JPH0372496A - 固相多重ペプチド合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明の分野は、固体支持体上でのペプチド台底に関す
る。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕生物
学的過程の研究は、クローニング、シーフェンシング、
制限酵素、遺伝子バンク、改良された診断装置の出現、
並びに生理学的過程のメカニズムやそのような過程にか
かわる分子を研究する能力の増加を考慮に入れた多くの
他の発展と共に大きく拡大してきている。単離されそし
て特徴づけられる生物学的分子の数が増加するにつれて
、ペプチドの調製が付随して着目されてきている。

多くの生理学的過程で、オリゴペプチドが該過程の中心
的な役割を果たす。これは、抗原提示細胞、例えばマク
ロファージやＢ−細胞と、Ｔ−細胞との間の相互作用に
より例示される。この場合、オリゴペプチドがＭＨＣ抗
原に結合しモしてＭＨＣ抗原と共同してＴ−細胞レセプ
ターにより認識されなければならない。タンパク質全体
が役割を果たす場合でさえも、タンパク質の小配列のみ
がしばしば完全なタンパク質の活性の実質的部分を模倣
することができる。従って、免疫グロブリンと結合する
エピトープ部位は、抗体形成を誘導するためのハプテン
として抗体との結合に利用することができ、またはタン
パク質もしくはそれらの相補的レセプターを検出するた
めの診断アッセイにおいて利用することができる。ペプ
チドはまた、薬剤として活性であり得る化合物について
のスクリーニングに重要な役割を果たすこともでき、ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニスト活性に要求され
るコンホーメーションにおける洞察を提供することもで
きる。ｌシリーズのオリゴペプチドの調製は、配列中の
変化の結果としてのシグナルの導入の効果およびレセプ
ターの結合部位を限定するために役立つこともできる。

従って、異なる。ｖＩｔｃの種々のオリゴペプチドの製
造のための単純で且つ効率的な技術を考慮した方法に実
質的な関心がある。

〔関連文献〕

ＰＣＴ出ＷＩＭＷＯ８４１０３５６４，ＷＯ８４１０３
５０６および一〇　８６１００９９１は、多数のペプチ
ドの製造のための技術を提供している。前記出願明細書
中に引用された引例も参照のこと。１９８７年５月１９
日に出願された同時係属出願第０５１．９１７号明細書
は、ポリスチレン表面を機能化するための方法を記載し
ている。

〔課題を解決するための手段〕

活性な置換可能なハライドまたは擬似ハライドを有する
機能化されたポリスチレン表面を、リンカ−としてのア
ミノアルキルまたはヒドロキシアルキル鎖で置換する。

次に得られたリンク基を適当な保護アミノ酸活性エステ
ルと反応せしめ、次いで脱保護しそして更なる保護アミ
ノ酸を用いて延長する。所望により、リンカ−はベンジ
ルアルコール基で更に延長することができる。ヒドロキ
シル基を使ったリンカ−をまず、ペンタフルオロフェニ
ル活性エステルよりも反応性のカルボキシル官能基、例
えば対称無水物と反応せしめ、ここで次なるアミノ酸を
ペンタフルオロフェニル等の活性エステルとして添加す
る。

〔具体的説明〕 多数のオリゴペプチドを効率的に且つ迅速に、通常実質
上同時に、高いオーダーの忠実度で製造するための方法
および組成物が提供される。該方法は、アミノまたはヒ
ドロキシル基で終わる活性化されたポリスチレン表面を
使用する０次いで各サイクルにおいてカップリングおよ
び脱保護に特定の試薬を使って、カルボキシルが保護さ
れた活性化されたアミノ酸を順次付加することにより、
オリゴペプチドを調製する。

この方法の第一段階は、ポリスチレンの活性化である。

ポリスチレンは様々な形態、例えばマルチウェルプレー
ト、ロンド、シート、ビーズ、実質的に密閉または開放
されている容器、フラスコなどの形で存在することがで
き、ここでシート上の特定領域をくぼませたり、突出し
た線または他のバリヤー等により分離したりすることも
できる。

望ましくは、ポリスチレンは加工され、例えば押出また
は成形され、ロンドの場合は細断されてビーズを提供す
ることができる。該装置の特徴は、付加の各サイクルご
とに同一または異なるアミノ酸および同一または異なる
試薬の複数の連続付加部位における同時操作を考慮して
いるだろうことである。

機能化については、１９８９年３月２９日に出願された
同時係属出願第３３０　、２０７号明細書中に記載され
ている。この方法では、α−ヒドロキシアルキル２−置
換アセトアミドが使用され、ここで置換基はハライドま
たは擬似ハライドである。大部分については、活性化さ
れるポリスチレン目的物は、主として架橋されておらず
、普通は約０．５％未満の架橋、より普通には約０．１
％未満の架橋を有するであろう。ポリスチレン製品は、
通常はとんど傷や裂は目のない滑らかな表面を提供する
ために加工され、成形されまたは押出される。それらの
製品を用いると、分子が表面に結合することができ、そ
して別の分子との結合に容易に利用可能である。成形ま
たは押出ポリスチレンを用いて本発明の方法を使うこと
により、ポリスチレンは実質的に透明性を維持しており
、そのため反応の進行をモニターすることができる。

成形ポリスチレンの望ましい性質の保持は、機能化され
たＹ−メチルアセドア【ドを使って達成され、ここでＹ
−メチル基は穏和な条件下でルイス酸触媒の存在下でポ
リスチレン非膨潤性または非溶解性溶媒中でポリスチレ
ンと反応し、モしてＹはルイス酸触媒の存在下でアリー
ル基、例えばベンゼンによる求核置換を行うことのでき
る成分である。Ｙ−メチルアミドのα−アシル官能基は
、芳香族求電子置換条件下では安定であるが、求核置換
の条件下でルイス塩基により容易に置換され得る基であ
る。

ポリスチレンを機能化するのに使われる化合物は、大部
分については次の式を有するであろう。

Ｘ（Ｒ）ＣＩｌＣＯＮＨＣＨ２Ｙ 上式中： Ｒは１〜３個、より普通には１〜２個の炭素原子を有す
るアルキル基または水素であり、通常は水素である。

Ｘはハロゲン（擬似ハロゲンを含む）であり、ここで該
ハロゲンは少なくとも１７の原子番号を有し、塩素、臭
素もしくはヨウ素、または擬似ハロゲン、例えばアリー
ルスルホン酸エステル、スルホニウム塩等であることが
できる。通常、ハロゲン以外の場合、アシル基のα−炭
素原子上の置換基は、少なくとも約２個の炭素原子を有
し且つ多くて約００個、通常多くて約８個の炭素原子を
有するものであり、そして１〜６個、より普通には１〜
５個、好ましくは１〜４個のへテロ原子を有することか
でき、ハロゲンおよびカルコゲン（酸素および硫黄）を
含むことができる。ここで、対イオンは限定の範囲内に
含まれない。多数の他の官能基、例えばシアノおよびニ
トロが存在し得るが、大部分は有用な役割をもたず、そ
してそのような化合物は通常入手不可能である。

ＹはＸと同じかまたは異なることができ、通常は異なり
、そして求核置換が可能な基、特にオキシ誘導体、ハラ
イドおよび擬似ハライドであり、ここでオキシ誘導体は
有機もしくは無機のいずれかのエステル、またはエーテ
ルであることができる。Ｙは通常多くて２０個、通常多
くて１２個の炭素原子、および約８個まで、通常多くて
約６個のへテロ原子を有するであろう、Ｙ基はヒドロキ
シ、少なくとも１７の原子番号のハロゲン、擬似ハロゲ
ン、例えばアリールスルホン酸エステル、リン酸エステ
ル、カルボン酸エステル、イミドエステル等、アルキル
エーテル、アリールエーテル、オキシアルキルエーテル
等を包含する。

使用されるＮ−ヒドロキシメチルアセトアミドは２−置
換Ｎ−ヒドロキシメチルアセトアミドであり、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−クロロアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ヨードアセドアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−〇−（ｐ−ブロモベンゼンスルホニ
ル）グリコールアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−０
−（ｐ−トルエンスルホニル）グリコールアミド、Ｎ−
（ヒドロキシメチル）−２−アセトアミドベンタメチレ
ンスルホニウムヨージド、およびＮ−（ヒドロキシメチ
ル）−２−アセトアミドペンタメチレンスルホニウムト
リフルオロアセテートを含むが、これに限定されない。

これらの各化合物についての合成反応は実施例において
示す。

Ｎ−ヒドロキシメチル化合物は、特定の酸またはヒドロ
キシル置換基を用いてα−置換アセトアξドのＮ−置換
の間の反応混合物中で、あるいはα−クロロメチルメト
キシエチルエーテルなどのホルムアルデヒド−誘導体を
使うことにより、直接誘導化されるかまたは調製され得
る。

ポリスチレンの活性化は、ポリスチレンを溶解したり膨
張させたりしない溶媒中で穏和な条件下で起こるだろう
。好ましい溶媒はＴＭＳであるけれども、あまり効果的
でない他の溶媒、例えばアセトニトリル、ニトロメタン
およびＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）もまた利用さ
れ得る。

この反応は、強酸、特にプロトン酸、好ましくは有機酸
、例えばトリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、またはフッ化
水素酸の存在下で行われる。

酸の濃度は通常約０．１〜２Ｍの範囲内であろう。

反応は通常大気水分の実質的非存在下にて行われ、これ
は反応混合物にカバーをすることにより、不活性雰囲気
を提供することにより、等で達成することができる。

ポリスチレン表面は、該支持体の表面を活性化するのに
適当な温度および時間の範囲内でＮ−（Ｙ−メチル）ア
セトアミド化合物と接触される。

通常、温度は約−５℃〜約６０℃１好ましくは約Ｏ℃〜
約３０℃の範囲内であり、そして活性化時間は約５分〜
約４８時間、通常約２時間〜約８時間の範囲内であろう
。Ｎ−（Ｙ−メチル）アセトアミド化合物の濃度は、典
型的には約０．０１〜２Ｍ、通常約ｏ、ｏｓ〜０．５　
Ｍである。はとんどの適用については、固体支持体表面
積平方センチメートル（ｃｍ）あたり少なくとも約０．
０５ｄ、通常０．１　ｄの反応溶液の使用が、支持体表
面上の求電子性基の反応による所望のレベルの活性化を
提供するのに充分であろう。

巨大分子の接合前に、緩衝液および／または水で洗浄す
ることにより未反応のＮ−（Ｙ−メチル）アセトアミド
化合物を除去することができる。洗浄段階に使用される
特定の物質は本発明にとって重要でなく、モして該アミ
ドの置換可能基に影響を与えない条件である限り、都合
のよいように選択される。該表面は不活性環境において
保存すれば安定であるので、置換可能基の置換は、活性
化の直後でも、幾らか時間を置いた後でも行うことがで
きる。

ポリスチレン表面の活性化後、該表面上に存在するハラ
イドまたは擬似ハライドの置換により、リンク基が形成
される。ハロゲンまたは擬似ハロゲンの置換のために種
々の基を使用することができ、例えばチオール、オキシ
またはアミンを含み、好ましくはチオールである。求核
置換の条件は、実質的には常用のものであり、通常非溶
解性で非膨潤性の溶媒、例えば水および水性緩衝液、Ｔ
ＭＳ。

ＤＭＳＯ１脂肪族アルコールを使用し、−５〜６０″Ｃ
２通常Ｏ〜３０″Ｃの範囲の温度にて、通常約８〜１４
の範囲のｐｉであろう。反応時間は約５分〜１２時間の
間で異なり得る。置換基は、次の分子の結合に利用可能
なアミノ基またはヒドロキシル基を供給するだろう。使
用する化合物は、普通約２〜８個の炭素原子、より普通
には２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原
子、より好ましくは２個の炭素原子を有するだろう、大
部分については、該化合物は脂肪族であり、そして脂肪
族的に飽和されたものであろう。反応中は、置換基の性
質に依存して、アミノ基は保護されてもよいし未保護で
もよい。保護基としては、ベンジルオキシカルボニル、
アセチル、ブチルオキシカルボニル等を包含するだろう
。

例となる化合物は、アミノエチルメル力ブタン、メルカ
プトエタノール、エチレンジアミン、他のアルキレンシ
アミンおよびトリアミンを包含する。

成る場合には、オリゴペプチドを調製するために酸、塩
基またはヒドラジン除去可能なベンジルアルコール官能
基を用意することにより、リンク基を更に延長すること
が望ましいかもしれない。

種々ノヘンジルアルコール誘導体を利用可能なアミノ基
との反応のために使用することができ、この場合、該ア
ミノ基に結合する延長分子は、少なくとも７個で且つ多
くても約１４個の炭素原子、通常多くても約１２個の炭
素原子を有するであろう。

製造されるオリゴペプチドの切断および単離を考慮して
、エステル結合を提供するベンジルアルコールを使う。

これに対して、オリゴペプチドをポリスチレン固体支持
体に結合したままにしておく場合、安定なアミド結合が
好ましい。

大部分については、製造されるオリゴベプチドは、天然
に存在するＬ−アミノ酸かまたは通常は天然に存在しな
いＤ−アミノ酸のいずれかのアミノ酸から単に成るであ
ろう。しかしながら、所望により、アミノ酸以外の分子
が鎖の内部にまたは末端基として含まれてもよい。非天
然アミノ酸、例えばｐ−アミノ安息香酸、４−アミノ酪
酸等を使用することもできる。アミノ酸に対する言及に
ついては、分子がカルボキシル官能基とアミノ官能基を
有する場合総称してこの用語を用いることにする。

本発明の目的上、ポリスチレンの透明度が維持されるこ
とが好ましい。従って、効率的であり、高レベルの忠実
度を提供し、通常入手可能な試薬を使用し、そして容易
に再現され得る方法が考案された。この系では、ポリス
チレンと反応するかまたは作用するであろう溶媒および
試薬は避けられる。アミノ酸反応体は、使用する溶媒中
での溶解性について選択される。アミノ酸は、常用の保
護基を使って保護された末端アミノ基を通常有するだろ
う。本発明には、フルオレニルメトキシカルボニル基が
効果的であることがわかり、そして好ましい。適当であ
れば他の基も使用することができる。

使用するモノマーは、それらを結合させようとする官能
基と反応できるように活性化されるだろう。大部分につ
いては、種々の方法で、特に無水物または活性化エステ
ルとして活性化されるであろうカルボキシル基を含むで
あろう。無水物は、大部分は対称無水物であるが、ある
場合には混合無水物を使用することもできる。混合無水
物は、通常モノマーのカルボン酸エステル無水物を含む
だろう。あるいは、活性エステルを使用することができ
、この場合種々のアルコールまたはフェノールが使用さ
れ得る。多くは、特定のモノマーに応して、異なるエス
テル化剤が使用されるだろう。

特に着目のエステル化剤には、ペンタフルオロフェノー
ル、■−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３．４−ジヒ
ドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ１．２．３−ベンゾ
トリアジン、４−ニトロフェノール、２．４−ジニトロ
フェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイくド、およびペ
ンタクロロフェノールが含まれる。

活性化されたモノマーは、曇らない溶媒中でリンク基ま
たは伸長類に付加されるであろう。望ましくは、溶媒と
して、通常約ｌ：３〜３：Ｉ、好ましくは約１：１の比
におけるテトラメチレンスルホンとジメチルスルホキシ
ドが使用されるであろう。反応時間は、通常少なくとも
約０．５時間で且つ多くても約３時間、通常約１〜２時
間の範囲で異なるだろう。モノマーの濃度は、通常約０
．０５〜１．０　Ｍの範囲であろう。望ましくは、室温
が使用されるが、低または高温、通常約４〜６０″Ｃの
範囲内の温度も使用され得る。

反応の完了後、溶液が除去され、そして未反応のアミノ
基がキャッピングされ得る。キャッピングには、アセチ
ル化剤、便利には１−アセチルイごダゾールが使用され
得る。１：ｌのＴＭＳ／ＤＭＳＯ中のキャツピング剤溶
液は、少なくとも約０．５時間で且つ通常約３時間を超
えず、普通は約２時間を超えない時間使用され、通常１
時間で十分であろう。キャツピング剤の濃度は、普通食
なくとも約０．５Ｍであり、且つ多くても約１６５Ｍ、
より普通には多くても約１Ｍであろう。

キャッピング終了後、保護基が除去される。通常、窒素
が環、特に５〜６個の炭素原子を有する環の一員であり
そして望ましくはヒドロキシル基を有する、複素環アミ
ンが使用される。好ましいのは４−ヒドロキシピペリジ
ンである。脱保護アミンの濃度は通常約０．１〜１．０
Ｍの範囲であり、そして脱保護は、１０″Ｃ〜３０″Ｃ
のいずれの温度でも使用することができるが、通常はぼ
室温において行われるだろう。溶媒は上記で使用したも
のと同じであろう。

次いで脱保護溶液が除去され、そして次のモノマーを添
加することによりサイクルが繰返される。

この方法は、通常少なくとも５サイクル間行われ、モし
て２５サイクル以上の間行うこともできる。本方法は、
１５モノマーを超えないペプチドに関しては高い収率を
供給するけれども、サイクルごとに収率が減少すること
は理解される。

合成の終了後、上述のようにして末端アミノ基が脱保護
され、次いで側鎖官能基が脱保護される。

側鎖官能基は特定のモノマーに応じて異なるので、脱保
護条件は、最も厳密な条件を必要とする側鎖官能基に十
分となるものが使用されるだろう。あまり厳密でない条
件で十分であれば、厳密でない条件を使用することがで
きる。大部分については、種々の酸処理、便利には室温
で少なくとも約１２０分間、好ましくは少なくとも１８
０分間の水中９５％トリフルオロ酢酸処理が使用され得
る。ペプチドがエステル結合により固体支持体に結合さ
れている場合、酸加水分解はまたペプチドを該支持体か
ら遊離せしめる。

本発明は、約１０アミノ酸より多いオリゴペプチドにつ
いて少なくとも約７０％の最低純度を提供する。加えて
、マルチウェルブレートのウェル当り、１ナノモル以上
を得ることができる。

支持体に結合されたペプチドは、様々な用途を見つける
ことができる。便利には、診断アッセイにおいて使用す
るためのりガントとしてペプチドが調製され得る。従っ
て、媒質中の分析物と競合して酵素〜抗体接合体が支持
体上のオリゴペプチドに結合するため、該ペプチドは着
目のりガンドヒ交差反応する。常用のアッセイ、例えば
ＥＬＩＳＡアッセイが有利に使用され得る。例えば、米
国特許第３．８５０．７５２号を参照のこと。プレート
を前もって調製し、これを着目のリガンドについてのＥ
ＬＩＳＡアンセイに直接使用することができる。

加えて、オリゴペプチドを含むプレートは、レセプター
のスクリーニングのため、オリゴペプチドと特異的に結
合する細胞、レセプター、抗体等を単離するため、オリ
ゴペプチド配列を変更することによってそのような結合
分子の構造的コンホメーションを調べるため、等に利用
することができる。

次の例は説明のために与えられ、限定のためではない。

〔実施例〕

グイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ポリスチレンミクロ
タイタープレートを、次のようにしてＮ−ヒドロキシメ
チル２−ブロモアセトアミド（ＢＡ）で機能化した。テ
トラメチレンスルホン（ＴＭＳ）中のＮ−ヒドロキシメ
チル２−ブロモアセトアミドの・０．２Ｍ溶液を、１：
ｌの比で２Ｍ）リフルオロメチルスルホン酸（ＴＭＳＡ
）と混合し、そしてその反応溶液を即座に旦クロタイタ
ープレートウェルに添加した。その反応溶液を室温で５
時間ポリスチレン表面と接触させておき、次いで無臭に
なるまで水で洗浄し、そして室温で一晩風乾する。この
表面は、乾燥した遮光環境中で少なくとも２週間安定で
あった。ポリスチレン表面１平方センチメートル（ｃｄ
）当り少なくとも０．１　ｄの反応溶液を使った。

ボｉスチレンの　　　　ＡＥＡ　　： ＢＡ活性化表面を、１　：　１　（ｖ／ｖ）のＴＭＳ／
ＤＭＳＯまたは０．２５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３／水中の０．
１５Ｍ溶液を使って２−アミノエタンエチオール（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）　と反応させ、ペプチド合成用のアミノエ
チルアセドア藁ド（ＡＥＡ）第一アミン表面を提供した
。

ＢＡ裏表面らＡＥＡ表面への変換は、ＡＥＡウェルヲＤ
ＭＳＯ中の５ｍＭブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）で
処理することによりテストした。この色素はアミン基と
イオン対を形成する。該色素は、１０％ＤＭＳＯを含む
５０ｍＭ炭酸塩（ｐＨ＝　９．２　）を使って遊離され
得る。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って５７０ｎｍ
での可溶性色素の吸光度（６５０ｎｍでのバックグラウ
ンドを差し引いたもの）を測定する。

この技術は、固相多重ペプチド合ｅ、（ＳＰＭＰＳ）の
カップリング段階および脱保護段階を定量的にモニター
するのに頻繁に使用した。

第１表中のデータは、ＢＡ裏表面らＡＥＡ表面の変換を
調べるためのＢＰＢ／アミン結合の適用を示す、この転
換はＥＳＣＡによっても確認された。

ポリスチレンおよびＢＡ裏表面対する非特異的な色素染
色は低レベルであった。

第−」−一表 ＡＥＡプレートへのブロモフェノール 色素の結合 ０．００２±０．００１　　　　０．００４±０．００
１　０．７６７±０．０８４ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）およびＤＭＳＯとテトラメチレンスルホン（Ｔ
ＭＳ）との１＝１混合物に対するペプチド合成表面の安
定性をテストした。　Ｆｍｏｃ−アミノ酸−０Ｐｆｐエ
ステルは、ＴＭＳ単独では完全に可溶性ではなく、ＤＭ
ＳＱには非常に可溶性であった。　（Ｆｍｏｃ　＝フル
オレニルメトキシカルボニル、０Ｐｆｐ＝ペンタフルオ
ロフエニル）。

ＴＭＳ　：　ＤＭＳＯのｌ：ｌ混合物を溶媒として使っ
た。

この溶媒系は、自動ピペッタ−システムに適応できる（
即ち、硬質製品に対し非破壊性である）。

安定性の研究は、ＳＰＭＰＳ表面にアラニンを結合させ
、そして試薬の高値段のために一〇〇−アミノ酸−〇Ｐ
ｆｐエステルの使用（即ち至当な溶媒）を除外して、ペ
プチド台底の１５サイクルを行った。５゜１０および１
５サイクルの終わりにアラニンの分析を必要としたので
、酸で開裂可能なリンカ−である４−ヒドロキシメチル
フェノキシ酢酸を、それのペンタフルオロフェニルエス
テルを介してＡＥＡプレートに結合しく後記参照）、そ
して０．１　Ｍジイソプロピルカルボジイミド、０．１
　ＭＦｍｏｃ−アラニン、０．０５Ｍジメチルアミノピ
リジンを使った常法により、該リンカ−プレートにＦｍ
ｏｃ−アラニン対称無水物を結合させ、反応を９０分間
進行させた。

次いでＢｅｃｋｍａｎ　Ｂｉｏｍｅｋ　１０００自動ピ
ペッタ−にまり合成サイクルを実施した。

５．１０および１５サイクル終了後、ウェルをＴＦＡ／
　ＩＩ！０（９５：　５　）で処理してアラニンを遊離
させ、これをアミノ酸分析により定量した。ＡＥＡ＋リ
ンカ−＋アラニンはＴＭＳ／ＤＭＳＯに対して少なくと
も１５サイクル間は安定であった。ＤＭＳＯのみは、１
５サイクルにわたり回収アラニンの６７％の減少を引き
起こした。

ペプチド合成表面からのアラニンの開裂後、該ウェルに
水を添加し、そしてＥＩｊＳＡ　リーダーにおいて５７
０ｎｍでプレートを測定した。ＳＰ？ＩＰＳのＯ（ポリ
スチレン）、５．１０および１５サイクルにおける吸光
度のデータを第２表に示す。ペプチド合成表面は光学濃
度の増加を全く示さなかった。もし曇りが生したならば
、ＳＰＭＰＳサイクルの数と共に光学濃度が増加したで
あろう。

第一１−表 光学濃度により測定されたＳＰＭＰＳ表面の曇りＳＰＭ
ＰＳサイクル ０サイクル ５サイクル １０サイクル ＡＳ７゜ ０．０４６ ０．０４６ ０．０４７ 未結合の′ＩＴ１離ア貴ノ基をキャッピングすることが
必要な時は、１−アセチルイミダゾールを使用した。キ
ャッピングは、ｌ：１のＴＭＳ／ＤＭＳＯ中０．５Ｍア
セチルイミダゾールを用いて室温で１時間行った。

ＢＰＢ結合の減少を使って、キャッピング効率を表わし
た。キャッピング試薬は水に敏感であるため、反応時間
は室温で１時間に維持した。このデータから、１．０時
間の反応時間では０．８　Ｍのキャッピング濃度を選択
した。

ペプチド人　　　　１　　： Ｆｍｏｃ−グリシンと結合されたＡＥＡプレートを使っ
て、脱保護段階の時間依存性を研究した。４ヒドロキシ
ピペリジンによるＦｎ＋ｏｃ基の脱保護は、正確な間隔
でブロモフェノールブルー試験を使っである時間に渡り
モニターした。最大の色素結合（即ちアごン基の最大の
脱保護）は約６分で到達した。ＳＰＭＰＳについては、
完全だ脱保護を保証するために脱保護は２０分間行った
。

ペプチド人　　カ　ブ１ング　＝ 幾つかのＦｍｏｃ−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエ
ステルを用いてＡＥＡプレートへのカップリング反応の
時間依存性を研究した。カップリングは、１：１のＴＭ
Ｓ／ＤＭＳＯ中０．１　ＭＰｍｏｃ−アミノ酸−０Ｐｆ
ｐを行いて９０分間行った。ダブルカップリングの場合
、反応溶媒の吸引後、ステップを繰返した（第３表参照
）。カップリングの完全性は、ブロモフェノール試験を
使って測定した：低いＢＰＢの読みは、高いカップリン
グ効率を示す。カップリング反応の後、ウェルをキャッ
プし、そして再びＢＰＢ試験を行った。この工程の効率
を洞察するために、カップリングしたアミノ酸を脱保護
し、モしてもとのＡＥＡプレートとの比較のために色素
でテストした。この比較は効率についての洞察としての
み役立ち、調べたカップリング全てについて非常に良好
であった。

第−旦一表 ＡＥＡ表面へのカップリング効率を評価するためのＢＰ
Ｂ結合”０ｂｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活
性エステル ペプチド八　　カ　プ１　ング　　　。

幾つかのＦｍｏｃ−アミノ酸活性エステルを、ＡＥＡに
結合したグリシン残基への比較的立体障害のないカップ
リングを遠戚する能力についてテストした。第４表のデ
ータは、カップリング（ＢＰＢ″の吸光度の減少により
モニターした）は１回目の９０分のカシプリング後に完
了し、２回目のカップリング後に幾らか改善されること
を示す。Ｆｍｏｃ　−保護ジペプチドを４−ヒドロキシ
ピペリジンで脱保護し、そして出発のＡＥＡウェルにつ
いてと同様にＢＰＢでテストした。出発のＡＥＡウェル
と脱保護されたＦｍｏｃ−ＡＡ　（アミ）酸〉ウェルと
を比較することにより得られた定量的結果は、２残基を
カップリングする全効率が高いことを示した。

事実、ＢＰＢ結合は出発のＡＥＡウェルよりもジペプチ
ドについて実際に高い。

勇−二り一変 ＡＥＡに結合したグリシンへのカップリング効率を評価
するためのＢＰＢ結合 ＦＭＯＣ−３ＥＰ” ＦＩＩＯＣ−３ＥＲ” ｏｏｈｂｔ”　　１ｘ −ＯＤｈｂｔ”　２Ｘ ０．００４ ０．００４ ０．４６３　　　０．４０６ ０．４５８　　　０．４０３ 側鎖はＬ−ブチルエステルとして保護。

”　　ｏｏｈｂｔは３．４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリア・ジン活性エ
ステルである。

ベプチ′へ　　カ　プｉング グリシンカップリング研究（第４表）において使ったＦ
ｍｏｃ−アミノ酸−活性エステルと同じグループを、よ
り立体障害のある残基、即ちＡＥＡに予め結合されてい
るイソロイシンとのカップリングについてテストした。

第５表の結果は、より立体障害の大きい縮合では２回の
カップリングサイクルの必要性を指摘している。このこ
とは、Ｐｈｅ。

ＰｒｏおよびＴｙｒ残基の１回目と２回目のカップリン
グ間の差により証明される。また、出発のＡＥＡ吸光度
とＢＰＢ−ジペプチド結合の定量的比較は、それらの非
常に立体障害のあるカップリング反応においてさえも、
非常に効率的な全カップリングを示すように見える。

迅−５−表 ＡＥＡに結合したイソロイシンへのカップリング効率を
評価するためのＢＰＢ結合 ＦＭＯＣ−ＬＹＳ（ＢＯＣ） ＦＭＯＣ−ＬＹＳ（ＢＯＣ） ＦＭＯＣ−ＰＨＥ−ＯＰｆｐ ＦＭＯＣ−ＰＩＩＥ−ＯＰｆｐ ＦＭＯＣ−ＰＲＯ−ＯＰｆｐ ＰＭＯＣ−Ｐｌ？０−ＯＰｆｐ ＯＰｆｐ　　ＩＸ ｏｐｒｐ　２Ｘ ０．００６ ０．００５ １　Ｘ　　　　Ｏ，０１２ ２Ｘ　　　　Ｏ，００６ １Ｘ　　　　Ｏ，０１５ ２Ｘ　　　　Ｏ，００６ ＦＭＯＣ−３ＥＰ” ＦＭＯＣ−３ＥＲ” ０Ｄｈｂｔ”　　ｌＸ ０Ｄｈｂｔ”　　２Ｘ ０．００４ ０．００３ ０．４２７　　　０．４０２ ０．４０９　　　０．３９５ ０．３３１　　　０．３８３ ０．３３８　　　０．３８１ ０．３３０　　　０．３７９ ０．３５２　　　０．３９９ ０．４２２　　　０．４００ ０．４４２　　　０．４２３ 側鎖はｔ−ブチルエステルとして保護。

”　　０Ｄｈｂｔは３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン活性エステ
ルである。

ペプ　′人　　　　の　　　　゛ 直接およびリンカ−５ＰＭＰＳ法の両方において、Ｎ−
末端残基のＦｍｏｃ基を側鎖の脱保護の前に除去する０
次いで酸処理により、側鎖保護基（ｔ−ブチルエステル
、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）および２．２，５
．７．８−ペン・ダメチルクロマン−６−スルホニル（
ＰＭＣ））を除去する。

側鎖の脱保護の時間推移を第６表に示す、異なる酸／水
の組合せを、Ｌｙｓ　（Ｂｏａ）およびＡｒｇ　（ＰＭ
Ｃ）側鎖保護基の脱保護を行う能力について調べた。と
いうのは、それらの側鎖はα−ＭＳＨの合成に最も関連
があるからである。

第−旦一表 時間とともに脱保護された塩基性残基へのＢＰＢ結合Ｂ
ｏｃ保護基は、９５％ＴＦＡ／Ｈ１Ｏを用°いた反応の
最初の３０分以内に最大の色素結合に達する。

ＰＭＣ基は９５％ＴＦ＾／Ｈ，０を用いた反応の１８０
分まで最大に達しない、この実験からの結論は、９５：
５のＴＦＡ　：　ｕｔｏ室温にて３時間が、Ｂｏｃおよ
びＬ−ブチルエステル／エーテル、並びにあまり感受性
でないＰＭＣのような基を除去するのに十分であった。

直接ＳＰＭＰＳにおいては、ペプチドがプレートに共有
結合したままで、ペプチドの側鎖保護基をＴＦＡ／Ｉｈ
Ｏで脱保護した。この時点で、ペプチドをＥＩＪＳＡの
ような方法により分析する用意ができた。

リンカ−ＳＰＭＰＳ　（リンカ−はヒドロキシメチルフ
ェノキシ酢酸である）においては、ＴＦＡ／Ｈ，Ｏによ
りペプチド側鎖保護基を脱保護すると同時にペプチドを
プレートから開裂せしめた。該ペプチドに関して配列分
析を直接行うことができた。加えて、脱保護ア【ノ酸を
６ＮＨＣｆで１１０℃で２４時間加水分解することによ
り、アミノ酸分析を行うことができた。

ア果ノ　　　　（α−ＭＳＨ）　ニ リンカ一方法論を使った合成後、α−メラニン細胞刺激
ホルモン（α−ＭＳＩ（）に関するアミノ酸分析を行っ
た。このデータを下の第７表に示す。

易エニし一表 α−ＭＳＨについてのアミノ酸分析データＰｒｏ＝Ｐ Ｌｙｓ＝Ｋ Ｇ＋ｙ＝ｃ Ｔｒｐ＝Ｗ へｒｇ＝Ｒ Ｐｈｅ＝Ｆ Ｉｔ　ｉ　ｓ　＝　Ｉｔ Ｇｌｕ＝Ｅ！ Ｍｅｔ＝門 ５ｅｒ＝Ｓ １．０００ １　、０００ １．０００ １　、０００ １　、０００ １．０００ １．０００ ｔ、ｏｏ。

１．０００ ２．０００ １．０００（１０６２７） ０．６０６（６４３６） ０．３８０（４０３５） １．０００（５３８１） ０．５３１　（２８５７） ０．３７７（２０２７） ０．２５１（２６６７）　　０．２３９（１２８Ｂ）０
．２３６（２７９４）　　０．２３Ｈ１２４４）０．２
９６（３１４Ｂ）　　０．２５７（１３８９）０．２６
４（２８０６）　　０．２３０（１２４０）０．１００
（１０４８）　　０．１０３（５５５）０．５５５（５
９００）　　０．６３２（３４００）１．０００（５Ｂ
？？） ０．５６２（３３０６） ０．３９１（２３００） ０．２２１　（１３０２） ０．２３０（１３５５） ０．２６０（１５２９） ０．２３２（１３６６） ０．０１５（９１） ０．５７７（３３８９） （）−アミノ酸分析からのピーク面積 注：α−ＭＳＩ（１１＝最初の７残基にキャッピングを
行って合成されたα−ＭＳＲ。

α−ＭＳＩ−１１２および１３＝キヤツピングなしで合
成されたα−ＭＳＨ。

二のデータは、キャッピングを行った合成と行わない合
成との間に有意な差がないことを示した。

Ｔｒｐの分析は、６ＭＨＩ加水分解中の分解のために不
可能であった。メチオニンは、おそらく酸加水分解中の
酸化のために少なかった。

この研究からの結論は、正しい残基が好結果の合成を示
す量で存在することである。このことは、α−ＭＳＨの
配列分析（下記参照）により確かめられる。初めの方の
残基は後の方の残基よりも高い量である（３回の合成の
全てにおいて、検出されたリジンの４０％低および検出
されたグリシンの３３％低が認められた）。

アミノ　　　　Ｌｅｕ−５−エンケファ　ン　：Ｌｅｕ
−５−エンケファリンペプチドのアミノ酸分析を下の第
８表に示す。ロイシン、チロシンおよびフェニルアラニ
ンの比率は理論値に近い。

しかしながら、グリシンの比率は理論値よりも有意に高
いことがわかった。

蓬−８−表 Ｌｅｕ−５−エンケファリンの配列分析Ｌｅｕ＝Ｌ　　
　　　１　、０００　　　　３１４３　　　　０．６４
３Ｐｈｅ＝Ｆ　　　　　１　、０００　　　　４Ｂ９１
　　　　１　、０００Ｇｌｙ＝Ｇ　　　　　２．０００
　　　　１５５４８Ｂ　　　３．１６７Ｌｅｕ−５−エ
ンケファリンの実験において、幾つかのペプチド鎖につ
いての起こり得る立体的必要条件が避けられる。これは
、より満足できるアミノ酸分析値をもたらす。グリシン
は理論値よりも５０％高く、これは二重カップリングか
または汚染の結果である。残余の４−ヒドロキシピペリ
ジンが存在すれば、二重カップリングが生じる。

これは、Ｂｉｏｍｅｋ脱保護サブルーチンに余分な洗浄
を加えることにより避けられる。

１　　　α−旧■）： α−ＭＳＨＩｆについてのアミノ酸分析データ（第７表
）に加えて、配列分析を行った。そのデータを第９表に
示す。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４２０
ＡＤｅｒｉｖａｔｉｚｅｒにおける反復エドマン分解に
よる配列分析は、α−ＭＳＨ中の全ての残基（Ｔｒｐを
除く）について理論値の７０％以上の収率で正しいフェ
ニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を与えた。デ
ータの定量分析は、検出されたＮ−末端セリンの量に基
づくと、各ウェルが約１ナノモルの完全なペプチドを含
むことを示した。ピコモル範囲のペプチドの量がＥＬｒ
ＳＡ検出に必要であると考えられるので、明らかに本発
明は、各ウェルに十分な量の合成ペプチドを提供する。

はとんど全ての場合、主たるＰＴＨアミノ酸は、配列中
の次の残基に相当する少量の％のＰＴＨアミノ酸と共に
検出された。この“前兆（ｆｏｒｅｓｈａｄｏｉｍ−ｉ
ｎｇ）　’“は、おそらく機械の加工品であるか、また
はα−ＭＳＨ中の最後のセリン残基を完全にカップルで
きなかったものである。どちらの場合でも、７０％が合
成ペプチドの最低純度であることを示唆する。

トリプトファンは理論上存在しているはずであるが、検
出できなかった。トリプトファンが検出されるはずであ
るサイクル（サイクル９）で検出された主な残基は、ト
リプトファンの°“前兆”°残基のグリシンであった。

これは、全体的な脱保護条件によりＴｒｐが破壊される
ことを意味し、スカベンジャーの添加を含む全体的脱保
護条件を開発する強力な必要性を強調している。

匙ヨＬ１ α−ＭＳＩＩについてのＳ＋扮析データＳｅｒ＝Ｓ Ｔｙｒ＝Ｙ Ｓｅｒ＝Ｓ Ｍｅｔ＝Ｍ Ｇ１ｕ＝Ｅ Ｈｉｓ＝）！ Ｐｈｅ＝Ｆ Ａｒｇ＝Ｒ Ｔｒｐ＝Ｗ ｃｔｙ＝ｃ Ｌｙａ＝に Ｐｒｏｘ＝Ｐ Ｖａｌ＝Ｖ Ｓ　（Ｇ）　（Ｙ） Ｙ　（Ｌ） Ｓ（川 Ｍ　（Ｅ） Ｈ（Ｆ） Ｆ　（Ｒ） Ｒ（Ｇ） Ｇ（に） Ｇ　（Ｋ） Ｋ　（Ｐ） Ｐ　（Ｖ） ■ ３１４７　（６１３）　（４７０） ４２０６　（５６０） ３００５　（２１９） ５４５Ｂ　（１９０） ７３３ ７５３　　（２８０） ２１７０　（６１０） １４６５　（３４０） １０２２　（２４０） １７０３　（６９０） １２５Ｂ　（２６２） ３９３（９０） ４５ データは、８つの合成ウェルおよび１／３希釈の試料に
基づく。ペプチドの量は次のようにして決定され得る：
最後に合成された残基（セリン）　＝　３，１４７ピコ
モル×３／８−約１ナノモル／ウェル。

０　検出された全ピークについて全吸光度の３％以上を
有するＰＴＨアミノ酸を挙げる。他のピークは全てバン
クグラウンドとみなした。

ＥＬＩＳＡ（エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイ）は、ＳＰＭＰＳ技術の最も有用な可能性ある応用
である。ＡＢＡ表面上での該ペプチドの直接合成に続く
側鎖保護基の酸脱保護によるＳＰＭＰＳにおいてＥＬＩ
ＳＡを成し遂げた。次に、非特異的結合を少なくするた
めに、ウェルをウシ血清アルブミンでブロックした。ウ
サギ抗−（α−ＭＳＨ）またはウサギ抗−Ｌｅｕ−５−
エンケファリンをウェルに添加し、そして該ペプチドを
認識する抗体を結合させた。結合したウサギ抗体の結合
の検出は、ヤギ抗−ウサギＩｇＧに接合されたアルカリ
ホスファターゼ（ＡＰ）とのインキュベーション、次い
で過剰な接合体を除去するための洗浄、およびＡＰの基
質であるｐ−ニトロフェニルホスフエ−トの添加により
達成された。ＡＰは該基質を転換してｐ〜ニトロフエル
−トを生成せしめ、これをＥＬＩＳＡプレートリーダー
中で４０５ｎｍにて分光光度的に検出した。ポリスチレ
ンミクロタイタープレートに受動的に吸着されたウサギ
ＩｇＧの希釈液を種々の希釈度の該接合体で検出した。

１：３５００の最終希釈度が最適であることがわかった
。

対照ウェル（ウサギＩｇＧなし）は低いバックグラウン
ド結合を示した（４０５−６５０ｎｍでの吸光度＜０．
０４０）。これはＳＰＭＰＳ　ＥＩｊＳＡ研究へのこの
接合体の利用が妥当であることを示した。

ペンタペプチド（Ｙ−Ｇ−Ｃ−Ｆ−Ｌ）であるＬｅｕ−
５−エンケファリンペプチドに関してＩＥＬＩｓＡを行
った。ウサギ抗＝（Ｌｅｕ−５−エンケファリン）への
結合について幾つかの別の表面と比較した：Ｎ−末端Ｆ
ｏ＋ｏｃ−エンケファリン（ＦＭＯＣ−ＥＮＫ）、ペプ
チドの酸遊離後のリンカ−合成Ｌｅｕ−５−エンケファ
リン（Ｌ−ＥＮに）、トリペプチドＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ（Ｆ　−Ｇ　−Ｙ　）　、およびＮ−末端アセチル
化Ｌｅｕ−５−エンケファリン（ＥＮＫ−ＡＣ）　、下
のデータは、予想通り、ＥＮＫおよびＥＮＫ　−ＡＣで
最も強い免疫反応性が認められたことを示す、トリペプ
チドＦ−Ｇ−Ｙとは幾らか交差反応性があった。　ＦＭ
ＯＣ−ＥＮＫペプチドについては全く免疫反応性が認め
られなかった。Ｌ−ＥＮＫウェルに観察されたわずかな
免疫反応性は、酸加水分解後、幾らかのペプチドがウェ
ルに結合したままであることを指摘するだろう。

下表は、工程のフローチャートである。

洗浄”　　　　　　ＳＰＭＰＳ表面　　　ＴＭＳ／ｒｊ
Ｆ’ｌｓ０　　３洗浄　　　　　ＳＰＭＰＳ表面　　　
ＴＭＳ／ＤＭＳＯ３洗浄　　　　　ＳＰＭＰＳ表面　　
　ＴＭＳ／ＤＭＳＯ３−−−全サイクルは最初の洗浄で
始まる。

キャッピングは配列を連結するのに“困難°゛なものに
ついてのみ行った。ＢＰＢテストを再連結後、キャッピ
ング後および／または脱保護後に行った。

〔発明の効果〕

上記の結果から、本方法論は、比較的多量のオリゴペプ
チドを高い忠実度で製造するための便利で迅速な方法に
備えることが明らかである。従って、表面が特定の配列
かまたは複数の関連もしくは無関連の配列を有する装置
を、アッセイ、リサーチ等における利用のために提供で
きる。加えて、この支持体から容易に遊離し、そして薬
剤として、競合アッセイにおけるリガンドとして、等で
利用することのできるオリゴペプチドを調製することが
できる。該方法は、反応の過程を観察でき、そして問題
が生じた場合には反応を止めることができるように、光
学的に透明な固体支持体が考慮されている。更に、アッ
セイを行う場合には、分光光度計を効果的に使用できる
ように、透明な支持体は光の透過が考慮されている。従
って、この方法論は、ラベルが光の検出を必要とする蛍
光または酵素アッセイの実施を可能にする。

今まで本発明を理解の明確化のために説明および実施例
により幾分詳細に記載してきたが、特許請求の範囲また
は精神から逸脱することなく、幾つかの変更および改良
を行い得ることは、当業者に明白であろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光学的に透明なポリスチレン支持体に結合したアミ
   ノ酸モノマーの連続付加によりオリゴペプチドを調製す
   る方法であって、 （ａ）テトラメチレンスルホンとジメチルスルホキシド
   の混合物を含んで成る反応溶媒中で、リンク基を介して
   前記ポリスチレン表面に結合したアミノまたはヒドロキ
   シル官能基と保護された活性アミノ酸モノマーとを反応
   させ、前記活性エステル基と前記官能基との間に結合を
   形成せしめ、結合された最初のモノマーを提供し； （ｂ）未反応のアミノ酸モノマーを除去し、そして前記
   結合された最初のモノマーを前記溶媒中で環状アミノ基
   により脱保護し、利用可能なアミノ酸アミノ基を提供し
   ； （ｃ）前記アミノ酸アミノ基を前記反応溶媒中で次の保
   護された活性アミノ酸モノマーと反応させ、更なる１つ
   のアミノ酸によりペプチド鎖を延長し； （ｄ）未反応の利用可能なアミノ基をキャッピングし； （ｅ）最後から２番目のアミノ酸モノマーが反応するま
   で（ｃ）、（ｄ）および（ｂ）の順で段階を繰り返し；
   そして （ｆ）最後のアミノ酸モノマーを用いて段階（ｃ）およ
   び（ｂ）を繰返す； ことを含んで成る方法。 ２、前記リンク基がメチレンアミノアセチル基を含んで
   成る、請求項１に記載の方法。 ３、前記リンク基が前記アセチル基にチオを介して結合
   されたチオアルキレンアミンまたはヒドロキシ基を含ん
   で成る、請求項２に記載の方法。 ４、前記リンク基が前記アミノ基に結合されたベンジル
   アルコール基を含んで成る、請求項３に記載の方法。 ５、前記ポリスチレン表面が、前記表面と次の式の化合
   物： Ｘ（Ｒ）ＣＨＣＯＮＨＣＨ＿２Ｙ （上式中、Ｒは１〜３個の炭素原子を有するアルキル基
   または水素であり； Ｘはハロゲンまたは擬似ハロゲンであり；そしてＹは求
   核置換可能な基である） とを、強いプロトン酸の存在下で、前記化合物が前記ポ
   リスチレンとその表面で反応するのに十分な時間、約−
   ５℃〜６０℃の範囲の温度で反応させることにより機能
   化される、請求項１に記載の方法。 ６、光学的に透明なポリスチレン表面に結合されたアミ
   ノ酸モノマーの連続付加によりオリゴペプチドを調製す
   る方法であって、 （ａ）テトラメチレンスルホンとジメチルスルホキシド
   の混合物を含んで成る反応溶媒中で、リンク基を介して
   前記ポリスチレン表面に結合したアミノまたはヒドロキ
   シル官能基と保護された活性アミノ酸モノマーとを反応
   させ、前記活性エステル基と前記官能基との間に結合を
   形成せしめ、結合された最初のモノマーを提供し、ここ
   で前記活性アミノ酸がペンタフルオロフェノール、１−
   ヒドロキシベンゾトリアゾール、３，４−ジヒドロ−３
   −ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリア
   ジン、ｐ−ニトロフェノールまたはＮ−ヒドロキシスク
   シンイミドのエステルであり； （ｂ）未反応のアミノ酸モノマーを除去し、そして前記
   結合された最初のモノマーを前記溶媒中で４−ヒドロキ
   シピペリジンにより脱保護し、利用可能なアミノ酸アミ
   ノ基を提供し； （ｃ）前記アミノ酸アミノ基を前記反応溶媒中で次の保
   護された活性アミノ酸モノマーと反応させ、更なる１つ
   のアミノ酸によりペプチド鎖を延長し； （ｄ）未反応の利用可能なアミノ基を１−アセチルイミ
   ダゾールでキャッピングし； （ｅ）最後から２番目のアミノ酸モノマーが反応するま
   で（ｃ）、（ｄ）および（ｂ）の順で段階を繰り返し；
   そして （ｆ）最後のアミノ酸モノマーを用いて段階（ｃ）およ
   び（ｂ）を繰返す； ことを含んで成る方法。 ７、前記反応溶媒がテトラメチレンスルホンとジメチル
   スルホキシドとの実質的に等量の混合物である、請求項
   ６に記載の方法。 ８、前記リンク基が脂肪族第一アミン、脂肪族第一ヒド
   ロキシル、またはベンジルアルコールで終わる、請求項
   ７に記載の方法。 ９、光学的に透明であり；アミノまたはオキシ基で終わ
   っているリンク基を用いて高密度で表面が機能化されて
   おり；そして前記末端のアミノまたはオキシ基にアミノ
   酸またはオリゴペプチドが結合されており、ここで前記
   オリゴペプチドは組成において実質的に均質である；こ
   とを特徴とする二次加工されたポリスチレン装置。 １０、前記リンク基がメチレンアミノアセチル基を含ん
   で成る、請求項９に記載の装置。１１、前記リンク基が
   チオを通して前記アセチルに結合したチオアルキレンア
   ミン基を含んで成る、請求項１０に記載の装置。 １２、光学的に透明であり；アミノまたはオキシ基で終
   わっているリンク基を用いて高密度で表面が機能化され
   ており；そして前記末端のアミノまたはオキシ基にアミ
   ノ酸またはオリゴペプチドが結合されており、ここで前
   記オリゴペプチドは組成において実質的に均質である；
   ことを特徴とするビーズ。