JPH0215567B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は固相ポリペプチド合成用の樹脂支持体
の合成方法に関する。 関連技術の説明 ペプチドの合成は、一般に、アミノ酸のカルボ
キシル基と他のアミノ酸のアミノ基との縮合（ま
たはカツプリング）によつてペプチド結合を形成
することによつて行なわれる。この順序は個々の
アミノ酸の縮合の段階的延長の繰返しによるか、
ある場合には予め形成した２個のペプチド断片の
縮合（断片縮合）によつて構成できる。両種類の
縮合において、反応に関与しないアミノまたはカ
ルボキシル基は保護基によつて封鎖（または保
護）しなければならない。これに加えて、アミノ
酸の反応側鎖官能価も保護する必要がある。 一連の縮合反応による大きいペプチドの合成を
成功させるには、各化学工程でほぼ定量的回収を
達成しなければならない。この要求事項はR.B.
Merrifieldが開拓した固相ペプチド合成によつて
満足させうる。かような合成においては、ペプチ
ド連鎖は通常、ベンジル型カルボキシル―保護基
によつて不溶性ポリスチレン樹脂に結合してい
る。ベンジルエステル結合によつて樹脂に結合し
ている最初のアミノ酸は、そのアミノ部位で保護
を外され、そして、保護されたα―アミノ基を有
する第二のアミノ酸と結合し、保護されたジペプ
チドエステルを生成する。保護基はトリフルオロ
酢酸によつて除去され、中和されて塩基を有する
遊離アミンを形成し、そして、第二のＮ―保護ア
ミノ酸と結合する。これらの工程の多数の繰返し
の後に、酸処理によつて完成ペプチドを樹脂から
開裂させる。不溶性樹脂支持体の使用によつて、
樹脂を濾過し、そして、これを洗浄して副生物お
よび過剰な出発物質を除去することによつて各カ
ツプリング反応の生成物を単離することができ
る。 Barany.G.およびMerrifield.R.B.、「THe
Peptides」Vol.2、Academic Press.社、New
York.1979，１〜284頁、およびKemp―
Vellaccio、「Organic Chemistry」1030〜1032
（1980）参照。 固相ペプチド合成において、ペプチド―樹脂結
合は必須事項である。この結合は、典型的には濃
厚な酸の使用を伴うアミノ封鎖基の脱保護に対し
て安定でなければならない。この結合が脱保護化
条件に対して安定でないならば、ペプチドは早期
に樹脂から離れていまう。これに加えて、この結
合は、好ましくは、回収されるペプチドを損傷さ
せないような条件下でペプチド合成が完結したと
き容易に開裂されなければならない。 ペプチド―樹脂結合を改善するために多数の研
究が行なわれている。Merrifieldは、アミノ基の
脱保護に要する強酸条件下で比較的安定なフエニ
ルアセトアミドメチル結合を開発した。 （Stewart.J.M.およびYoung，J.D.Solid
Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce
Chemical CO.Rockford.Illinois.11〜12頁および
Gross.E.およびMeienhofer.J.，The Peptides.
Analysis，Synthesis，Biology.Vol.2、
Academic Press.1980，３〜250頁参照）。 ペプチドが大きくなり、かつさらに複雑になる
に伴い脱保護並びに開裂に必要な酸性条件に対し
て安定性が減少するため、研究者は比較的温和な
薬剤によつて開裂できるペプチド―樹脂結合を開
発した。Wangはジクロロメタン中の25％トリフ
ルオロ酢酸によつて開裂できるＰ―アルコキシベ
ンジルアルコール樹脂を開発した。Stewart.上記
文献12および13。 開裂のためのより緩和な条件の探求において、
Tam.（U.S.P.4，507，230）は、得られた酸性条
件下で大部分プロトン化されず、かつ、求核性の
ままで残る好適な弱塩基の使用によつて、典型的
には無水弗化水素である。開裂において使用され
る強酸の酸機能を減少させる方法を開発した。 上記に引用した本献いずれにも、酸安定性並び
に温和な酸条件下で容易な開裂の組合せが得られ
る固相ペプチド合成のペプチド―樹脂結合は記載
されていない。 J.M.SamanenおよびE.Bradelisは彼等の論文
「The ｐ―methylsulfinylbenzyl Group.A
Selectively Cleavable Carboxyl Protecting
Group」トロントにおける第９回アメリカ ペプ
チド シンポジウム（1985年６月23〜28日）にお
いて、溶液相ペプチド合成に使用するカルボキシ
ル保護基として有用なｐ―メチルスルフイニルベ
ンジル基を記載している。スルホオキサイド置換
ベンジルエステル結合はアミノ基の脱保護に使用
されるトリフルオロ酢酸条件に対して安定であ
る。スルホオキサイドがサルフアイドに還元され
たとき、エステル基は「錠を外され」
（unlocked）、そして無水トリフルオロ酢酸によ
つて開裂性になる。しかし、固相ペプチド合成に
おいて使用する目的のためのこの保護基の説明は
ない。 発明者等は、強酸条件に対して安定性があり、
比較的温和な酸条件下で容易に開裂してペプチド
と樹脂とが得られる固相ペプチド合成用の樹脂を
見出した。 本発明の概要 樹 脂 本発明は、固相ペプチド合成用樹脂の合成方法
である。この樹脂は構造 （式中、Ｐはポリマー支持体であり、R₁は置
換または未置換芳香族であり、R₂は炭素原子１
〜20個を有するアルキルであり、R₃は置換また
は未置換フエニルであり、そして、ｎおよびｍは
独立に、１または０に等しい）を有する。 樹脂の合成 固相ペプチド合成用の樹脂の合成方法は： (i) 求核反応を受けるここができるポリマー支持
体Ｐと式 HS―R₃CH₂OH （式中、R₃は置換または未置換フエニルであ
る）のメルカプタンとを反応させて式 Ｐ―R_1o―R_2n―Ｓ―R₃CH₂OH （式中、R₁は置換また未置換芳香族であり、
R₂は炭素原子１〜20個を有するアルキルであり、
そして、ｎおよびｍは独立に１または０に等し
い）のサルフアイド樹脂を形成し、そして、 (ii) 該サルフアイド樹脂を酸化して式 （式中、R₁、R₂、R₃、ｎおよびｍは上記の
定義である）のスルホオキシド樹脂を形成する
ことから成る。 本発明の詳細な説明 樹 脂 本発明の樹脂は、構造 （式中、Ｐはポリマー支持体であり、R₁は置
換または未置換芳香族、好ましくは未置換フエニ
ルであり、そして、R₂は炭素原子１〜20個を有
するアルキル、好ましくはメチレンである。R₃
は置換または未置換フエニル、好ましくは未置換
フエニルであり、そして、ｎおよびｍは独立に１
または０に等しい）を有する。R₁およびR₃が置
換されている場合には、置換基はペプチド合成条
件下で反応しないものでなければならない。R₁
およびR₃の好適な置換基の例は、メチルまたは
エチルのようなアルキル、フエニルのようなアリ
ール、プロペンのようなアルケン、ヘキシンのよ
うなアルキン、ニトロ基およびクロロ、フルオロ
またはブロモ基のようなハロゲンである。 ポリマー支持体は、ポリアミド、ポリスルフア
ミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコー
ル、フエノール樹脂、ポリサツカライド、または
ポリスチレンのような多数のポリマー、コポリマ
ーまたはポリマーの組合せの任意のものでよい。
ポリマー支持体は、ペプチド合成において使用さ
れる溶剤に不溶性、かつ不活性でなければならな
い。支持体は取扱い液体からの濾過が容易なよう
な寸法およびおよび形状であるのが好ましい。す
べての薬剤がポリマー粒子中に浸透し、そして、
ポリマー粒子内のすべての反応部位に近ずけるよ
うにポリマーは合成に使用される溶剤中で膨潤す
ることが好ましい。好ましいポリマー支持体は、
スチレンと約１％のｍ―ジビニルベンゼンまたは
架橋剤との懸濁共重合によつて製造されたゲルで
ある。かような架橋ゲルは、有機溶剤中において
それらの乾燥容積の約５〜６倍に膨潤する。この
膨潤は、ポリマーの反応部位へ溶剤および反応体
を接近させ、そして、ポリマーの内部並びに外部
表面における反応を可能にする。 クロロメチルメチルエーテルを使用することに
よつて行なわれるクロロメチレーシヨンによつて
このポリマーに官能基を導入できる。クロロメチ
ル化架橋ポリスチレンゲルは、当業界で
Merrifield樹脂と呼ばれている。Merrifield樹脂
は、Stewart.J.M.およびYoung.J.D.によるSolid
Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce
Chemical Co.Rockford.Illinoisにさらに詳細に
記載されており、本文献は本明細書の参考にな
る。 好ましい樹脂は、式、 （式中、Ｐは架橋ポリスチレン樹脂である）を
有する樹脂である。 本明細書の参考になる同時係属出願第946，558
に詳細に記載されている固相ペプチド合成用の樹
脂が使用できる。 樹脂の合成 樹脂は、求核反応を受けることができるポリマ
ー支持体Ｐと式 HSR₃CH₂OH （式中、R₃は置換または未置換フエニルであ
る）のメルカプタンとを反応させ、サルフアイド
樹脂を形成し、該サルフアイド樹脂を酸化してス
ルホオキサイド樹脂 （式中、R₁は置換または未置換芳香族であり、
R₂は炭素原子１〜20個を有するアルキルであり、
R₃は置換または未置換フエニルであり、そして、
ｎおよびｍは独立に、１または０に等しい）を形
成することによつて合成される。 メルカプタンは、式 HS―R₃CH₂OH （式中、R₃は置換または未置換フエニルであ
る）を有するものである。メルカプト化合物の例
は、ｐ―（メルカプト）ベンジルアルコール、ｏ
―（メルカプトベンジルアルコール、ｐ―（メル
カプト）―ｏ―クロロベンジルアルコール、また
はｐ―（メルカプト）―ｏ―クロロベンジルアル
コールである。好ましいメルカプタンは、ｐ―
（メルカプト）ベンジルアルコールである。この
反応は、トリエチルアミン、テトラメチルグアナ
ジン、ジイソプロピルエチルアミンおよびトリメ
チルアミンのような第三アミン塩基の存在下で行
なわれる。好ましい第三アミンはトリエチルアミ
ンである。あるいはまた、サルフアイド化合物と
水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような
無機塩基とを反応させることによつてサルフアイ
ド化合物の塩を予備形成することができる。ポリ
マー支持体とメルカプタンとの反応は、テトラヒ
ドロフラン、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼンまたはトルエンのような、ポリマーを膨潤
させるがメルカプタンとは反応しない極性溶剤中
において行なわれる。好ましい溶剤はテトラヒド
ロフランである。 サルフアイド樹脂は、式 （式中、Ｐ、R₁、R₂、R₃、ｎおよびｍは上記
の定義である）のスルホオキサイド樹脂に酸化さ
れる。酸化は過酸化水素、過酸、ヨードベンゼン
ジクロライド、過沃素酸ナトリウムなどを使用す
るような当業界で公知の任意の酸化方法によつて
行うことができる。好ましい酸化方法は、０〜25
℃でメチレンクロライド中のｍ―クロロ過安息香
酸による酸化である。 次の実施例は本発明を説明する目的のみのもの
であり、本発明の範囲を限定する積りはない。 実施例 １ 架橋ポリスチレン支持体に次のような機能を付
与した： 500ml丸底フラスコ中に、20.00ｇのクロロメチ
ル化１％架橋ポリスチレン：（Merrifield樹脂）
200〜400メツシユ、1.1meqクロライド／ｇ、
22m mol；160mlの乾燥テトラヒドロフラン
（THF）；6.32ｇ（45m mol）の４―メルカプト
ベンジルアルコールおよび6.6ml（4.8ｇ、48m
mol）のトリエチルアミンを入れた。フラスコ中
に溶剤を還流させるコンデンサーを備え、窒素雰
囲気下におかれ、60℃で水浴中に浸漬されている
ロータリーエバポレーター上にフラスコを置い
た。フラスコを24時間回転させた。室温に冷却
後、樹脂を濾過用の粗いガラスフリツトを備えた
振蘯容器に移し、各160mlのTHF、20％水／80％
THF（Ｖ：Ｖ）、50％水／50％メタノールおよび
エタノールで逐次３回洗浄した。樹脂を真空下で
乾燥させた。この樹脂を元素分析し、そして、
0.44重量％の塩化物（0.12meq／ｇ）および2.43
重量％の硫黄（0.79meq／ｇ）を含有することが
判明した。この樹脂の赤外分析で、クロロメチル
基による1265cm^-1の痕跡のバンドが示されたこと
は、クロロメチルとメルカプタンとの反応がほぼ
完全に完結したことを示している。 官能化された樹脂を、次のようにサルフアイド
からスルホオキサイドに酸化した： 500ml丸底フラスコ中に、17.1ｇ（0.79meq
ｓ／ｇ、13.5m mol）の上記の官能化樹脂および
170mlのメチレンクロライドを入れた。５℃に冷
却後、2.47ｇの83.3％のｍ―クロロ過酸化安息香
酸酸化剤（2.06ｇの活性過酸、11.9m mol）を15
分間にわたつて徐々に添加した。添加後、フラス
コを冷室中７℃で24時間ロータリーエバポレータ
ー上で回転させた。樹脂を振盪容器に移し、そし
て、各150mlのメチレンクロライドおよびメタノ
ールで逐次３回洗浄した。 この樹脂の赤外分析では、スルホオキサイド基
による1020cm^-1での強いバンドを示した。 合成 １ 最初のアミノ酸の固定 次のように、アミノ酸をスルホオキサイド樹脂
に固定した： 振盪容器中に、4.00ｇ（0.79meq ｓ／ｇ、
3.16m mol）のスルホオキサイド樹脂、および40
mlのメチレンクロライドを入れた。次の薬剤を、
添加の間１分間振盪してこの順で添加した：2.10
ｇ（7.9m mol）のＮ―（ｔ―ブチロキシカルボ
ニル）―Ｌ―フエニルアラニン、40mg（0.33m
mol）のＮ，Ｎ―メチル―４―アミノピリジンお
よび1.5ml（1.37ｇ、10.9m mol）の１，３―ジイ
ソプロピルカルボジイミド。反応混合物を室温で
24時間振盪し、溶剤を抜き取り、そして、樹脂を
各40mlのメチレンクロライド、メタノールおよび
メチレンクロライドで逐次３回洗浄した。湿樹脂
に40mlのメチレンクロライド、3.2ml（2.43ｇ、
18.8m mol）のＮ，Ｎ―ジイソプロピルエチルア
ミン、および1.5ml（1.80ｇ、17.7m mol）の無水
酢酸を添加し、容器を２時間振盪した。溶剤を抜
取つた後、樹脂を40mlのメチレンクロライドおよ
びメタノールで３回洗浄し、そして、真空下で乾
燥させた。この樹脂のアミノ酸分析では、樹脂の
フエニルアラニン充填量は0.64meq／ｇであるこ
とが示された。 スルホオキサイド樹脂の脱保護および 残留サルフアイド樹脂の封鎖 次のように、樹脂を脱保護し、そして、残留サ
ルフアイド樹脂を封鎖した： サルフアイド結合基に結合しているすべてのフ
エニルアラニンを除去し、同時にこれらの基を封
鎖するために、上記の樹脂を40mlの45％トリフル
オロ酢酸／５％アニソール／50％メチレンクロラ
イド（Ｖ：Ｖ：Ｖ）で21時間処理し、各各40mlの
メチレンクロライドおよびメタノールで３回洗浄
した。この樹脂のアミノ酸分析で、フエニルアラ
ニン充填量は0.58meq／ｇの樹脂が示された。こ
の樹脂はスルホオキサイド結合基のみに結合した
フエニルアラニンを有し（サルフアイド結合基は
封鎖されている）、そして、ペプチド合成に直ぐ
に使用できる。 スルホオキサイド結合の還元および開裂 次のように、樹脂結合をサルフアイド結合に還
元し、そして、低HF条件下でアミノ酸を樹脂か
ら開裂させた： 上記のフエニルアラニン置換スルホオキサイド
樹脂の試料（0.50ｇ、0.58meq／ｇ、0.29m mol）
を1.0mlのｐ―クレゾール、6.5mlのジメチルサル
フアイドおよび2.5mlの無水弗化水素酸の混合物
を使用し０℃で２時間処理した。真空下で薬剤を
追出した後に、樹脂を各５mlのメチレンクロライ
ド、トリフルオロ酢酸、メチレンクロライドおよ
びメタノールで逐次２回洗浄し、次いで、真空下
で乾燥させた。この樹脂のアミノ酸分析によつ
て、フエニルアラニン含量が0.062meq／ｇが示
されたことは89％の開裂収率が得られたことを示
す。赤外分析では、1020cm^-1でのスルホオキシド
バンドは示されなかつた。このことはスルホオキ
サイド基が完全に還元されたことを示す。 スルホオキサイド結合を還元し、かつ、アミノ
酸を樹脂から開裂させる別法においては、次のよ
うに低トリフルオロメタンスルホン酸条件を使用
した： 上記からのフエニルアラニン置換スルホオキサ
イド樹脂の試料（0.20ｇ、0.58meq／ｇ、0.12m
mol）を、0.60mlのジメチルサルフアイド、1.2ml
のトリフルオロ酢酸および0.20mlのトリフルオロ
メタンスルホン酸の混合物を使用し室温で１時間
処理した。樹脂を各５mlのトリフルオロ酢酸、メ
チレンクロライドおよびメタノールで逐次３回洗
浄し、次いで、真空下で洗浄した。樹脂のアミノ
酸分析でフエニルアラニン含量0.055meq／ｇが
示された、このことは91％の開裂収率が得られた
ことを示す。スルホオキサイドの存在に対する赤
外分析はトリフルオロメタンスルホン酸に起因す
るバンドによつて複雑になつた。 合成 上記の樹脂を使用してＬ―ロイシンおよびＬ―
フエニルアラニンのジペプチドを製造した。合成
の方法を使用してＮ―（ｔ―ブチロキシカルボ
ニル）―Ｌ―ロイシンを封鎖した。この樹脂のア
ミノ酸分析では0.75meq／ｇのロイシン含量が示
された。合成におけるように45％トリフルオロ
酢酸で処理して残留サルフアイド樹脂を脱保護
し、かつ、封鎖したとき、ロイシン含量は
0.49meq／ｇに低下した。この樹脂の試料（0.994
ｇ、0.49m mol）を、メチレンクロライド中の10
％ジイソプロピルエチルアミンの溶液で２回洗浄
して、次いで、メチレンクロライドで３回洗浄し
て樹脂を中和した。樹脂を10mlのメチレンクロラ
イド中に懸濁させ、464mg（1.75m mol）のＮ―
（ｔ―ブトキシカルボニル）―Ｌ―フエニルアラ
ニン、次いで、0.27ml（235mg、1.86m mol）の
Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルカルボジイミドを添加す
ることによつて封鎖した。２時間振盪後、樹脂を
メチレンクロライドで３回洗浄し、そして、真空
下で乾燥させた。アミノ酸分析では0.40meq／ｇ
のロイシン含量および0.40meq／ｇのフエニルア
ラニン含量が示された。 スルホオキサイド樹脂を、脱保護し、結合を無
水塩化水素によつて減少させ、そして、次のよう
にペプチドをトリフルオロ酢酸によつて樹脂から
開裂させた： 実施例２からの上記の封鎖樹脂の試料（100mg、
0.04m mol）をジオキサン中の無水塩化水素の
4.1モル溶液５mlと共に４時間振盪した。樹脂を
５mlのメチレンクロライドで５回洗浄し、そし
て、真空乾燥させた。アミノ酸分析では次のアミ
ノ酸含量ロイシン（0.28meq／ｇ）およびフエニ
ルアラニン（0.32meq／ｇ）が示されたことは25
％の開裂が起つたことを示す。次いで、この樹脂
を45％トリフルオロ酢酸／５％アニソール／50％
メチレンクロライド（Ｖ：Ｖ：Ｖ）の５mlで24時
間処理し、濾過し、５mlのメチレンクロライドで
６回洗浄し、そして、真空乾燥させた。この樹脂
のアミノ酸分析では、次のアミノ酸含量：ロイシ
ン（0.08meq／ｇ）およびフエニルアラニン
（0.11meq／ｇ）が示されたことは72〜81％の開
裂が起つたことを示す。別の実験において、無水
塩化水素による処理を24時間に延長し、そして、
トリフルオロ酢酸による処理を24時間維持したと
き、開裂量には何等の変化も観察されなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固相ペプチド合成用のスルホオキサイド樹脂
   の合成方法において、 (i) 求核反応を受けることができるポリマー支持
   体Ｐと式、 HS―R₃CH₂OH （式中、R₃は置換または未置換フエニルで
   ある）のメルカプタンとを反応させ、式、 Ｐ―R_1o―R_2n―Ｓ―R₃CH₂OH （式中、R₁は置換または未置換芳香族であ
   り、R₂は炭素原子１〜20個を有するアルキル
   であり、そして、ｎおよびｍは独立に１または
   ０に等しい）のサルフアイド樹脂を形成し、そ
   して、 (ii) 該サルフアイド樹脂を酸化して、式、 （式中、R₁、R₂、R₃、ｎおよびｍは上記の
   定義の通りである）のスルホオキサイド樹脂を
   形成する ことを特徴とする前記の方法。 ２ 前記のポリマー支持体が架橋ポリスチレンゲ
   ルである特許請求の範囲第１項の方法。 ３ ｎおよびｍは１に等しく、R₁およびR₃は未
   置換フエニルであり、そして、R₂はメチレンで
   ある特許請求の範囲第１項の方法。 ４ 前記のスルホオキサイド樹脂が、式 （式中、Ｐは架橋ポリスチレン樹脂である）を
   有する特許請求の範囲第１項の方法。