JPH0796556B2 - 固相上で複数のペプチドを同時に合成する方法 - Google Patents
固相上で複数のペプチドを同時に合成する方法Info
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- JPH0796556B2 JPH0796556B2 JP62231217A JP23121787A JPH0796556B2 JP H0796556 B2 JPH0796556 B2 JP H0796556B2 JP 62231217 A JP62231217 A JP 62231217A JP 23121787 A JP23121787 A JP 23121787A JP H0796556 B2 JPH0796556 B2 JP H0796556B2
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Description
【発明の詳細な説明】 化学的に合成したペプチド（オリゴおよびポリペプチ
ド）は、生物学的および医学的分子研究の分野で重要な
役割を有する様になって来ている。これらは、共動作用
又は拮抗作用を有するペプチドポルモンあるいはその類
縁体として、又はたん白質構造研究におけるモデル化合
物としては、免疫親和性クロマトグラフィーや未知の遺
伝子産物の同定や病原体に対するワクチンの開発用の特
異的抗体の製造用に使用される。
ド）は、生物学的および医学的分子研究の分野で重要な
役割を有する様になって来ている。これらは、共動作用
又は拮抗作用を有するペプチドポルモンあるいはその類
縁体として、又はたん白質構造研究におけるモデル化合
物としては、免疫親和性クロマトグラフィーや未知の遺
伝子産物の同定や病原体に対するワクチンの開発用の特
異的抗体の製造用に使用される。
ペプチドやオリゴマーやポリマー（下記式においてｎが
150まで）は、アミド結合（ペプチド結合）を介してア
ミノ酸を結合することによって作ることが出来る。
150まで）は、アミド結合（ペプチド結合）を介してア
ミノ酸を結合することによって作ることが出来る。
本発明において、ペプチドとは、20個の天然Ｌ−アミノ
酸の他に、化学的に変性したＤ−アミノ酸や希アミノ酸
や非天然アミノ酸ならびに合成アミノ酸（Ｒは任意の値
で良い）をも含有する化合物をも含むものである。所定
のアミノ酸配列を有するペプチドの化学合成は、適当に
保護したアミノ酸、ジ−またはオリゴーペプチド単位等
の構成要素を順次結合することによって行なわれる。保
護基の性質およびアミド結合の化学的な生成の仕方を異
にする色々な合成法が当分野において知られている。例
えば下記の文献を参照すると良い。
酸の他に、化学的に変性したＤ−アミノ酸や希アミノ酸
や非天然アミノ酸ならびに合成アミノ酸（Ｒは任意の値
で良い）をも含有する化合物をも含むものである。所定
のアミノ酸配列を有するペプチドの化学合成は、適当に
保護したアミノ酸、ジ−またはオリゴーペプチド単位等
の構成要素を順次結合することによって行なわれる。保
護基の性質およびアミド結合の化学的な生成の仕方を異
にする色々な合成法が当分野において知られている。例
えば下記の文献を参照すると良い。
（１） R.B.Merrifield;J.Am.Chem.Soc.,85（1963）21
49。
49。
（２） E.Wuensch等;Houben−Weyl,Methoden der Orga
mischen Chemie,第４判、第15巻（E.Mueller刊）、（西
独、Thieme,Sfuttgart）,1974年。
mischen Chemie,第４判、第15巻（E.Mueller刊）、（西
独、Thieme,Sfuttgart）,1974年。
（３） G.Barany,R.B.Merrifield;The Peptides,第２
巻（E.Gross,J.Meienhofer編、Academic Press刊）（米
国New York）,1979年、第１ページ。
巻（E.Gross,J.Meienhofer編、Academic Press刊）（米
国New York）,1979年、第１ページ。
Merrifieldの開発した固相法の原理を使用すると速やか
に合成することが可能であり、これによると、オリゴマ
ーの生長連鎖は通常、その伸長しない末端において、巨
視的に固状の基質の形の固相と化学的に結合している。
次いで鎖伸長反応又は結合反応は基質の表面で行なわ
れ、その際反応生成物は基質に結合したまま残留し、そ
して反応余剰物や反応成分は洗浄により除去される。
に合成することが可能であり、これによると、オリゴマ
ーの生長連鎖は通常、その伸長しない末端において、巨
視的に固状の基質の形の固相と化学的に結合している。
次いで鎖伸長反応又は結合反応は基質の表面で行なわ
れ、その際反応生成物は基質に結合したまま残留し、そ
して反応余剰物や反応成分は洗浄により除去される。
これまでこの様な合成にたくさんの基質が使用されてお
り、そして基質と合成法とは互いに順応し合うものでな
くては成らない。（例えば、上記文献ならびに本文中記
載する他の文献を参照。）又当業者にはその適合仕様は
周知である。従って、従来ペプチドは一般に個々に少量
の粒状体上に合成されていた。（例えば、Rietschoen
等;Peptides,1974年第13回欧州ペプチド委員会（1974,P
roc.13th Europ.Peptide Symp.）第113〜116頁、（John
Wiley ＆ Sons刊）参照。）又ペプチドを個々にプラス
チックシート上に合成することも知られている。（例え
ば、西独DE−OS 1,593,880.4参照。）この様な従来法に
よると、ｍ個のアミノ酸単位の鎖長を有するｎ個のペプ
チドを作るには、一般に（ｎ×ｍ）の合成工程を行うこ
とになる。又一方、小さな袋につめた粒状体をいくつか
組合わせて複数の群としてこれらを使用することがすで
に提案されている。（Houghtem;Proc.Natl.Acad.Sci.
（米国）,82,（1985）5131参照）。
り、そして基質と合成法とは互いに順応し合うものでな
くては成らない。（例えば、上記文献ならびに本文中記
載する他の文献を参照。）又当業者にはその適合仕様は
周知である。従って、従来ペプチドは一般に個々に少量
の粒状体上に合成されていた。（例えば、Rietschoen
等;Peptides,1974年第13回欧州ペプチド委員会（1974,P
roc.13th Europ.Peptide Symp.）第113〜116頁、（John
Wiley ＆ Sons刊）参照。）又ペプチドを個々にプラス
チックシート上に合成することも知られている。（例え
ば、西独DE−OS 1,593,880.4参照。）この様な従来法に
よると、ｍ個のアミノ酸単位の鎖長を有するｎ個のペプ
チドを作るには、一般に（ｎ×ｍ）の合成工程を行うこ
とになる。又一方、小さな袋につめた粒状体をいくつか
組合わせて複数の群としてこれらを使用することがすで
に提案されている。（Houghtem;Proc.Natl.Acad.Sci.
（米国）,82,（1985）5131参照）。
本発明の目的は１種、２種又はそれ以上のシート状又は
平板状の基質を使用して成り、そして使用した液体媒質
に対して透過性を有し、かつ機械的安定性とカラム反応
器での使用に適した形状とを有する固相上において複数
のペプチドを同時に合成する方法を提供することにあ
る。
平板状の基質を使用して成り、そして使用した液体媒質
に対して透過性を有し、かつ機械的安定性とカラム反応
器での使用に適した形状とを有する固相上において複数
のペプチドを同時に合成する方法を提供することにあ
る。
この様な本発明の目的を達成するために、本発明は使用
した液体媒質に対して透過性を有する、場合により繊維
補強されたセルロース又は紙の平板物質から成る、１
種、２種又はそれ以上の基質を固相として使用し、そし
てそれ自体公知の方法により （ａ） それぞれの第１アミノ酸を、適当な方法により
機能性を付与した基質断片に、各群の出発単位として結
合させ、その際各基質群は少なくとも１つの基質断片を
有するものであり、そしてこの基質断片を各群毎に異な
る出発単位と結合させ（後記反応機構（１）参照）、そ
して （ｂ） こうして（ａ）により結合させた基質断片を合
成すべきペプチドの配列に従って相当するアミノ酸単位
と各群毎に反応させ（後記反応機構（１）参照）なお、 （ｃ） 所望の合成法に従って、工程（ｂ）の前に脱保
護工程を行うか、そして（または）該工程（ｂ）の後に
保護工程を行うことにより成る、固相上における複数ペ
プチドの同時合成法を提供するものである。
した液体媒質に対して透過性を有する、場合により繊維
補強されたセルロース又は紙の平板物質から成る、１
種、２種又はそれ以上の基質を固相として使用し、そし
てそれ自体公知の方法により （ａ） それぞれの第１アミノ酸を、適当な方法により
機能性を付与した基質断片に、各群の出発単位として結
合させ、その際各基質群は少なくとも１つの基質断片を
有するものであり、そしてこの基質断片を各群毎に異な
る出発単位と結合させ（後記反応機構（１）参照）、そ
して （ｂ） こうして（ａ）により結合させた基質断片を合
成すべきペプチドの配列に従って相当するアミノ酸単位
と各群毎に反応させ（後記反応機構（１）参照）なお、 （ｃ） 所望の合成法に従って、工程（ｂ）の前に脱保
護工程を行うか、そして（または）該工程（ｂ）の後に
保護工程を行うことにより成る、固相上における複数ペ
プチドの同時合成法を提供するものである。
セルロースおよび紙は化学的に不活性な物質ではなく、
又、これらは均質な孔分布も有していない。（例えば、
Amarnath ＆ Broom;Chem.Rev.,77,（1977）,103参
照。）従って従来技術においてプラスチック基質を化学
的に特異的にペプチド合成に選択して適用したことには
充分な理由があったのである。この様なことからみて、
セルロースと紙とがペプチド合成を阻害するものではな
くむしろこれらの利点を開発利用し得る、すなわち、そ
の入手の容易さ、その機械的安定性およびその使用した
液体媒質に対する良好な透過性等をペプチド合成に利用
し得るということは全く予期し得ない驚くべきことであ
った。
又、これらは均質な孔分布も有していない。（例えば、
Amarnath ＆ Broom;Chem.Rev.,77,（1977）,103参
照。）従って従来技術においてプラスチック基質を化学
的に特異的にペプチド合成に選択して適用したことには
充分な理由があったのである。この様なことからみて、
セルロースと紙とがペプチド合成を阻害するものではな
くむしろこれらの利点を開発利用し得る、すなわち、そ
の入手の容易さ、その機械的安定性およびその使用した
液体媒質に対する良好な透過性等をペプチド合成に利用
し得るということは全く予期し得ない驚くべきことであ
った。
本発明において使用する平板状物質とは、互いに直交す
る３空間次元の内の１つの次元が他の２次元よりも実質
的に小さい様な形状を有する物質を意味するものであ
る。この様な平板状基質は断片として使用するのに任意
の３次元形状を有してて良く、例えば、シート状又は細
長いテープ状のものであっても良い。この様な平板状シ
ート物質としては、ろ紙又はガラス繊維で補強したろ紙
を例として挙げることが出来る。この平板状物質はそれ
自体最初のアミノ酸単位（すなわち、構造要素としての
出発単位）と結合するのに適当であり、あるいは又従来
から当業者に周知の方法によりこの目的のために変性す
ることも出来る。
る３空間次元の内の１つの次元が他の２次元よりも実質
的に小さい様な形状を有する物質を意味するものであ
る。この様な平板状基質は断片として使用するのに任意
の３次元形状を有してて良く、例えば、シート状又は細
長いテープ状のものであっても良い。この様な平板状シ
ート物質としては、ろ紙又はガラス繊維で補強したろ紙
を例として挙げることが出来る。この平板状物質はそれ
自体最初のアミノ酸単位（すなわち、構造要素としての
出発単位）と結合するのに適当であり、あるいは又従来
から当業者に周知の方法によりこの目的のために変性す
ることも出来る。
本発明の好ましい態様としては、使用する平板状物質は
液状反応媒体および（または）その中に含まれる反応成
分に対して透過性を有するものである。
液状反応媒体および（または）その中に含まれる反応成
分に対して透過性を有するものである。
平板状基質を有する本発明方法によれば、１つの同一の
反応容器中で複数の基質断片を１つの同一アミノ酸単位
すなわち構造要素と同時に反応させ、しかる後に何ら互
いに汚染することなくこれらを再度互いにきちんと分離
することが可能である。
反応容器中で複数の基質断片を１つの同一アミノ酸単位
すなわち構造要素と同時に反応させ、しかる後に何ら互
いに汚染することなくこれらを再度互いにきちんと分離
することが可能である。
こうして各ペプチドは１つまたはそれ以上の断片から成
る基質群上で合成される。この目的のために、合成すべ
きペプチド鎖の第１アミノ酸を、特定の基質に適用され
るそれ自体公知の方法により基質に化学的に結合させ
る。次いで所望によっては、その出発分子に結合した基
質断片の残りの反応性官能基を保護し、そしてその出発
分子を末端脱保護する。同一の合成分子を結合させるべ
き断片の基質群を１つの同一反応容器中で反応させる。
結合反応は使用される特定の合成方法に従って行なわれ
る。結合後に、保護および末端第保護を再度行うことが
出来る。この反応サイクル完了後に次の結合サイクルを
行うのであるが、この目的のために、基質断片を各群毎
に、合成すべき配列に相当するアミノ酸分子に反応させ
る。この様な合成サイクルの１例を反応機構（１）とし
て下記に示した。最後の合成工程終了後に、全基質断片
を分離することが出来、こうしてペプチドをその基質断
片から放し、脱保護しそして単離する。
る基質群上で合成される。この目的のために、合成すべ
きペプチド鎖の第１アミノ酸を、特定の基質に適用され
るそれ自体公知の方法により基質に化学的に結合させ
る。次いで所望によっては、その出発分子に結合した基
質断片の残りの反応性官能基を保護し、そしてその出発
分子を末端脱保護する。同一の合成分子を結合させるべ
き断片の基質群を１つの同一反応容器中で反応させる。
結合反応は使用される特定の合成方法に従って行なわれ
る。結合後に、保護および末端第保護を再度行うことが
出来る。この反応サイクル完了後に次の結合サイクルを
行うのであるが、この目的のために、基質断片を各群毎
に、合成すべき配列に相当するアミノ酸分子に反応させ
る。この様な合成サイクルの１例を反応機構（１）とし
て下記に示した。最後の合成工程終了後に、全基質断片
を分離することが出来、こうしてペプチドをその基質断
片から放し、脱保護しそして単離する。
適当に保護されたアミノ酸構成要素分子の代りに、適当
に保護されたジ−又はオリゴーペプチドを使用してペプ
チドを構築することも出来る。合成工程は従来技術に従
って、手動式又は自動の合成装置の振動型反応容器又は
カラム式反応容器（例えばDryland ＆ Sheppard;J.Che
m.Soc.Perkin Terans.,I（1986）125に記載）中のいず
れでも行うことが出来る。
に保護されたジ−又はオリゴーペプチドを使用してペプ
チドを構築することも出来る。合成工程は従来技術に従
って、手動式又は自動の合成装置の振動型反応容器又は
カラム式反応容器（例えばDryland ＆ Sheppard;J.Che
m.Soc.Perkin Terans.,I（1986）125に記載）中のいず
れでも行うことが出来る。
本発明の方法によれば、出来るだけ長い反応サイクルを
一緒に反応する異種の基質群の配列（異種のペプチド配
列用の）とすることによって、複数のペプチドの生成の
ための合成工程の数を減らすことが出来る。反応機構
（１）の例について言えば、７×10＝70の反応サイクル
の数が15に減っている。本発明方法に従って、たくさん
の異配列ペプチド、すなわち2,3か所の位置だけが異な
る配列のペプチドを大量に作るのに特に有利である。
一緒に反応する異種の基質群の配列（異種のペプチド配
列用の）とすることによって、複数のペプチドの生成の
ための合成工程の数を減らすことが出来る。反応機構
（１）の例について言えば、７×10＝70の反応サイクル
の数が15に減っている。本発明方法に従って、たくさん
の異配列ペプチド、すなわち2,3か所の位置だけが異な
る配列のペプチドを大量に作るのに特に有利である。
本発明におけるペプチド合成には公知の合成法を使用出
来る。
来る。
次に本発明を実施例により詳しく説明する。
反応機構（２）にセルロース基質（例えばろ紙）をモノ
メトキシ−トリチル−ｐ−ヒドロキシメチル−ｘ−フェ
ノキシヘキサン酸と縮合剤としてのMSNTとでエステル化
する工程を示した。セルロースの残りの反応性OH基を保
護した後に、モノメトキシトリチル基をジクロル酢酸で
脱離し、そして生成した遊離のｐ−ヒドロキシメチル基
と第１のアミノ酸分子とをエステル結合を介して結合さ
せる。残りの変化しないｐ−ヒドロキシメチル基を保護
しても良い。その後に、この第１のアミノ酸分子のNH2
基を脱保護し、そして次いで第２のアミノ酸分子のカル
ボキシル基と結合させ、その後で残っている遊離のNH2
基を保護してもよい。末端NH2基の脱保護および次のア
ミノ酸分子の結合として更に所望によっては未反応のNH
2基の保護から成るサイクル工程配列によってペプチド
鎖が生成する。結合反応には適当に保護されたアミノ酸
無水物又はｐ−ニトロフェニルエーテルを使用した。一
次的なNH2保護基としてフルオレニルメトキシカルボニ
ル基を選択使用し、該保護基はそれぞれの場合にジメチ
ルホルムアミド中20％ピペリジンで脱離させた。７個又
はそれ以上のアミノ酸を連鎖として有するペプチドが得
られた。収量は従来法に匹敵するものであった。
メトキシ−トリチル−ｐ−ヒドロキシメチル−ｘ−フェ
ノキシヘキサン酸と縮合剤としてのMSNTとでエステル化
する工程を示した。セルロースの残りの反応性OH基を保
護した後に、モノメトキシトリチル基をジクロル酢酸で
脱離し、そして生成した遊離のｐ−ヒドロキシメチル基
と第１のアミノ酸分子とをエステル結合を介して結合さ
せる。残りの変化しないｐ−ヒドロキシメチル基を保護
しても良い。その後に、この第１のアミノ酸分子のNH2
基を脱保護し、そして次いで第２のアミノ酸分子のカル
ボキシル基と結合させ、その後で残っている遊離のNH2
基を保護してもよい。末端NH2基の脱保護および次のア
ミノ酸分子の結合として更に所望によっては未反応のNH
2基の保護から成るサイクル工程配列によってペプチド
鎖が生成する。結合反応には適当に保護されたアミノ酸
無水物又はｐ−ニトロフェニルエーテルを使用した。一
次的なNH2保護基としてフルオレニルメトキシカルボニ
ル基を選択使用し、該保護基はそれぞれの場合にジメチ
ルホルムアミド中20％ピペリジンで脱離させた。７個又
はそれ以上のアミノ酸を連鎖として有するペプチドが得
られた。収量は従来法に匹敵するものであった。
反応機構（１）の説明 ASn＝アミノ酸（同指標のものは同一アミノ酸を意味す
る。） Trn＝配列（ｎ）用の基質断片群（ｎ） ZN＝ｎ番目の結合サイクル 反応機構（２）の説明 Ｐ＝基質（ポリマー、この場合セルロース） MeOTr＝ｐ−モノメトキシトリチル MSNT＝2,4,6−メシチレン−３−ニトロ−1,2,4−トリア
ゾリド Ac＝アセチル DCC＝ジシクロヘキシルカルボジイミド DMAP＝４−ジメチルアミノピリジン DIPEA＝ジイソプロピルエチルアミン、 Rn＝アミノ酸側鎖基 Fmoc＝フルオレニルメトキシカルボニル− DMF＝ジメチルホルムアミド DCA＝ジクロル酢酸 反応機構 （１） 第１サイクル:Tr1-5 AS1結合（チャージング） 第２サイクル:Tr6-10 AS2結合（チャージング） 第３サイクル:Tr1-10 AS3結合 第４サイクル:Tr1,6,10 AS4結合 第５サイクル:Tr2,4,7 AS5結合 第６サイクル:Tr3,5,8,9 AS6結合 第７サイクル:Tr1-10 AS7結合 第８サイクル:Tr3,4,5,6,8,9,10 AS9結合 第９サイクル:Tr1,2,4,7,10 AS8結合 第10サイクル:Tr1,2,5,7,8 AS10結合 第11サイクル:Tr3 AS11結合 第12サイクル:Tr6 AS12結合 第13サイクル:Tr4,5,6,9 AS13結合 第14サイクル:Tr1,2,3,10 AS14結合 第15サイクル:Tr7,8,9 AS9結合 反応機構 （２）
る。） Trn＝配列（ｎ）用の基質断片群（ｎ） ZN＝ｎ番目の結合サイクル 反応機構（２）の説明 Ｐ＝基質（ポリマー、この場合セルロース） MeOTr＝ｐ−モノメトキシトリチル MSNT＝2,4,6−メシチレン−３−ニトロ−1,2,4−トリア
ゾリド Ac＝アセチル DCC＝ジシクロヘキシルカルボジイミド DMAP＝４−ジメチルアミノピリジン DIPEA＝ジイソプロピルエチルアミン、 Rn＝アミノ酸側鎖基 Fmoc＝フルオレニルメトキシカルボニル− DMF＝ジメチルホルムアミド DCA＝ジクロル酢酸 反応機構 （１） 第１サイクル:Tr1-5 AS1結合（チャージング） 第２サイクル:Tr6-10 AS2結合（チャージング） 第３サイクル:Tr1-10 AS3結合 第４サイクル:Tr1,6,10 AS4結合 第５サイクル:Tr2,4,7 AS5結合 第６サイクル:Tr3,5,8,9 AS6結合 第７サイクル:Tr1-10 AS7結合 第８サイクル:Tr3,4,5,6,8,9,10 AS9結合 第９サイクル:Tr1,2,4,7,10 AS8結合 第10サイクル:Tr1,2,5,7,8 AS10結合 第11サイクル:Tr3 AS11結合 第12サイクル:Tr6 AS12結合 第13サイクル:Tr4,5,6,9 AS13結合 第14サイクル:Tr1,2,3,10 AS14結合 第15サイクル:Tr7,8,9 AS9結合 反応機構 （２）
Claims (3)
- 【請求項１】使用した液体媒質に対して透過性を有する
場合により繊維補強されたセルロース又は紙の平板物質
から成る、１種、２種又はそれ以上の基質を固相として
使用し、そしてそれ自体公知の方法により、 （ａ） それぞれの第１アミノ酸を、適当な方法により
機能性を付与した基質断片に、各群の出発単位として結
合させ、その際各基質群は少なくとも１つの基質断片を
有するものであり、そしてこの基質断片を各群毎に異な
る出発単位と結合させ、そして、 （ｂ） こうして（ａ）により結合させた基質断片を、
合成すべきペプチドの配列に従って相当するアミノ酸単
位と各群毎に反応させ、なお、 （ｃ） 所望の合成法に従って、工程（ｂ）の前に脱保
護工程を行うか、そして（または）該工程（ｂ）の後に
保護工程を行なうことを特徴とする、同相上において複
数のペプチドを同時に合成する方法。 - 【請求項２】該方法を１個又は数個のカラム式反応容器
中で行う、特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。 - 【請求項３】基質断片を流れ方向に横断して設け、そし
ていずれの場合も該断面がカラム式反応容器の全内部顔
面積を占める様にして成る、特許請求の範囲第（１）又
は（２）項に記載の方法。
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| DE19863631662 DE3631662A1 (de) | 1986-09-17 | 1986-09-17 | Verfahren zur simultanen synthese mehrerer peptide an fester phase |
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|---|---|
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| JPH0796556B2 true JPH0796556B2 (ja) | 1995-10-18 |
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