JP2645396B2 - オリゴペプチドならびに関連化合物の合成法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオリゴペプチド及び関連化合物の合成法に関
し、更に詳細にはスペーサーとして４−（２−ヒドロキ
シエチルスルホニル）ジヒドロシンナモイル基を導入し
たセルロースアセテート誘導体を高分子担体として用
い、そのスペーサーの末端水酸基上にペプチド鎖を構築
することを特徴とするオリゴペプチドならびに関連化合
物の合成に関するものである。

〔従来の技術及びその課題〕

ペプチド類の化学合成は液相法ならびに固相法の二法
によつて、種々の縮合剤を用いて広く行われている
（「ザ ペプチド（the Peptides）」第１巻（1966）,S
chrder及びRuhke著、Academic Press,U.S.A及び「ペ
プチド合成」泉屋ら、丸善株式会社（1975））。

なかでも、固相法は試薬や縮合剤を過剰に必要とする
が、固相担体と未反応の試薬等との分離をロ過するだけ
て簡単に行えるなどの長所を有し、迅速合成が可能とな
るところから、大量のサンプルの合成は不可能であつて
も、広く利用されてきている。しかしながら、固相法で
オリゴペプチド鎖を構築した場合、フツ化水素酸で処理
して固相担体からの脱着と保護基の除去を同時に行うこ
とが必要であるため、Ｃ−末端だけが遊離の、オリゴペ
プチド・ユニツトの導入に利用できるような誘導体を調
製することは不可能である。それに対して、液相法は試
薬や縮合剤を少過剰使用するだけで各縮合反応を行うこ
とができるが、縮合反応を行うたびにクロマトグラフ等
による精製操作を必要とするところから、大量合成が可
能であるものの長時間を要し、迅速性に欠けている。そ
のような見地から、縮合反応を液相的一系で行うことが
でき、かつ別の溶媒中、高分子担体を析出させて、分離
を固相で行えるようにしようとする試みがバイヤーら
｛E.Bayer und M.Mutter,Chem. Ber.,107,1344−1352
（1974）｝によつて報告されている。この方法は分子量
15,000程度のポリエチレングリコールの末端水酸基にペ
プチド鎖を構築することを特徴とするものであるが、担
持量が固相法と同程度で0.11mmol/gと低く、大量サンプ
ルの合成には適していない。

〔課題を解決するための手段〕

斯る実情において本発明者らは液相法と固相法両者の
長所を兼ね備えた高純度オリゴペプチド類の新規な大量
合成法に関し、鋭意研究をおこなつた結果、次の式
（Ｉ） で表わされる、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニ
ル）ジヒドロシンナモイル基をスペーサーとして有する
セルロースアセタート誘導体を担体として用い、そのス
ペーサーの末端水酸基上でペプチド鎖を構築すれば上記
目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式（Ｉ）で表わされるセルロー
スアセタート誘導体を高分子担体として用いることを特
徴とするオリゴペプチド及び関連化合物飯の合成法であ
る。

本発明において用いる式（Ｉ）の高分子担体は、セル
ロースアセテートから常法により調製されるもので、す
でに本発明者らはオリゴヌクレオチド類の合成に用いて
優れた結果を得ているものである。すなわち、高分子担
体（Ｉ）がオリゴヌクレオチド類の化学合成に広く用い
られているピリジンに易溶性であるところから、ピリジ
ン中で縮合反応を行つてそのスペーサー末端水酸基にオ
リゴヌクレオチオ鎖を構築し、難溶性を示すエタノール
中に反応液を注いで、目的のオリゴヌクレオチド鎖を担
持した高分子担体（Ｉ）を析出させて、ロ過することに
よつて未反応の試薬等から分離するという一連の操作を
行い、大量の高純度オリゴヌクレオチドが簡便に得られ
ることを明らかにしている〔K.Kamaike,S.Yamakage,Y.H
asegawa,and Y.Ishido,Nucleic Acids Res.,Symp.Ser.,
No.17,89（1986）；釜池、長谷川、石戸、糖質シンポジ
ウム講演要旨集、p.25（1987,7月，東京）;K.Kamaike,
Y.Hasegawa,and Y.Ishido,Tetrahedron Lett.,29
（６）,647−650（1988）〕。

本発明方法を実施するには、まず高分子担体（Ｉ）を
塩化メチレン、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）、あ
るいは塩化メチレン−DMF混合溶媒等の溶媒中、均一系
で縮合剤の存在下にBoc−アミノ酸、Boc−オリゴペプチ
ド−OH誘導体、あるいはＯ−グリコシル−Boc−セリン
−または−トレオニン−OH誘導体と処理する導入および
脱Boc化の反応操作を繰り返し行つて目的とするペプチ
ド鎖の構築を行う。ついで、得られた反応液を大量のエ
タノール等の中に激しく撹拌しながら注げば、官能基が
完全に保護された、目的のオルゴペプチド鎖を担持した
セルロース誘導体が析出し、これをロ過すれば、容易に
分取できる。更に、セルロース担体に担持されたオリゴ
ペプチド誘導体はフツ化テトラブチルアンモニウム・３
水和物と処理して高分子担体からＣ−末端が遊離の誘導
体として容易に取り出すことができる。

次に、ロイシン−エンケフアリン誘導体、すなわちBo
c−Tyr（OBn）−Gly−Gly−Phe−Leu−OH〔化合物
（２）〕の合成を例に本発明について、以下に具体的に
説明する。標記の高分子担体（１）を用いる２の合成
は、段階的縮合法とフラグメント縮合法の二法があるの
で、これらについて示した。

１） 段階的縮合法：塩化メチレン中、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド：（DCCI）と４−ジメチルアミノピリ
ジン（DMAP）の存在下、高分子担体（Ｉ）のスペーサー
末端水酸基にBoc−Leu−OHを縮合、導入したのち、1/5
容程度に濃縮し、30倍容のエタノール中へ激しく撹拌し
ながら注ぎ、白色の析出物をロ取、乾燥する。これを塩
化メチレンに溶解し、塩化水素飽和塩化メチレン溶液と
処理したのち、減圧濃縮、乾燥し、再びこれを塩化メチ
レン溶液とする。別に、塩化メチレン中、Boc−Phe−OH
にトリエチルアミンの存在下、塩化ジメチルホスフイノ
チオイルを作用させてBoc−Phe化に用いる混合酸無水物
Boc−Phe−OP（Ｓ）Me₂を調製しておく。これを上記の
塩化メチレン溶液に加えてBoc−Phe−Leu−高分子担体
（Ｉ）とし、同様にして減圧濃縮したのち、過剰量のエ
タノール中に注いで、白色の析出物をロ取、乾燥する。
ついで、Boc−Gly−OHについて２回、およびBoc−Tyr
（OBn）OHについて１回の導入反応を順次繰り返すこと
により、Boc−Tyr（OBn）−Gly−Gly−Phe−Leu−高分
子担体（Ｉ）〔化合物（３）〕が得られる。化合物
（３）を塩化メチレン溶液とし、これをフツ化テトラブ
チルアンモニウム・３水和物と室温で処理したのち、1/
5容程度に減圧濃縮して、約30倍容のエタノール中に激
しく撹拌しながら滴下する。析出物をロ別し、ロ液を減
圧濃縮する。残留部を酢酸エチルに溶解、乾燥、減圧濃
縮し、得られる粗生成物をHPLCで分析したところ、図１
のようなクロマトグラムが得られた。さらに、これを分
取TLCとLH−20によるゲルロ過によつて精製したころ、
図２のようなHPLクロマトグラムを与えた。こうして得
られた化合物（２）は再結晶すると鋭い融点を示し、元
素分析も予定の構造を支持する結果を与えた。

２） フラグメント縮合法：上記の方法に従つてBoc−T
yr（OBn）−Gly−Gly−OH（1.5mol.当量）をＨ−Phe−L
eu−高分子担体（Ｉ）塩酸塩とアジ化ジメチルホスフイ
ノチオイル、Me₂P（Ｓ）−N₃（1.5mol.当量）およびト
リエチルアミン（2.5mol.当量）の存在下にDMF中で縮合
させたのち、得られた化合物（３）から化合物（２）を
１）と全く同様にして取り出した。得られたサンプルは
１）で得た標品と同定した。１）に述べた段階的縮合法
と比較すると、このフラグメント縮合法による場合は化
合物（２）の収率が向上するだけでなく、その純度も改
善されるため、その精製操作も簡略化することができ
る。

〔発明の効果〕

上記１）および２）に述べた反応は規模を任意に拡大
できることは自明であり、目的とするオリゴペプチドを
大量に合成することが可能である。すなわち、オリゴペ
プチドには、アンギオツンテンシンＩ（ヒト）｛Asp−A
rg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe−His−Leu｝、ブラ
ジキニン｛Arg−Pro−Phe−His−Leu｝、ブラジキニン
｛Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Arg｝、
ブラジキニン−ポテンシエーターＢ−（マムシ）｛Pyr
−Gly−Leu−Pro−Pro−Arg−Pro−Lys−Ile−Pro−Pr
o｝、CCK−オクタペプタイド（26−33）（スルフエート
フオーム）｛Asp−Tyr（SO₃H）−Met−Gly−Trp−Met−
Asp−Phe−NH₂｝、ロイシン−エンケフアリン｛Tyr−Gl
y−Gly−Phe−Leu｝、メチオニン−エンケフアリン｛Ty
r−Gly−Gly−Phe−Met｝、ガストリンＩ（ヒト）｛Pyr
−Gly−Pro−Trp−Leu−Glu−Glu−Glu−Glu−Glu−Ala
−Tyr−Gly−Trp−Met−Asp−Phe−NH₂｝、黄体ホルモ
ン放出ホルモン〔LH−RH〕｛Pyr−His−Trp−Ser−Tyr
−Gly−Leu−Arg−Pro−Gly−NH₂｝、 サブスタンスＰ｛Arg−Pro−Lys−Pro−Gln−Gln−Ph
e−Phe−Gly−Leu−Met−NH₂｝、甲状線刺激ホルモン放
出ホルンモン〔TRH〕｛Pyr−His−Pro−NH₂ H₂O｝、あ
るいは といつた生理活性を有するものが知られている。また、
ムチン型糖タンパク質分子のなかには、セリンやトレオ
ニンの水酸基にＤ−グルコサミンやＤ−ガラクトサミン
がグリコシル基として導入されたグリコシド・ユニツト
が組み込まれて散在しており、抗原性の発現に深く関わ
つていると考えられており、そのクラスター構造の構築
にも強い関心が寄せられている。こうした高純度オリゴ
ペプチドならびに関連化合物の大量合成が本発明の高分
子担体（Ｉ）を用いることによつて可能となる。

〔実施例〕 以下、実施例について本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれによつて限定されるものではない。

実施例１ ロイシン−エンケフアリン誘導体（Boc−Tyr（OBn）−G
ly−Gly−Phe−Leu−OH:化合物（２））の合成： １） Boc−Leu−高分子担体（Ｉ）の合成 精製した塩化メチレン（50ml）に４−（２−ヒドロキ
シエチルスルホニル）ジヒドロシンナモイル基をスペー
サーとして導入したセルロースアセタート誘導体（高分
子担体（Ｉ）：スペーサー担持量は1.10mmol/g）（2.99
10g,3.29mmol）を溶解した溶液にBoc−Leu−OH（2.466
g,3mol.等量）、DCCI（2.036g,3mol.等量）、ついでDMA
P（1.2058g,3mol.等量）を加えて、室温で５時間撹拌し
た。反応混合液を減圧濃縮して約10mlとし、これをエタ
ノール（300ml）中に激しく撹拌しながら滴下した。析
出物をロ過して乾燥し、白色粉末（3.4700g,76.2％）を
得た。元素分析の実測値がN:1.27％であることから、Bo
c−Leu担持量は0.907mmol、すなわち縮合収率は82.5％
となつた。

２） Boc−Phe−Leu−高分子担体（Ｉ）の合成 Boc−Leu−高分子担体（Ｉ）（3.4700g）を精製塩化
メチレン（20ml）に溶解し、これに飽和塩化水素−塩化
メチレン溶液（100ml）を加えたのち、室温で５時間撹
拌した。得られた反応混合液を減圧濃縮し、更にポンプ
の減圧下に乾燥した。残渣に精製塩化メチレン（20ml）
を加え、ついでトリエチルアミン（362μ）を加え
て、１時間撹拌した。これとは別に、Boc−Phe−OH（1.
3157g,1.5mol.）の精製塩化メチレン（30ml）溶液に氷
冷下塩化ジメチルホスフイノチオイル（Me₂P（Ｓ）Cl:5
01.4mg）の塩化メチレン（5ml）溶液およびトリエチル
アミン（544μ）を加えたのち、１時間撹拌し、in si
tuで混合酸無水物Boc−Phe−Ｏ−Ｐ（Ｓ）Me₂を調製し
た。先の溶液に、これを加え、さらにトリエチルアミン
（544μ）を加えたのち、１時間撹拌した。反応混合
液を減圧濃縮して10mlとし、これをエタノール（3000m
l）に激しく撹拌しながら滴下した。析出物をロ取し
て、乾燥したところ、白色粉末（3.5285g）が得られ
た。

３） Boc−Gly−Phe−Leu−高分子担体（Ｉ）の合成 ２）で得られた白色粉末の全量を用いて、２）と同様
に、トリエチルアミン（362μ）で塩酸塩を中和、Boc
−Gly−OH（683.2mg），トリエチルアミン（544μ
）、およびMe₂P（Ｓ）Cl（501.4mg）を用いて混合酸
無水物を調製、ついで、これをトリエチルアミン（544
μ）を用いてＨ−Phe−Leu−高分子担体（Ｉ）に縮合
し、後処理することにより、Boc−Gly−Phe−Leu−高分
子担体（Ｉ）の白色粉末（3.5500g）を得た。

４） Boc−Gly−Gly−Phe−Leu−高分子担体（Ｉ）の
合成 ３）の場合と全く同様な操作を行い、３）で得られた
生成物の全量から、目的物の白色粉末（3.5618g）を得
た。

５） Boc−Tyr（OBn）−Gly−Gly−Phe−Leu−高分子
担体（Ｉ）〔化合物（３）〕の合成 反応操作は上記２）、３）、４）の場合と全く同様
で、トリエチルアミン（362μ）による中和、Boc−Ty
r−（OBn）−OH（1.4486g）,Me₂P（Ｓ）Cl（501.4m
g）、およびトリエチルアミン（544μ）を用いる混合
酸無水物の調製、トリエチルアミン（362μ）による
縮合反応、ついで後処理を行い、目的物の白色粉末（3.
3721g）を得た。元素分析の実測値がN:3.76％であるこ
とから、この段階の縮合収率は88.8％と算出された。

６） Boc−Tyr（OBn）−Gly−Gly−Phe−Leu−高分子
担体（Ｉ）〔化合物（３）〕からのBoc−Tyr（OBn）−G
ly−Gly−Phe−Leu−OH〔化合物（２）〕の剥離 ５）の生成物（1.6602g）を精製塩化メチレン（50m
l）に溶解し、これにフツ化テトラブチルアンモニウム
・３水和物（315mg）の精製塩化メチレン（3ml）溶液を
加え、室温で１時間撹拌した。反応混合液を減圧濃縮し
て約10mlとしたのち、これをエタノール（300ml）中に
激しく撹拌しながら滴下した。析出物をロ別したのち、
ロ液を減圧濃縮し、残部を酢酸エチル（50ml×３）で抽
出、水洗（20ml×３）した。有機層を分取し、無水硫酸
マグネシウムで乾燥したのち、乾燥剤をロ別して、減圧
濃縮した。残部を乾燥したところ、目的物の粗生成532.
9mgが得られた。そのHPLCは図１の通りであつた。これ
を分取用TLC（展開溶媒＝95:5:1クロロホルム−メタノ
ール−酢酸）、ついでLH−20を用いたゲルロ過によつて
精製し、目的物（206mg,収率31％）が得られた。この精
製標品は図２のようなHPLクロマトグラムを与えた。ま
た、再結晶（ヘキサン−エチルアセテートより）によつ
て融点148.8−149.6℃〔文献値｛H.Kinoshita,K.Inomat
a,O.Miyano,and H.Kotake,Bull,Chem.Soc.Jpn.,52,2619
（1979））：融点149−150℃（エチルアセテートよ
り）〕の結晶を与えた。

元素分析： C₄₀H₆₁N₅O₉としての 計算値:C,64.53 H,6.77 N,9.40 実測値:C,64.72 H,7.04 N,9.61 実施例２ 高分子担体（Ｉ）のスペーサー担持量を換え、スペー
サー担持量とペプチド収率の関係を調べた。

反応は、実施例１の１）〜２）と同一の反応により、
収率はBoc−Phe−Leu−高分子担体（Ｉ）の生成量から
求めた。この結果を下表に示す。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１の６）で得た粗Boc−Tyr（OBn）−Gly
−Gly−Phe−Leu−OHのHPLCを示す図面である。 図２は、精製した同化合物のHPLCを示す図面である。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の式（Ｉ） で表わされる、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニ
   ル）ジヒドロシンナモイル基をスペーサーとして有する
   セルロースアセタート誘導体を高分子担体として用いる
   ことを特徴とするオリゴペプチド及び関連化合物の合成
   法。