JPH01250395A

JPH01250395A - オリゴペプチドならびに関連化合物の合成法

Info

Publication number: JPH01250395A
Application number: JP29443588A
Authority: JP
Inventors: Ryoji Ishido; 石戸　良治; Izumi Takai; 泉高井
Original assignee: NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-11-21
Publication date: 1989-10-05
Anticipated expiration: 2012-08-25
Also published as: JP2645396B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はオリゴペプチド及び関連化合物の合成法に関し
、更に詳細にはスペーサーとして４−（２−ヒドロキシ
エチルスルホニル）ジヒドロシンナモイル基を導入シた
セルロースアセタート誘導体を高分子担体として用い、
そのスペーサーの末端水酸基上にペプチド鎖を構築する
ことを特徴とするオリゴペプチドならびに関連化合物の
合成に関するものである。

〔従来の技術及びその課題Ａ〕

ペプチド類の化学合成は液相法ならびに固相法の二法に
よって、種々の縮合剤を用いて広く行われている（［ザ
　ペプチド（ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）　Ｊ第１巻
（Ｉ９６６）　、　５ｃｈｒ６ｄｅｒ及びＲｕｈｋｅ著
、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ及
び「ペプチド合成」東屋ら、丸善株式会社（Ｉ９７５）
）。

なかでも、固相法は試薬や縮合剤を過剰に必要とするが
、固相担体と未反応の試薬等との分離を口過するだけで
簡単に行えるなどの長所を有し、迅速合成が可能となる
ところから、大量のサンプルの合成は不可能であっても
、広く利用されてきている。しかしながら、固相法でオ
リゴ−ｅｆチド鎖を構築した場合、フッ化水素酸で処理
して固相担体からの脱着と保護基の除去を同時に行うこ
とが必要であるため、Ｃ−末端だけが遊離の、オリゴペ
プチド・ユニットの導入に利用できるような誘導体を調
製することは不可能である。それに対して、液相法は試
薬や縮合剤を少過剰使用するだけで各縮合反応を行うこ
とができるが、縮合反応を行うたびにクロマトグラフ等
による精製操作を必要とするところから、大量合成が可
能であるものの長時間を要し、迅速性に欠けている。そ
のような見地から、縮合反応を液相均一系で行うことが
でき、かつ別の溶媒中、高分子担体を析出させて、分離
を同相で行えるようにしようとする試みが、６イヤーら
（Ｅ−Ｂａｙｅｒ　ｕｎｄ　Ｍ、　Ｍｕｔｔｅｒ、　Ｃ
ｈｅｍ。

Ｂｅｒ、、１０７．１３４４−１３５２（Ｉ９７４））
によって報告されている。この方法は分子量１５０００
程度の？リエチレングリコールの末端水酸基にペプチド
鎖を構築することを特徴とするものであるが、担持量が
固相法と同程度で０．１１ｍｍｏｔ／Ｐ　　と低く、大
量サンプルの合成には適していない。

〔課題１１．を解決するだめの手段〕斯る実情において本発明者らは液相法と固相法両者の長
所を兼ね備えた高純度オリゴペプチド類の新規な大量合
成法に関し、鋭意研究をおこなった結果、次の式（Ｉ）で表わされる、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル
）ジヒドロシンナモイル基をスペーサーとして有するセ
ルロースアセタートＭ導体を担体として用い、そのスペ
ーサーの末端水酸基上で一１２ｆチド鎖を構築すれば上
記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、式（Ｉ）で表わされるセルロース
アセタートル導体を高分子担体として用いることを特徴
とするオリゴペプチド及び関連化合物の合成法である。

本発明において用いる式（Ｉ）の高分子担体は、セルロ
ースアセテートから常法により調製されるもので、すで
に本発明者らがオリゴヌクレオチド類の合成に用いて優
れた結果を得ているものである。

すなわち、高分子担体（Ｉ）がオリゴヌクレオチド類の
化学合成に広く用いられているビリシンに易溶性である
ところから、ビリシン中で縮合反応を行ってそのスペー
サー末端水酸基にオリゴヌクレオチド類を構築し、離溶
性を示すエタノール中に反応液を注いで、目的のオリゴ
ヌクレオチド＠を担持した高分子担体（Ｉ）を析出させ
て、口過することによって未反応の試薬等から分離する
という一連の操作を行い、大量の高純度オリゴヌクレオ
チドが簡便に得られることを明らかにしている（　Ｋ。

Ｋａｍａｉｋｅ、　Ｓ、　Ｙａｍａｋａｇｅ、　Ｙ、　
）（ａｓｅｇａｗａ、　ａｎｄ　Ｙ。

８９（Ｉ９８６）；釜池、長谷用、５戸、糖質シン？ゾ
ウム講演要旨集、り、２５（Ｉ９８７，７月。

東京）　：　Ｋ、　Ｋａｍａｉｋｅ、　Ｙ、Ｈａｓｅｇ
ａｗａ、　ａｎｄ　Ｙ、　ｌ５ｈｉｄｏ。

（Ｉ９８８））。

本発明方法を実施するには、まず高分子担体（Ｉ）を塩
化メチレン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
、あるいは塩化メチレン−ＤＭＦ混合溶媒等の浴媒中、
均−系で縮合剤の存在下にＢｏｃ　−アミノ酸、ＢＯＣ
−オリゴペゾチドーＯＨｇ導体、あるいはＯ−グリコシ
ルーＢｏｃ−セリ／−または−トレオニンーＯＨｐ導体
と処理する導入および脱ＢｏＣ化の反応操作を繰り返し
行って目的とするペプチド鎖の構築を行う。ついで、得
られた反応液を大量のエタノール等の中に倣しく攪拌し
ながら注げば、官能基が完全に保強された、目的のオリ
ゴペプチド鎖を担持したセルロース誘導体が析出し、こ
れを口過すれば、容易に分取できる。更に、セルロース
担体に担持されたオリゴペプチド誘導体はフッ化テトラ
ブチルアンモニウム−３水和物と処理して高分子担体か
らＣ−末端が遊離のｖ１２４体として容易に取り出すこ
とができる。

次ニ、ロイシン−エンケファリン訪導体、すなわちＢｏ
ｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）　−Ｇｌｙ−Ｑｌｙ　−Ｐｈｅ　
−Ｌｅｕ−ＯＨ［化合物（２）〕の合成を例に本発明に
ついて、以下に具体的に説明する。標記の高分子担体（
Ｉ）ヲ用いる２の合成は、段階的縮合法とフラグメント
縮合法の二法があるので、これらについて示した。

キシルカルボシイミド（ＤＣＣＩ）と４−ジメチルアミ
ノビリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、高分子担体（Ｉ）の
スペーサー末端水酸基にＢｏｃ　−Ｌｅｕ　−ＯＨを縮
合、導入したのち、１１５容程度に濃縮し、３０倍容の
エタノール中へ激しく攪拌しながら注ぎ、白色の析出物
を口取、乾燥する。これを塩化メチレンに浴解し、塩化
水素飽和塩化メチレン浴液と処理したのち、減圧濃縮、
乾燥し、再びこれを塩化メチレン浴液とする。別に、塩
化メチレン中、Ｂｏｃ　−Ｐｈｅ　−ＯＨにトリエチル
アミンの存在下、塩化ジメチルホスフィノチオイルを作
用させてＢｏｃ　−Ｐｈｅ化に用いる混合酸無水物Ｂｏ
ｃ　−Ｐｈｅ　−０−Ｐ（Ｓ）Ｍｅｚを調製しておく。

これを上記の塩化メチレン溶液に加えてＢｏｃ　−Ｐｈ
ｅ　−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）とし、同様にして減圧
濃縮したのち、過剰量のエタノール中に注いで、白色の
析出物を口取、乾燥する。ついで、Ｂｏｃ　−Ｇｌｙ　
−ＯＨについて２回、およびＢｏｃ　−Ｔｙｒ（ＯＢｎ
）ＯＨについて１回の導入反応を順次繰り返すことによ
り、Ｂｏｃ　−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ
　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−高分子担体（■）〔化合物（３
）〕が得られる。化合物（３）　ｆ！：塩化メチレン溶
液とし、これをフッ化テトラブチルアンモニウム・３水
和物と室温で処理したのち、１１５容程腿に減圧濃縮し
て、約３０倍容のエタノール中に激しく攪拌しながら滴
下する。析出物を日別し、口銭を減圧濃縮する。残留部
を酢酸エチルに熔解、乾燥、減圧濃縮し、得られる粗生
成物をＨＰＬＣで分析したところ、図１のようなりロマ
トダラムが得られた。さらに、これを分取ＴＬＣとＬＨ
−２０によるダル口過によって精製したところ、図２の
よりなＨＰＬクロマトダラムを与えた。こうして得られ
た化合物（２）は再結晶すると鋭い融点を示し、元素分
析も予定の構造を支持する結果を与えた。

Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　−Ｏ
Ｈ（Ｉ，５ｍｏｔ。

当量）をＨ−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）塩酸
塩とアシ化ゾメチルホスフイノチオイル、Ｍｅｚｐ（Ｓ
）　−Ｎｓ　（Ｉ，５ｍｏｔ、当量）およびトリエチル
アミン（２，５ｍｏｔ、当量）の存在下にＤＭＦ中で縮
合させたのち、得られた化合物（３）から化合物（２）
を１）と全く同様にして取り出した。得られたサンプル
は１）で得た標品と同定した。ｌ）に述べた段階的縮合
法と比較すると、このフラグメント縮合法による場合は
化合物（２）の収率が向上するだけでなく、その純度も
改善されるため、その精製操作も簡略化することができ
る。

〔発明の効果〕上記１）および２）に述べた反応は規模を任意に拡大で
きることは自明であり、目的とするオリゴベゾチドを大
量に合成することが可能である。すなわち、オリゴペゾ
チドには、アンギオテンシンＩ（ヒ　ト　）　　　（Ａ
ｓｐ　　−Ａｒｇ−Ｍａｌ　　−Ｔｙｒ　　−１１ｅ　
　−Ｈｌｓ　　−Ｐｒ。

−Ｐｈｅ　−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ　）、ブラシキニン（Ａｒ
ｇ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−Ｓｅｒ
　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　）、プラゾキニンーー
テンシエータ−Ｂ（マムシ）（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−１１ｅ
−Ｐｒ。

−Ｐｒｏ）、ＣＣＫ−オクタペデタイド（２６−３３）
（スルフェートフオーム）　（Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　（Ｓ
Ｏ３Ｍ）　−Ｍｅｔ　−Ｇｌｙ　−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ　−
Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　−ＮＨｚ　）、ロイシン−エンケフ
ァリン（Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｌ
ｅｕ）、メチオニン−エンケファリン（Ｔｙｒ　−Ｇｌ
ｙ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｍｅｔ　）、ガストリン■
（ヒト）　（Ｐｙｒ　−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　−Ｔｒｐ　−
Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｕ　−Ｇ
ｌｕ　−Ａｌａ−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−Ｔｒｐ　−Ｍｅ
ｔ　−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　−ＮＨｚ　）、黄体ホルモン
放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）　（Ｐｙｒ−Ｈｉｓ　−Ｔ
ｒｐ−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ　−ＮＨｚ　）、０ｘｙｔｏｃｉｎ　
（Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇｉｎ　−Ａｓｎ　
−Ｃｙｓ　−Ｐｒ。

−Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　−ＮＨｚ　）　、サブスタンスＰ
　（Ａｒｇ　−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ　−
Ｇｌｎ　−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ
ｔ−ＮＨｚ）、甲伏線刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲ
Ｈ）（Ｐｙｒ　−Ｈｌｓ　−Ｐｒｏ　−ＮＨｚ　ＨｚＯ
）、あるいは（Ａｒｇ’　）　−Ｖａｓ　−５ｏｐｒｅ
ｓｓｉｎ　（Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ｇｉｎ　
−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−Ｇｌｙ　−
ＮＨｚ　）といった生理活性を有するものが知られてい
る。また、ムチン型糖タンノ９り質分子のなかには、セ
リンやトレオニンの水酸基にＤ−グルコサミンやＤ−ガ
ラクトサミンがグリコジル基として導入されたグリコシ
ド・二二ツトが組み込まれて散在しており、抗原性の発
現に深く関わっていると考えられており、そのクラスタ
ー構造の構築にも強い関心が寄せられている。

こうした高純度オリゴペプチドならびに関連化合物の大
量合成が本発明の高分子担体（Ｉ）’を用いることによ
って可能となる。

〔実施例〕

以下、実施例について本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれによって限定されるものではない。

実施例１０イシン一エンケフアリン誘４体（Ｂｏｃ　−Ｔｙｒ（
２））の合成：精製した塩化メチレン（５０ｄ）に４−（２−ヒドロキ
シエチルスルホニル）ジヒドロシンナモイル基をスペー
サーとして導入したセルロースアセタート誘導体（高分
子担体（Ｉ）ニスペーサ−担持量は１．１０ｍｍｏｔ／
９）　（２，９９１０？　、　３．２９ｍｍｏｔ）を溶
解した溶液にＢｏｃ　−Ｌｅｕ−ＯＨ（２，４６６９、
３ｍａｔ、等ｔ）、ＤＣＣｔ（２，０３６？　、　３　
ｍｏｔ、等量）、ついでＤＭＡＰ　（Ｉ，２０５８ｔ　
、　３　ｍｏｌ・等量）を加えて、室温で５時間攪拌し
た。反応混合液を減圧濃縮して約１０ｍ１とし、これを
エタノール（３００ｎ／）中に激しく攪拌しながら滴下
した。析出物を口過して乾燥し、白色粉末（３，４７０
０？　、　７６．２％）を得た。元素分析の実測値がＮ
　：　１．２７％であることがら、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ担持
ｉは０．９０７　ｍｍｏＬ、すなわち動台収率は８２．
５％となった。

２）　　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）の
合成りｏｃ　−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）（３，４７０
０？　”）ｅ精製塩化メチレン（２０ｍｌ　）に溶解し
、これに胞和塩化水素−塩化メチレン溶液（Ｉ００ｍｌ
）を加えたのち、室温で５時間ｆｔ拌した。得られた反
応混合液を減圧濃縮し、更に？／′ｆの減圧下に乾燥し
た。残渣に精製塩化メチレン（２０ｄ）？加え、ついで
トリエチルアミン（３６２μｔ）を加えて、１時間攪拌
した。これとは別に、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ　−０Ｈ（Ｉ，３
１５７？　、　１．５　ｍｏｌ、　）のａｍ塩化メチレ
ン（３０ｍ）溶液に水冷上塩化ゾメチルホスフィノチオ
イｈ　（ＭｅｚＰ（Ｓ）Ｃ２：　５０１．４　”Ｆ　）
の塩化メチレン（５ｎ／）溶液およびトリエチルアミン
（５４４μｔ）を加えたのち、１時間攪拌し、ｉｎ　５
ｉｔｕで混合酸無水物Ｂｏｃ　−Ｐｈｅ　−０−Ｐ（Ｓ
）Ｍｅ２を調製した。

先の浴液に、これを加え、さらにトリエチルアミン（５
４４μｔ）を加えたのち、１時間攪拌した。

反応混合液を減圧＃縮して１０ｍ１とし、これをエタノ
ール（３００ｍ）に激しく攪拌しながら滴下した。析出
物を口取して、乾燥したところ、白色粉末（３，５２８
５Ｆ　）が得られた。

２）で得られた白色粉末の全景を用いて、２）と同様に
、トリエチルアはン（３６２μｔ）で塩酸塩を中和、Ｂ
ｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（６８３，２”Ｆ）　、　）リエチ
ルアミ７（５４４ｐＬ）、およびＭｅｚＰ（Ｓ）Ｃ２（
５０１，４ｒｌｌ？）を用いて混合酸無水物を調製、つ
いで、これをトリエチルアミン（５４４μｔ＞Ｗ用いて
Ｈ−ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）に縮合し、後
処理することにより、ＢｏＣ−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｌ
ｅｕ−高分子担体（Ｉ）の白色粉末（３，５５００ｒ　
）’に得た。

合成３）の場合と全く同様な操作を行い、３）で得られた生
成物の全量から、目的物の白色粉末（３，５６ｔｓｆ）
を得た。

子担体（Ｉ）〔化合物（３）〕の合成反応操作は上記２）、３）、４）の場合と全く同様で、
トリエチルアミン（３６２μｔ）による中和、Ｂｏｃ−
Ｔｙｒ　−（ＯＢｎ）　−ＯＨ（Ｉ，４４８６？　）　
、　ＭｅｚＰ（Ｓ）Ｃｔ（５０１，４■）、およびトリ
エチルアミン（５４４μｔ）を用いる混合酸無水物の調
製、トリエチルアミン（３６２μｔ）ＶＣよる縮合反応
、ついで後処理を行い、目的物の白色粉末（３，３７２
１ｙ　）を得た。

元素分析の実測値がＮ：３．７６％であることから、こ
の段階の縮合収率は８８．８％と算出された。

−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　−ＯＨＣ化合物（
２）〕の剥離５）の生成物（Ｉ，６６０２９）を精製塩化メチレン（
５０ｄ）に帛解し、これにフッ化テトラブチルアンモニ
ウム・３水和物（３１５■）の精製塩化メチレン（３ｍ
ｌ　）浴液を加え、室温で１時間攪拌した。反応混合液
を減圧濃縮して約１０ｍとしたのち、これをエタノール
（３００ｍｌ　）中に激しく攪拌しながら滴下した。析
出物を口利したのち、口銭を減圧濃縮し、残部を酢酸エ
チル（５０ｒｎｔＸ３）で抽出、水洗（２０ｍ／Ｘ３）
した。有機層を分取し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し
たのち、乾燥剤を口利して、減圧濃縮した。残部を乾燥
したところ、目的物の粗生成物７ｓ　３２．９■が得ら
れた。そのＨＰＬＣは図１の通りであった。これを分取
用ＴＬＣ（展開溶媒＝９５：５：１　　クロロホルム−
メタノール−酢酸）、ついでＬＨ−２０を用いたグル口
過によって精製し、目的物（２０６η、収率３１％）が
得られた。この精！！！！標品は図２のようなＨＰＬク
ロマトダラムを与えた。また、再結晶（ヘキセ／−エチ
ルアセテートより）によって融点１４８．８−１４９．
６℃〔文献値（Ｈ。

Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ、　Ｋ、　Ｉｎｏｍａｔａ、　Ｏ，
Ｍｉｙａｎｏ、　ａｎｄ　Ｈ。

（Ｉ９７９）！融点１４９−１５０℃（エチルアセテー
トよシ）〕の結晶を与えた。

元素分析：０４０Ｈ６１Ｎ！１０９としての計算値：　Ｃ，６４，５３Ｈ，６，７７Ｎ、９．４０実
測値：　Ｃ，６４，７２Ｈ，７，０４Ｎ、９．６１実施
例２高分子担体（Ｉ）のスペーサー担持量を換え、スペーサ
ー担持量とペゾチド収率の関係を調べた。

反応は、実施例１の１）〜２）と同一の反応により、収
率はＢｏｃ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−高分子担体（Ｉ）の
生成量から求めた。この結果を下表に示す。

１．３０　　　　　　　　　　　　　　　　７０１．５
６　　　　　　　　　　　　　　　　７５１．８７　　
　　　　　　　　　　　　　　４４

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１の６）で得た粗Ｂｏｃ　−Ｔｙｒ（Ｏ
Ｂｎ）−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｏ
ＨのＨＰＬｃ　’に示す図面である。図２は、精製した同化合物のＨＰＬＣ’ｒ示す図面であ
る。以上図１　　　　　　　　　　　図２

Claims

【特許請求の範囲】１、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）で表わされる、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル
）ジヒドロシンナモイル基をスペーサーとして有するセ
ルロースアセタート誘導体を高分子担体として用いるこ
とを特徴とするオリゴペプチド及び関連化合物の合成法
。