JPH10503216A - Ｎα−２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニル−アミノ酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｒ₁が水素原子を表わし、Ｒ₂が水素、メチル、イソプロピル、１−メチルプロピル，２−メチルプロピル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−ｔｅｒｔ−ブトキシエチル、２−メチルチオエチル、ベンジル、カルボキシアミドメチル、２−カルボキシアミドエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボアミド）ブチル、４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジル、インドリル−３−メチル、Ｓ−（トリフェニルメチル）チオメチル、１−（トリフェニルメチル）イミダゾリル−４−メチル、３−（Ｎ^G−メシチレンスルフォニル）グアニジノプロピル、Ｎ−キサンチルカルボキシアミドメチル、２−（Ｎ−キサンチルカルボキシアミド）エチルまたはＳ−（アセトアミドメチル）チオメチルを表わし、あるいはＲ₁とＲ₂が一緒にプロピレン基を表わす一般式（Ｉ）に対応する被保護アミノ酸誘導体。また前記誘導体の製法が提供され、また前記誘導体を使用する固相ペプチド合成法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎα−２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニル−アミノ酸発明の分野 本発明の分野は固相ペプチド合成用の被保護アミノ酸誘導体、すなわち、下記 の一般式を有し、固相ペプチド合成用のＮα保護アミノ酸誘導体として使用され るＮα−２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニル−アミノ 酸に関するものである。 ここに、Ｒ₁は水素原子を表わし、Ｒ₂は水素、メチル、イソプロピル、１−メチ ルプロピル，２−メチルプロピル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−ｔｅｒｔ− ブトキシエチル、２−メチルチオエチル、ベンジル、カルボキシアミドメチル、 ２−カルボキシアミドエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル、２−（ｔ ｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボアミド ）ブチル、４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジル、インドリル−３−メチル、Ｓ−（ トリフェニルメチル）チオメチル、１−（トリフェニルメチル）イミダゾリル− ４−メチル、３−（Ｎ^G−メシチレンスルフォニル）グアニジノプロピル、Ｎ− キサンチルカルボキシアミドメチル、２−（Ｎ−キサンチルカルボキシアミド） エチルまたはＳ−（アセトアミドメチル）チオメチルを表わす事ができ、あるい はＲ₁とＲ₂が一緒にプロピレン基を表わすものとする。 固相ペプチド合成は、医学および生物学的研究においてまた薬学、獣医学およ び診断において活性物質として使用される生物学的活性ペプチドの製造のために 広く使用されている。 固相ペプチド合成の本質は、不溶性キャリヤに結合された第１Ｃ−末端アミノ から始まる反復化学反応サイクルによるペプチド分子鎖の段階的伸張と概括する 事ができる。合成工程中に、すべての反応の目標生成物はキャリヤに結合された ままであるが、余分の反応物と副生物がキャリヤの濾過および洗浄によって除去 される。 ペプチドの固相合成を実行するため、被保護α−アミノ基を有する第１アミノ 酸（目標アミノ酸配列のＣ−末端）が遊離α−カルボキシ基を介してエステル結 合またはアミド結合形成により不溶性ポリマーキャリヤに対して共有結合される 。次に、Ｎα保護基がこのようにして得られたＮα保護アミノアシル−ポリマー から選択的に開裂され、遊離α−アミノ基を有するアミノアシル−ポリマーが形 成される。このポリマーがさらに次のＮα被保護アミノ酸によってアシル化され 、このようにしてＮα被保護ジペプチドポリマーを生じる。Ｎα保護基の開裂と 次のＮα被保護アミノ酸による遊離アミノ基のアシル化とから成るこのような合 成サイクルが、目標アミノ酸配列組立体の完成まで繰り返される。 実際の固相合成に際して完全転化を生じるため、一般に大モル余剰量（２〜１ ０倍）のアシル化試薬が使用されるので、アミノ酸の側鎖中に存在するアミノ基 、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、グアニジノ基などのすべての 反応基が適当な保護基によってブロックされなければならない。この目的の保護 基は、ペプチジル−ポリマーアシル化反応条件においてまた一時的Ｎα保護基の 開裂に際して側鎖を確実に永久的に保護するため慎重に選択されなければならな い。他方これらの側鎖保護基は、１段階または２段階において定量的にまた合成 ペプチドの構造を破壊する事なく、この合成ペプチドを保護解除する機会を与え なけ ればならない。多くの場合、ペプチジル−ポリマー結合も同時的に開裂されなけ ればならない。アミノ酸の側鎖の永久的保護基の構造および化学特性は、保護さ れる反応性官能基の性質によって決定されるのみならず、使用される一時的Ｎα 保護基の構造および化学的特性によって大きく決定される事は明かである。従っ て、一時的Ｎα保護は固相ペプチド合成の全ストラテジーのキーエレメントであ る。 固相ペプチド合成に際しては、その目的からＲ．Ｂ．メリフィールドによって Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６４、Ｖ．３，ｐ．１３８５に記載されたＮα −ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル アミノ酸（Ｂｏｃ−アミノ酸）が公知であり 、広く使用されている。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基は、中強度 の酸性試薬、例えばトリフルオロ酢酸およびその塩素化炭化水素中の溶液、有機 溶媒中の塩化水素溶液、三フッ化ホウ素／ジエチルエーテル錯体およびその他の 二、三の酸の作用によって、イソブチレンおよび二酸化炭素の生成を伴なって開 裂する事ができる。 一時的Ｎα−Ｂｏｃ−保護と共に、側鎖の永久的ブロッキングのため、Ｎα− Ｂｏｃ開裂に際して安定であるが、より強力な酸性試薬によって開裂され、同時 にペプチジル−ポリマー結合の分裂を生じる保護基が使用される。この目的に使 用される公知の試薬は液状フッ化水素、トリフルオロメタンスルフォン酸および そのアニゾール、チオアニゾール、ジメチルスルフィドとの混合物である。一時 的Ｎα−Ｂｏｃ−保護を使用する合成ストラテジーの主な欠点は、一時的および 永久的保護基の開裂のために酸性分解を使用するにあり、これは完全に安定な永 久的保護を与える事ができない。合成ペプチドの分子鎖の長さが増大するに従っ て、永久的保護基がＢｏｃ開裂段階中に酸性試薬の累積作用を受け、その結果、 これらの保護基の部分的損失と副生物の累積を生じる。これとは別に、組立てら れたペプチジル−ポリマーの過酸性試薬による最終処理は目標ペプチドの部分的 破壊を生じる可能性がある。過酸の非常に危険な性質の故に操作中に特殊な装置 および適当な安全手段を備える必要がある事にも注意しよう。 最終ペプチドの保護解除のための過酸性試薬の使用を避けるため、最近、一時 的Ｎα保護基として二、三の高度に酸感性の基が提案され、これらの基は、中庸 強度の酸性試薬によって開裂可能のいわゆるｔｅｒｔ−ブチル型の永久的側鎖保 護基と相容性であるとみなされる。このようなＮα保護基の例は、１−（３，５ −ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−１−メチル−エトキシカルボニル（ｔ−Ｂ ｕｍｅｏｃ）基である。これは、Collect．Czech．Chem．Commun.,1992，V.57,P .1707に記載されている。Ｎα−ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ−基はジクロロメタン中の１ ％トリフルオロ酢酸によって開裂され、トリフルオロ酢酸そのものまたはその濃 縮溶液によって開裂可能のｔ−ブチル型永久的保護基と共に使用する事ができる 。この場合、過酸の使用は避けられるが、示差酸性分解の基本原理は不変である 。 固相ペプチド合成のストラテジーに関する他のアプローチがＲ．Ｂ．メリフィ ールドによってＳｃｉｅｎｃｅ、１９８６、Ｖ．２３２，ｐ．３４１に概説され ている。「直交原理」と呼ばれるこのアプローチは、一時的および永久的保護基 が完全に別個の化学メカニズムにより完全に別個の試薬によって除去可能であっ て、一時的Ｎα保護基が絶対的選択性をもって開裂されて永久的保護基を完全に 保存し、またはその逆とする事ができるという仮説に基づいている。現在この「 直交原理」は、固相ペプチド合成の効率的ストラテジーの開発のガイドラインと して一般に受け入れられている。 「直交原理」の実施例として、固相合成におけるＮα−ジチアスクシニルアミ ノ酸（Ｄｔｓ−アミノ酸）の使用例がInst．J．Peptide and Protein Res.,1987 , V.30 p.740 に記載されている。Ｎα−ジチアスクシニル（Ｄｔｓ）保護基は 中庸強度の酸性媒質に対してきわめて抵抗性であって、中性媒質中においてチオ ール試薬によって順調に開裂され、アミノ基を解放し、チオ酸化炭素を形成する 。 実際の合成におけるＤｔｓ−アミノ酸の利用はその有効な製造法が存在しないの で、なお制限されている。 「直交原理」に対応する固相合成の最もよく知られまた広く使用されているス トラテジーはＣ．Ｄ．チャングおよびＪ．マイエンホーファによってInt．J．Pe ptide and Protein Res.，1975，V.11，P.246 に記載されたＮα−９−フルオレ ニルメトキシカルボニルアミノ酸（Ｆｍｏｃ−アミノ酸）の使用に基づいている 。Ｎα−９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基は酸性試薬に対し て抵抗性であり、β−除去メカニズムによって、非プロトン性溶媒中の有機塩基 によって、例えばジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）またはジクロロメタンの中 でモルフォリン ジエチルアミン、ピペラジンまたはピペリジンによって開裂さ れ、アミノ基が解放されジベンゾフルベンがＣＯ₂と共に形成される。固相合成 に際して、Ｆｍｏｃ基の開裂は好ましくはＮα被保護ペプチジル−ポリマーをＤ ＭＦの中で１０乃至３０分間、２０乃至５０％ピペリジンによって処理する事に よって実行される。前記の条件はｔ−ブチル型の永久的酸感性保護基を一時的Ｎ α−Ｆｍｏｃ−保護基と共に使用する事を可能とし、このようにして合成ストラ テジーの「直交性」を生じる事ができる。 Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸は手動式固相ペプチド合成においても、あらゆる型 の自動的または半自動的合成装置においても広く使用されている。しかしＮα− Ｆｍｏｃ−アミノ酸の極度の塩基感性と中性非プロトン性溶媒中のある程度の不 安定性の故に、アシル化条件と使用される溶媒の純度を慎重に制御する必要のあ る事を注意しよう。分子鎖において３０残基を超えるペプチドの合成のためにＮ α−Ｆｍｏｃ−アミノ酸を使用する場合には特に注意が必要である。さらに比較 的製造コストが高いので、Ｆｍｏｃ誘導体を大規模ペプチド製造に使用する事が できない。 発明の概要 従って、固相ペプチド合成の効率的なストラテジーを開発するために有用な新 規なＮα被保護アミノ酸誘導体を開発する事が望ましい。本発明の目的は新規な アミノ酸誘導体、特に下記の一般式を有し、 ここに、Ｒ₁は水素原子を表わし、Ｒ₂は水素、メチル、イソプロピル、１−メチ ルプロピル，２−メチルプロピル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−ｔｅｒｔ− ブトキシエチル、２−メチルチオエチル、ベンジル、カルボキシアミドメチル、 ２−カルボキシアミドエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル、２−（ｔ ｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボアミド ）ブチル、４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジル、インドリル−３−メチル、Ｓ−（ トリフェニルメチル）チオメチル、１−（トリフェニルメチル）イミダゾリル− ４−メチル、３−（Ｎ^G−メシチレンスルフォニル）グアニジノプロピル、Ｎ− キサンチルカルボキシアミドメチル、２−（Ｎ−キサンチルカルボキシアミド） エチルまたはＳ−（アセトアミドメチル）チオメチルを表わし、あるいはＲ₁と Ｒ₂は一緒にプロピレン基を表わし、 固相ペプチド合成用のＮα保護アミノ酸誘導体として使用する事のできるＮα −２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニル−アミノ酸（Ｎ α−Ｎｓｃ−アミノ酸）を提供するにある。 本発明の他の目的はＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸の製造法を提供するにある。 本発明のさらに他の目的は、Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸を使用する固相ペプチド 合成法を提供するにある。本発明のこれらの目的およびその他の目的は下記の説 明から明かとなろう。 発明の詳細な説明 本発明のＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸（Ｉ）は一般式（ＩＩ）のアミノ酸（ここに Ｒ１とＲ２は式Ｉについて与えられた意味を有する）を、２−（ニトロフェニル スルフォニル）クロロフォルメート（ＩＩＩ）と共に、水性／有機溶媒混合物の 中で、塩基の存在において、０乃至４０℃、好ましくは０乃至２０℃の温度で処 理する事によって製造される（スキーム１）。 クロロフォルメートＩＩＩはアミノ酸に対して０．５乃至１．５、好ましくは ０．７乃至０．９モル当量を反応中に導入される。溶媒の有機成分としては、ア シル化試薬を溶解する事ができ水と混和性の任意の非プロトン性有機溶媒、例え ばアセトニトリル、ＤＭＦ、テトラヒドロフランまたはジオキサンを使用する事 ができる。塩基は有機または無機塩基、例えば炭酸ナトリウムまたはカリウム、 酸化マグネシウムまたはカルシウム、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルフォリ ンとする事ができる。 本発明の他の方法によれば、まず一般式ＩＩのアミノ酸を業界公知の方法によ ってＮ，Ｏ−ビス−トリメチルシリル誘導体ＩＶに転化し、次に無水有機溶媒中 において、例えばジクロロメタンの中でクロロフォルメートＩＩＩによって処理 する。中間トリメチルシリル誘導体の水性加水分解後に、所望のＮα−Ｎｓｃ− アミノ酸Ｉが遊離形で得られる（スキーム２）。 Ｒ₁が水素、Ｒ₂がＮ−キサンチルカルボキシアミドメチルまたは２−（Ｎ−キ サンチルカルボキシアミド）エチルである式Ｉの誘導体は、Ｒ１が水素、Ｒ２が カルボキシアミドメチルまたは２−（カルボキシアミド）エチルである式Ｉの誘 導体を非プロトン性有機溶媒の中で、酸の存在においてキサンチドロールと反応 させる事によって製造する事ができる。溶媒としてＤＭＦを使用する事ができ、 また好ましい酸は有機酸、例えばトリフルオロ酢酸、メタンスルフォン酸、また はｐ−トルエンスルフォン酸である。 分子式から明かなように、化合物Ｉは（Ｒ₁＝Ｒ₂＝Ｈの化合物以外は）、非対 称α−炭素原子を有する。α−炭素原子は化合物Ｉの製造に使用される反応には 参加しないので、出発アミノ酸ＩＩ中に存在するこのキラール中心の形態は得ら れたＮα−Ｎｓｃ−誘導体Ｉの中に保持される。従って、本発明の方法は、出発 化合物ＩＩの構造に従って、任意のキラール形状（Ｌ型またはＤ型）の、またラ セミ化合物としての、Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸Ｉの製造に使用できる事は明かで ある。 本発明による式Ｉの誘導体中のＲ₁およびＲ₂置換基の意味は、業界公知の保護 基、多くの場合にはｔｅｒｔ−ブチル型基または開裂条件に関して類似の基を含 みまたは含まない天然アミノ酸の側鎖の構造に対応する。（表１） 明らかに、前記の表１に示された式Ｉの化合物は任意のアミノ酸組成物のペプ チドの合成に必要な被保護タンパク質形成アミノ酸誘導体の完全セットを示す。 また明かに、他の型のバックボーン保護基を有するアミノ酸Ｎα−Ｎｓｃ−誘導 体および非タンパク質形成または異常アミノ酸のＮα−Ｎｓｃ−誘導体が本発明 の方法によって合成される。 Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸Ｉは、水中に不溶性または軽度溶性であって、極性有 機溶媒中に可溶、−１０℃乃至２５℃で長期間安定な結晶性化合物である。 本発明によれば、式ＩのＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸を使用して固相ペプチド合成 を実施する方法が提供される。 この方法によれば、第１Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸（目標アミノ配列のＣ−末端 ）が不溶性ポリマーキャリヤに対して遊離α−カルボキシ基を介してエステル結 合またはアミド結合の形成により共有結合され、Ｎα−Ｎｓｃ−アミノアシルポ リマーが得られる。種々のポリマーをポリマーキャリヤとして使用する事ができ る。例えば、橋かけ結合またはマクロ細孔ポリスチレン、粒状のまたはけいそう 土との複合体としての橋かけ結合されたポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド 、橋かけ結合されたデキストラン、セルロース、ペーパまたはその他業界公知の ポリマーを使用する事ができる。 第１Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸の結合のため、ポリマーキャリヤは適当なアンカ ー基を含まなければならない。多くの場合、トリフルオロ酢酸などの酸性試薬お よびその溶液または有機溶媒中の塩化水素溶液によるペプチジルポリマーの処理 に際してポリマーキャリヤから合成ペプチドを開裂してＣ−末端カルボキシル基 またはカルボキシアミド基を解放するアンカー基が好ましい。このようなエステ ル型アンカー基は４−ヒドロキシメチルフェノキシアルキル、４−クロロ−また は４−ブロモメチルフェノキシアルキル、α−ヒドロキシジフェニルメチルおよ びその他の業界公知の基であり得る。カルボキシアミド型結合の場合、ジ−およ びトリアルコキシベンズヒドリルアニム基、４−アミノメチル−３，５−ジメト キシフェノキシアルキル基およびこの目的に使用されるその他公知の基であり得 る。 ポリマーキャリヤのアンカー基に対するＣ−末端Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸の結 合は業界公知の方法によって実施される。 得られたＮα−Ｎｓｃ−アミノアシルポリマーからＮα−保護基を開裂するた め、前記の保護されたアミノアシルポリマーを塩基性試薬によって処理する。好 ましい塩基性試薬は窒素塩基、例えばアンモニア、モルフォリン、ピペリジン、 ピペラジン、ジエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク −７−エン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジニンおよび非プロトン性有 機溶媒中のその溶液である。さらに好ましい塩基試薬はＤＭＦ中の２０乃至５０ ％ピペリジン溶液である。この場合、Ｎｓｃ基はＮ−［２−（４−ニトロフェニ ルスルフォニル）エチル］ピペリジンと二酸化炭素の形成を伴なって開裂され、 α−アミノ基が解放される。 さらに遊離アミノ基を有するアミノアシルポリマーが次のＮα−Ｎｓｃ−アミ ノ酸によってアシル化されて、Ｎα−Ｎｓｃ−ジペプチジル−ポリマーを生じる 。この目的から通常この目的に使用される方法が使用される。アシル化試剤とし て、例えばＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸の４−ニトロフェニル、ペンタクロロフェニ ル、ペンタフルオロフェニル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルおよ び固相ペプチド合成に使用されるその他業界公知の活性エステル、Ｎα−Ｎｓｃ −アミノ酸の対称無水物が使用される。またアシル化は、公知の結合試薬、例え ばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ヘキサフ ルオロリン酸ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−（トリス−ジメチルアミノ）ホ スホニウムの存在においてＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸によって実施する事ができる 。 Ｎα−Ｎｓｃ−基開裂と次のＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸による遊離アミノ基のア シル化とから成る合成サイクルが、目標アミノ酸配列組立体が完成するまで繰り 返される。 所望のＮα−Ｎｓｃ−ペプチジル−ポリマー組立体が得られた後に、Ｎα−保 護基が前記の方法によって開裂され、次に多くの場合、目標ペプチドがキャリヤ のアンカー基から分離され、同時にアミノ酸の側鎖から永久的保護基を開裂する 。そのため、ｔｅｒｔ−ブチル保護基の開裂用の業界公知の酸性試薬を使用する 事ができる。例えば発生したカルボニウムイオンを捕捉するための公知の添加剤 、例えば水、アニゾール、チオアニゾール、ジメチルスルフィド、エタンジチオ ール−１，２−トリイソプロピルシランを含有しまたは含有しないトリフルオロ 酢酸、メタンスルフォン酸またはｐ−トルエンスルフォン酸の溶液を使用する事 ができる。 オプションとして、目標ペプチドは開裂なしでポリマーキャリヤからデブロッ キングする事ができる。このような場合、耐酸性ペプチジル−ポリマー結合を生 じる事のできる公知のアンカー基を使用しなければならない。 Ｆｍｏｃと比較して、Ｎｓｃ基は塩基性試薬に対して一層抵抗性であり、その 開裂率は同一条件ではるかに低いが、固相合成プロトコールによってＮα−保護 基の開裂に通常割当てられる時間（１５〜２０分）は、ＤＭＦ中ピペリジンの２ ０乃至５０％溶液などの塩基性試薬によって、被保護ペプチジル−ポリマーから Ｎα−Ｎｓｃ−基を定量的に開裂するのに十分である。他方、塩基性試薬に対す るＮｓｃ基の抵抗性の増大の故に、好ましくはアシル化段階の実施に使用される 中性または弱塩基性媒体の中でその安定性が著しく増大される。 前述のように、Ｎｓｃ基は、有機性塩基に対して抵抗性のｔｅｒｔ−ブチル型 保護基の存在において、塩基性試薬によって定量的に開裂される。他方、Ｎｓｃ 基は、ｔｅｒｔ−ブチル型の保護基の開裂のために通常使用される酸性試薬の作 用に対して完全に抵抗性である。従って、好ましくはｔｅｒｔ−ブチル型の保護 基または開裂条件に関してこれと同等の保護基を側鎖中に含む一般式ＩのＮα− Ｎｓｃ−アミノ酸の使用は、「直交原理」による固相ペプチド合成の新しいスト ラテジーを展開させる。 以下、本発明を図面に示す実施例について詳細に説明するが本発明はこれに限 定されない。下記の説明におけるすべてのアミノ酸は特記なき限りＬ構造を有す るものとする。 実施例 １ Ｎα−Ｎｓｃ−アスパラギン（Ｉ−１０） ３．９５ｇのアスパラギンと７．７ｇの炭酸カリウムを１００ｍｌの水−ジオ キサン混合物（３：１、ｖ／ｖ）の中に溶解し、氷浴で冷却し、次にジオキサン ７０ｍｌ中７．５ｇの２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エチル クロロ フォルメートＩＩＩの溶液を１５分間、撹拌しながら滴下した。冷却浴を除去し 、混合物をさらに２０分間撹拌し、次に減圧下に約１００ｍｌまで蒸発させ、分 離漏斗中に移した。１００ｍｌの水を加え、得られた溶液を２×５０ｍｌの酢酸 エチルによって抽出した。水性層を分離し、４０％硫酸をもってｐＨ２まで酸性 化し、氷浴の中で冷却した。３０分後に、形成された析出物を濾別し、氷水で十 分に洗浄し、空気乾燥して所望化合物Ｉ−１０を白色結晶粉末として生じた。特 性については、表２参照（実施例５）。 実施例 ２ Ｎα−Ｎｓｃ−ロイシン（Ｉ−５） ４．９２ｇのロイシンと９０ｍｌの無水ジクロロメタンとを、還流凝縮装置と 滴下漏斗とを備えた２５０ｍｌ丸底フラスコの中に入れた。懸濁液となるまで、 ９．５ｍｌのクロロトリメチルシランを強く撹拌しながら添加し、この混合物を １時間、沸騰点まで加熱した。得られた溶液を氷浴の中で冷却し、次に９．１ｍ ｌのトリエチルアミンと９．０ｇのクロロフォルメートＩＩＩとを撹拌しなが ら添加した。混合物を２０分間、氷浴の中で撹拌し、次に常温で１．５時間撹拌 した。溶媒を減圧で蒸発させ、残留物を２００ｍｌの酢酸エチルと２５０ｍｌの ２．５％水性重炭酸ナトリウムとに分配した。水相を分離し、５０ｍｌのエーテ ルで洗浄し、１Ｎ塩酸でｐＨ２まで酸性化し、次に３×７０ｍｌ酢酸エチルで抽 出した。結合された抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させた 。ヘキサン−酢酸エチルから残留物を再晶出させて、所望の生成物Ｉ−５を白色 結晶性粉末（８０％）の形で得た。その特性については表２（実施例５）参照。 実施例 ３ Ｎα−Ｎｓｃ−アスパラギン酸β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ｉ−１２） ７．０９ｇのアスパラギン酸β−ｔｅｒｔ−ブチル エステルと９０ｍｌの無 水ジクロロメタンとを、還流凝縮装置と滴下漏斗を備えた２５０ｍｌ丸底フラス コの中に配置した。この混合物に対して１２．７ｍｌのジイソプロピルエチルア ミン、次に９．５ｍｌのクロロトリメチルシランを強く撹拌しながら添加し、次 に混合物を１．５時間沸騰点まで加熱した。次に反応混合物を氷浴の中で冷却し 、９．０ｇのクロロフォルメートＩＩＩを一度に添加し、さらに常温で１．５時 間、撹拌を続けた。溶媒を減圧で蒸発させ、残留物を２００ｍｌの酢酸エチルと ２５０ｍｌの２．５％水性重炭酸ナトリウムとに分配した。水相を分離し、５０ ｍｌのエーテルで洗浄し、１Ｎ塩酸をもってｐＨ２まで酸性化し、次に３×７０ ｍｌの酢酸エチルをもって抽出した。抽出された混合物を無水硫酸ナトリウムで 乾燥し、減圧で蒸発させた。ヘキサン−酢酸エチルから残留物を再晶出させて、 所望の生成物Ｉ−１２を白色結晶性粉末（８６％）の形で得た。その特性につい ては表２（実施例５）参照。 実施例 ４ Ｎα−Ｎｓｃ−Ｎ−キサンチル−アスパラギン（Ｉ−２０） ３．８９ｇのＮα−Ｎｓｃ−アスパラギン（Ｉ−１０）と２．６ｇのキサンチ ドロールとを２０ｍｌの乾燥ＤＭＦの中に溶解した。溶液に対して、０．４ｍｌ のメタンスルフォン酸を添加し、混合物を２日間常温で放置した。得られた混合 物を１００ｍｌの氷冷却水の中に撹拌しながら注出し、得られた析出物を濾別し 、水洗し、次に酢酸エチルとエーテルで洗浄した。粗生成物を１０ｍｌの暖かい ＤＭＦの中に溶解し、濾過し、エーテルで再析出させた。析出物を濾過によって 捕集し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥して、所望の化合物Ｉ−２０を結晶性粉末 として得た（７４％）。その特性については、表２（実施例５）参照。 実施例 ５ Ｎα−Ｎｓｃ−アミン酸Ｉの特性 表２には、実施例１−４に詳細に記載の方法によって製造された式Ｉの化合物 の特性を示す。「方法」欄の数字は特定の方法の記載された実施例の番号に対応 する。特異旋光［ａ］_D ²⁵はＤＩＰ３２０ポラリメータ（ＪＡＳＣＯ、日本）上 で、１０ｃｍキュベット中で測定された。融点は開放毛管中で測定され、補正さ れなかった。クロマトグラフィー移動度Ｒｆは薄層クロマトグラフィーシートAl ufolien Kieselgel 60 F254（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）において表 示された。展開溶媒として、（Ａ）クロロフォルム／メタノール／酢酸、９５： ５：３と、（Ｂ）ベンゼン／アセトン／酢酸、１００：５０：３とを使用し、ス ポットはＵＶ−吸光度および／またはニンヒドリン反応によって検出された。分 子イオン量（Ｍ＋Ｈ）⁺は、Ｃｆ²⁵²放射線加速脱離型の飛行時間質量スペクトロ メータＭＳ−ＢＣ−１（ＥｌｅｃｔｒｏｎＳＰＡ，スミー、ウクライナ）を使用 して測定された。 実施例 ６ ドデカペプチドの固相合成 Ala-Ser-Ser-Thr-Ile-Ile-Lys-Phe-Gly-Ile-Asp-Lys. ａ）ポリマーキャリヤの中へのアンカー基の挿入 ＤＭＦ３ｍｌ中の２５０ｍｇのアミノメチル化 スチレン−１％ ジビニルベ ンゼン コポリマー（１．０ｍｅｑ．ＮＨ₂／ｇ）に対して、０．７５ｍｍｏｌ の２，４，５−トリクロロフェニル−４−ヒドロキシルメチルフェノキシプロピ オネートと０．７５ｍｍｏｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加し、懸 濁液を２４時間、常温で振とうした。ポリマーを濾別し、ＤＭＦ、エタノール、 エーテルで洗浄し、最後にヘキサンで洗浄し、２４時間、五酸化リン上で減圧乾 燥した。 ｂ）アンカー基に対するＮｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの結合 得られたポリマーを４ｍｌの１，２−ジクロロエタン／Ｎ−メチルピロリジン 混合物（３：１）中で膨潤させ、次に０．７５ｍｍｏｌのＮｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏ ｃ）−ＯＨ（Ｉ−１４）と、０．１ｍｍｏｌの４−ジメチルアミノピリジンと、 ０．７５ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。懸濁液を２４ 時間、常温で振とうした。ポリマーを濾別し、クロロフォルム、クロロフォルム ／メタノール混合物（１：１）、エタノール、エーテル、最後にヘキサンで完全 洗浄し、乾燥して、４００ｍｇのＮｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマーを得た。 ｃ）ペプチド組立体 底部にポリプロピレンフリットを備えた１０ｍｌポリプロピレン注射器の中に Ｎｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ポリマー（２００ｍｇ）を入れた。注射器中のポリ マーをＤＭＦで洗浄し、さらに下記の操作手順で合成サイクルを実施した。 １．前洗浄 ３３％ピペリジン／ＤＭＦ、 ４ｍｌ；０．５分間、 ２．デブロッキング ３３％ピペリジン／ＤＭＦ， ４ｍｌ；１５分間、 ３．洗浄 ＤＭＦ，６×（４ｍｌ；１分間） ４．アシル化 Ｎα−Ｎｓｃ−アミノ酸Ｉ,0.5mmol； ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−（トリスジメチルアミノ） ホスホニウム ヘキサフルオロ フォスフェート、０．５ｍｍｏｌ； １−ヒドロキシベンゾトリアゾール、 ０．５ｍｍｏｌ； Ｎ−メチル−モルフォリン、 ０．７５ｍｍｏｌ； ＤＭＦ，２ｍｌ； ６０分間（ＮＳＣ−Ｉｌｅ−ＯＨについては９０分間） ５．洗浄 ＤＭＦ，５×（４ｍｌ；１分間） 合成サイクル中、下記の順序でＮα−Ｎｓｃ−アミノ酸を導入した：Nsc-Asp( OtBu)-OH，Nsc-Ile-OH，Nsc-Gly-OH，Nsc-Phe-OH，Nsc-Lys(Boc)-OH，Nsc-Ile-O H，Nsc-Ile-OH，Nsc-Thr(tBu)-OH，Nsc-Ser(tBu)-OH，Nsc-Ser(tBu)-OH，Nsc-Al a-OH. 目標アミノ酸配列の配列後に、ペプチジル−ポリマーを３３％ピペリジン／Ｄ ＭＦ（４ｍｌ）で２０分間処理し、次にＤＭＦ，ジクロロメタン、エタノール、 エーテル、最後にヘキサンで洗浄した。 ｄ）デブロッキングと精製 ペプチジルポリマーを５ｍｌの５０％トリフルオロ酢酸をもって、１，２−ジ クロロエタン中で、６０分間、常温で処理した。ポリマーを濾別し、１，２−ジ クロロエタン中５０％トリフルオロ酢酸５ｍｌをもって洗浄し、洗浄液を合体し て１００ｍｌの氷冷却無水エーテルによって希釈した。析出物を濾別し、エーテ ルで乾燥し、減圧乾燥し、１７０ｍｇの粗ドデカペプチド（分析逆相高性能液体 クロマトグラフィーによる純度７０％）を得た。 この粗ドデカペプチドを３ｍｌの１Ｍ水性酢酸中に溶解し、ＴＳＫ ＨＷ−４ ０Ｆ（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）を封入された１．５×７０ｃｍカラ ム上でクロマトグラフィー分析し、平衡させ、同一緩衝剤で溶離した。純粋ペプ チドを含有するフラクションをプールし、親液化した。目標ドデカペプチドの最 後の収率は１０４ｍｇ（４１％）であり、純度は分析逆相高性能液体クロマトグ ラフィーにより９５％以上であった。アミノ酸組成（６Ｎ ＨＣｌ 加水分解、 １１０℃、２４時間および４８時間後）は下記であった。Asp 1.02(1): Ser 1.8 4(2): Thr 0.93(2): Thr 0.93(1): Glu 0.94(1): Gly 1.03(1): Ala 1.00(1): I le 2.78(3): Lys 2.04(2)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポツニャルコフ，パベル イワノビッチ ロシア連邦ノボシビルスク、リージョン、 コルツォホ、１−47

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｒ₁が水素原子を表わし、Ｒ₂が水素、メチル、イソプロピル、１−メチ ルプロピル，２−メチルプロピル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、１−ｔｅｒｔ− ブトキシエチル、２−メチルチオエチル、ベンジル、カルボキシアミドメチル、 ２−カルボキシアミドエチル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル、２−（ｔ ｅｒｔ−ブトキシカルボニル）エチル、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボアミド ）ブチル、４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジル、インドリル−３−メチル、Ｓ−（ トリフェニルメチル）チオメチル、１−（トリフェニルメチル）イミダゾリル− ４−メチル、３−（Ｎ^G−メシチレンスルフォニル）グアニジノプロピル、Ｎ− キサンチルカルボキシアミドメチル、２−（Ｎ−キサンチルカルボキシアミド） エチルまたはＳ−（アセトアミドメチル）チオメチルを表わし、あるいはＲ₁と Ｒ₂が一緒にプロピレン基を表わす下記の一般式に対応する Ｎα−２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニル−アミノ酸 。 ２． Ｒ₁とＲ₂が請求項１による基を示す下記一般式を有するアミノ酸を、 ＨＮＲ₁−ＣＨＲ₂−ＣＯＯＨ ２−（４−ニトロフェニルスルフォニル）エトキシカルボニルクロロフォルメー トと共に、水性／有機溶媒混合物の中で、塩基の存在において反応させる段階を 含む事を特徴とする請求項１に記載の化合物の製造法。 ３． ａ）Ｒ₁とＲ₂が請求項１による基を示す下記一般式を有するアミノ酸を 、 ＨＮＲ₁−ＣＨＲ₂−ＣＯＯＨ Ｏ，Ｎ−トリメチルシリル化誘導体に変換する段階と、 ｂ）前記のＯ，Ｎ−トリメチルシリル化誘導体を２−（４−ニトロフェニ ルスルフォニル）エトキシカルボニルクロロフォルメートと、非プロトン性溶剤 中で塩基の存在において反応させ、次に加水分解する段階とを含む事を特徴とす る請求項１に記載の化合物の製法。 ４． Ｒ₁が水素原子、Ｒ₂がＮ−キサンチルカルボキシアミドメチルまたは２ −（Ｎ−キサンチルカルボキシアミド）エチルである請求項１による化合物の製 法において、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がカルボキシアミドメチルまたは２−（カル ボキシアミド）エチルである請求項１による化合物を非プロトン性有機溶媒の中 で、酸の存在においてキサンチドロールと反応させる段階を含む事を特徴とする 方法。 ５． 不溶性ポリマーキャリヤに結合された成長ペプチド鎖に対して、請求項 １による化合物から成る被保護アミノ酸モノマーを逐次添加する事によりペプチ ドを製造する方法において、 ａ）前記ポリマーキャリヤに結合されたアンカー基のアミノ官能基またはヒド ロキシル官能基に対して、前記被保護モノマーの遊離カルボキシル基を介して、 Ｃ−末端被保護モノマーを結合して、被保護アミノアシル−ポリマーを生じる段 階と、 ｂ）前記被保護アミノアシル−ポリマーを塩基性試薬処理によってデブロッキ ングして、遊離α−アミノ基を有するアミノアシル−ポリマーを生じる段階と、 ｃ）次の被保護アミノ酸モノマーを前記アミノアシル−ポリマーの遊離α−ア ミノ基に結合して被保護ペプチジル−ポリマーを生じる段階と、 ｄ）最後の被保護アミノ酸モノマーが結合されるまで段階（ｂ）と（ｃ）を繰 り返し、次いで段階（ｂ）を実施する段階とを含むペプチドの製法。 ６． 前記塩基性試薬はアンモニア、モルフォリン、ピペリジン、ピペラジン 、ジエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク−７−エン 、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンおよび非プロトン性有機溶媒中のそ の溶液から成るグループから選定される窒素塩基である事を特徴とする請求項５ に記載の方法。 ７． 前記窒素塩基はピペリジンであり、また前記有機溶剤はジメチルフォル ムアミドである事を特徴とする請求項６に記載の方法。