivelse av stillingen i kjeden i hvilken tilbindingen skjer, og med angivelse av den benyttede reaktant og den foretrukne beskyttende gruppe.

På samme måte som beskrevet i forbindel£3 med tilkoblingen av glutamsyre i reaksjon 2, omfatter hver påfølgende reaksjon for tilkobling av nok en aminosyregruppe den samme prosess, hvor det allerede fremstilte harpikspeptid tilkobles en annen aminosyregruppe under beskyttende betingelser, og det koblede peptid deretter avbeskyttes og nøytraliseres. Mer spesifikt kan de etterfølgende trinn ut-føres som følger:

Kobling:

15 mmol av den passende BOC-aminosyre (0,43 ekvivalent

overskudd i 100 ml methylenklorid)

15 mmol dicyclohexylcarbodiimid (koblingsmiddel) i 15 ml

methylenklorid - 4 0 minutters reaksjonstid

2 x 125 ml kloroformvaskevæske - 2 minutter hver gang

2 x 125 ml - methylenklorid - 2 minutter hver gang Avbeskyttelse: 2 x 125 ml - methylenkloridvaskevæske - 2 minutter hver gang

50% trifluoreddiksyre i methylenklorid - 5 minutter,

125 ml

50% trifluoreddiksyre - methylenklorid - 25 minutter,

125 ml

3 x 125 ml - methylenkloridvaskevæske - 2 minutter hver

gang

2 x 125 ml - methanolvaskevæske - 2 minutter hver gang

3 x 125 ml - kloroformvaskevæske - 2 minutter hver gang Nøytralisasjon: 2 x 125 ml - 10% triethylamin i kloroform - 5 minutter

hver gang

4 x 125 ml - kloroformvaskevæske - 2 minutter hver gang Metoden for å utføre koblings-, avbeskyttelses- og nøy-tralisasjonstrinnene i hver av reaksjonene 3 til 38, er den samme som den som er beskrevet i forbindelse med reaksjon nr. 2, med de unntak som er angitt i den følgende beskrivelse.

Forbindelse nr. 2, som er resultatet av reaksjon nr. 2 (etter avbeskyttelse og nøytralisasjon), er som tidligere anført:

Dette syntesemønster fortsettes til og med reaksjon

nr. 38.

I reaksjoner nr. 17 og 38, i stillinger nr. 23 henholds-vis nr. 2, hvor tyrosin tilkobles, foretrekkes det ikke å anvende noen beskyttelse av det fenoliske hydroxyl av tyrosinet, men der kan anvendes en benzylgruppe som beskytter. Symbolet Y er anvendt for å betegne ingen beskyttelse eller benzyl.

Eksempelvis har forbindelse nr. 17, som dannes som følge av reaksjon nr. 17, følgende strukturformel:

I reaksjon nr. 19, stilling nr. 21, hvor lysin tilkobles, foretrekkes det å anvende som epsilon-aminbeskyttelsesmiddel 2-klorcarbobenzyloxy (Cl-CBZ), men man kan også anvende carbobenzyloxy (CBZ), 2-bromcarbobenzyloxy, 2,4-diklorcarbobenzyloxy eller trifluoracetyl (TFA).

Symbolet V anvendes for å betegne at epsilon-beskyttel-sesmidlet er én av disse nevnte grupper. Dette V-beskyttelsesmiddel anvendes også for tilkoblingen av lysin i hver av reaksjonene nr. 24, 25 og 29 i stillingene nr. 16, 15 og 11. Således kan strukturformelen for forbindelse nr. 19 dannet som følge av reaksjon nr. 19, angis som følger:

For koblingen av arginin-aminosyren i reaksjon nr. 22 i stilling 18 foretrekkes det å anvende som guanidino-beskyttelsesmiddel en tosylgruppe (p-toluensulfonyl), men også en nitrogruppe kan anvendes, og i formlene anvendes symbolet T for å betegne tosyl eller nitro. T-beskyttelsesgruppen anvendes også ved tilkobling av arginin i reaksjon 23 i stilling 17, og i reaksjon 32 i stilling 8.

For å vise dette angis strukturformelen av forbindelse nr. 22 fremstilt ved reaksjon nr. 22, som følger:

For koblingen av histidinet i reaksjon nr. 34 i stilling 6, foretrekkes det å anvende som imidazol-beskyttelsesmiddel, carbobenzyloxygruppen (CBZ), men en tosyl-, dinitrofenyl- eller benzylgruppe kan likeledes anvendes, eller den beskyttende gruppe kan sløyfes. Symbolet W er anvendt for å betegne ingen beskyttende gruppe eller en av de ovennevnte grupper.

Symbolene T, Y, V og W har overalt i beskrivelsen og

kravene de ovenfor angitte betydninger.

Etter hver koblingsreaksjon, og før avbeskyttelse av harpikspeptidet, foretrekkes det å anvende ninhydrinprøven, og det viste seg at prøven ikke alltid er negativ,hvilket krevet en gjen-tagelse av den sist .utførte koblingsreaksjon.

Etter utførelsen av de i Tabell I angitte reaksjoner til og med reaksjon nr. 38 ender man opp med forbindelse nr. 38:

hvor symbolene har de ovenfor angitte betydninger.

Denne forbindelse anvendes så som utgangsmateriale ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilkobles serin til forbindelse nr. 38 i stilling nr. 1. Tilkoblingstrinnet utføres på samme måte som de ovenfor beskrevne forutgående koblingstrinn. Derved fåes forbindelse nr. 39, med følgende formel:

Det som sluttprodukt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen erholdte harpikspeptid, forbindelse nr. 39, er anvendelig for fremstilling av biclgisk aktive peptider, såsom ACTH (adrenocorticotropt hormon) med strukturen:

Når V i forbindelse nr. 39 ikke er trifluoracetyl (TFA),

kan forbindelse nr. 39 overføres direkte til det biologisk aktive peptid, forbindelse nr. 41, ved behandling med hydrcgen-fluorid. Et eksempel på en slik reaksjon ble utført som følger: 2 g av forbindelse nr. 39 ble anbragt i et Kel-F-kar med 2 ml anisol, og 10 ml vannfritt hydrogenfluorid ble tilsatt ved destillasjon. Denne blanding ble omrørt ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluoridet ble fjernet ved vakuumdestillasjon, og residuet ble vasket fire ganger med ethylacetat fulgt av ekstraksjon med iseddik. Eddiksyreekstraktet ble lyofilisert, hvorved man fikk 0,86 g av et voluminøst hvitt pulver, bestående av forbindelse nr. 41.

Når V i forbindelse nr. 39 er TFA, kan overføringen til forbindelse nr. 41 utføres på følgende måte:

Harpikspeptidforbindelsen

hvor (r), Bz, T, Y og W har de ovenfor angitte betydninger og V er trifluoracetyl, bringes i kontakt med vannfritt hydrogenfluorid, hvor gruppene (r) , -CH2, Bz, T, Y og W fjernes og det erholdes et peptid med formelen

hvor TFA betegner trifluoracetatyl

Det erholdte peptid, forbindelse nr. 40, overføres så til det biologisk aktive ACTH-hormonprodukt, forbindelse nr. 41:

ved behandling med en passende, vandig base som piperidin eller ammoniumhydroxyd, hvorved TFA-gruppene fjernes.

Et eksempel på en slik omsetning ble utført som følger: 100 g av ovennevnte harpikspeptid, forbindelse nr. 39, ble anbragt i et Kel-F-kar i stor målestokk sammen med 5 g dithioerythritol og

100 ml anisol. 350 ml vannfritt hydrogenfluorid ble tilsatt ved destillasjon og blandingen omrørt ved 0°C i 20 minutter.

Derpå ble hydrogenfluoridet fjernet ved vakuumdestillasjon. Residuet ble vasket fire ganger med 1 liters porsjoner ethylacetat fulgt av ekstraksjon med iseddik. Eddiksyreekstraktet ble lyofilisert , hvorved man fikk 47,6 g av et voluminøst hvitt pulver som er TFA-peptidet (forbindelse 40) .

47,6 g av TFA-peptidet ble omrørt i 3 timer i 5,5 liter 0,2 molart piperidin og 1,0 molart urea inneholdende 0,1% mercaptoethanol. Denne oppløsning ble så innstilt på pH 4,0 med eddiksyre og filtrert gjennom et 0,22 um milliporefilter.

Det erholdte, urene ACTH-peptid (forbindelse nr. 41), hvor harpiksen og alle beskyttende grupper var fjernet, ble absorbert på en kolonne av carboxymethylcellulose med et lagvolum på

1800 ml. Forurensningene ble eluert med 44 liter ammoniumacetatpuffer ved pH 6,7 og 4,0 mmho ACTH-toppen ble eluert med ammoniumacetatpuffer ved pH 7,5 og 4,0 mmho og lyofilisert til et hvitt pulver. Dette pulver ble oppløst i 400 ml 0,5 molar eddiksyre inneholdende 0,1% mercaptoethanol og avsaltet i en kolonne med 16 liter lagvolum av Sephadex <®>G-25 superfine. Den peptid-inneholdende fraksjon ble lyofilisert, hvorved man fikk 7,19 g av et voluminøst hvitt pulver med den riktige aminosyre-sammensetning og en ACTH-aktivitet på 82 + 7 enheter pr. mg.

De nedenstående eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

I dette eksempel beskrives syntesen utført i middels stor skala.

Syntese av utgangsmaterialet (forbindelse nr. 38)

25 g BOC-fenylalanin-harpiks fremstilt ved reaksjon nr. 1, beskrevet ovenfor, ble anbragt i reaksjonskaret av et peptid-synteseapparat markedsført av Schwarz-Mann, Inc., Orangoburg, New York. Dette apparat er beregnet for automatisert syntese av peptider og gjør bruk av en båndlesende programmeringsinnretning. Den anvendte harpiks hadde en 0,397 mokv/g ekvivalens og 9,927 totale milliekvivalenter. Metoden for kobliny, avbeskyttelse

og nøytralisasjon var som følger:

Kobling:

25 mmol passende aminosyre (1,5 ekvivalent overskudd

oppløst i. 25 ml dimethylformamid, 25 ml anisol, 25 r urethan og 75 ml methylenklorid - 10 minutters omrøring 25 mmol dicyclohexylcarbodiimid i 70 ml triklorethylen -

4 5 minutters reaksjonstid under omrøring

3 x 150 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang

3 x 150 ml methanol - 2 minutter hver gang

2 x 150 ml triklorethylen - 2 minutter hver gang

Avbeskyttelse:

2 x 150 ml triklorethylen - 2. minutter hver gang

75 ml 20 % fenol i 4N HCl-dioxan + 75 ml 50 % triklor-eddiksyre i triklorethylen med 4 % mercaptoethanol i minutter

2 x 150 ml kloroform - 2 minutter hver gang

2 x 150 ml methanol - 2 minutter hver gang

3 x 150 ml kloroform - 2 minutter hver gang ■

Nøytralisasjon:

1 x 150 ml 10 % triethylamin i klofoform - 10 minutter 4 x 150 ml kloroform - 2 minutter hver gang

Aminosyrene ble koblet i den rekkefølge som er angitt i tabell I, under anvendelse av de samme kombinasjoner av aminosyre og beskyttende gruppe som angitt i tabellen.

I reaksjon 10 i stilling 30 ble harpiksen vasket tre ganger med dimethylformamid, og etter nøytralisasjonstrinnet ble 25 mmol BOC-A-flutamin-p-nitrofenylester, oppløst i 150 ml dimethylformamid inneholdende 1% eddiksyre, tilsatt og tillatt å reagere 1 16 timer. Harpiksen ble så vasket med tre porsjoner dimethylformamid, i 2 minutter hver gang, med to porsjoner methanol, i 2 minutter hver gang, og med tre porsjoner triklorethylen, i 2 minutter hver gang.

Harpiksen ble underkastet ninhydrinprøven etter hver kobling, og dette ga et positivt resultat ved reaksjon 17, men ga negativt resultat etter at denne reaksjon var gjentatt. Ved av-slutning av de 38 koblingsreaksjoner og etter endelig avbesky-telse og nøytralisasjon og tørring under vakuum var utbyttet av forbindelse nr. 38 av størrelsesordenen 39 - 40 g.

Fremstilling av sluttproduktet ( forbin delse nr. 39)

Under anvendelse av den samme prosedyre som ovenfor angitt ble forbindelse nr. 38 tilkoblet serin i stilling 1. Etter avbeskyttelse og nøytralisasjon ble det koblede harpikspeptid (forbindelse nr. 39) erholdt i et utbytte på 4 0,5 g.

Eksempel 2

1 dette eksempel beskrives syntesen utført i stor skala Fremstilling av utgangsmaterialet (forbindelse nr. 38)

116,5 g BOC-fenylalaninharpiks ble anbragt i en spesial-bygget reaktor for Schwarz-Mann peptidsynteser. Denne harpiks hadde en titer på 0,57 mekv/g eller 66,4 mekv totalt. I denne syntese var koblings-, avbeskyttelse- og nøytraliseringstrinnene som følger:

Kobling:

133 mmol av den passende BOC-aminosyre (1 ekvivalent overskudd) oppløst i 600 ml methylenklorid - 10 minutters omrøring

133 mmol dicyclohexylcarbiimid i 133 ml methylenklorid - 45 minutters reaksjonstid

2 x 750 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang

2 x 750 ml methanol - 2 minutter hver gang

3 x 75 0 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang Avbeskyttelse:

2 x 750 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang

50-50 blanding av trifluoreddiksyre og methylenklorid -

30 min, 750 ml

3 x 75 0 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang

3 x 750 ml methanol - 2 minutter hver gang Nøytralisasjon:

2 x 750 ml 10% triethylamin i kloroform - 5 minuLter

hver gang

2 x 75 0 ml kloroform- 2 minutter hver gang

2 x 750 ml methylenklorid - 2 minutter hver gang Rekkefølgen av aminosyrene, kombinasjonene av amino-grupper og beskyttende grupper og metodene som ble anvendt, var de samme som i eksempel 1.

Ninhydrinprøven ble anvendt vod hver koblingsreaksjon

og viste seg å være positiv ved hver av reaksjonene nr. 2, 22 og 23, men i alle tilfeller viste prøven negativt resultat ette gjen-tagelse av koblingstrinnet.

I reaksjon nr. 10 i stilling 20, ble det i koblinga, anvendt aktiv p-nitrofenyl-ester som i eksempel 1.

Harpikspeptidet (forbindelse nr. 38) som ble erholdt etter den siste, eller 38te, kobling, ble etter avbeskyttelse, nøytralisasjon og tørring i vakuum anvendt som utgangsmateria i det neste trinn.

Fremstilling av sluttproduktet (forbindelse, nr.- 39)

Under anvendelse av den samme prosedyre som ovenfor ble den erholdte forbindelse nr. 38 tilkoblet serin i stilling 1. Etter avbeskyttelse og nøytralisasjon i vakuum ble det koblede harpikspeptid (forbindelse nr. 39) erholdt i et utbytte på

316 g.

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et harpikspeptid av strukturen

nvor Bz er benzyl, p-methoxybenzyl, p-klorbenzyl, p-nitrobenzyl eller benzylhydrid,(r) er divinylbenzen^tverrbundet polystyrenharpiks, Y er Bz eller hydrogen, V er 2-klorcarbo-benzyloxy, carbobenzyloxy, 2-bromcarbobenzyloxy, 2,4-diklorcarbobenzyloxy eller trifluoracetyl, T er tosyl eller nitro, og W er carbobenzyloxy, tosyl, dinitrofenyl, en gruppe Bz eller hydrogen/

karakterisert ved at P-Bz-l-serin, hvor P er tert.-butyloxycarbonyl, amyloxycarbonyl eller o-nitrofenylsulfenyl, eller en aktiv ester eller et azid av dette serin, kobles til et harpikspeptid av strukturen

hvor Bz,^r), Y, V, T og W har de ovenfor angitte betydninger, idet koblingen utføres i nærvær at et diimid, med mindre det benyttes en aktiv ester eller et azid av reaktanten P-Bz-1-serin. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

karakterisert ved at det anvendes et harpikspeptid hvor B er trifluoracetyl.