JP3266600B2 - 固相ペプチド合成のための樹脂を製造する方法 - Google Patents
固相ペプチド合成のための樹脂を製造する方法Info
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- C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
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Description
【０００１】スペーサーアームは、現代の生化学の多く
の領域において必須である。スペーサーアームは、１つ
の分子をもう一つの分子にまたは不活性支持体に結合す
る分子として定義することができる。例えば、ポリエチ
レングリコールは、酵素を、酵素の活性を保留しなが
ら、不溶性担体及び他の生体分子に結合するために有利
に使用されてきた。Ｍ．Ｓｔａｒｋ及びＫ．Ｈｏｌｍｂ
ｅｒｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．、３
４：９４２〜９５０（１９８９）。この概念は、固定さ
れた酵素を使用する工業的プロセス（例えば、親和力カ
ラム精製プロセス）のための、そして診断評価（例え
ば、ＥＬＩＳＡ評価）のための重要な結果を有する。ポ
リエチレングリコールスペーサーアームが使用されてき
た２つのその他の領域は、ペプチド合成及びシークエン
シング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）である。保護されたヌ
クレオチド及びアミノ酸残基の不活性支持体例えばシリ
カ、膜及びポリスチレン支持体へのカップリング速度
は、しばしば支持体主体からの反応サイトの分離に釣り
合って増加する。類似の効果が、固相の固定されたサン
プルのシークエンシングに関しても示された。Ｊ．Ｋ．
Ｉｎｍａｎら、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、Ｐｒｅｖｉｅｒｏ ａｎｄ Ｃｏｌｅｔｔｉ
−Ｐｒｅｖｉｅｒｏ、（編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、北
オランダ、Ｂｉｏｍｅｄ．出版社、８１〜９４頁（１９
７７）。
の領域において必須である。スペーサーアームは、１つ
の分子をもう一つの分子にまたは不活性支持体に結合す
る分子として定義することができる。例えば、ポリエチ
レングリコールは、酵素を、酵素の活性を保留しなが
ら、不溶性担体及び他の生体分子に結合するために有利
に使用されてきた。Ｍ．Ｓｔａｒｋ及びＫ．Ｈｏｌｍｂ
ｅｒｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．、３
４：９４２〜９５０（１９８９）。この概念は、固定さ
れた酵素を使用する工業的プロセス（例えば、親和力カ
ラム精製プロセス）のための、そして診断評価（例え
ば、ＥＬＩＳＡ評価）のための重要な結果を有する。ポ
リエチレングリコールスペーサーアームが使用されてき
た２つのその他の領域は、ペプチド合成及びシークエン
シング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）である。保護されたヌ
クレオチド及びアミノ酸残基の不活性支持体例えばシリ
カ、膜及びポリスチレン支持体へのカップリング速度
は、しばしば支持体主体からの反応サイトの分離に釣り
合って増加する。類似の効果が、固相の固定されたサン
プルのシークエンシングに関しても示された。Ｊ．Ｋ．
Ｉｎｍａｎら、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、Ｐｒｅｖｉｅｒｏ ａｎｄ Ｃｏｌｅｔｔｉ
−Ｐｒｅｖｉｅｒｏ、（編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、北
オランダ、Ｂｉｏｍｅｄ．出版社、８１〜９４頁（１９
７７）。
【０００２】固相核酸若しくはペプチド合成またはシー
クエンス分析の有効性は、反応性サイトを固定する固相
または支持体によって影響される。ポリスチレンゲルま
たは多孔性ガラスは、両方とも、例えば、ペプチドシー
クエンシングのための固体支持体として利用されてき
た。多くの応用においては、このプロセスにおいて使用
される溶媒は、ポリスチレン粒子の体積を変化せしめ、
そしてこれは、反応カラムの閉塞及び背圧を引き起こす
可能性がある。逆に、多孔性ガラスは完全に堅くそして
体積が変化しないが、多孔性ガラス誘導体の化学的特性
は、再現性を欠いてきた。反応性基がポリマー粒子に結
合され得るように誘導されたポリマー粒子、例えばポリ
スチレン粒子は、多くの応用において有用であることが
証明された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造体
は、それらが広い範囲の溶媒と適合性であるので、化学
的に不活性なスペーサーアームとして使用されてきた。
Ｉｎｍａｎら、上記文献。ＰＥＧスペーサーアームの使
用は、支持体によって引き起こされる立体的な効果を最
小にする。ＰＥＧスペーサーアームは、細孔スペースの
特性を、支持体結合された反応性部分が広い範囲の溶媒
及び試薬と適合性であるように改質するというもう一つ
の有用な機能を与える。
クエンス分析の有効性は、反応性サイトを固定する固相
または支持体によって影響される。ポリスチレンゲルま
たは多孔性ガラスは、両方とも、例えば、ペプチドシー
クエンシングのための固体支持体として利用されてき
た。多くの応用においては、このプロセスにおいて使用
される溶媒は、ポリスチレン粒子の体積を変化せしめ、
そしてこれは、反応カラムの閉塞及び背圧を引き起こす
可能性がある。逆に、多孔性ガラスは完全に堅くそして
体積が変化しないが、多孔性ガラス誘導体の化学的特性
は、再現性を欠いてきた。反応性基がポリマー粒子に結
合され得るように誘導されたポリマー粒子、例えばポリ
スチレン粒子は、多くの応用において有用であることが
証明された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造体
は、それらが広い範囲の溶媒と適合性であるので、化学
的に不活性なスペーサーアームとして使用されてきた。
Ｉｎｍａｎら、上記文献。ＰＥＧスペーサーアームの使
用は、支持体によって引き起こされる立体的な効果を最
小にする。ＰＥＧスペーサーアームは、細孔スペースの
特性を、支持体結合された反応性部分が広い範囲の溶媒
及び試薬と適合性であるように改質するというもう一つ
の有用な機能を与える。
【０００３】ＰＥＧ改質されたポリスチレン（ＰＥＧ−
ＰＳ）樹脂は、固相ペプチドシークエンシングにおける
使用のために記述されてきた。Ｉｎｍａｎら、上記文
献。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂はまた、相移動触媒として利用さ
れてきた。Ｗ．Ｍ．ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５４１〜５４
３頁（１９７８）；Ｓ．Ｌ．Ｒｅｇｅｎら、Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０１：１１６〜１２０（１
９７９）；Ｊ．Ｇ．Ｈｅｆｆｅｒｎａｎら、Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ II、５１４〜５１７頁（１
９８１）；Ｙ．Ｋｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、４８、３８５〜３８６（１９８３）；Ｍ．Ｔｏｍ
ｏｉら、反応性ポリマー、１０：２７〜３６（１９８
９）。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、固相ペプチド合成のための
支持体として記述されてきた。Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍａｋ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．、
３：２１７〜２２３（１９８２）；Ｈ．Ｈｅｌｌｅｒｍ
ａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８４：２
６０３〜２６１７（１９８３）。しかしながら、引用し
た方法によって製造されたＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、数個の
欠点をこうむる。高分子量ＰＥＧ（例えば、４００ドル
トンより大きい）に関しては反応は不十分にしか進ま
ず、そして対称性２官能ＰＥＧは橋かけを形成する傾向
があった。これらの問題は、エチレンオキシドの橋かけ
されたポリスチレンの上への直接のアニオン重合によっ
て軽減された。Ｂａｙｅｒら、ペプチド：構造及び機
能、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｈ（編
集）、Ｐｒｏｃ．８ｔｈ Ａｍ．ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍ
ｐ．８７〜９０頁、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８３）中で。Ｂａｙｅｒ
及びＲａｐｐ、ドイツ特許ＤＥ ３５００１８０ Ａ１
（１９８６）。しかしながら、この方法を使用するとＰ
ＥＧ連鎖長さは制御することが困難であり、そしてＰＥ
Ｇポリマーの均一性は不確かである。このプロセスに関
するもう一つの問題は、ポリスチレンは高度に毒性であ
るクロロメチルエーテルを使用して官能化され、そして
残留のクロロメチル基はペプチド合成の間に副反応を引
き起こす可能性があるということである。
ＰＳ）樹脂は、固相ペプチドシークエンシングにおける
使用のために記述されてきた。Ｉｎｍａｎら、上記文
献。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂はまた、相移動触媒として利用さ
れてきた。Ｗ．Ｍ．ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５４１〜５４
３頁（１９７８）；Ｓ．Ｌ．Ｒｅｇｅｎら、Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０１：１１６〜１２０（１
９７９）；Ｊ．Ｇ．Ｈｅｆｆｅｒｎａｎら、Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ II、５１４〜５１７頁（１
９８１）；Ｙ．Ｋｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．、４８、３８５〜３８６（１９８３）；Ｍ．Ｔｏｍ
ｏｉら、反応性ポリマー、１０：２７〜３６（１９８
９）。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、固相ペプチド合成のための
支持体として記述されてきた。Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍａｋ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．、
３：２１７〜２２３（１９８２）；Ｈ．Ｈｅｌｌｅｒｍ
ａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８４：２
６０３〜２６１７（１９８３）。しかしながら、引用し
た方法によって製造されたＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、数個の
欠点をこうむる。高分子量ＰＥＧ（例えば、４００ドル
トンより大きい）に関しては反応は不十分にしか進ま
ず、そして対称性２官能ＰＥＧは橋かけを形成する傾向
があった。これらの問題は、エチレンオキシドの橋かけ
されたポリスチレンの上への直接のアニオン重合によっ
て軽減された。Ｂａｙｅｒら、ペプチド：構造及び機
能、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ及びＤ．Ｈ．Ｒｉｃｈ（編
集）、Ｐｒｏｃ．８ｔｈ Ａｍ．ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍ
ｐ．８７〜９０頁、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８３）中で。Ｂａｙｅｒ
及びＲａｐｐ、ドイツ特許ＤＥ ３５００１８０ Ａ１
（１９８６）。しかしながら、この方法を使用するとＰ
ＥＧ連鎖長さは制御することが困難であり、そしてＰＥ
Ｇポリマーの均一性は不確かである。このプロセスに関
するもう一つの問題は、ポリスチレンは高度に毒性であ
るクロロメチルエーテルを使用して官能化され、そして
残留のクロロメチル基はペプチド合成の間に副反応を引
き起こす可能性があるということである。
【０００４】ＰＥＧグラフトコポリマーを製造するもう
一つの方法は、Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってペプチド：
構造及び機能、Ｃ．Ｍ．Ｄｅｂｅｒ，Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂ
ｙ及びＫ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ（編集）、Ｐｒｏｃ．９ｔ
ｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，２５７〜２６０頁、Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
（１９８５）中で記述されている。この方法において
は、規定された分子量（即ち、２０００〜４０００ドル
トン）のある種のヘテロ２官能ＰＥＧ誘導体が使用され
た。しかしながら、これらの誘導体は容易には入手でき
ず、これはそれらの商業化を阻害する。
一つの方法は、Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってペプチド：
構造及び機能、Ｃ．Ｍ．Ｄｅｂｅｒ，Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂ
ｙ及びＫ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ（編集）、Ｐｒｏｃ．９ｔ
ｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，２５７〜２６０頁、Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
（１９８５）中で記述されている。この方法において
は、規定された分子量（即ち、２０００〜４０００ドル
トン）のある種のヘテロ２官能ＰＥＧ誘導体が使用され
た。しかしながら、これらの誘導体は容易には入手でき
ず、これはそれらの商業化を阻害する。
【０００５】広い範囲の溶媒と共に使用することができ
る非毒性で効果的な固体支持体を製造する方法があれ
ば、それはペプチド若しくは核酸の固相合成若しくはシ
ーケンシングにおける使用のために、またはその他の固
相応用のために価値あるものであろう。
る非毒性で効果的な固体支持体を製造する方法があれ
ば、それはペプチド若しくは核酸の固相合成若しくはシ
ーケンシングにおける使用のために、またはその他の固
相応用のために価値あるものであろう。
【０００６】本発明は、ポリエチレングリコール誘導さ
れたグラフト支持体に、これらの支持体を製造するため
の方法に、そしてこれらの支持体を使用して固相合成技
術によってペプチドを合成する方法に関する。本発明の
ＰＥＧグラフト支持体は、固体支持体に共有結合してい
る官能化されたＰＥＧ誘導体を含有して成る。１つの実
施態様においては、これらのＰＥＧグラフト支持体は、
式Ｉ：
れたグラフト支持体に、これらの支持体を製造するため
の方法に、そしてこれらの支持体を使用して固相合成技
術によってペプチドを合成する方法に関する。本発明の
ＰＥＧグラフト支持体は、固体支持体に共有結合してい
る官能化されたＰＥＧ誘導体を含有して成る。１つの実
施態様においては、これらのＰＥＧグラフト支持体は、
式Ｉ：
【０００７】
【化２】
【０００８】［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であ
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素（Ｈ）、
及び単純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エ
チルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、Ｘ
は、ＨまたはＨ2Ｎ−Ｂ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｃ
（Ｏ）−であり、そしてＡ及びＢは、独立に、直鎖のま
たは分岐したアルキレン基例えばエチレン、プロピレ
ン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレンまたは長
さが約Ｃ−１０までのその他の基（例えば、コハク酸、
グルタル酸、アジピン酸またはその他のこのような酸か
ら誘導されたＡ；エチレンジアミンまたはその他の脂肪
族ジアミンから誘導されたＢ）、ＣＨ＝ＣＨ基（例え
ば、マレイン酸から誘導されたＡ）または芳香族基（例
えば、フタル酸から誘導されたＡ；フェニレンジアミン
から誘導されたＢ）である］によって表されそして図１
Ａ中に示される。ＳＳは固体支持体を表す。末端アミノ
基は、必要に応じてＮω保護基例えばＢｏｃ、Ｆｍｏｃ
及びその他の既知の保護基によって保護することができ
る。括弧内部に示された、式のコア部分は、一連の容易
に入手できるアミノ官能化されたポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）ポリマー誘導体に相当する。
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素（Ｈ）、
及び単純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エ
チルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、Ｘ
は、ＨまたはＨ2Ｎ−Ｂ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｃ
（Ｏ）−であり、そしてＡ及びＢは、独立に、直鎖のま
たは分岐したアルキレン基例えばエチレン、プロピレ
ン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレンまたは長
さが約Ｃ−１０までのその他の基（例えば、コハク酸、
グルタル酸、アジピン酸またはその他のこのような酸か
ら誘導されたＡ；エチレンジアミンまたはその他の脂肪
族ジアミンから誘導されたＢ）、ＣＨ＝ＣＨ基（例え
ば、マレイン酸から誘導されたＡ）または芳香族基（例
えば、フタル酸から誘導されたＡ；フェニレンジアミン
から誘導されたＢ）である］によって表されそして図１
Ａ中に示される。ＳＳは固体支持体を表す。末端アミノ
基は、必要に応じてＮω保護基例えばＢｏｃ、Ｆｍｏｃ
及びその他の既知の保護基によって保護することができ
る。括弧内部に示された、式のコア部分は、一連の容易
に入手できるアミノ官能化されたポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）ポリマー誘導体に相当する。
【０００９】本発明のもう一つの実施態様においては、
ペプチド合成がＰＥＧの末端以外の点で起こり得るよう
に樹脂が構成される。このような樹脂は、図１Ｂ中に図
示されそして更に一般式II：
ペプチド合成がＰＥＧの末端以外の点で起こり得るよう
に樹脂が構成される。このような樹脂は、図１Ｂ中に図
示されそして更に一般式II：
【００１０】
【化３】
【００１１】［式中、Ｙは、必要に応じてＮω保護基に
よって保護されることができるジアミノモノカルボン酸
であり、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、
固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜
Ｃ１０のアルキレン基例えばメチレン、エチレン、プロ
ピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンで
あり、そしてＲ1、Ｒ2及びＲ3は、水素、アルキル基及
びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって
表される。
よって保護されることができるジアミノモノカルボン酸
であり、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、
固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜
Ｃ１０のアルキレン基例えばメチレン、エチレン、プロ
ピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンで
あり、そしてＲ1、Ｒ2及びＲ3は、水素、アルキル基及
びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって
表される。
【００１２】本発明は、出発物質として１官能またはホ
モ２官能ポリエチレングリコールを使用して官能化され
た不活性支持体を製造するための数個のコンパクトな商
業的に価値あるルートを与える。本発明のＰＥＧグラフ
ト支持体は、固相ペプチド合成、核酸合成、及び固定さ
れた分子が使用されるその他の応用のために有利な物理
的及び機械的特性を与える。
モ２官能ポリエチレングリコールを使用して官能化され
た不活性支持体を製造するための数個のコンパクトな商
業的に価値あるルートを与える。本発明のＰＥＧグラフ
ト支持体は、固相ペプチド合成、核酸合成、及び固定さ
れた分子が使用されるその他の応用のために有利な物理
的及び機械的特性を与える。
【００１３】本発明は、固体支持体に共有結合された官
能化されたポリエチレングリコールを含有して成る樹脂
に関する。１つの実施態様においては、生成するグラフ
ト支持体は、支持体に結合された対称的なポリ（オキシ
エチレン）ジアミン誘導体を含有して成り、そして式
Ｉ：
能化されたポリエチレングリコールを含有して成る樹脂
に関する。１つの実施態様においては、生成するグラフ
ト支持体は、支持体に結合された対称的なポリ（オキシ
エチレン）ジアミン誘導体を含有して成り、そして式
Ｉ：
【００１４】
【化４】
【００１５】「式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であ
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素（Ｈ）、
及び単純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エ
チルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、ＳＳ
は、固体支持体であり、Ｘは、ＨまたはＨ2Ｎ−Ｂ−Ｎ
Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＡ及びＢ
は、独立に、直鎖のまたは分岐したアルキレン基例えば
エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イ
ソブチレンまたは長さがＣ−１０までの類似物（例え
ば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸またはその他の
このような酸から誘導されたＡ；エチレンジアミンまた
はその他の脂肪族ジアミンから誘導されたＢ）、ＣＨ＝
ＣＨ基（例えば、マレイン酸から誘導されたＡ）または
芳香族基（例えば、フタル酸から誘導されたＡ；フェニ
レンジアミンから誘導されたＢ）である］によって表さ
れる。括弧された部分内部の、式のコア部分は、一連の
ポリオキシエチレンジアミンポリマーに相当する。一ま
たは複数の末端アミノ基は、必要に応じて既知のＮω保
護基によって保護することができる。
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、水素（Ｈ）、
及び単純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エ
チルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、ＳＳ
は、固体支持体であり、Ｘは、ＨまたはＨ2Ｎ−Ｂ−Ｎ
Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｃ（Ｏ）−であり、そしてＡ及びＢ
は、独立に、直鎖のまたは分岐したアルキレン基例えば
エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イ
ソブチレンまたは長さがＣ−１０までの類似物（例え
ば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸またはその他の
このような酸から誘導されたＡ；エチレンジアミンまた
はその他の脂肪族ジアミンから誘導されたＢ）、ＣＨ＝
ＣＨ基（例えば、マレイン酸から誘導されたＡ）または
芳香族基（例えば、フタル酸から誘導されたＡ；フェニ
レンジアミンから誘導されたＢ）である］によって表さ
れる。括弧された部分内部の、式のコア部分は、一連の
ポリオキシエチレンジアミンポリマーに相当する。一ま
たは複数の末端アミノ基は、必要に応じて既知のＮω保
護基によって保護することができる。
【００１６】式Ｉのグラフト支持体を製造するための１
つの方法は、アミノ官能化されたコアポリマーを、無水
物を含むジカルボン酸誘導体と反応させて、カルボキシ
ル官能性分子を製造することによる。この方法によれ
ば、ジアミンポリマーを少なくとも２当量の活性化され
たジカルボン酸誘導体と反応させる。この方法において
有用であるジカルボン酸は、約１２までの炭素原子を有
するアルキルジ酸、例えば、マレイン酸、コハク酸、グ
ルタル酸またはアジピン酸；無水物例えば無水マレイン
酸、無水コハク酸若しくは無水グルタル酸；または芳香
族無水物、例えば無水フタル酸を含む。この方法の１つ
の実施態様においては、ジアミンポリマーを、無水コハ
ク酸、無水マレイン酸または無水グルタル酸と反応させ
て、請求された化合物の代表例、ビス（スクシニル化さ
れた）、ビス（マレイル化された）またはビス（グルタ
リル化された）ＰＥＧを製造する。図２及び３は、製造
及びアミノ官能化された固体支持体の上へのこれらの誘
導体の後続のカップリングを例示する。
つの方法は、アミノ官能化されたコアポリマーを、無水
物を含むジカルボン酸誘導体と反応させて、カルボキシ
ル官能性分子を製造することによる。この方法によれ
ば、ジアミンポリマーを少なくとも２当量の活性化され
たジカルボン酸誘導体と反応させる。この方法において
有用であるジカルボン酸は、約１２までの炭素原子を有
するアルキルジ酸、例えば、マレイン酸、コハク酸、グ
ルタル酸またはアジピン酸；無水物例えば無水マレイン
酸、無水コハク酸若しくは無水グルタル酸；または芳香
族無水物、例えば無水フタル酸を含む。この方法の１つ
の実施態様においては、ジアミンポリマーを、無水コハ
ク酸、無水マレイン酸または無水グルタル酸と反応させ
て、請求された化合物の代表例、ビス（スクシニル化さ
れた）、ビス（マレイル化された）またはビス（グルタ
リル化された）ＰＥＧを製造する。図２及び３は、製造
及びアミノ官能化された固体支持体の上へのこれらの誘
導体の後続のカップリングを例示する。
【００１７】式Ｉの樹脂を製造するために引き続いて反
応させることができるホモ２官能ＰＥＧジアミン化合物
は、一般式III：
応させることができるホモ２官能ＰＥＧジアミン化合物
は、一般式III：
【００１８】
【化５】
【００１９】［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であ
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、アルキル
基及びアリール基から成る群から独立に選ばれ、Ｘは、
ＯＨ、ハロゲン及び活性エステルまたはチオエステルの
活性化基から成る群から選ばれ、そしてＡは、約１０ま
での炭素原子を有する直鎖のまたは分岐したアルキレン
基、ＣＨ＝ＣＨ基及び芳香族基から成る群から選ばれ
る］を有する。“活性エステル”という術語は、カルボ
キシル基をそれらがアミノ基と一層容易な反応を受ける
ように活性化する化合物を指す。本発明の組成物及び方
法において使用することができる活性化基は、例えば、
トリクロロフェニル（ＴＣＰ）エステル、ペンタフルオ
ロフェニル（ＰＦＰ）エステル及びメチルフェニルピラ
ゾリノン（ＭＰＰ）エステルを含む。
り、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、アルキル
基及びアリール基から成る群から独立に選ばれ、Ｘは、
ＯＨ、ハロゲン及び活性エステルまたはチオエステルの
活性化基から成る群から選ばれ、そしてＡは、約１０ま
での炭素原子を有する直鎖のまたは分岐したアルキレン
基、ＣＨ＝ＣＨ基及び芳香族基から成る群から選ばれ
る］を有する。“活性エステル”という術語は、カルボ
キシル基をそれらがアミノ基と一層容易な反応を受ける
ように活性化する化合物を指す。本発明の組成物及び方
法において使用することができる活性化基は、例えば、
トリクロロフェニル（ＴＣＰ）エステル、ペンタフルオ
ロフェニル（ＰＦＰ）エステル及びメチルフェニルピラ
ゾリノン（ＭＰＰ）エステルを含む。
【００２０】前記ポリマーのコア部分として使用するこ
とができる対称的なジアミンは、式Ｉ及び式III中に示
された構造の括弧された部分に対応するポリマーを含
む。アミノ基の理論的含量を有するこのようなＰＥＧ誘
導体は、多数の既知のプロセスによって得ることができ
る。例えば、Ｄｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１８２：１３７９（１９８３）；Ｚａｌｉ
ｐｓｋｙら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９：１１７
７（１９８３）を参照せよ。この目的のために特に有用
であるポリマーは、商標Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)（Ｔｅ
ｘａｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｂｅｌｌａｉｒ
ｅ，ＴＸ）の下で商業的に入手できる約６０００ドルト
ンまでの分子量を有する一連のポリ（オキシエチレン）
ジアミンを含む。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)ポリ（オキシ
エチレン）ジアミン樹脂は、ポリプロピレンオキシドで
キャップされたポリエチレングリコールから構造的に誘
導された脂肪族第一ジアミンである。これらの生成物
は、高い全及び第一アミン含量によって特徴づけられ
る。所望の特性を有するその他の対称的なジアミンも使
用することができる。幾つかの応用のためには、ほぼ同
じ一般構造を有する対称的なジカルボン酸で官能化され
たポリマーを使用することができる。
とができる対称的なジアミンは、式Ｉ及び式III中に示
された構造の括弧された部分に対応するポリマーを含
む。アミノ基の理論的含量を有するこのようなＰＥＧ誘
導体は、多数の既知のプロセスによって得ることができ
る。例えば、Ｄｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１８２：１３７９（１９８３）；Ｚａｌｉ
ｐｓｋｙら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，１９：１１７
７（１９８３）を参照せよ。この目的のために特に有用
であるポリマーは、商標Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)（Ｔｅ
ｘａｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｂｅｌｌａｉｒ
ｅ，ＴＸ）の下で商業的に入手できる約６０００ドルト
ンまでの分子量を有する一連のポリ（オキシエチレン）
ジアミンを含む。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)ポリ（オキシ
エチレン）ジアミン樹脂は、ポリプロピレンオキシドで
キャップされたポリエチレングリコールから構造的に誘
導された脂肪族第一ジアミンである。これらの生成物
は、高い全及び第一アミン含量によって特徴づけられ
る。所望の特性を有するその他の対称的なジアミンも使
用することができる。幾つかの応用のためには、ほぼ同
じ一般構造を有する対称的なジカルボン酸で官能化され
たポリマーを使用することができる。
【００２１】本発明の方法によって製造されたカルボキ
シルで官能化されたスペーサーアームリンカーは、次
に、アミノ基によって官能化された適切な親（ｐａｒｅ
ｎｔ）担体にカップリングさせる。本発明において固相
として有用である担体は、巨大分子または固体、例えば
膜、多孔性ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリジメチ
ルアクリルアミド、綿または紙を含む。特に有用である
アミノ官能化された固体支持体（−ＮＨ−ＳＳ）は、ア
ミノ官能化されたポリスチレン、アミノメチルポリスチ
レン、アミノアセチルポリスチレン及びｐ−メチルベン
ズヒドリルアミンポリスチレンを含む。特に好ましい−
ＮＨ−ＳＳは、アミノ官能化されたポリスチレン−コ−
１％ジビニルベンゼンである。親担体のすべてのアミノ
基は、アミノ基を基にして１当量の担体を過剰のカルボ
キシル官能化された誘導体と反応させることによって覆
うことができる。担体の上の殆どのアミノ基は、ポリエ
チレングリコール誘導体によって置換され、それによっ
て１つの遊離の吊り下がったカルボキシル基を有するス
ペーサーアームを形成するようになった。
シルで官能化されたスペーサーアームリンカーは、次
に、アミノ基によって官能化された適切な親（ｐａｒｅ
ｎｔ）担体にカップリングさせる。本発明において固相
として有用である担体は、巨大分子または固体、例えば
膜、多孔性ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリジメチ
ルアクリルアミド、綿または紙を含む。特に有用である
アミノ官能化された固体支持体（−ＮＨ−ＳＳ）は、ア
ミノ官能化されたポリスチレン、アミノメチルポリスチ
レン、アミノアセチルポリスチレン及びｐ−メチルベン
ズヒドリルアミンポリスチレンを含む。特に好ましい−
ＮＨ−ＳＳは、アミノ官能化されたポリスチレン−コ−
１％ジビニルベンゼンである。親担体のすべてのアミノ
基は、アミノ基を基にして１当量の担体を過剰のカルボ
キシル官能化された誘導体と反応させることによって覆
うことができる。担体の上の殆どのアミノ基は、ポリエ
チレングリコール誘導体によって置換され、それによっ
て１つの遊離の吊り下がったカルボキシル基を有するス
ペーサーアームを形成するようになった。
【００２２】本発明のＰＥＧ誘導体の上へのアミノ官能
性の導入は、多くの合成応用のために望ましい。これ
は、アミド部分の酸加水分解（図２参照）（これによっ
てジアミンの上に元々存在していたアミノ基をさらすこ
と（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）になる）によって、または遊離
の若しくは１保護された低分子量ジアミン（例えば、エ
チレン若しくはヘキサメチレンジアミン）をカルボキシ
レート末端基と更にカップリングさせることによって
（図３参照）達成することができる。ビス（マレイル化
された）ＰＥＧリンカーによって改質された親担体（図
２参照）に関しては、例えば、末端の吊り下がったマレ
イル基が、酸、例えば、トリフルオロ酢酸または希塩酸
（ＨＣｌ）による制御された処理によって選択的に加水
分解され、一方、今やＰＥＧを担体に結合している他方
のマレイル基は本質的に安定である。これらの方法によ
って、アミノ官能化されＰＥＧ改質された物質が、急速
に、効率的にそして経済的に得られる。
性の導入は、多くの合成応用のために望ましい。これ
は、アミド部分の酸加水分解（図２参照）（これによっ
てジアミンの上に元々存在していたアミノ基をさらすこ
と（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）になる）によって、または遊離
の若しくは１保護された低分子量ジアミン（例えば、エ
チレン若しくはヘキサメチレンジアミン）をカルボキシ
レート末端基と更にカップリングさせることによって
（図３参照）達成することができる。ビス（マレイル化
された）ＰＥＧリンカーによって改質された親担体（図
２参照）に関しては、例えば、末端の吊り下がったマレ
イル基が、酸、例えば、トリフルオロ酢酸または希塩酸
（ＨＣｌ）による制御された処理によって選択的に加水
分解され、一方、今やＰＥＧを担体に結合している他方
のマレイル基は本質的に安定である。これらの方法によ
って、アミノ官能化されＰＥＧ改質された物質が、急速
に、効率的にそして経済的に得られる。
【００２３】ＰＥＧ−ＰＳグラフトコポリマーを製造す
る方法のもう一つ実施態様においては、ジ酸または無水
物を、まずアミノ官能化された支持体と反応させ、それ
によってアミド結合されカルボキシル官能化された支持
体を形成させる。このカルボキシル官能化された支持体
を、活性化しそして次に、上で述べたコア構造体によっ
て代表される、過剰の２官能ジアミンポリマーと接触さ
せる。
る方法のもう一つ実施態様においては、ジ酸または無水
物を、まずアミノ官能化された支持体と反応させ、それ
によってアミド結合されカルボキシル官能化された支持
体を形成させる。このカルボキシル官能化された支持体
を、活性化しそして次に、上で述べたコア構造体によっ
て代表される、過剰の２官能ジアミンポリマーと接触さ
せる。
【００２４】上で述べたＰＥＧグラフト支持体は、図１
Ａ中に示したようにＰＥＧ末端で生体ポリマーを組み立
てることを可能にする。しかしながら、もう一つの実施
態様においては、本発明の樹脂は、ペプチド合成がＰＥ
Ｇ末端以外の点で起こり得るように構成することができ
る。このような樹脂は、図１Ｂ中に例示され、そして更
に一般式II：
Ａ中に示したようにＰＥＧ末端で生体ポリマーを組み立
てることを可能にする。しかしながら、もう一つの実施
態様においては、本発明の樹脂は、ペプチド合成がＰＥ
Ｇ末端以外の点で起こり得るように構成することができ
る。このような樹脂は、図１Ｂ中に例示され、そして更
に一般式II：
【００２５】
【化６】
【００２６】［式中、Ｙは、必要に応じてＮω保護基に
よって保護されることができるジアミノモノカルボン酸
でありｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固
体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜Ｃ
１０のアルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロ
ピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンで
あり、そしてＲ1、Ｒ2及びＲ3は、水素、アルキル基及
びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって
表される。
よって保護されることができるジアミノモノカルボン酸
でありｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固
体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜Ｃ
１０のアルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロ
ピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンで
あり、そしてＲ1、Ｒ2及びＲ3は、水素、アルキル基及
びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって
表される。
【００２７】このタイプのＰＥＧグラフト支持体（式I
I）は、誘導化された１官能化されたポリエチレングリ
コール（例えば、ＰＥＧモノアミンまたはＰＥＧモノメ
チルエーテル）を使用して合成される。商業的に入手で
きるＰＥＧ出発物質は、１官能Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)
かまたはメトキシ及びヒドロキシル末端基を有するＰＥ
Ｇモノメチルエーテルかのどちらかである。ＰＥＧの上
のアミノ基は、既に述べたようにジカルボン酸または無
水物と反応させることができる。その代わりに、ＭＰＥ
Ｇのカルボキシル官能化された誘導体は、例えば以下の
式中に示されるように、エチルブロモアセテート、４−
ブロモバレレートまたはイソシアンアセテートとの反応
と、それに続く鹸化によって作ることができる。
I）は、誘導化された１官能化されたポリエチレングリ
コール（例えば、ＰＥＧモノアミンまたはＰＥＧモノメ
チルエーテル）を使用して合成される。商業的に入手で
きるＰＥＧ出発物質は、１官能Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)
かまたはメトキシ及びヒドロキシル末端基を有するＰＥ
Ｇモノメチルエーテルかのどちらかである。ＰＥＧの上
のアミノ基は、既に述べたようにジカルボン酸または無
水物と反応させることができる。その代わりに、ＭＰＥ
Ｇのカルボキシル官能化された誘導体は、例えば以下の
式中に示されるように、エチルブロモアセテート、４−
ブロモバレレートまたはイソシアンアセテートとの反応
と、それに続く鹸化によって作ることができる。
【００２８】
【化７】
【００２９】図４は、式IIのＰＥＧ樹脂の合成を図式的
に示す。この方法に従うと、Ｎα−Ｆｍｏｃ、Ｎδ−Ｂ
ｏｃ−Ｏｒｎ−ＰＳ樹脂（またはこのテーマに関する互
換）を選択的に脱保護し、そして１官能ＰＥＧ酸をカッ
プリングさせて生体ポリマー連鎖成長の基本的な方向に
直交する分岐を生成させる。オルニチン残基（図４中に
示したような）を、ＰＥＧ誘導体を固体支持体に結合す
るために使用する。しかしながら、カルボキシル基及び
２つのアミノ基を有する他の化学的部分も使用すること
ができる。
に示す。この方法に従うと、Ｎα−Ｆｍｏｃ、Ｎδ−Ｂ
ｏｃ−Ｏｒｎ−ＰＳ樹脂（またはこのテーマに関する互
換）を選択的に脱保護し、そして１官能ＰＥＧ酸をカッ
プリングさせて生体ポリマー連鎖成長の基本的な方向に
直交する分岐を生成させる。オルニチン残基（図４中に
示したような）を、ＰＥＧ誘導体を固体支持体に結合す
るために使用する。しかしながら、カルボキシル基及び
２つのアミノ基を有する他の化学的部分も使用すること
ができる。
【００３０】本発明の方法によって作られたポリエチレ
ングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト
支持体は、特に有用である。本発明のＰＥＧ誘導体を使
用して作られたＰＥＧ−ＰＳ支持体は、固相応用のため
に数個の望ましい特性を有する：それらは、種々の溶媒
中で膨潤し、たいていの固相合成において使用される条
件下で安定であり、そして固相応用、特に、固相ペプチ
ド合成において使用されるバッチ及びカラム反応器の両
方において良く挙動する。
ングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト
支持体は、特に有用である。本発明のＰＥＧ誘導体を使
用して作られたＰＥＧ−ＰＳ支持体は、固相応用のため
に数個の望ましい特性を有する：それらは、種々の溶媒
中で膨潤し、たいていの固相合成において使用される条
件下で安定であり、そして固相応用、特に、固相ペプチ
ド合成において使用されるバッチ及びカラム反応器の両
方において良く挙動する。
【００３１】固相ペプチド合成は、典型的には第一アミ
ノ酸の固体支持体へのカルボキシル末端の共有結合で始
まる。Ｎα保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、Ｐ
ＥＧスペーサーアームの遊離末端（固体支持体に結合し
ていない末端）上のアミノ基に（図１Ａ、２及び３）ま
たはＰＥＧ末端以外の点で（図１Ｂ及び４）結合してい
るハンドル部分に共有結合する。“ハンドル”は、初期
アミノ酸残基をポリマー状支持体に結合する役割を果す
２官能スペーサーとして定義される。ハンドルの１つの
末端はすんなりと開裂可能な保護基を一員とし、そして
ハンドルの他の末端は官能化された固体支持体にカップ
リングする。固相ペプチド合成における本発明のスペー
サーアームに関して使用することができるハンドルは、
例えば酸で変化しやすいｐ−アルコキシベンジル（ＰＡ
Ｂ）ハンドル、光で変化しやすいｏ−ニトロベンジルエ
ステルハンドル、並びにＡｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：３７３０〜３７４３（１９９
０）及びその中に引用された引用文献によって、そして
両方とも１９９０年８月３１日に出願された共に継続中
のＧ．Ｂａｒａｎｙ及びＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏによる
Ｕ．Ｓ．出願連番第０７／５７６，２３３号及びＧ．Ｂ
ａｒａｎｙによる連番第０７／５７６，２３２号中に述
べられたハンドルのようなハンドルを含む。なおこれら
のすべての教示は、引用によって本明細書中に組み込ま
れる。適切なハンドルは、アミノ官能化された支持体の
上に単一のステップで定量的にカップリングして、ペプ
チド連鎖組立体のための十分に規定された構造の一般的
な出発点を与える。ハンドル保護基は除去され、そして
Ｎα保護された第一アミノ酸のＣ末端残基はハンドルに
定量的にカップリングされる。一度ハンドルが固相にカ
ップリングされ、そして初期アミノ酸またはペプチドが
ハンドルに結合されると、一般的な合成サイクルが進行
する。この合成サイクルは、一般的に樹脂上のアミノ酸
またはペプチドのＮα−アミノ基の脱保護、洗浄、及
び、もし必要ならば、中和ステップ、及びそれに続く次
のＮα保護されたアミノ酸のカルボキシル活性化された
形との反応から成る。このサイクルを繰り返して興味の
あるペプチドまたは蛋白質を生成させる。官能化された
不溶性支持体を使用する固相ペプチド合成方法は、よく
知られている。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６３）；Ｂａｒ
ａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ペプチド、２巻、１
〜２８４頁（１９７９）中；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、３
０：７０５〜７３９（１９８７）。
ノ酸の固体支持体へのカルボキシル末端の共有結合で始
まる。Ｎα保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、Ｐ
ＥＧスペーサーアームの遊離末端（固体支持体に結合し
ていない末端）上のアミノ基に（図１Ａ、２及び３）ま
たはＰＥＧ末端以外の点で（図１Ｂ及び４）結合してい
るハンドル部分に共有結合する。“ハンドル”は、初期
アミノ酸残基をポリマー状支持体に結合する役割を果す
２官能スペーサーとして定義される。ハンドルの１つの
末端はすんなりと開裂可能な保護基を一員とし、そして
ハンドルの他の末端は官能化された固体支持体にカップ
リングする。固相ペプチド合成における本発明のスペー
サーアームに関して使用することができるハンドルは、
例えば酸で変化しやすいｐ−アルコキシベンジル（ＰＡ
Ｂ）ハンドル、光で変化しやすいｏ−ニトロベンジルエ
ステルハンドル、並びにＡｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：３７３０〜３７４３（１９９
０）及びその中に引用された引用文献によって、そして
両方とも１９９０年８月３１日に出願された共に継続中
のＧ．Ｂａｒａｎｙ及びＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏによる
Ｕ．Ｓ．出願連番第０７／５７６，２３３号及びＧ．Ｂ
ａｒａｎｙによる連番第０７／５７６，２３２号中に述
べられたハンドルのようなハンドルを含む。なおこれら
のすべての教示は、引用によって本明細書中に組み込ま
れる。適切なハンドルは、アミノ官能化された支持体の
上に単一のステップで定量的にカップリングして、ペプ
チド連鎖組立体のための十分に規定された構造の一般的
な出発点を与える。ハンドル保護基は除去され、そして
Ｎα保護された第一アミノ酸のＣ末端残基はハンドルに
定量的にカップリングされる。一度ハンドルが固相にカ
ップリングされ、そして初期アミノ酸またはペプチドが
ハンドルに結合されると、一般的な合成サイクルが進行
する。この合成サイクルは、一般的に樹脂上のアミノ酸
またはペプチドのＮα−アミノ基の脱保護、洗浄、及
び、もし必要ならば、中和ステップ、及びそれに続く次
のＮα保護されたアミノ酸のカルボキシル活性化された
形との反応から成る。このサイクルを繰り返して興味の
あるペプチドまたは蛋白質を生成させる。官能化された
不溶性支持体を使用する固相ペプチド合成方法は、よく
知られている。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６３）；Ｂａｒ
ａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ペプチド、２巻、１
〜２８４頁（１９７９）中；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、３
０：７０５〜７３９（１９８７）。
【００３２】本発明のＰＥＧ誘導体は、合成プロセスの
間にペプチド連鎖を形成している反応するアミノ酸から
不活性支持体を分離するスペーサーアームとして特に有
用である。この隔絶を与えるスペーサーアームの選択
は、固相応用における重要なパラメーターである。
間にペプチド連鎖を形成している反応するアミノ酸から
不活性支持体を分離するスペーサーアームとして特に有
用である。この隔絶を与えるスペーサーアームの選択
は、固相応用における重要なパラメーターである。
【００３３】本発明の好ましい実施態様においては、約
２０００ドルトンの平均分子量を有する種々のＰＥＧス
ペーサーアームを、ポリスチレン主鎖の上のアミノ官能
基と適切なハンドルの結合のための点との間に組み入れ
た。生成したグラフト支持体は、ほぼ等しい重量のＰＥ
Ｇ及びＰＳを含んでいた。これらの支持体は、物理的及
び化学的特性例えば膨潤に関してそしてモデルペプチド
の合成においてＰＳ支持体を凌ぐ再現性のある利点を示
した。本発明のＰＥＧ−ＰＳ支持体は、すべての反応ス
テップ及び洗浄のための溶媒としてアセトニトリルを使
用してペプチド合成を実施することを可能にする。ＰＳ
を使用しそして溶媒としてアセトニトリルを用いる対照
実験は、結果としてペプチド生成物をもたらさなかっ
た。
２０００ドルトンの平均分子量を有する種々のＰＥＧス
ペーサーアームを、ポリスチレン主鎖の上のアミノ官能
基と適切なハンドルの結合のための点との間に組み入れ
た。生成したグラフト支持体は、ほぼ等しい重量のＰＥ
Ｇ及びＰＳを含んでいた。これらの支持体は、物理的及
び化学的特性例えば膨潤に関してそしてモデルペプチド
の合成においてＰＳ支持体を凌ぐ再現性のある利点を示
した。本発明のＰＥＧ−ＰＳ支持体は、すべての反応ス
テップ及び洗浄のための溶媒としてアセトニトリルを使
用してペプチド合成を実施することを可能にする。ＰＳ
を使用しそして溶媒としてアセトニトリルを用いる対照
実験は、結果としてペプチド生成物をもたらさなかっ
た。
【００３４】もう一つの実施態様においては、困難なア
シル担体蛋白質６５−７４デカペプチド配列（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）をＦｍｏｃアミノ酸を使用して合成する比較
実験を実施した。この新しいＰＥＧ−ＰＳに関しては、
ＰＳ、ＴｅｎｔａｇｅｌTM（ドイツ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ
のＲａｐｐ Ｃｈｅｍ．の商標）またはＰｅｐｓｙｎＫ
TM（イギリス、ケンブリッジのケンブリッジＲｅｓｅａ
ｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．の商標）のいずれに関するより
も高い純度でペプチドが製造された。ＰＥＧ- ＰＳ材料
は、流通式合成及びバッチ操作の両方に高度に適切であ
ることが証明された。高い流量においてさえ、殆ど無視
できる背圧しか見い出されなかった。
シル担体蛋白質６５−７４デカペプチド配列（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）をＦｍｏｃアミノ酸を使用して合成する比較
実験を実施した。この新しいＰＥＧ−ＰＳに関しては、
ＰＳ、ＴｅｎｔａｇｅｌTM（ドイツ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ
のＲａｐｐ Ｃｈｅｍ．の商標）またはＰｅｐｓｙｎＫ
TM（イギリス、ケンブリッジのケンブリッジＲｅｓｅａ
ｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．の商標）のいずれに関するより
も高い純度でペプチドが製造された。ＰＥＧ- ＰＳ材料
は、流通式合成及びバッチ操作の両方に高度に適切であ
ることが証明された。高い流量においてさえ、殆ど無視
できる背圧しか見い出されなかった。
【００３５】ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体の一般的な有
用性は、多数の大きな（例えば、約３０〜６０の残基を
有する）複雑なペプチド配列、例えばセクロピン同族
体、カルシトニン、β−エンドルフィン、コルチコトロ
ピン放出因子、２つの亜鉛フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）
結合配列、及びＨＩＶ−１ ｔａｔ蛋白質の数個の部分
的配列の合成によって示された。本発明のＰＥＧ−ＰＳ
リンカーの使用から生じた合成効率における改善は、以
下のものの１以上から発生するように見える：（i）ポ
リマー主鎖の近くから反応サイトを除去するスペーサー
アーム効果；（ii）反応速度に対する付随的に好ましい
影響を含む樹脂の疎水性性質を改質する一般的な環境上
の効果；及び（iii）減少した二次的構造による構造的
に困難なカップリングに対する特定の効果（水素結合生
成）。
用性は、多数の大きな（例えば、約３０〜６０の残基を
有する）複雑なペプチド配列、例えばセクロピン同族
体、カルシトニン、β−エンドルフィン、コルチコトロ
ピン放出因子、２つの亜鉛フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）
結合配列、及びＨＩＶ−１ ｔａｔ蛋白質の数個の部分
的配列の合成によって示された。本発明のＰＥＧ−ＰＳ
リンカーの使用から生じた合成効率における改善は、以
下のものの１以上から発生するように見える：（i）ポ
リマー主鎖の近くから反応サイトを除去するスペーサー
アーム効果；（ii）反応速度に対する付随的に好ましい
影響を含む樹脂の疎水性性質を改質する一般的な環境上
の効果；及び（iii）減少した二次的構造による構造的
に困難なカップリングに対する特定の効果（水素結合生
成）。
【００３６】本発明のＰＥＧ誘導体はまた、核酸合成、
または不活性支持体と反応ヌクレオチド若しくは核酸と
の間のスペーサーアーム若しくはリンカーとしての配列
において使用することもできる。例えば、前記誘導体
は、上で述べたようにポリスチレン樹脂に結合させ、そ
してアミダイト媒体ＤＮＡ合成において使用することが
できる。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、アミダイトカップリング
法において溶媒として使用されるアセトニトリル中で膨
潤する。
または不活性支持体と反応ヌクレオチド若しくは核酸と
の間のスペーサーアーム若しくはリンカーとしての配列
において使用することもできる。例えば、前記誘導体
は、上で述べたようにポリスチレン樹脂に結合させ、そ
してアミダイト媒体ＤＮＡ合成において使用することが
できる。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、アミダイトカップリング
法において溶媒として使用されるアセトニトリル中で膨
潤する。
【００３７】本発明を以下の実施例によって以下に更に
例示する。
例示する。
【００３８】実施例１．Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)ＥＤ−
２００１のビス（マレイル化）誘導体の製造 無水マレイン酸（４．５ｇ、４６ミリモル）を、２５℃
でテトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中のＪｅｆｆａｍｉ
ｎｅ(R)ＥＤ−２００１（３０ｇ、１５ミリモル、３０
ミリモルのアミノ官能性）の撹拌された溶液に一度に添
加した。５時間後に、真空中での蒸発によって溶媒を除
去し、そして生成したオイルを、５分間にわたって０℃
で冷たい撹拌されたエーテル（１００ｍＬ）に添加し
た。生成した白い懸濁液を、０℃で更に１５分間撹拌
し、次に濾過によって収集し、エーテルで完全にリンス
し、そして真空中で五酸化リンの上で乾燥した。収量：
２８．９ｇ（８８％）。ＮＭＲデータ及び元素分析は、
以下に示した予期された構造と一致した：
２００１のビス（マレイル化）誘導体の製造 無水マレイン酸（４．５ｇ、４６ミリモル）を、２５℃
でテトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中のＪｅｆｆａｍｉ
ｎｅ(R)ＥＤ−２００１（３０ｇ、１５ミリモル、３０
ミリモルのアミノ官能性）の撹拌された溶液に一度に添
加した。５時間後に、真空中での蒸発によって溶媒を除
去し、そして生成したオイルを、５分間にわたって０℃
で冷たい撹拌されたエーテル（１００ｍＬ）に添加し
た。生成した白い懸濁液を、０℃で更に１５分間撹拌
し、次に濾過によって収集し、エーテルで完全にリンス
し、そして真空中で五酸化リンの上で乾燥した。収量：
２８．９ｇ（８８％）。ＮＭＲデータ及び元素分析は、
以下に示した予期された構造と一致した：
【００３９】
【化８】
【００４０】［式中、ａ＋ｂ＝２．５］。
【００４１】実施例２．Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ(R)ＥＤ−
２００１のビス（グルタリル化）誘導体の製造 ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＪｅｆｆａｍｉｎｅ
(R)ＥＤ−２００１（４０ｇ、２０ミリモル、４０ミリ
モルのアミノ官能性）及び無水グルタル酸（５．０ｇ、
４４ミリモル）の混合物を、２５℃で２時間撹拌した。
完全なアシル化を示す陰性のニンヒドリンテスト結果を
与えた均一な反応混合物を真空中で濃縮すると粘性のオ
イルが得られたが、これを４℃でエチルエーテル（３０
０ｍＬ）を含むビーカー中に激しく撹拌しながら注いだ
（ｄｅｃａｎｔｅｄ）。急速に生成した沈殿を、収集
し、更に冷たいエーテルで洗浄し、そして真空中で五酸
化リンの上で乾燥した。収量：３８ｇ（８６％）。ＮＭ
Ｒデータ及び元素分析は、構造と一致した。
２００１のビス（グルタリル化）誘導体の製造 ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＪｅｆｆａｍｉｎｅ
(R)ＥＤ−２００１（４０ｇ、２０ミリモル、４０ミリ
モルのアミノ官能性）及び無水グルタル酸（５．０ｇ、
４４ミリモル）の混合物を、２５℃で２時間撹拌した。
完全なアシル化を示す陰性のニンヒドリンテスト結果を
与えた均一な反応混合物を真空中で濃縮すると粘性のオ
イルが得られたが、これを４℃でエチルエーテル（３０
０ｍＬ）を含むビーカー中に激しく撹拌しながら注いだ
（ｄｅｃａｎｔｅｄ）。急速に生成した沈殿を、収集
し、更に冷たいエーテルで洗浄し、そして真空中で五酸
化リンの上で乾燥した。収量：３８ｇ（８６％）。ＮＭ
Ｒデータ及び元素分析は、構造と一致した。
【００４２】実施例３．ポリエチレングリコールメチル
エーテル（ＭＰＥＧ）のカボキシメチル誘導体の製造 トルエン（５００ｍＬ）中のポリエチレングリコールメ
チルエーテル（ＭＰＥＧ）、Ｍw２０００（１００ｇ、
５０ミリモル）の溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラッ
プ付属品によって水を除去しながら、共沸乾燥のために
一晩還流した。溶液を、８０℃に冷却し、カリウムｔｅ
ｒｔ．−ブトキシド（１１．２ｇ、０．１モル）で処理
し、そして次にエチルブロモアセテート（１１ｍＬ、
０．１モル）及びトルエン（１０ｍＬ）の混合物を３０
分にわたって添加した。反応を９０℃で８時間継続し、
それに続いて混合物をロータリーエバポレータ中で濃縮
すると、茶色の粘性の溶融物が生成した。ジクロロメタ
ン（５００ｍＬ）を添加してポリマーを抽出し、そして
活性アルミナ（２００ｇ）を添加した。３０分後、濾過
で有機相を収集し、部分的に濃縮し（〜１００ｍＬ
に）、エチルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして
数時間−２０℃にした。沈殿したポリマーを、濾過によ
って収集し、空気乾燥し、そして２５℃で３時間水性水
酸化ナトリウム（１Ｎ、５００ｍＬ）中に取った。この
鹸化反応を、濃水性ＨＣｌによるｐＨ３までの酸性化に
よって終了せしめ、そしてこの生成物をジクロロメタン
（３ｘ２５０ｍＬ）中へ抽出した。有機相を乾燥し（Ｍ
ｇＳＯ4）、部分的に濃縮し（〜１００ｍＬに）、エチ
ルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして数時間−２
０℃にした。最終生成物を濾過によって収集し、そして
数日間Ｐ2Ｏ5の上で真空中で乾燥した。収量：７５ｇ
（７３％）、カルボキシル基の滴定：理論の９４％、Ｎ
ＭＲデータ及び元素分析：構造と一致。
エーテル（ＭＰＥＧ）のカボキシメチル誘導体の製造 トルエン（５００ｍＬ）中のポリエチレングリコールメ
チルエーテル（ＭＰＥＧ）、Ｍw２０００（１００ｇ、
５０ミリモル）の溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラッ
プ付属品によって水を除去しながら、共沸乾燥のために
一晩還流した。溶液を、８０℃に冷却し、カリウムｔｅ
ｒｔ．−ブトキシド（１１．２ｇ、０．１モル）で処理
し、そして次にエチルブロモアセテート（１１ｍＬ、
０．１モル）及びトルエン（１０ｍＬ）の混合物を３０
分にわたって添加した。反応を９０℃で８時間継続し、
それに続いて混合物をロータリーエバポレータ中で濃縮
すると、茶色の粘性の溶融物が生成した。ジクロロメタ
ン（５００ｍＬ）を添加してポリマーを抽出し、そして
活性アルミナ（２００ｇ）を添加した。３０分後、濾過
で有機相を収集し、部分的に濃縮し（〜１００ｍＬ
に）、エチルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして
数時間−２０℃にした。沈殿したポリマーを、濾過によ
って収集し、空気乾燥し、そして２５℃で３時間水性水
酸化ナトリウム（１Ｎ、５００ｍＬ）中に取った。この
鹸化反応を、濃水性ＨＣｌによるｐＨ３までの酸性化に
よって終了せしめ、そしてこの生成物をジクロロメタン
（３ｘ２５０ｍＬ）中へ抽出した。有機相を乾燥し（Ｍ
ｇＳＯ4）、部分的に濃縮し（〜１００ｍＬに）、エチ
ルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして数時間−２
０℃にした。最終生成物を濾過によって収集し、そして
数日間Ｐ2Ｏ5の上で真空中で乾燥した。収量：７５ｇ
（７３％）、カルボキシル基の滴定：理論の９４％、Ｎ
ＭＲデータ及び元素分析：構造と一致。
【００４３】実施例４．ＰＥＧジ酸誘導体をＭＢＨＡ樹
脂にカップリングする手順 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３０ｍＬ）
中の実施例１で製造したＰＥＧジ酸（２６ｇ、１１．８
ミリモル、２３．６ミリモルのカルボキシル基）の撹拌
された溶液に、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；０．８１ｇ、６．０ミリ
モル）及びＤＭＦ（８ｍＬ）中のベンゾトリアゾール−
１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ；２．６３
ｇ、６．０ミリモル）を添加した。ジクロロメタン（５
ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＥＡ；１．５６ｍＬ、９ミリモル）の溶液を１０分にわ
たって添加し、そして予備洗浄されたｐ−メチルベンズ
ヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレン樹脂支持体
（５．０ｇ、０．６ミリモル／ｇ、３．０ミリモルのア
ミノ基）が入った反応容器に移す前に、生成した溶液を
更に１０分間撹拌した。この混合物を、サンプルに関す
るニンヒドリンテストが殆ど陰性になるまで、２日間振
った。未反応アミノ基をアシル化によってキャップし、
そして次に支持体を、実施例７中で述べるように、更に
処理するためにジクロロメタンで洗浄した。
脂にカップリングする手順 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３０ｍＬ）
中の実施例１で製造したＰＥＧジ酸（２６ｇ、１１．８
ミリモル、２３．６ミリモルのカルボキシル基）の撹拌
された溶液に、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；０．８１ｇ、６．０ミリ
モル）及びＤＭＦ（８ｍＬ）中のベンゾトリアゾール−
１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ；２．６３
ｇ、６．０ミリモル）を添加した。ジクロロメタン（５
ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＥＡ；１．５６ｍＬ、９ミリモル）の溶液を１０分にわ
たって添加し、そして予備洗浄されたｐ−メチルベンズ
ヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレン樹脂支持体
（５．０ｇ、０．６ミリモル／ｇ、３．０ミリモルのア
ミノ基）が入った反応容器に移す前に、生成した溶液を
更に１０分間撹拌した。この混合物を、サンプルに関す
るニンヒドリンテストが殆ど陰性になるまで、２日間振
った。未反応アミノ基をアシル化によってキャップし、
そして次に支持体を、実施例７中で述べるように、更に
処理するためにジクロロメタンで洗浄した。
【００４４】実施例５．ＰＥＧジ酸誘導体のＮｌｅ樹脂
へのカップリングのための手順 別の実験において、アミノメチルポリスチレン樹脂支持
体（０．６８ミリモル／ｇ）を、標準的な手順によって
Ｆｍｏｃ−ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）で誘
導化した。生成したＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−樹脂（０．２３
ｇ、０．５５ミリモル／ｇ、０．１３ミリモル）の一部
を、ピペリジン - ＤＭＦ（３：７、ｖ／ｖ）（２＋１
０分）で脱保護し、そしてＤＭＦ及びジクロロメタンで
洗浄した。一方、実施例２からのＰＥＧジ酸（０．８６
ｇ、０．３９ミリモル、０．７８ミリモルのカルボキシ
ル基）、ＢＯＰ（８８ｍｇ、０．２ミリモル）及びＨＯ
Ｂｔ（２７ｍｇ、０．２ミリモル）を、ＤＭＦ（４ｍ
Ｌ）中に溶解し、そして次にジクロロメタン（２ｍＬ）
中のＤＩＥＡ（４５μＬ、０．２６ミリモル）の溶液を
添加した。２５℃での予備活性化期間の後で、ＰＥＧ溶
液を添加して脱保護し、そして樹脂を洗浄し、そして２
５℃で５時間カップリングを実施すると、本質的に陰性
のニンヒドリンテスト結果が得られた。ジクロロメタン
（２ｍＬ）中の無水酢酸（４０μＬ、０．４ミリモル）
の添加によって３０分間キャッピングを行った。最後の
ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体（０．４９ｇ）は、元素分
析及びアミノ酸分析を基にしてＰＥＧ：ＰＳ：Ｎｌｅ＝
０．５１：０．４５：０．０４から成っていたが、これ
から、約４０％のＰＥＧ連鎖が橋かけ中に含まれていた
ことが計算できる。
へのカップリングのための手順 別の実験において、アミノメチルポリスチレン樹脂支持
体（０．６８ミリモル／ｇ）を、標準的な手順によって
Ｆｍｏｃ−ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）で誘
導化した。生成したＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−樹脂（０．２３
ｇ、０．５５ミリモル／ｇ、０．１３ミリモル）の一部
を、ピペリジン - ＤＭＦ（３：７、ｖ／ｖ）（２＋１
０分）で脱保護し、そしてＤＭＦ及びジクロロメタンで
洗浄した。一方、実施例２からのＰＥＧジ酸（０．８６
ｇ、０．３９ミリモル、０．７８ミリモルのカルボキシ
ル基）、ＢＯＰ（８８ｍｇ、０．２ミリモル）及びＨＯ
Ｂｔ（２７ｍｇ、０．２ミリモル）を、ＤＭＦ（４ｍ
Ｌ）中に溶解し、そして次にジクロロメタン（２ｍＬ）
中のＤＩＥＡ（４５μＬ、０．２６ミリモル）の溶液を
添加した。２５℃での予備活性化期間の後で、ＰＥＧ溶
液を添加して脱保護し、そして樹脂を洗浄し、そして２
５℃で５時間カップリングを実施すると、本質的に陰性
のニンヒドリンテスト結果が得られた。ジクロロメタン
（２ｍＬ）中の無水酢酸（４０μＬ、０．４ミリモル）
の添加によって３０分間キャッピングを行った。最後の
ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体（０．４９ｇ）は、元素分
析及びアミノ酸分析を基にしてＰＥＧ：ＰＳ：Ｎｌｅ＝
０．５１：０．４５：０．０４から成っていたが、これ
から、約４０％のＰＥＧ連鎖が橋かけ中に含まれていた
ことが計算できる。
【００４５】実施例６．ＰＥＧ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｐ
Ｓ樹脂の製造 アミノメチルポリスチレン樹脂支持体（６．０ｇ、０．
９５ミリモル／ｇ、５．７ミリモル）を、標準的な手順
によってＮα−Ｆｍｏｃ、Ｎδ−Ｂｏｃ−オルニチンで
誘導化した。この樹脂を、膨潤させ、そしてジクロロメ
タンで洗浄し、ジクロロメタン中の５％ＤＩＥＡで（１
×５ｍｉｎ＋３×１０ｍｉｎ）中和し、そしてジクロロ
メタンで洗浄した。Ｏｒｎ誘導体のカップリングを、Ｄ
ＭＦ法においてＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミ
ド（ＤＩＰＣＤＩ）／ＨＯＢｔ（各々３当量、１５分の
予備活性化、４０ｍＬの反応容積）によって３時間媒介
した。ＤＭＦ及びジクロロメタンによる洗浄が続いた。
サンプルに関するニンヒドリンテストは陰性に近かった
が、未反応サイトをＤＭＦ（２０ｍＬ）中の無水酢酸
（４．５ｍＬ、５当量）及びトリエチルアミン（７．０
ｍＬ、５当量）での３０分間のキャッピングによってブ
ロックした。保護されたＯｒｎ−ＰＳ樹脂（０．７８ミ
リモル／ｇ、予期された重量増加に関してバランスを取
った理論的なローディングにマッチする）を、ＤＭＦ、
ジクロロメタンで洗浄し、そしてピペリジン−ＤＭＦ
（１：４、ｖ／ｖ）（２＋１０ｍｉｎ）によって処理し
て、ＮαＦｍｏｃ基を選択的に除去した。ＤＭＦ、ジク
ロロメタン、２−プロパノール及びＤＭＦ−ジクロロメ
タン（３：７、ｖ／ｖ）によるさらなる洗浄は、実施例
３中で述べたように製造したＭＰＧＥ酸誘導体のカップ
リングのための樹脂を製造した。ＤＭＦ−ジクロロメタ
ン（３：７、ｖ／ｖ、７５ｍＬ）中のＭＰＧＥ酸（３７
ｇ、１８ミリモル）の溶液を、ＨＯＢｔ（２．７５ｇ、
１８ミリモル）及びＤＩＰＣＤＩ（２．８３ｍＬ、１８
ミリモル）と１５分間合わせ、そして次にＨ−Ｏｒｎ
（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂に添加した。カップリングを５時
間進めたところ、少し陽性のニンヒドリンテスト結果が
得られた。もっと小量のＭＰＧＥ酸誘導体及び活性化剤
（９ミリモルのスケール）による第二のカップリング、
並びに既に述べた手順によるアシル化が続いた。最後の
ＭＰＧＥ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂を、ジクロロメ
タン、ＤＭＦ、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄
し、そして真空中でＰ2Ｏ5の上で４８時間乾燥した。
０．３１ミリモル／ｇのローディングを有し、重量でＰ
ＥＧ：ＰＳ：Ｏｒｎ＝０．５７：０．３６：０．０７
（元素分析及びアミノ酸分析を基にして）から成る１
６．９ｇの樹脂（理論的な重量増加と良く一致する）が
得られた。ＤＭＦ手順においてＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＮＭ
Ｍを活性化及びカップリングのために使用した時にも類
似の結果が得られた。
Ｓ樹脂の製造 アミノメチルポリスチレン樹脂支持体（６．０ｇ、０．
９５ミリモル／ｇ、５．７ミリモル）を、標準的な手順
によってＮα−Ｆｍｏｃ、Ｎδ−Ｂｏｃ−オルニチンで
誘導化した。この樹脂を、膨潤させ、そしてジクロロメ
タンで洗浄し、ジクロロメタン中の５％ＤＩＥＡで（１
×５ｍｉｎ＋３×１０ｍｉｎ）中和し、そしてジクロロ
メタンで洗浄した。Ｏｒｎ誘導体のカップリングを、Ｄ
ＭＦ法においてＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミ
ド（ＤＩＰＣＤＩ）／ＨＯＢｔ（各々３当量、１５分の
予備活性化、４０ｍＬの反応容積）によって３時間媒介
した。ＤＭＦ及びジクロロメタンによる洗浄が続いた。
サンプルに関するニンヒドリンテストは陰性に近かった
が、未反応サイトをＤＭＦ（２０ｍＬ）中の無水酢酸
（４．５ｍＬ、５当量）及びトリエチルアミン（７．０
ｍＬ、５当量）での３０分間のキャッピングによってブ
ロックした。保護されたＯｒｎ−ＰＳ樹脂（０．７８ミ
リモル／ｇ、予期された重量増加に関してバランスを取
った理論的なローディングにマッチする）を、ＤＭＦ、
ジクロロメタンで洗浄し、そしてピペリジン−ＤＭＦ
（１：４、ｖ／ｖ）（２＋１０ｍｉｎ）によって処理し
て、ＮαＦｍｏｃ基を選択的に除去した。ＤＭＦ、ジク
ロロメタン、２−プロパノール及びＤＭＦ−ジクロロメ
タン（３：７、ｖ／ｖ）によるさらなる洗浄は、実施例
３中で述べたように製造したＭＰＧＥ酸誘導体のカップ
リングのための樹脂を製造した。ＤＭＦ−ジクロロメタ
ン（３：７、ｖ／ｖ、７５ｍＬ）中のＭＰＧＥ酸（３７
ｇ、１８ミリモル）の溶液を、ＨＯＢｔ（２．７５ｇ、
１８ミリモル）及びＤＩＰＣＤＩ（２．８３ｍＬ、１８
ミリモル）と１５分間合わせ、そして次にＨ−Ｏｒｎ
（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂に添加した。カップリングを５時
間進めたところ、少し陽性のニンヒドリンテスト結果が
得られた。もっと小量のＭＰＧＥ酸誘導体及び活性化剤
（９ミリモルのスケール）による第二のカップリング、
並びに既に述べた手順によるアシル化が続いた。最後の
ＭＰＧＥ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂を、ジクロロメ
タン、ＤＭＦ、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄
し、そして真空中でＰ2Ｏ5の上で４８時間乾燥した。
０．３１ミリモル／ｇのローディングを有し、重量でＰ
ＥＧ：ＰＳ：Ｏｒｎ＝０．５７：０．３６：０．０７
（元素分析及びアミノ酸分析を基にして）から成る１
６．９ｇの樹脂（理論的な重量増加と良く一致する）が
得られた。ＤＭＦ手順においてＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＮＭ
Ｍを活性化及びカップリングのために使用した時にも類
似の結果が得られた。
【００４６】実施例７．末端マレニル基の除去のための
手順 実施例４中で製造されたＰＥＧ官能化された支持体を、
シンターされた漏斗上でトリフルオロエタノールで洗浄
し、シラン化された丸底フラスコに移した。トリフルオ
ロエタノール／トリフルオロ酢酸／水（８：１：１、５
０ｍＬ）の混合物を添加し、そしてこの懸濁液を還流で
（オイルバス温度、１００℃）加熱し、そして磁気で２
４時間撹拌した。次に、この物質をジクロロメタン、ジ
クロロメタン中の５％ＤＩＥＡ及びメタノールで洗浄
し、そして真空中でＰ2Ｏ5中で乾燥した。アミノ基含量
をピクリン酸滴定によるか、またはＦｍｏｃアミノ酸に
よるローディングによってアリコートに関して測定し
た。最後のＰＥＧ−ＰＳはＰＥＧ：ＰＳ＝０．４５：
０．５５から成り、そして０．１７ミリモル／ｇのロー
ディング（ＣＨＮ元素分析及びアミノ酸分析を基にし
て）を有する。この支持体中の約６５％のＰＥＧ連鎖が
スペーサーとして作用していて、そして残りが橋かけ中
に含まれていることが計算できる。
手順 実施例４中で製造されたＰＥＧ官能化された支持体を、
シンターされた漏斗上でトリフルオロエタノールで洗浄
し、シラン化された丸底フラスコに移した。トリフルオ
ロエタノール／トリフルオロ酢酸／水（８：１：１、５
０ｍＬ）の混合物を添加し、そしてこの懸濁液を還流で
（オイルバス温度、１００℃）加熱し、そして磁気で２
４時間撹拌した。次に、この物質をジクロロメタン、ジ
クロロメタン中の５％ＤＩＥＡ及びメタノールで洗浄
し、そして真空中でＰ2Ｏ5中で乾燥した。アミノ基含量
をピクリン酸滴定によるか、またはＦｍｏｃアミノ酸に
よるローディングによってアリコートに関して測定し
た。最後のＰＥＧ−ＰＳはＰＥＧ：ＰＳ＝０．４５：
０．５５から成り、そして０．１７ミリモル／ｇのロー
ディング（ＣＨＮ元素分析及びアミノ酸分析を基にし
て）を有する。この支持体中の約６５％のＰＥＧ連鎖が
スペーサーとして作用していて、そして残りが橋かけ中
に含まれていることが計算できる。
【００４７】実施例８．エチレンジアミン添加のための
手順 実施例５からのＰＥＧ−ＰＳ支持体（０．４ｇ、０．１
２ミリモルの元のＮｌｅサイト）を、初期膨潤のために
ジクロロメタンで洗浄し、次にＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤ
ＩＰＣＤＩ（９４μＬ、０．６ミリモル）及びＨＯＢｔ
（８１ｍｇ、０．６ミリモル）を、５分の予備活性化期
間の間に樹脂に添加した。次に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）
中のエチレンジアミン（４０μＬ、０．６ミリモル）
を、５時間の反応の間に樹脂に添加した。ＤＭＦ、ジク
ロロメタン及びメタノールによる最後の洗浄を行った。
樹脂（０．４ｇ；このステップからは重量変化無し）を
Ｐ2Ｏ5の上で真空中で乾燥したが、それに引き続く通常
のＦｍｏｃ−Ａｌａによるローディング測定は０．１１
ミリモル／ｇの置換レベル及び０．３０のＡｌａ：Ｎｌ
ｅ比（橋かけの程度のより前の推定と一致する）を現し
た。
手順 実施例５からのＰＥＧ−ＰＳ支持体（０．４ｇ、０．１
２ミリモルの元のＮｌｅサイト）を、初期膨潤のために
ジクロロメタンで洗浄し、次にＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤ
ＩＰＣＤＩ（９４μＬ、０．６ミリモル）及びＨＯＢｔ
（８１ｍｇ、０．６ミリモル）を、５分の予備活性化期
間の間に樹脂に添加した。次に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）
中のエチレンジアミン（４０μＬ、０．６ミリモル）
を、５時間の反応の間に樹脂に添加した。ＤＭＦ、ジク
ロロメタン及びメタノールによる最後の洗浄を行った。
樹脂（０．４ｇ；このステップからは重量変化無し）を
Ｐ2Ｏ5の上で真空中で乾燥したが、それに引き続く通常
のＦｍｏｃ−Ａｌａによるローディング測定は０．１１
ミリモル／ｇの置換レベル及び０．３０のＡｌａ：Ｎｌ
ｅ比（橋かけの程度のより前の推定と一致する）を現し
た。
【００４８】実施例９．ポリエチレングリコール−ポリ
スチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）によるバッチ式ペプ
チド合成 ５ｇのｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（０．６ミ
リモル／ｇのローディングを有する）から出発して、実
施例４及び７中で設定された手順に従ってＰＥＧ - Ｐ
Ｓを製造し、そして８．７ｇのＰＥＧ−ＰＳ生成物を得
た（０．１７ミリモル／ｇのローディング）。このＰＥ
Ｇ−ＰＳの２ｇの部分を、ＢＯＰ＋ＨＯＢｔ手順（Ｄ．
Ｈｕｄｓｏｎ、（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、
５３：６１７〜６２４によって結合された、Ｆｍｏｃ−
ＰＡＬ［５′−（４″−（９−フルオレニルメチルオキ
シカルボニル）アミノエチル−３，５−ジメトキシフェ
ノキシ）吉草酸ハンドルによって延長すると、完全に官
能化されたニンヒドリン陰性生成物が得られた。テスト
ペプチド、アシル担体蛋白質６５〜７４を、Ｍｉｌｌｉ
ｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９６００ペプチド合
成機を使用して、標準的なＢＯＰ＋ＨＯＢｔカップリン
グプログラム（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）によって合成した。次ぎ次の
実験において、Ｐｅｐｓｙｎ ＫTM、通常のポリスチレ
ン及びＴｅｎｔａｇｅｌTM支持体をまた、同じ配列を製
造するために使用した。生成したペプチドを、アミノ酸
分析（ＡＡＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）及び高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法によって分
析した。結果は、ＰＥＧ−ＰＳを使用した合成が優れた
純度で最高の収量で生成物を与えたことを示した。
スチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）によるバッチ式ペプ
チド合成 ５ｇのｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（０．６ミ
リモル／ｇのローディングを有する）から出発して、実
施例４及び７中で設定された手順に従ってＰＥＧ - Ｐ
Ｓを製造し、そして８．７ｇのＰＥＧ−ＰＳ生成物を得
た（０．１７ミリモル／ｇのローディング）。このＰＥ
Ｇ−ＰＳの２ｇの部分を、ＢＯＰ＋ＨＯＢｔ手順（Ｄ．
Ｈｕｄｓｏｎ、（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、
５３：６１７〜６２４によって結合された、Ｆｍｏｃ−
ＰＡＬ［５′−（４″−（９−フルオレニルメチルオキ
シカルボニル）アミノエチル−３，５−ジメトキシフェ
ノキシ）吉草酸ハンドルによって延長すると、完全に官
能化されたニンヒドリン陰性生成物が得られた。テスト
ペプチド、アシル担体蛋白質６５〜７４を、Ｍｉｌｌｉ
ｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９６００ペプチド合
成機を使用して、標準的なＢＯＰ＋ＨＯＢｔカップリン
グプログラム（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃ
ｈ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）によって合成した。次ぎ次の
実験において、Ｐｅｐｓｙｎ ＫTM、通常のポリスチレ
ン及びＴｅｎｔａｇｅｌTM支持体をまた、同じ配列を製
造するために使用した。生成したペプチドを、アミノ酸
分析（ＡＡＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）及び高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法によって分
析した。結果は、ＰＥＧ−ＰＳを使用した合成が優れた
純度で最高の収量で生成物を与えたことを示した。
【００４９】実施例１０．ポリエチレングリコール−ポ
リスチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）による連続流通ペ
プチド合成 実施例６中で述べたようにして製造したＰＥＧ−Ｏｒｎ
（Ｂｏｃ）−ＰＳをＴＦＡ−ジクロロメタン（１：１）
（５＋２５ｍｉｎ）で処理して、Ｎδ−Ｂｏｃ基を選択
的に除去した。ジクロロメタンによる洗浄、ジクロロメ
タン中の５％のＤＩＥＡ及びジクロロメタンによる中和
が続いた。実施例９と同様にして、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬハ
ンドルを付け、そしてＤＩＰＣＤＩ＋ＨＯＢｔカップリ
ング手順（０．０５Ｍの濃度）に従ってＭｉｌｌｉｇｅ
ｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９０５０を使用して、挑
戦的なデカ−アラニル−バニリン配列を作った。引き続
く実験においては、通常のポリスチレン支持体を使用し
て同じ配列を作った。ＨＰＬＣを基にしてペプチドの純
度は、ＰＳを使用した時の５３％と比較して、ＰＥＧ -
ＰＳを使用した時には７７％であった。
リスチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）による連続流通ペ
プチド合成 実施例６中で述べたようにして製造したＰＥＧ−Ｏｒｎ
（Ｂｏｃ）−ＰＳをＴＦＡ−ジクロロメタン（１：１）
（５＋２５ｍｉｎ）で処理して、Ｎδ−Ｂｏｃ基を選択
的に除去した。ジクロロメタンによる洗浄、ジクロロメ
タン中の５％のＤＩＥＡ及びジクロロメタンによる中和
が続いた。実施例９と同様にして、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬハ
ンドルを付け、そしてＤＩＰＣＤＩ＋ＨＯＢｔカップリ
ング手順（０．０５Ｍの濃度）に従ってＭｉｌｌｉｇｅ
ｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９０５０を使用して、挑
戦的なデカ−アラニル−バニリン配列を作った。引き続
く実験においては、通常のポリスチレン支持体を使用し
て同じ配列を作った。ＨＰＬＣを基にしてペプチドの純
度は、ＰＳを使用した時の５３％と比較して、ＰＥＧ -
ＰＳを使用した時には７７％であった。
【図１】１Ａ及び１Ｂは、２つのポリエチレングリコー
ル−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト支持体の２
つのタイプの一般的な構造を示す。Ｘは、生体ポリマー
連鎖の成長が始まる点を示す。
ル−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト支持体の２
つのタイプの一般的な構造を示す。Ｘは、生体ポリマー
連鎖の成長が始まる点を示す。
【図２】一連の、スペーサーアームリンカーの製造を導
く反応、アミノ官能化されたポリスチレン樹脂へのそれ
のカップリング、樹脂結合されたリンカーへのハンドル
の取付、及びペプチドを合成するためのそれの使用を示
す略図である。
く反応、アミノ官能化されたポリスチレン樹脂へのそれ
のカップリング、樹脂結合されたリンカーへのハンドル
の取付、及びペプチドを合成するためのそれの使用を示
す略図である。
【図３】別のＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体を導く一連の
反応を示す略図である。
反応を示す略図である。
【図４】Ｏｒｎ残基から生体ポリマーを合成することが
できる、ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体を導く一連の反応
を示す略図である。
できる、ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体を導く一連の反応
を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジエイン・チヤング アメリカ合衆国イリノイ州60061バーノ ンヒルズ・ヒユーズプレイス820 (72)発明者 サミユエル・ザリプスキー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08540プリンストン・ウインドハムコー ト２エイ (72)発明者 ヌリア・エイ・ソール アメリカ合衆国ミネソタ州55401ミネア ポリス・アパートメントエイ−1108・サ ウスフアーストストリート15 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/04 C08G 65/333 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】 ａ）ポリ（オキシエチレン）コア及びカ
ルボキシル末端基を有する２官能化合物をアミノ官能化
された固体支持体に、２官能化合物上のカルボキシル基
の１つが固体支持体上のアミノ基と反応するのに十分な
条件下でカップリングさせて酸官能化樹脂を生成させる
ステップ、及び ｂ）ステップａ）で生成した酸官能化樹脂をアミン官能
化樹脂に転化するステップ、 を含む、固相ペプチド合成のための樹脂を製造する方
法。 - 【請求項２】 ２官能化合物が、ポリ（オキシエチレ
ン）ジアミンポリマー上のアミノ基をジカルボン酸また
はジカルボン酸無水物と反応させることによって製造さ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ステップａ）の生成物が、一般式： 【化１】 ［式中、 ｎは、５〜１５０の整数であり、 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、アルキル基及
びアリール基から成る群から独立に選ばれ、 Ｘは、ＯＨ、ハロゲン及び活性エステルまたはチオエス
テルの活性化基から成る群から選ばれ、そしてＳＳは、
固体支持体であり、そしてＡは、１０までの炭素原子を
有する直鎖のまたは分岐したアルキレン基、ＣＨ＝ＣＨ
基及び芳香族基から成る群から選ばれる］ によって表される請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 ステップｂ）が、ステップａ）で生成し
た酸官能化樹脂のアミド部分の酸加水分解を含む請求項
１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 酸加水分解が、酸官能化樹脂をトリフル
オロ酢酸又は希塩酸 と接触させることを含む請求項４に
記載の方法。 - 【請求項６】 ステップｂ）が、遊離のもしくは１保護
されたジアミンを、ステップａ）で生成した酸官能化樹
脂とカップリングさせることを含む請求項１〜３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項７】 ステップｂ）が、遊離のもしくは１保護
されたエチレンジアミン又は遊離のもしくは１保護され
たヘキサメチレンジアミンのカップリングを含む請求項
６に記載の方法。 - 【請求項８】 ジカルボン酸がマレイン酸、コハク酸、
グルタル酸及びアジピン酸から成る群から選ばれる請求
項２〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 ジカルボン酸無水物が無水マレイン酸、
無水コハク酸、無水グルタル酸及び無水フタル酸から成
る群から選ばれる請求項２〜７のいずれかに記載の方
法。
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| WO1995034813A1 (en) * | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Smithkline Beecham Corporation | Resins for solid state synthesis |
| US5604097A (en) | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
| US5656707A (en) * | 1995-06-16 | 1997-08-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Highly cross-linked polymeric supports |
| US5858534A (en) * | 1995-09-05 | 1999-01-12 | Solid Phase Sciences Corp. | Method of making and using derivatized paramagnetic polymer beads |
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