KR101088579B1

KR101088579B1 - 젤 타입의 코어-쉘 수지

Info

Publication number: KR101088579B1
Application number: KR1020040078860A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 김한영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2011-12-05
Also published as: WO2006126760A1; KR20060029981A

Abstract

본 발명은 젤 타입의 코어-쉘(core-shell)수지에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은, 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함하는 젤 타입 코어-쉘 수지에 대한 것이다.

코어-쉘 수지

Description

젤 타입의 코어-쉘 수지 {THE GELL TYPE CORE SHELL RESIN}

도 1은 코어-쉘 수지 표면에 광분해성 링커를 도입하는 방법을 나타낸 반응 개략도이다.

도 2는 (1)폴리스티렌 아미노메틸 수지과 (2) 텐타젤 (3) 코어-쉘 수지의 공초점 형광사진이다.

도 3은 (1)텐타젤과 (2)코어-쉘 수지의 비특이적 흡착을 비교한 사진이다.

도 4는 종래 수지과 코어-쉘 수지의 첫 번째 아미노산 도입시간을 비교한 그래프이다.

도 5는 종래 수지과 코어-쉘 수지의 광분해도를 비교한 그래프이다.

본 발명은 젤 타입의 코어-쉘(core-shell)수지에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은, 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함 하는 젤 타입 코어-쉘 수지에 대한 것이다.

최근 화학 기술 연구 분야에 있어서 조합화학 기술 연구의 중요성이 대두되고 있다. 특히 여러 가지 물질 중에서 활성이 있는 물질 하나를 찾아내야 하는 의약품 개발 분야에서는 조합 화학적 기술의 중요성이 더욱 강조되고 있다.

조합화학이란, 화합물 간의 다양한 조합을 이용해 많은 화합물 군(library)을 효율적으로 합성하여, 그것들의 화합물을 여러 가지의 목적으로 활용하여 가는 기술을 말한다. 조합 화학 중에서도 조합에 의해서 다수의 화합물 군을 한번에 합성하는 방법을 특히 조합 합성 (combinatorial synthesis)이라고 지칭된다.

1963년 Merrifield에 의한 펩타이드 고체상 합성법 개발을 계기로 하여 고체상 합성법에 기계를 사용하는 자동화가 가능하게 되었고 이러한 자동화된 고체상 합성법을 통하여 다양한 화합물의 라이브러리를 비교적 용이하게 합성할 수 있게 되었다. 또한 이러한 펩타이드 고체상 합성법은 올리고당이나 올리고뉴클레오타이드 등의 생체 고분자의 합성에도 응용되고 있다.

고체상 합성이 액상의 합성보다 선호되는 이유는, 필요로하는 각각의 기질들이 고분자 지지체에 연결되어 있다면, 고체상에 연결되어 있지 아니한 과량의 반응물과 부산물은 단순히 세척과정에 의해서 제거될 수 있으며, 또한 과량의 기질을 사용함으로써 반응을 완결시키는 것이 가능하고, 반응성이 없고 휘발성이 있는 용매를 사용하여 세척함으로써 반응 종결 후 과량으로 사용된 기질 역시, 고체상으로부터 제거가 가능하기 때문이다. 따라서 조합화학 분야에서는 주로 고체상 합성법을 이용하는 것이 적절하므로, 최근 이 고체상 합성에 관한 연구가 활발하게 진행 중이다.

이러한 고체상 합성에 사용되는 기술은 크게 세 가지 중요한 부분으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 고분자 지지체이고, 두 번째는 링커로서 이것은 고분자 지지체와 스캐폴드(scaffold) 혹은 목적 화합물을 연결시켜주는 것이며, 세 번째는 스캐폴드 자체나 목적 화합물 자체이다.

우선 고분자 지지체는 다양한 유기 용매와 시약 그리고 여러가지 반응조건에 대해 안정적일 것을 요건으로 한다. 현재 일반적으로 가장 많이 쓰이고 있는 고분자 지지체는 1% 내지 2% 가교된 젤 타입의 수지이다. 초기에는 기계적 강도가 좋고 작용기를 도입하기가 쉬운 폴리스티렌 수지를 주로 이용하였다.

그러나 이는 고체상 반응의 범위가 점점 넓어짐에 따라 효소반응 이나 올리고뉴클레오타이드 합성 등 친수성 미디어에서 반응을 수행해야 하는 경우가 증가하고, 또한 분자량이 큰 펩티드를 합성하는데 있어서 소수성의 수지과 친수성의 펩티드 사슬간의 상용성이 저하되며, 수지를 팽윤시키기 위해 사용되는 CH₂Cl₂와 같은 비극성, 소수성 용매 역시 펩티드 사슬을 쉽게 용해시키지 못하여 펩티드 사슬이 길어질수록 커플링 반응 효율이 저하된다는 문제점이 있었다.

이러한 폴리스티렌계 수지의 문제점을 해결하면서도 이러한 수지의 장점을 동시에 가지는 고분자 지지체로서, 폴리스티렌 수지에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 도입된 젤 타입 수지의 개발이 시도되고 있다.

PEG는 생체 적합성이 있으며 단백질의 흡착을 최소화한다고 알려져있다. 이 것은 고분자 지지체에 PEG를 링커로 도입하는 것과 유사하여 입체 장애 효과를 어느 정도 줄일 수 있고, 친수성의 PEG가 펩티드 사슬과 고분자 지지체와의 상용성을 증대시켜 커플링 수율을 향상시킬 수 있게 된다.

또한 PEG가 도입된 젤 타입 수지는 극성이 높은 용매에 대해서도 팽윤성이 좋아지기 때문에 펩티드 합성과정에서 생기는 염을 효과적으로 제거할 수도 있다. 최근 널리 이용되는 수지중의 하나인 텐타젤(TentaGel), BT-Gel등이 가교된 폴리스티렌에 PEG를 도입시킨 수지들의 대표적인 예이다.

그런데 이러한 가교폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 수지는 전체적으로 하나의 균질한(homogeneous) 상(phase)을 형성하며, 폴리스티렌 도메인이나 폴리에틸렌글리콜 도메인으로 분리되지 아니한다.

이러한 고분자 지지체의 가교된 폴리스티렌 수지는 고분자 지지체가 반응 용매에 팽윤될 뿐 용해되지 아니하도록 하는 골격을 형성하며, 이러한 폴리스티렌 가교 구조에 그라프팅된 폴리에틸렌글리콜 수지는 폴리스티렌 수지의 소수성을 보완하며, 폴리펩티드 합성 반응이나 올리고뉴클레오티드 합성 반응에 참여하는 아미노산이나 뉴클레오티드 또는 반응 결과물과 혼화성(miscibility)을 나타낸다.

이러한 종래 기술에 따른 폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 수지로 이루어진 지지체에서는, 폴리펩티드 합성 반응이나 올리고뉴클레오티드 합성 반응이 지지체 수지의 전체에 균질하게 혼재되는 폴리에틸렌글리콜 사슬 끝에서 진행되지만, 이와 혼화되어 있는 폴리스티렌 구조가 그대로 존재하기 때문에 아미노산이나 뉴클레오티드가 고분자 지지체 내부로의 확산 침투하는 것을 억제하는 역할을 한 다.

따라서 종래의 고분자 지지체를 사용하여 폴리펩티드나 올리고뉴클레오티드 고체상 합성 반응을 진행하는 경우, 고분자 지지체 수지 표면뿐만 아니라 수지 내부에서도 합성 반응이 진행된다. 그런데 고분자 지지체 수지 내부에서 진행되는 반응은, 폴리스티렌수지의 존재로 인하여 아미노산이나 뉴클레오티드가 지지체 수지 내부로 확산 침투하는 것이 용이하지 아니하므로, 반응의 진행이나 반응 정도를 조절하기 어렵다. 또한 고분자 지지체 수지 내부에서 합성되는 반응 결과물의 분리 회수도 어려워서 반응의 수율이 매우 낮다는 문제점도 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜 사슬이 그라프트됨에 따라 반응기의 치환율이 ~0.2mmol/g에 이르기까지 낮아져 펩타이드 등의 다량 합성 반응에 적합하지 않다.

이러한 문제점은 종래의 고분자 지지체 수지의 가교 구조를 이루는 폴리스티렌 수지가 단량체나 반응 결과물과 친화성(affinity)를 갖지 못하기 때문에 발생한다. 특히 폴리펩티드 합성 반응이나 올리고뉴클레오티드 합성 반응을 종래의 폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 지지체 수지를 사용하여 고체상 반응으로 진행시키더라도 반응물의 수지 내부로 확산 침투 문제가 여전히 존재함으로, 용액상 반응에 비하여 반응율, 회수율등이 크게 떨어진다는 문제점이 있다. 또한, 이 수지를 바이오 관련 에세이에 사용할 경우, 단백질의 비특이흡착 현상이 여전히 존재하기 때문에 유용성이 떨어지는 단점이 있어 왔다.

이러한 종래 기술의 문제점들을 극복하기 위해서, 폴리에틸렌글리콜 상과 폴리스티렌 상을 분리시키고, 폴리에틸렌글리콜 상만이 단량체나 용매에 노출시킬 수 있도록 폴리에틸렌글리콜 상이 고분자 지지체의 외표면을 형성하는 형상의 폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 지지체 수지의 개발이 시도되어 왔다.

한편, 일반적인 고체상 합성에 있어서 기질이 되는 아미노산 등의 저분자 화합물과 불용성의 고분자 지지체와의 연결부분, 통상은 기질과 고분자 지지체를 결합 및 절단하기 위한 기능기를 갖는 부분을 링커라고 지칭한다. 링커는 생성물을 만드는데 필요한 반응 조건 하에서 안정해야만 하고, 링커 제거 요건은 온화할수록 좋으며 자동화가 쉬운 것일수록 좋다.

따라서 고체상 반응을 최적화하기 위해서는 적당한 용매와 농도, 반응온도와 고분자 지지체의 선택이 중요한 요소로 작용하며 뿐만 아니라 적당한 링커의 선택 역시 고체상 반응의 중요한 단계이다. 이러한 링커는 모든 합성단계에서 상용성이 유지되어야 하며 고체 지지체상에서 만들어진 화합물을 적당한 분리 조건에서 얻어낼 때에 만들어진 화합물의 분해 없이 쉽게 절단될 수 있어야 한다.

일반적으로 산분해성 링커가 가장 널리 쓰이고 있지만, 이 링커를 사용할 경우에는 산성 조건의 반응은 수행할 수 없는 단점이 있고, 이에 대한 대안으로 염기분해성 링커들이 개발되기는 했으나, 이 역시 염기 조건에서는 사용할 수 없는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 최근에 주목을 받기 시작한 것이 광분해성 링커이다. 광분해성 링커는 빛으로 유리가 가능한 링커이므로 반응 과정 중 산성이나 염기성 조건을 모두 적용할 수 있어 응용할 수 있는 반응의 범위가 넓을 뿐 아니라, 유리해 낸 생성물을 바로 이용할 수 있는 장점 때문에 그 효용이 기대되고 있다.

따라서 이 기술 분야 에서는 폴리스티렌 수지 코어 외부에 폴리에틸렌글리콜 수지 쉘층을 형성시킴으로써, 폴리에틸렌글리콜 수지로 이루어진 쉘 층만을 반응 용매나 아미노산등의 단량체에 노출시켜 고분자 지지체 수지의 외표면에서만 합성 반응이 진행되도록 함으로써, 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드 고체상 합성 반응의 수율을 크게 향상시키는 기술의 개발이 요구되어 왔다.

또한, 폴리펩티드 합성 반응이나 올리고뉴클레오티드 합성 반응의 단량체나 반응 결과물과 혼화성이 우수한 폴리에틸렌글리콜 수지상 쉘 층을 지지체 외표면에 형성시켜, 반응 물질들간의 접촉이나 노출을 최대화하여 반응율과 수율을 향상시킬 뿐만 아니라, 산분해성 또는 광분해성 링커를 상기 쉘 층의 외부 말단에 도입시켜 반응 진행 위치(site)를 외부 표면에 최대한 노출시킴으로써, 반응율이나 수율을 더욱 향상시키는 기술의 개발이 기대되고 있다.

따라서, 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해, 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노메틸로 이루어진 코어 수지를 용매로 팽윤 시키는 단계; 상기에서 팽윤시킨 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 상기 아미노 메틸 말단을 트리아진으로 가교시켜 보호시키는 단계; 그리고 아미노 메틸 말단이 트리아진에 의해 가교 보호된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지에, 양 말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌글리콜을 반응시켜 쉘을 형성시키는 단계를 포함하는, 젤 타입 코어-쉘 수지 제조 방법을 제공하는 것을 기본적 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함하는 젤 타입 코어-쉘 수지를 제공하는 것이다.

상기의 본 발명의 목적은 i) 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노메틸로 이루어진 코어 수지를 용매로 팽윤 시키는 단계; ii) 상기에서 팽윤시킨 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 상기 아미노 메틸 말단을 트리아진으로 가교시켜 보호시키는 단계 (I); 그리고 iii) 아미노 메틸 말단이 트리아진에 의해 가교 보호된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지에, 양 말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌글리콜을 반응시켜 쉘을 형성시키는 단계(II)를 포함하는, 젤 타입 코어-쉘 수지 제조 방법을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 코어-쉘 수지의 제조 방법은 상기 단계 (II) 이후에, 상기 쉘의 표면 말단에 노출된 수산기 또는 아민기에 링커를 결합시키는 단계(III)을 추가로 포함할 수 있다.

상기의 본 발명의 또 다른 목적은 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함하는 젤 타입 코어-쉘 수지를 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 출발 물질인 폴리스티렌 아미노메틸 수지는 이미 상용화 되어 있는 것으로, 폴리스티렌 수지에 프리델크라프트(Freeiedel-crafts) 알킬레이션 반응으로 하이드록시기를 만든 후, 이를 미쯔노부 스타우딩거반응(Mitsunobu-staudinger)을 통해 아미노기로 치환된 것을 말한다.

폴리스티렌 아미노메틸 수지를 클로로포름으로 팽윤 시킨 후, 트리아진의 한 종류인 시아누릭클로라이드를 이용하여 가교시킨다. 시아누릭 클로라이드는 2,4,5번에 Cl기가 존재하는 트리아진으로 그 중 2개의 Cl기와 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 아민기와 결합한다.

시아누릭 클로라이드를 이용하여 상기 폴리스티렌 아미노메틸 수지를 가교시키면 폴리스티렌 아미노메틸 수지 표면에는 자유 아민기가 남아있지 아니하게 되며, 자유 아민기의 소멸 여부는 상기 시아누릭 클로라이드를 사용하여 가교시킨 수지를 건조시킨 이후에 카이저 테스트(kaier's test)를 이용하여 확인하였다.

이렇게 시아누릭 클로라이드를 사용하여 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 아민 말단을 가교 보호시킨 다음, 가교 보호에 참여하지 아니한 시아누릭 할라이드의 자유 할라이드 말단에 수산기나 아민기로 종지된 폴리에틸렌글리콜을 결합시켜 쉘층을 형성시킨다.

본 발명에 있어서, 아민 말단이 가교 보호된 폴리스티렌 코어 수지에 폴리에틸렌글리콜 수지가 그라프팅되는 경우에는, 폴리에틸렌글리콜 수지와 폴리스티렌 수지간에는 혼화성이 없고, 상용성이 부족하며, 또한 폴리에틸렌글리콜 수지가 비교적 고분자량임으로 인하여, 폴리에틸렌글리콜 수지가 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 내부로 확산 침투하지 못한다.

따라서 본 발명의 폴리스티렌 아미노메틸 코어 수지와 폴리에틸렌글리콜 수지 간에 그라프팅 반응은 폴리스티렌 아미노메틸 코어 수지의 내부에서는 일어날 수 없으며, 오로지 폴리스티렌 아미노메틸 코어 수지의 외표면에서만 그라프팅 반응이 이루어짐으로써, 상기 코어 수지 외표면에만 폴리에틸렌글리콜 쉘 층을 형성하게 된다.

종래의 폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 수지에서는 폴리스티렌 수지와 폴리에틸렌글리콜 수지가 상 분리 없이 균일한 상을 형성하여 서로 혼화되어 존재하지만, 본 발명의 고분자 지지체 수지에서는 폴리스티렌 코어 수지 층과 폴리에틸렌글리콜 쉘 수지 층이 서로 분리되어 존재한다는 점을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고 ii) 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말 단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함하는 젤 타입 코어-쉘 수지를 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 젤 타입 코어-쉘 수지에서는 폴리펩타이드 합성 반응이나 올리고 뉴클레오티드 합성 반응이 진행되는 폴리에틸렌글리콜 수지가 폴리스티렌 수지와 상 분리되어 존재하므로, 반응 용매나 단량체들의 폴리에틸렌글리콜 수지 쉘 층에서의 확산, 침투 및 반응 결과물의 회수가 자유롭게 된다.

이에 반해, 종래 기술에 따른 폴리스티렌-폴리에틸렌글리콜 그라프트 수지에서는 소수성(hydrophobicity)을 나타내는 폴리스티렌 수지와 폴리에틸렌글리콜 수지가 서로 혼화되어 있음으로 인해 아미노산 등의 단량체가 지지체 수지 내부로 확산, 침투되기가 어렵고 또한 상기 지지체 수지 내부에서 생성된 반응 결과물을 용이하게 회수할 수 없었다.

본 발명에 있어서, 코어-쉘 수지가 형성되었는지 여부는 기존의 수지과 공초점 형광사진을 비교함으로써 확인이 가능하며, 이는 도 3에 도시하였다. 도 3의 (1)은 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 사진이고, (2)는 텐타젤의 사진이며, (3)은 수지 표면에만 아민기를 다시 생성시킨 코어-쉘 수지의 사진이다.

또한 코어-쉘 수지의 표면 말단에 노출된 수산기 또는 아민기에 광분해성 링커를 결합시킨다. 본 발명에 사용된 광분해성 링커에는 ("Sythetic Peptide-A User's Guide", 2nd Ed., G.A. Grant(Ed), Oxford, pp123-127) 3-nitro-4-hydroxymethylbenzoic acid, 3-nitro-4-aminomethyl benzoic acid, 4-(1-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitro-phenoxypropionic acid 등이 사용될 수 있으 며, 4-(1-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitro-phenoxybutanoic acid 등이 사용되는 것이 가장 적합하다.

본 발명의 광분해성 링커는 빛으로 유리가 가능한 링커이므로 반응 과정 중 산성이나 염기성 조건을 모두 적용할 수 있어 응용할 수 있는 반응의 범위가 넓을 뿐 아니라, 유리해 낸 생성물을 바로 이용할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 산분해성 링커는, 본 발명의 젤 타입 코어-쉘 수지 상의 쉘 외표면 말단과 합성된 폴리펩티드나 올리고 뉴클레오티드를 결합시키고 있는 구조로서, 산을 부가함으로써 반응 결과물이 상기 지지체 수지 말단으로부터 분리될 수 있는 것이다. 본 발명에 사용될 수 있는 산분해성 링커는 당업계에 이미 공지된("Sythetic Peptide-A User's Guide", 2nd Ed., G.A. Grant(Ed), Oxford, pp123-127) Rink amide 링커, Wang 링커, SASRIN 링커 등 산분해성 링커가 사용될 수 있으며 4-(2',4'-dimethoxyphenylaminomethyl)phenoxyacetic acid (Rink amide 링커), 또는 4-(2'-chlorophenylphenylhydroxymethyl)phenoxybutyric acid 등이 사용되는 것이 가장 적합하다.

이하 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

코어-쉘 수지의 제조

디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노메틸 수지를 먼저 클로로포름(200ml)에서 팽윤시킨 후, 2,4,6-트리클로로- 1,3,5-트리아진(2,4,5-trichloro-1,3,5-triazine, cyanuric chloride)을 사용하여 가교시켰다.

폴리스티렌 아미노메틸 수지(10 g, 2.1 mmol/g)과 2,4,6-트리클로로 1,3,5-트리아진(19.4 g, 105 mmol), DIEA(95ml, 105mmol)를 둥근바닥 플라스크에 넣고, 정제한 클로로포름(chloroform, 300 ml)을 용매로 가해 준 다음, 50℃에서 12시간동안 교반시켜 주었다. 가교 반응이 끝난 후 용매를 걸러서 제거한 다음, 가교된 수지를 클로로포름(200 ml), 메탄올(MeOH, 200 ml)로 각각 3회 세척하고 진공오븐에서 12시간 동안 건조시켰다. 건조 시킨후에 카이저 테스트(kaier's test)를 이용하여 가교된 수지에 아민기가 남아있지 아니함을 확인하였다.

본 발명의 코어-쉘 수지의 쉘층을 형성시키기 위하여 제파민600(O,O-bis (2-aminopropyl) poly(ethylene glycol) 500, Jeffamine ED-600)을 도입하였다. 2,4,6-트리클로로-1,3,5-트리아진으로 가교된 수지(10 g)을 둥근바닥 플라스크에 넣고 용매로 클로로포름(200 ml)을 가하여 수지를 팽윤시켜 준 뒤 제파민600(63 g, 105 mmol)을 클로로포름(100 ml)에 녹여서 가해 주고, 70℃에서 12시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 끝난 후 용매를 걸러서 제거한 다음, 클로로포름(200 ml), 메탄올(MeOH, 200 ml)로 각각 3회 세척해 주고 진공오븐에서 12시간 동안 건조해 주었다.

[실시예 2]

코어-쉘 수지 위에 광분해성 링커의 도입

코어-쉘 수지에 Fmoc으로 아민기가 보호된 광분해성 링커(Fmoc-aminoethyl photolabile linker, 4-(4-(1-(Fmoc-amino)ethyl)-2- methoxy-5-nitrophenoxy)butanoic acid 를 BOP(benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate) 커플링 시약을 이용하여 NMP(N-methylpyrrolidone) 용매 하에서 도입하였다.

코어-쉘 수지(300 mg, 0.35 mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, 광분해성 링커(109 mg, 0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt (N-hydroxybenzotriazole, 28 mg, 0.21 mmol), DIEA(diisopropyiethylamine, 55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다.

광분해성 링커가 도입된 그림은 도 1의 (II)에 나타내었다.

[실시예 3]

광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지 위에서 펩타이드의 합성

실시예 2에서 제조된 광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지에 Leu-enkepalinamide (YGGFL-NH₂)를 Fmoc 아미노산과 BOP커플링 시약을 이용하여 NMP 용매 하에서 고체상 합성법으로 합성하였다. 광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지(300mg, 0.35mmol/g)를 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, Fmoc 아미노산(0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt(28 mg, 0.21 mmol), DIEA(55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다.

이렇게 Fmoc 아미노산이 도입된 수지의 Fmoc 보호기를 제거한 다음 Fmoc 아미노산을 반복하여 순서대로 도입하였다. 이 때, Fmoc을 떼어내는 조건은 25% piperidine/NMP로 각각 3분, 7분씩 2회 처리해 주었다.

광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지 표면에 펩타이드를 합성시킨 그림은 도 1의 (III)에 나타내었다.

[실시예 4]

코어-쉘 수지위에 링크아마이드 링커의 도입

코어-쉘 수지에 Fmoc으로 아민기가 보호된 링크아마이드 링커(p-(R,S)-α-(1-(9H-fluoren -9-yl)-methoxyformamido)-2,4-dimethoxybenzyl)-phenoxyacetic acid)를 BOP 커플링 시약을 이용하여 NMP(N-methylpyrrolidone) 용매 하에서 도입하였다. 코어-쉘 수지(300 mg, 0.35 mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, 링크아마이드 링커(113 mg, 0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt (N-hydroxybenzotriazole, 28 mg, 0.21 mmol), DIEA(diisopropyiethylamine, 55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후, 여액을 걸러서 제거해 주고 DCM, MeOH, NMP, MeOH의 순으로 각각 2ml씩 가하여 세척한 후 진공오븐에서 12시간 동안 건조하였다.

[실시예 5]

링크아마이드 링커가 도입된 코어-쉘 수지위에서 펩타이드의 합성

실시예 4에서 제조된 링크아마이드 링커가 도입된 코어-쉘 수지에 HIV fusion inhbitor인 T-20의 27-35 fragment를 Fmoc 아미노산과 BOP커플링 시약을 이용하여 NMP 용매 하에서 고체상 합성법으로 합성하였다. 광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지(300mg, 0.35mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, Fmoc 아미노산(0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt(28 mg, 0.21 mmol), DIEA(55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다. 이렇게 Fmoc 아미노산이 도입된 레진의 Fmoc 보호기를 제거한 다음 Fmoc 아미노산을 반복하여 순서대로 도입하였다. 이 때, Fmoc을 떼어내는 조건은 25% piperidine/NMP로 각각 3분, 7분씩 2회 처리해 주었다. 이 레진을 95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% TES(triethylsilane) 으로 처리하여 합성된 펩타이드를 유리해주었다. 펩타이드를 얻은 최종 수율은 91%, HPLC(high performance liquid chromatography) 순도는 98.4% 였다.

[실시예 6]

코어-쉘 수지위에 2-클로로 트리틸 링커의 도입

코어-쉘 수지에 Fmoc으로 아민기가 보호된 트리틸 링커인 4-(2'-chlorophenylphenylhydroxymethyl)phenoxybutyric acid를 BOP 커플링 시약을 이용하여 NMP 용매 하에서 도입하였다. 코어-쉘 수지(300 mg, 0.35 mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, 2-클로로 트리틸 링커(84 mg, 0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt (N-hydroxybenzotriazole, 28 mg, 0.21 mmol), DIEA(diisopropyiethylamine, 55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후, 여액을 걸러서 제거해 주고 DCM, MeOH, NMP, MeOH의 순으로 각각 2 ml씩 가하여 세척한 후 진공오븐에서 12시간 동안 건조하였다. 건조한 레진(315 mg)을 다시 정제한 DCM 3 ml 에 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, thionyl chloride를 0.5 ml 가해 준 뒤 1.5시간 동안 반응시켜서 트리틸 링커의 히드록시기를 클로라이드로 치환하였다. 반응이 끝난 후, 여액을 걸러서 제거해 주고 DCM 2ml로 5회 세척한 후 진공오븐에서 12시간 동안 건조하였다.

[실시예 7]

2-클로로 트리틸 링커가 도입된 코어-쉘 수지 위에서 펩타이드의 합성

실시예 6에서 제조된 2-클로로 트리틸 링커가 도입된 코어-쉘 수지에서 Leu-enkepalinamide (YGGFL-NH₂)를 합성하였다. 광분해성 링커가 도입된 코어-쉘 수지(300mg, 0.35mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, Fmoc 아미노산(0.21 mmol), DIEA(55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 2시간 동안 반응시켜 주었다. 이렇게 Fmoc 아미노산이 도입된 레진의 Fmoc 보호기를 제거한 다음, Fmoc 아미노산을 BOP 커플링 시약을 이용하여 도입하였다. 위에서 아미노산이 도입된 레진(300mg, 0.35mmol/g)을 2 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시켜 준 다음, Fmoc 아미노산(0.21 mmol), BOP(93 mg, 0.21 mmol), HOBt(28 mg, 0.21 mmol), DIEA(55 μl, 0.32 mmol)을 1 ml의 NMP에 녹여서 가해 주고, 1시간 동안 반응시켜 주었다. 이렇게 Fmoc 아미노산이 도입된 레진의 Fmoc 보호기를 제거한 다음 Fmoc 아미노산을 반복하여 순서대로 도입하였다. 이 때, Fmoc을 떼어내는 조건 은 25% piperidine/NMP로 각각 3분, 7분씩 2회 처리해 주었다. 이 레진을 95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% TES(triethylsilane) 으로 처리하여 합성된 펩타이드를 유리해주었다. 펩타이드를 얻은 최종 수율은 95%, HPLC(high performance liquid chromatography) 순도는 97.5% 였다.

[비교예 1]

기존의 수지과 코어-쉘 수지의 공초첨 형광사진 비교

코어-쉘 수지가 코어-쉘 수지임을 증명하기 위하여 이미 상용화 되어 쓰이고 있는 수지인 폴리스티렌 아미노메틸 수지, 텐타젤(TentaGel)과 코어-쉘 수지에 형광물질인 FITC (5-fluorescein isothiocyanate)를 도입한 뒤, 공초점 형광사진을 찍었다. 각각의 수지를 10 mg씩 취하여 1.5 ml 에펜도르 프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고 0.5 ml의 NMP에서 30분 동안 팽윤시겼다. 여기에 FITC( 8 mg, 20 μmol), DIEA (3.5 μl, 20 μmol)을 5 ml의 NMP에 녹여서 가해준 뒤, 상온에서 12시간 반응시겼다. 반응후 여액을 걸러내고 NMP, 메탄올, DCM(dichloromethane), 메탄올, NMP, 메탄올의 순서로 각각 1 ml씩 가하여 30분 동안 세척한 뒤 여과해 준 후, 이 비드들을 공초점 형광사진기(Zeiss, LSM 5 Pasc)를 이용하여 형광사진을 찍었다.

공초점 형광사진은 도 2에 도시하였다. 도 2의 (1)은 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 사진이고, (2)는 텐타젤의 사진이며, (3)은 코어-쉘 수지의 사진이다. 도 3을 볼 때, 코어-쉘 수지임을 확인할 수 있었다.

[비교예 2]

텐타젤과 코어-쉘 수지의 비특이적 흡착 비교

수지를 단백질이나 DNA등의 분석에 이용하기 위해서는 비특이적 흡착이 없어야 한다. 기존의 수지들은 비특이적 흡착을 보이기 때문에 이런 실험에 직접 쓰이는데 문제점을 가지고 있다. 기존의 수지들 중에 PEG를 포함하고 있어서 비교적 비특이적 흡착이 없는 것으로 알려져 있는 텐타젤과 코어-쉘 수지를 비교한다. 텐타젤과 코어-쉘 수지를 각각 5 mg 씩 취하여 바이알에 넣은 후, 30당량의 aceticanhydride와 DIEA를 1 ml의 NMP와 함께 가해 준 뒤, 2시간 동안 반응을 진행하여 수지의 모든 아민기를 아세틸로 막았다. 이렇게 아민기가 아세틸기로 막힌 비드들을 각각 1 mg 씩 취하여 에펜도르 프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고, PH 7.5의 트리스 완충용액(100 mM) 1 ml을 가하여 현탁상태로 만들어 준 다음, ST-AP(Streptavidin-alkaline phosphatase) 용액 1 μl (alkaline phosphatase 1 units)를 가하고 30℃에서 30분간 반응시겼다. 반응 후, 여액을 걸러주고, PH 9.5의 트리스 완충 용액(100mM)으로 5회 세척해 준 다음, 1ml 의 PH 9.5의 트리스 완충 용액(100mM)에 현탁시켰다. 이 현탁액에 NBT(nitro blue tetrazolium) 용액(10 mg/ml) 6 μl와 BCIP(5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate) 용액( 5 mg/ml) 3 μl를 가해 준 다음, 30초간 반응을 진행 시켜 주고 바로 1N HCl 용액 100 μl를 가해주어 반응을 종결 시켰다. 여기서 수지에 streptavidin이 비특이적 흡착을 하였을 경우에는 그 위에 있는 효소와 NBT, BCIP가 반응을 하여 비드 위에 diformazan 이라는 보라색의 물질이 형성된다.

도 3는 비특이적 흡착을 비교하기 위한 사진으로 (1)은 코어-쉘 수지를 반응시킨 사진이며, (2)는 텐타젤을 반응시킨 사진이다. 도 3에서 보듯이 코어-쉘 수지는 비특이적 흡착이 전혀 없었고, 따라서 단백질이나 DNA의 분석 등에도 이용할 수 있는 가능성을 보였다.

[비교예 3]

기존의 수지과 코어-쉘 수지의 첫 번째 아미노산 도입 시간 비교 테스트

이미 상용화 되어 쓰이고 있는 수지인 폴리스티렌 아미노메틸 수지, 텐타젤과 코어-쉘 수지 위에 처음 아미노산을 도입할 때의 반응시간을 비교했다. 아미노산을 도입하는 방법은 실시예 3에서와 같이 BOP 커플링 시약을 이용하였으며, 커플링 수율은 Fmoc-적정법을 이용하여 확인했다.

도 4는 코어-쉘 수지와 텐타젤, 폴리스티렌 아미노메틸 수지에 첫번째 아미노산 도입시간을 비교한 그래프로 코어-쉘 수지의 커플링 반응 속도가 다른 기존의 수지에 비해 월등히 빠름을 알 수 있었다.

[비교예 4]

기존의 수지과 코어-쉘 수지의 광분해도 비교 테스트

이미 상용화 되어 있는 폴리스티렌 아미노메틸 수지, 텐타젤에 실시예 2의 CS수지과 같이 광분해성 링커를 도입하고, 실시예 4와 같이 Leu-enkepalinamide를 도입했다. 각각의 수지들을 100 mg씩 취하여 5 ml 바이알에 넣은 뒤, 2.5 ml의 메 탄올을 용매로 넣어주고 파장 360nm, 빛의 세기 50 mW/cm₂에서 광분해 반응을 진행해 주면서 시간별로 각각의 수율을 확인했다.

도 5는 코어-쉘 수지와 텐타젤, 폴리스티렌 아미노메틸 수지의 광분해도를 비교한 그래프로 이에 따르면 기존의 수지 중 폴리스티렌 아미노메틸 수지는 3시간이 지나서도 40% 이하의 수율을 보였고, PEG가 도입되어 있어서 메탄올에서 팽윤이 잘 되는 텐타젤의 경우에는 2시간 후에 70%의 광분해 수율을 보였으며 더 이상 향상되지 않았다. 코어-쉘 수지는 1시간 안에 95% 이상의 수율을 보여서 다른 기존의 수지에 비해 광분해도가 월등히 뛰어남을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 기존의 고분자 지지체 수지의 표면 부근에만 기능기가 존재하여 여러 가지 고체상 유기합성 반응을 수행함에 있어 효율과 수율에 향상이 예상되는 새로운 쉘-타입 수지를 만들 수 있다.

따라서 본 발명에 따르면 기능기가 수지의 표면 부근에만 존재하기 때문에 고분자 지지체에 아미노산등의 물질을 도입할 때 반응시간을 단축시킬 수 있으며, 특히 여러 가지 산과 염기 조건에서 안정하기 때문에 다양한 합성 반응 조건을 사용할 수 있다.

또한 고체상 합성에 사용할 경우에는 수지 내부로의 빛의 투과성 문제 때문에 반응의 수율이 떨어지는 것으로 알려져 있는 광분해성 링커를 이용한 반응을 수 행할 수 있다.

Claims

i) 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노메틸로 이루어진 코어 수지를 용매로 팽윤 시키는 단계;

ii) 상기에서 팽윤시킨 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 상기 아미노 메틸 말단을 트리아진으로 가교시켜 보호시키는 단계; 그리고

iii) 아미노 메틸 말단이 트리아진에 의해 가교 보호된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지에, 양 말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌글리콜을 반응시켜 쉘을 형성시키는 단계를 포함하는, 젤 타입 코어-쉘 수지 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 iii) 단계 이후에, 상기 쉘의 표면 말단에 노출된 수산기 또는 아민기에 링커를 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 링커가 광분해성 링커인 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지의 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 링커가 산분해성 링커인 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 iii) 단계의 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 젤 타입 코어-쉘 수지 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 iii) 단계의 폴리알킬렌 글리콜이 폴리프로필렌글리콜인 것을 특징으로 하는 젤 타입 코어-쉘 수지 제조방법.
i) 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌 아미노 메틸 수지의 아미노 메틸 말단이 시아누릭 클로라이드로 가교된 코어 수지부와; 그리고

ii) 상기 아미노메틸말단의 가교에 참여하는 트리아진의 나머지 클로라이드 말단에 결합되고, 양말단이 수산기 또는 아민기로 종지된 폴리알킬렌클리콜 수지로 이루어진 쉘 수지부를 포함하는 젤 타입 코어-쉘 수지.
제7항에 있어서, 상기 쉘 수지부 표면 말단에 결합된 링커를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지.
제8항에 있어서, 상기 링커가 광분해성 링커인 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지.
제8항에 있어서, 상기 링커가 산분해성 링커인 것을 특징으로 하는, 젤 타입 코어-쉘 수지.
제7항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 젤 타입 코어-쉘 수지.
제7항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜이 폴리프로필렌글리콜인 것을 특징으로 하는 젤 타입 코어-쉘 수지.