PT1310510E - Bibliotecas de fase sólida codificadas, segregadas topologicamente - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "BIBLIOTECAS DE FASE SÓLIDA CODIFICADAS, SEGREGADAS TOPOLOGICAMENTE"

1. CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a bibliotecas de composto de teste sintético ligado a suportes de sintese de fase separada. Em particular, a invenção refere-se a bibliotecas de composto de teste sintético ligado a suportes de síntese de fase separada que também contêm sequências poliméricas codificantes que codificam a estrutura do composto de teste sintético. Cada uma das esferas de suporte de síntese de fase sólida contém um tipo único de composto de teste sintético e uma única sequência polimérica codificante singular e prontamente determinável, codificando a estrutura do composto de teste sintético. 0 composto de teste sintético pode ter estruturas básicas com ligações, tais como amida, ureia, carbamato (i. e., uretano), éster, amino, sulfureto, dissulfureto ou carbono-carbono, tais como alcano e alceno ou qualquer combinação das mesmas. 0 composto de teste sintético também pode ser andaimes moleculares, tais como derivados de hidratos de carbono monociclicos ou biciclicos, esteróides, açúcares, estruturas heterociclicas, estruturas poliaromáticas ou outras estruturas capazes de actuar como um andaime. A invenção também se refere a métodos de síntese dessas bibliotecas e a utilização dessas bibliotecas para identificar e caracterizar moléculas de interesse de entre a biblioteca de composto de teste sintético. 1

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 reconhecimento e ligação de ligandos regulam guase todos os processos biológicos, incluindo reconhecimento imunológico, sinalização e comunicação de células, transcrição e tradução, sinalização intracelular e catálise enzimática. Como resultado, existe na técnica um interesse de longa data na identificação de moléculas gue podem ser utilizadas como se segue: para servir como agonistas ou antagonistas de ligandos, tais como hormonas, factores de crescimento ou neurotransmissores; para induzir imunidade de células B (mediada por anticorpo) ou células T (mediada por célula); para induzir catálise de reacções químicas; e para regular a expressão génica ao nível da transcrição ou tradução. Uma razão principal para este interesse é o desejo de utilizar directamente estas moléculas biologicamente activas como fármacos ou, se necessário, para converter estas moléculas em derivados que podem funcionar como fármacos.

Muitos ligandos biológicos são proteínas ou péptidos. Esta lista inclui a maioria das hormonas, factores de crescimento, moléculas neuroactivas e epitopos imunológicos. Por esta razão, os esforços iniciais para desenvolver agonistas ou antagonistas de actividades biológicas mediadas por receptores ou enzimas envolveram a concepção e síntese de péptidos. Contudo, os péptidos que se verificou possuírem actividades biológicas desejáveis são frequentemente inadequados como fármacos. Para se tornarem fármacos, os péptidos necessitam frequentemente de ser convertidos em derivados ou análogos estruturais, i. e., miméticos peptídicos que, ao contrário da maioria dos péptidos, possuem propriedades farmacocinéticas e de estabilidade satisfatórias. Surgiram muitas publicações descrevendo o desenvolvimento de miméticos peptídicos promissores ou medicinalmente úteis; alguns exemplos recentes incluem Rudy 2

Baum, em Chemical & Engineering página 33; Hirschmann, R. et al. 9699-9701; Hirschmann, R. et al. 9217-9218.

News, 18 de Janeiro de 1993 J. M. Chem. Soc., 1 992, 114 J. M. Chem. Soc., 1 992, 114 A descoberta de compostos biologicamente activos pode ser um processo difícil, moroso e extremamente dispendioso. Um problema chave nesta área é a identificação de uma única estrutura química, a partir de um grande número de estruturas relevantes possíveis, que possua as propriedades desejadas. Quando o processo de descoberta emprega uma estratégia sequencial de concepção, síntese e teste biológico da estrutura, a identificação de uma estrutura química desejável torna-se extremamente laboriosa. Para contornar esta tarefa altamente exigente, podem ser preparadas bibliotecas com um grande número de moléculas de estruturas diversas. Idealmente essas bibliotecas podem ser rastreadas e avaliadas rapidamente.

Muito do trabalho nesta área da síntese e rastreio de bibliotecas tem sido realizado com péptidos, e. g., as abordagens de Geysen (Geysen et al. Molecular Immunology, 1986, 23, 709-715; Geysen et al. J. Immunologic Methods, 1987, 102, 259-274), Fodor (Fodor et al., Science, 1991, 251, 767-773) e Houghten (Houghten et al., Nature, 1991, 354, 84-86). Contudo, essas bibliotecas estão limitadas em termos do número de variantes estruturais possíveis que podem ser preparadas, testadas e identificadas numa dada experiência. A invenção de bibliotecas verdadeiramente aleatórias de composto de teste sintético polimérico, em que uma única espécie polimérica originária de uma combinação de subunidades é ligada a um único suporte sólido, marcou um avanço importante na descoberta de compostos biologicamente activos que são péptidos 3 ou, de forma muito importante, péptido miméticos (ver pedido WO-A-9200091).

Os compostos orgânicos não peptidicos, tais como miméticos peptidicos, podem frequentemente superar ligandos peptidicos na afinidade para um determinado receptor ou enzima. A ligação de biotina e avidina, a mais forte alguma vez registada, envolve a associação de uma estrutura orgânica não peptidica (biotina) com uma proteína (avidina). Uma estratégia eficaz para a identificação rápida de ligandos biológicos de afinidade elevada, e em última análise novos e importantes fármacos, requer a construção e rastreio rápido de bibliotecas diversas de estruturas não peptídicas contendo uma variedade de unidades estruturais capazes de estabelecer um ou mais tipos de interacções com um aceitador biológico (e. g., um receptor ou enzima), tal como ligações de hidrogénio, pontes salinas, complexação n, efeitos hidrofóbicos, etc. Contudo, o trabalho na produção e rastreio de bibliotecas de compostos de teste sintéticos contendo moléculas não peptídicas está agora na sua infância. Um exemplo desta área é o trabalho de Ellman e Bunin numa síntese combinatória de benzodiazepinas num suporte sólido {J. Am. Chem. Soc. 114. 10997, (1992); ver Chemical and Engineering News, 18 de Janeiro de 1993, página 33) .

Um problema chave por resolver na área da produção e utilização de bibliotecas não peptídicas é a elucidação da estrutura de moléculas seleccionadas de uma biblioteca que mostram actividade biológica promissora.

Uma tentativa para revelar as estruturas de péptidos seleccionados de uma biblioteca utilizando códigos de sequências de nucleótidos únicos, que são sintetizados em série com a biblioteca de péptidos, foi recentemente descrita por Brenner e Lerner (Brenner, S. e Lerner, R.A. Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 4 1992 89, 5381-5383) . A sequência de nucleótidos do código ligado a cada péptido deve ser amplificável através da reacção em cadeia da polimerase (PCR). Contudo, as técnicas de síntese de nucleótidos não são compatíveis com todas as técnicas sintéticas requeridas para a síntese de muitos tipos de bibliotecas moleculares. Além disso, a íntima proximidade do nucleótido e do composto de teste sintético na biblioteca, que pode resultar em interacções entre estas moléculas, interferindo com a ligação do ligando com um receptor ou enzima alvo durante o ensaio biológico, também limitam esta abordagem. 0 componente nucleotídico da biblioteca pode interferir também durante ensaios biológicos numa variedade de outras formas.

Dower et al. (documento WO 93/06121) referem-se a um método estocástico para sintetizar bibliotecas de oligómeros aleatórios. Os oligómeros aleatórios são sintetizados em suportes sólidos ou partículas, mas podem ser clivados desses suportes para proporcionarem uma biblioteca solúvel. Os oligómeros são compostos de uma sequência de monómeros, sendo os monómeros quaisquer membros do conjunto de moléculas que se podem ligar conjuntamente para formar um oligómero ou polímero, i. e., aminoácidos, carbamatos, sulfonas, sulfóxidos, nucleósidos, hidratos de carbono, ureias, fosfonatos, lípidos, ésteres, combinações dos mesmos, e semelhantes. É utilizado um marcador identificável para identificar a sequência de monómeros no oligómero. O marcador identificável pode ser qualquer característica reconhecível que de alguma forma contenha a informação requerida e que é decifrável ao nível de um ou mais suportes sólidos. Os suportes sólidos podem ser ligados aos oligómeros e ao marcador identificável através de uma ou mais moléculas ligantes.

Kerr et al. (J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2520-2531) descreveram a síntese de bibliotecas de fase de solução de 5 péptidos, contendo resíduos de aminoácidos não naturais, em paralelo com cadeias codificantes de péptido. 0 ligando peptídico e a sua cadeia codificante nesta biblioteca estão ligados conjuntamente de forma covalente que permite o isolamento e determinação da sequência de pares de composto de teste sintético e código correspondente. Contudo, tal como com a biblioteca codificada por ácidos nucleicos descrita por Brenner e Lerner, supra, o péptido codificante pode interferir com o ensaio de rastreio. Além disso, a exigência de purificação de quantidades suficientes de material a partir da biblioteca com o método de selecção de afinidade, de modo a obter a sequência dos péptidos codificantes, impossibilita a síntese de bibliotecas com mais do que alguns milhares de espécies.

Assim, existe uma necessidade na técnica para novos métodos, gerais e versáteis para a produção e rastreio de bibliotecas de compostos pertencentes a uma variedade de classes químicas. Existe uma necessidade adicional para métodos eficazes para elucidarem as estruturas de compostos seleccionados a partir da biblioteca como resultado do rastreio, cujas estruturas não podem ser determinadas através de técnicas tradicionais, e. g., degradação de Edman ou espectrometria de massa, isoladamente. Ainda, uma outra necessidade na técnica é um sistema de código molecular que não interaja em ensaios de rastreio ou influencie a ligação do composto de teste sintético através de efeitos de proximidade. A citação ou identificação aqui de qualquer referência não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior para a presente invenção.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A requerente descobriu uma biblioteca para a identificação e análise de um ligando de um aceitador. A presente invenção é 6 dirigida a bibliotecas que compreendem uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada; a cada um dos quais está ligado um composto de teste e uma ou mais moléculas codificantes. 0 composto de teste é compreendido de uma sequência de subunidades e cada composto de teste está ligado a cada suporte de fase sólida através de um ligante clivável. As moléculas codificantes estão ligadas a cada suporte de fase sólida através de um ligante não clivável ou separadamente clivável. As moléculas codificantes são compreendidas de alfa aminoácidos. Além disso, cada espécie de molécula codificante é diferente da espécie de composto de teste, a sequência das subunidades do composto de teste é codificada pela espécie de moléculas codificantes, e as moléculas codificantes possuem subunidades organizadas num código não sequencial e estão topologicamente segregadas do composto de teste que está ligado ao suporte de modo que a molécula codificante esteja no interior do suporte e o composto de teste esteja no exterior do suporte. A presente invenção refere-se ainda a uma biblioteca para a identificação de um ligando ou um aceitador de interesse, compreendendo a biblioteca uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada, tendo a superfície de cada suporte ligado um ligante compreendendo uma espécie única de composto de teste possuindo uma sequência de subunidades, e tendo o interior de cada suporte ligada uma molécula codificante que codifica a sequência de subunidades do composto de teste tendo o ligante uma ligação que é clivável por uma enzima que não cliva uma ligação da molécula codificante, e sendo a molécula codificante compreendida de alfa aminoácidos. A presente invenção também proporciona uma biblioteca para a identificação de um ligando ou um aceitador de interesse, compreendendo a biblioteca uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada, tendo a superfície de cada suporte ligado 7 um ligante compreendendo uma espécie única de composto de teste compreendendo uma sequência de subunidades à qual está ligado um primeiro grupo protector, e tendo o interior de cada suporte ligada uma molécula codificante que codifica a sequência de subunidades e à qual está ligado um segundo grupo protector, sendo o primeiro grupo protector diferente do segundo grupo protector, e sendo a molécula codificante compreendida de alfa aminoácidos.

Os ensaios de rastreio para os compostos, tais como, mas não limitados a, actividade enzimática, actividade de transporte electrónico e fotoactividade, para mencionar alguns, são também contemplados pela invenção. São seleccionados os suportes sólidos que contêm compostos que demonstram a actividade de interesse no ensaio de rastreio. A estrutura do composto é determinada, e. g., através de espectrometria de massa, espectrometria de ressonância magnética nuclear ou outros métodos espectrométricos. De um modo preferido, a biblioteca é uma biblioteca codificada, o que nesse caso a estrutura do composto é codificada pela sequência da molécula codificante que pode ser prontamente determinada.

Os compostos da presente invenção podem proporcionar vias para agentes terapêuticos ou diagnósticos. De um modo mais preferido, os próprios compostos podem ser agentes terapêuticos ou diagnósticos úteis. Os compostos em suportes de fase separada podem também ser úteis para transporte electrónico, e. g., como transístores ou semicondutores.

4. DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Figura 1. Estratégias para ligação de bibliotecas codificadas de composto de teste sintético. As subunidades do composto de teste sintético são indicadas como [NONSEQ]; a molécula codificante é indicada por A-B-C. (A) O composto de teste e a molécula codificante podem ser ligados separadamente ao suporte, directamente ou através de um ligante, numa distribuição estatística que pode ser alterada com base na acção de massa e reactividade inerente. (B) 0 composto de teste sintético e a molécula codificante podem ser ligados ao mesmo ligante no suporte de fase separada, numa proporção molar definida. (C) 0 composto de teste sintético está ligado na superfície e a molécula codificante está ligada no interior de um suporte de fase separada, tal como uma esfera de resina. Alternativamente em (c), a molécula codificante pode estar na superfície e o composto de teste no interior.

Figura 2. Três formas de um modelo de biblioteca codificada em que o composto de "teste" (Ala-Phe-Val) e a molécula codificante (Gly-Tyr-Leu) são ambos péptidos. (A) 0 composto de "teste" foi sintetizado utilizando o grupo protector Fmoc, e a molécula codificante foi sintetizada com o grupo protector Boc. Fmoc e Boc são grupos protectores ortogonais. (B) 0 composto de "teste" desprotegido de Fmoc foi acetilado de modo que apenas o péptido codificante fosse sequenciado através de degradação de Edman. (C) 0 péptido codificante foi bloqueado com trifluoroacetil (TFA), permitindo a sequenciação de Edman do composto de "teste", seguida por remoção de TFA e sequenciação do péptido codificante. Os péptidos foram ligados à resina TentaGel (TG) através de um ligante de amida de segurança (SCAL; Patek e Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894) com ramificações de lisina.

Figura 3. Modelos de bibliotecas de andaime ramificado, mostrando várias químicas de ligação possíveis, incluindo a reacção de uma amina com um ácido carboxílico para formar uma amida; reacção de um ácido carboxílico com uma amina para formar 9 uma amida; reacção de um tiol com um alquil-halogénio para formar um sulfureto.

Figura 4. Um modelo de interseção de um composto de teste sintético de andaime com uma molécula aceitadora. (A) Os grupos funcionais ligados ao andaime são livres para assumirem uma conformação de ligação apropriada. (B) Os grupos funcionais no andaime estão confinados à conformação de ligação apropriada.

Figura 5. As estruturas de algumas das subunidades que podem ser quimicamente ligadas em estruturas aleatórias para formar as bibliotecas de composto de teste sintético.

Figura 6. Um modelo de biblioteca cíclica formada a partir de reacçóes de condensação repetidas com subunidades bloqueadas com Boc e Fmoc.

Figura 7. Um esquema para a preparação de uma biblioteca de andaime em resina TentaGel em que o andaime é ciclopentano.

Figura 8. Estruturas de subunidades utilizadas para preparar uma biblioteca de andaime da invenção. 0 código de aminoácidos de duas letras dos dipéptidos para cada uma das subunidades é mostrado abaixo de cada um. A preparação e utilização desta biblioteca são descritas na Secção 9, infra.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se a bibliotecas de composto de teste sintético ligado a suportes de fase separada, em que cada suporte de fase separada contém uma única espécie de composto de 10 teste sintético, e métodos de sintese e utilização dessas bibliotecas. 0 termo "suporte de fase separada" refere-se a uma matriz à qual o composto de teste sintético pode ser ligado, cuja matriz não é solúvel num liquido ou forma um sistema bifásico com um liquido. De um modo preferido, a fase separada é uma fase sólida, embora sejam também contempladas fases separadas, tais como hidrogéis e aerogéis.

Como aqui utilizado, o termo "biblioteca de composto de teste sintético" refere-se a colecções de composto de teste sintético em partículas de suporte de fase separada, em que cada partícula de suporte de fase separada contém uma única espécie estrutural do composto de teste sintético. Cada suporte contém muitas cópias da única espécie estrutural. Por exemplo, um suporte de resina típico para síntese peptídica de fase sólida contém cerca de 50-250 pmol de péptido. As estruturas do composto de teste sintético são derivadas a partir de uma combinação química substancialmente aleatória de "subunidades".

Como aqui utilizado, o termo "composto de teste sintético" refere-se a pequenas moléculas consistindo de 2 a 100, e de um modo mais preferido, 2-20 subunidades, com ou sem um andaime. Numa forma de realização, o composto de teste sintético é um polímero formado de subunidades ligadas através de ligações, tais como amida, ureia, éster, éter, carbamato, amina, sulfureto, dissulfureto, carbono-carbono, tais como alcano, alceno e alcino, e semelhantes; em particular, o composto pode incluir, mas não é limitado a, policarbamato, poliureia, poliamida, poliéster, poliéter, etc., ou qualquer combinação das mesmas, como descrito em detalhe infra. Noutra forma de realização, um composto de teste sintético pode ser um andaime molecular aleatoriamente funcionalizado, tal como, mas não limitado a, uma estrutura heterocíclica esteróide, um anel 11 poliaromático ou estrutura de hidrato de carbono, e semelhantes, como descrito em detalhe infra.

Como aqui utilizado, o termo "subunidade" refere-se a um subcomponente químico, por meio do qual o composto de teste sintético é formado por ligação dos subcomponentes através de uma química definida. Por exemplo, uma "biblioteca de péptidos" é uma colecção de péptidos (o composto de teste sintético), i. e, cadeias consistindo de 2-100 resíduos de α-aminoácidos (as subunidades), cujas sequências contêm qualquer resíduo de aminoácido anterior ou posterior a qualquer outro resíduo de aminoácido. Um exemplo de uma "biblioteca de derivados esteróides" é uma colecção de derivados esteróides contendo qualquer um de um conjunto de grupos funcionais, as subunidades, em posições específicas do núcleo esteróide.

De um modo mais preferido, a presente invenção refere-se a bibliotecas codificadas de composto de teste sintético. Como aqui utilizado, o termo "biblioteca codificada" refere-se a uma biblioteca em que, cada espécie distinta de composto é emparelhada em cada suporte de fase separada com uma molécula codificante cuja estrutura é prontamente determinável e codifica uma estrutura única para o seu parceiro de par na biblioteca. Numa forma de realização preferida de uma biblioteca molecular codificada, a molécula polimérica codificante é um péptido. Noutra forma de realização, a molécula polimérica codificante é um oligonucleótido.

Os exemplos de formas de realização de bibliotecas incluem, mas não estão limitados, aos seguintes: bibliotecas em que o composto de teste sintético são poliamidas, i. e., o composto de teste sintético são cadeias de 2-100 aminoácidos ligados através de ligações amida; 12 bibliotecas em que o composto de teste sintético são poliésteres, í. e., cadeias de 2-100 hidroxiácidos ligados através de ligações éster; bibliotecas em que o composto de teste sintético são poliéteres, i. e., cadeias de 2-100 hidroxiálcoois ligados através de ligações éter; bibliotecas poliureias; bibliotecas poliuretanos; em que o composto de teste sintético são em que o composto de teste sintético são bibliotecas em que o composto de teste sintético são policarbonatos; bibliotecas em que o composto de teste sintético são poliaminas; bibliotecas em que o composto de teste sintético são polialcanos, polialcenos ou poliálcoois, incluindo seus derivados halo; bibliotecas em que o composto de teste sintético são polissulfuretos; bibliotecas em que o composto de teste sintético são polidissulfuretos; biblioteca em que composto de teste sintético são polímeros cujas estruturas contêm segmentos organizados aleatoriamente a 13 partir de duas ou mais das estruturas poliméricas descritas nas formas de realização acima; bibliotecas em que o composto de teste sintético são derivados de uma estrutura esteróide; bibliotecas em que o composto de teste sintético são derivados de um açúcar, tal como β-D-glucose; bibliotecas em que o composto de teste sintético são derivados de uma estrutura heterocíclica, tal como benzodiazepina; bibliotecas em que o composto de teste sintético são derivados de uma estrutura capaz de servir um andaime sobre o qual podem ser ligadas de uma forma definida, uma multiplicidade de estruturas, tais como, mas não limitadas a, ácidos carboxilicos, aminas e derivados de halogéneo; bibliotecas em que as moléculas são estruturas quiméricas contendo uma ou mais sequências de comprimento variável ligadas através de química seleccionada de uma ou mais das seguintes: amidas, ésteres, éteres, carbonatos, sulfuretos, dissulfuretos, alcenos e aminas, e uma ou mais estruturas capazes de actuar como um andaime, tal como um esteróide, um açúcar, uma estrutura aromática ou poliaromática.

Muitas subunidades diferentes para as classes diferentes de composto de teste sintético estão comercialmente disponíveis a partir de fornecedores, tais como Sigma, Aldrich, ICI Chemicals, etc. Alternativamente, as subunidades podem ser preparadas sinteticamente utilizando técnicas convencionais de síntese química. 14

Numa forma de realização preferida, as bibliotecas listadas acima são bibliotecas codificadas em que cada suporte de fase separada contém um composto de teste sintético e uma sequência polimérica codificando a estrutura do composto de teste sintético. De um modo preferido, a sequência polimérica codificante é um péptido.

5.1 ESTRATÉGIAS DE CODIFICAÇÃO

Como assinalado acima, num aspecto preferido, as bibliotecas da invenção são bibliotecas codificadas em que a sequência de uma molécula codificante em cada suporte corresponde à estrutura deo composto de teste sintético em cada suporte. Assim, cada estrutura única de composto de teste sintético é codificada através de uma sequência única de molécula codificante. Como assinalado supra, de um modo preferido, a molécula codificante é um péptido, embora a presente invenção abranja a utilização de ácidos nucleicos ou qualquer polímero sequenciável como uma sequência codificante. 0 paradigma de uma sequência codificante é o código genético, em que sequências de nucleótidos triplos num gene correspondem a um aminoácido específico numa proteína codificada por um gene. A organização de codões num gene corresponde a uma sequência de aminoácidos numa proteína. Assim, o gene codifica a proteína.

No seguimento desta analogia, a codificação da sequência de uma biblioteca de composto de teste sintético, tal como uma poliamida cuja sequência não pode ser estabelecida através de métodos tradicionais (e. g., degradação de Edman), com uma molécula codificante pode ser realizada prontamente, utilizando um código análogo. A escolha do código é puramente arbitrária, 15 incluindo se combinações simples, duplas ou triplas (ou maiores) de subunidades da molécula codificante correspondem a cada subunidade do composto de teste sintético.

Por exemplo, a molécula codificante pode ser um péptido. Neste caso, são considerados como sendo especialmente úteis os códigos consistindo de um ou mais resíduos de aminoácidos que podem ser prontamente detectados através de degradação de Edman, e são também conhecidos por acoplarem eficientemente em síntese peptídica de fase sólida sem requererem protecção de cadeia lateral. Por exemplo, se for utilizado um código tripleto com base nos aminoácidos leucina (Leu), glicina (Gly), alanina (Ala) e fenilalanina (Phe) (todos os quais não requerem protecção da cadeia lateral e acoplam eficientemente durante a síntese peptídica e são, além disso, prontamente detectáveis através de degradação de Edman), as bibliotecas de composto de teste sintético contendo até sessenta e quatro subunidades estruturalmente diferentes, com cada subunidade emparelhada com um único péptido contendo tripletos de Leu, Gly, Ala ou Phe (cada tripleto correspondendo a uma e apenas uma subunidade na poliamida), podem ser sintetizadas utilizando reacções químicas adequadas. Outros aminoácidos preferidos, í. e., aqueles que não requerem protecção da cadeia lateral, incluem mas não estão limitados a isoleucina, valina, ciclo-hexil-L-alanina, norleucina, norvalina, prolina e semelhantes. São menos preferidos a asparagina e glutamina. Noutra forma de realização, cada um dos 20 aminoácidos naturais pode codificar para uma subunidade específica. Uma subunidade de sequência codificante única ou codão pode codificar para mais de que uma subunidade do composto de teste sintético, resultando num código degenerado, embora isto não seja necessário. A presente invenção proporciona várias estratégias para aumentar a probabilidade de que os ensaios de rastreio 16 reconheçam o composto de teste sintético activo em vez das moléculas codificantes num dado suporte que são discutidas na Secção 5.3., infra.

5.2 MÉTODOS PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE COMPOSTO DE TESTE SINTÉTICO

Como acima referido, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma biblioteca de composto de teste sintético em suportes de fase separada. De um modo preferido, a biblioteca é uma em que cada composto de teste sintético é emparelhado com uma molécula codificante única, e. g., um péptido, cuja sequência codifica a estrutura do composto de teste sintético ligado ao mesmo suporte e pode ser prontamente determinada utilizando técnicas analíticas tradicionais, e. g., degradação de Edman.

Se forem funcionalizados andaimes moleculares ao composto de teste sintético, o andaime ou um precursor do andaime irá ser ligado ao suporte de fase sólida antes do início da síntese. A síntese de bibliotecas de composto de teste sintético compreende a repetição dos seguintes passos: (i) divisão do suporte seleccionado num número de porções que é, pelo menos, igual ao número de subunidades diferentes a serem ligadas; (ii) ligação química de uma e apenas uma das subunidades do composto de teste sintético com uma e apenas uma das porções do suporte sólido do passo (i), assegurando de um modo preferido que a reacção de formação da ligação 17 química seja conduzida até à conclusão na extensão máxima possível; (iii) mistura exaustiva das porções de suporte sólido contendo o composto de teste sintético crescente; (iv) repetição dos passos (i) a (iii) um número de vezes igual ao número de subunidades em cada um dos compostos de teste sintéticos da biblioteca desejada, crescendo assim o composto de teste sintético; (v) remoção de quaisquer grupos protectores que foram utilizados durante a montagem do composto de teste sintético no suporte sólido.

De um modo preferido, é sintetizada uma molécula codificante em paralelo com o composto de teste sintético. Neste caso, antes ou depois da ligação da subunidade do composto de teste sintético ao suporte no passo (ii) , uma ou mais subunidades da molécula codificante que corresponde(m) à subunidade adicionada do composto de teste sintético, são ligadas à molécula codificante crescente de modo que seja criado em cada suporte um código estrutural único (ver Secção 5.1, supra), correspondente à estrutura do composto sintético de teste crescente. Pode ser prontamente apreciado que se for preparada uma biblioteca codificada, a síntese da subunidade ou subunidades codificantes deve preceder o passo de mistura, (iii). A repetição dos passos (i)-(iii) (ver passo (iv)) resultará naturalmente no crescimento do composto de teste sintético e, se o processo for modificado para incluir a síntese de uma molécula codificante, a molécula codificante em paralelo com o composto de teste. 0 braço de teste e o braço codificante são aqui utilizados para referirem o composto de teste sintético 18 sintetizado no suporte e, se presente, a molécula codificante sintetizada no suporte, respectivamente. A presente invenção abrange a modificação de qualquer dos passos do processo acima. Por exemplo, uma biblioteca diferente, e ocasionalmente desejável, resultará se o passo (ii) for alterado para envolver a ligação da mesma subunidade de polimero a todas as porções do suporte sólido. Neste caso, a elongação do polimero codificante necessita ser modificada analogamente.

Noutra forma de realização, se o mesmo polimero for alongado no braço de teste como no braço codificante, o braço codificante não necessita ser alongado para além do ponto requerido para codificar uma subunidade não sequenciável do composto de teste sintético, desde que a história da síntese seja conhecida, e. g., o número de subunidades seja conhecido.

Noutra forma de realização da invenção, o suporte sólido utilizado para realizar a síntese de um composto de teste sintético, que é um polímero curto, é derivatizado com uma ou mais das subunidades do polímero antes da sua utilização na síntese de uma biblioteca.

Numa forma de realização, são utilizadas partículas de suporte suficientes de modo que exista uma probabilidade elevada de que esteja presente na biblioteca cada estrutura possível do composto de teste sintético. Essa biblioteca é referida como uma biblioteca "completa". Para assegurar uma probabilidade elevada de representação de cada estrutura é requerida a utilização de um número de suportes em excesso, e. g., em cinco vezes, vinte vezes, etc., de acordo com a estatística, tal como a estatística de Poisson, do número de espécies possíveis de compostos. Noutra forma de realização, especialmente no caso em que o número de estruturas possíveis excede o número de suportes, nem todas as 19 estruturas possíveis são representadas na biblioteca. Essas bibliotecas "incompletas" são também muito úteis.

Numa forma de realização adicional, uma biblioteca pode ter composto de teste sintético cujas estruturas incluem uma sequência polimérica desejável, encontrada como resultado de rastreio de outra biblioteca adicionada antes da produção da biblioteca ou no final da produção da biblioteca. Essa biblioteca é preparada através da síntese de um suporte sólido contendo a sequência polimérica desejável e utilizando este suporte derivatizado como o suporte sólido para a síntese da nova biblioteca. Alternativamente, uma porção do composto de teste sintético da biblioteca pode ser sintetizada, seguida por síntese da sequência polimérica desejável como uma extensão dos compostos de teste em todos os suportes de fase separada. Alternativamente, a sequência desejável pode ser descontínua e incluída dentro da biblioteca aleatória.

5.3 DESENVOLVIMENTO E UTILIZAÇÃO DE SUPORTES DE SÍNTESE DE FASE SEPARADA E LIGANTES EM SÍNTESES DE BIBLIOTECA MOLECULAR CODIFICADA

5.3.1 SUPORTES E LIGANTES ÚTEIS NA SÍNTESE DE BIBLIOTECA MOLECULAR CODIFICADA

Um suporte de fase separada adequado para utilização na presente invenção é caracterizado pelas seguintes propriedades: (1) insolubilidade em fases líquidas utilizadas para a síntese 20 ou rastreio; (2) capaz de mobilidade em três dimensões independentemente de todos os outros suportes; (3) conter muitas cópias de cada um dos compostos de teste sintéticos e, se presente, da sequência codificante ligada ao suporte; (4) compatibilidade com condições do ensaio de rastreio; e (5) ser inerte às condições de reacção para a sintese de um composto de teste e para a sintese da molécula codificante. Um suporte preferido também tem grupos funcionais reactivos, tais como hidroxilo, carboxilo, amino, tiol, etc., para ligação de uma subunidade que é um precursor de cada um dos compostos de teste sintéticos e moléculas codificantes, ou para ligação de um ligante que contém um ou mais grupos reactivos para a ligação do monómero ou outro precursor de subunidade.

Como aqui utilizado, o suporte de fase separada não está limitado a um tipo especifico de suporte. Mais exactamente, está disponível grande número de suportes e são conhecidos dos especialistas na técnica. Num aspecto preferido, o suporte de fase separada é um suporte de fase sólida, embora a presente invenção abranja a utilização de semi-sólidos, tais como aerogéis e hidrogéis. Os suportes de fase sólida incluem sílica gel, resinas, películas de plástico derivatizadas, esferas de vidro, algodão, esferas de plástico, géis de alumina, polissacáridos, tais como Sepharose e semelhantes, etc. Um suporte de fase sólida adequado pode ser seleccionado com base na utilização final desejada e na adequação para vários protocolos sintéticos. Por exemplo, na síntese de poliamida, o suporte de fase sólida útil pode ser resinas, tais como poliestireno (e. g., resina PAM obtida a partir da Bachem Inc., Península Laboratories, etc.), resina POLYHIPE® (obtida a partir da Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtida a partir da Península Laboratories), resina de poliestireno enxertada com polietilenoglicol (TentaGel®, Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha) ou resina de polidimetil-acrilamida (obtida a partir da 21

Califórnia).

Milligen/Biosearch, Califórnia). Numa forma de realização preferida para péptidos e outras sínteses de poliamida, o suporte de fase sólida preferido é resina de polidimetil-acrilamida. Os suportes de síntese de fase sólida preferidos para sínteses específicas são descritos abaixo. Por exemplo, numa forma de realização específica de modelo, infra, um suporte tal como é utilizado na síntese peptídica de Merrifield pode ser derivatizado sequencialmente através de um aminoácido protegido com Fmoc, o qual através de ciclos sintéticos subsequentes é estendido para produzir o "composto de teste sintético" de poliamida, e um aminoácido protegido com Boc ou Ddz, que é estendido para produzir o péptido codificante. Outras derivatizações sequenciais são descritas abaixo. Assim, cada esfera de resina é funcionalizada para conter tanto o composto de teste sintético como as estruturas codificantes correspondentes, cujas quantidades relativas dependem das condições de reacção para ligação dos primeiros aminoácidos protegidos com Fmoc- e Ddz- (ou Boc-) . Numa variação desta abordagem, as moléculas de composto de teste sintético e codificantes são ligadas ao suporte sólido através de ligantes, tais como aqueles descritos abaixo.

Os suportes da invenção podem também compreender ligantes ou um arranjo de ligantes. Como aqui utilizado, um ligante refere- se a qualquer molécula contendo uma cadeia de átomos, e. g., carbono, azoto, oxigénio, etc., que serve para ligar as moléculas a serem sintetizadas no suporte com o suporte. 0 ligante é geralmente ligado ao suporte através de uma ligação covalente, antes da síntese começar no suporte, e proporciona um ou mais locais para a ligação de precursores das moléculas a serem sintetizadas no suporte. Podem ser utilizados vários ligantes para ligar os precursores das moléculas a serem sintetizadas ao suporte de fase sólida. Os exemplos de ligantes incluem o ácido aminobutírico, ácido aminocapróico, ácido 22 7-amino-heptanóico, ácido 8-aminocaprílico, lisina, ácido iminodiacético, polioxietileno, ácido glutâmico, etc. Numa forma de realização adicional, os ligantes podem compreender adicionalmente uma ou mais β-alaninas ou outros aminoácidos como espaçadores.

Noutra forma de realização, o "ligante de amida de segurança" (SCAL) (ver Patek, M. e Lebl, M. 1991, Tetrahedron Letters 32:3891-3894; Publicação de Patente Internacional WO 92/18144, publicada em 29 de Outubro de 1992) é introduzido no suporte.

Para além dos ligantes descritos acima podem ser utilizados ligantes selectivamente cliváveis, de um modo preferido para ligação da molécula de composto de teste sintético. Um exemplo é o ligante sensível à luz ultravioleta, ONb, descrito por Barany e Albericio (1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942). Outros exemplos de ligantes fotocliváveis são encontrados em Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45) e Kreib-Cordonier et al. (1990, em "Peptides - Chemistry, Structure and Biology", Rivier e Marshall, eds., pp. 895-897). Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149) utilizou ácido fórmico aquoso para clivar ligações Asp-Pro; esta abordagem tem sido utilizada para caracterizar determinantes de células T conjuntamente com o método de síntese de pin de Geysen (Van der Zee et al., 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Outros ligantes potenciais cliváveis sob condições básicas incluem aqueles baseados em ácido p-(hidroximetil)benzóico (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin 1:538-546) e ácido hidroxiacético (Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28). Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33; Publicação Internacional WO 90/09395, publicada em 23 de Agosto de 1990) descreveram 23 clivagem peptídica através de um mecanismo de dicetopiperazina. As ligações de dicetopiperazina preferidas são divulgadas no Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/919454, apresentado em 24 de Julho de 1992 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Também podem ser úteis ligantes cliváveis por enzima. Uma enzima pode clivar especificamente um ligante que compreenda uma sequência que seja reconhecida pela enzima. Assim, os ligantes contendo sequências peptidicas adequadas podem ser clivados por uma protease e os ligantes contendo sequências de nucleótidos adequadas podem ser clivados por uma endonuclease. Em determinados casos, pode-se derivatizar uma porção (e. g., 10-90%) dos grupos funcionais de resina disponíveis com um ligante clivável utilizando determinadas condições de reacção, e o restante dos grupos funcionais de resina com um ligante que é estável às condições de clivagem para assegurar que permaneça material suficiente na resina depois da clivagem para posterior estudo. Este arranjo é particularmente preferido quando não existe molécula codificante. Podem também ser utilizadas combinações de ligantes cliváveis sob condições de reacção diferentes para permitir clivagem selectiva de moléculas a partir de uma única esfera de suporte sólido.

De um modo preferido, pode ser utilizado um ligante clivável para libertar o composto de teste sintético, ou uma sua porção, para testar num ensaio de rastreio. Neste caso, a sequência codificante, se presente, é ligada ao suporte de fase sólida através de um ligante não clivável.

Uma abordagem para a síntese de bibliotecas codificadas envolve a ligação conjunta de precursores de moléculas de composto de teste sintético e codificantes da biblioteca, através de um ligante ramificado que também serve para ligar ambos os precursores ao suporte sólido. Dependendo da estrutura 24 do ligante, qualquer uma das moléculas ou ambas podem ser destacadas do suporte sólido para um posterior estudo. Um exemplo desta abordagem de ancoramento de moléculas de composto de teste sintético e codificantes é a utilização de TentaGel derivatizado com Lys(SCAL).

Um ligante de suporte de fase sólida para utilização na presente invenção pode ainda compreender uma molécula de interesse, que pode ser ainda derivatizada para produzir uma biblioteca molecular. A molécula pré-ligada pode ser seleccionada de acordo com métodos aqui descritos ou pode compreender uma estrutura conhecida por incorporar propriedades desejadas. A presente invenção abrange a utilização de uma série de ligantes ligados ao suporte sólido num de muitos arranjos. Por exemplo, um grupo carboxilo de lisina pode ser ligado a um ligante SCAL que esteja ligado ao suporte de fase sólida, produzindo assim um suporte funcionalizado com um ligante lisina-SCAL. Noutra forma de realização, a lisina pode ser ligada ao suporte de fase sólida através de um ligante de polietilenoglicol. Um ligante SCAL de suporte sólido pode também ser ligado a um grupo amino de um ligante de diamina, enquanto o outro grupo amino pode ser utilizado directamente para acoplamento adicional. Ainda noutra forma de realização, um ligante clivável pode ser ligado a um dos grupos amino de uma lisina ligada a um suporte enquanto o outro grupo amino é utilizado sem modificação adicional. Os acoplamentos específicos a cada grupo amino de um ligante de lisina podem ser realizados através da utilização de grupos protectores ortogonais.

Numa forma de realização específica, infra, o SCAL ligado a TentaGel pode ser acilado com lisina, cujos grupos amino estão protegidos com Fmoc e Boc; o suporte resultante é TentaGel com o 25 ligante Boc-Lys(Fmoc)-SCAL, o qual pode ser desprotegido sequencialmente para proporcionar dois grupos amino únicos que, e. g., após acilações através de dois conjuntos diferentes de aminoácidos, podem tornar-se âncoras para duas poliamidas. A acilação de um dos grupos amino da unidade lisina do ligante com Boc-Lys(Fmoc) proporciona um novo ligante com um total de três potenciais âncoras amino (após desprotecção sequencial), e acilação de ambos os grupos amino do ligante de lisina através de Boc-Lys(Fmoc) proporciona um novo ligante com um total de quatro potenciais âncoras amino.

5.3.2 TOPOLOGIA DE ANCORAMENTO DE COMPOSTOS DE TESTE SINTÉTICO E MOLÉCULAS CODIFICANTES SOBRE SUPERFÍCIES DE SUPORTE SÓLIDO

Uma variedade de abordagens para separação topológica do composto do teste sintético e moléculas codificantes num suporte sólido são contempladas de modo a produzir bibliotecas. A separação topológica do composto de teste sintético e da molécula codificante refere-se à separação no espaço para um suporte. Por exemplo, se o suporte for uma esfera de resina, a separação pode ser entre a superfície e o interior da esfera de resina de um número significativo das moléculas candidatas a ligando de um número significativo de moléculas codificantes. De um modo preferido, a superfície do suporte contém principalmente moléculas de composto de teste sintético e muito poucas moléculas codificantes. De um modo mais preferido, a superfície do suporte contém mais do que 90% de composto de teste sintético. De um modo ainda mais preferido, a superfície do suporte contém mais do que 99% de moléculas de composto de teste sintético; de um modo muito preferido, contém mais do que 99,9% de composto de teste sintético. A vantagem de tal arranjo é que 26 este limita a interferência da molécula codificante num ensaio de rastreio de ligação (ver Secção 5.6, infra). Não é necessário que a área topológica que contém a sequência codificante, i. e., o interior de uma esfera de resina, esteja livre de composto de teste sintético.

No exemplo anterior, a molécula codificante é segregada no interior da partícula de suporte. É também contemplado que a molécula codificante possa ser segregada à superfície de uma partícula de suporte, ou a um lado de uma partícula de suporte.

Uma abordagem geral para a separação topológica do composto de teste sintético de moléculas codificantes envolve a derivatização selectiva de locais reactivos no suporte com base na acessibilidade diferencial dos locais de acoplamento para reagentes e solventes. Por exemplo, as regiões de acessibilidade baixa numa esfera de resina são o interior da esfera, e. g., vários canais e outras cavidades. A superfície de uma esfera de resina, que está em contacto com as moléculas da solução em que a esfera está suspensa, é uma região de acessibilidade relativamente elevada. Os métodos para efectuar a ligação selectiva de precursores codificantes e de composto de teste sintético a um suporte de fase sólida adequado incluem, mas não estão limitados, ao seguinte. (i) Derivatização selectiva de superfícies de suporte sólido através de fotólise controlada: podem ser utilizadas duas abordagens. Numa, um suporte sólido funcionalizado é protegido com um grupo protector fotoclivável, e. g., nitroveratriloxicarbonilo (Nvoc) (Patchornik et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92:6333). As partículas de suporte derivatizadas com Nvoc são organizadas numa formação em monocamada numa superfície adequada. A monocamada é fotolisada utilizando luz de 27 intensidade controlada de modo que a área da esfera mais provável de ser desprotegida pela luz seja a área da esfera em maior contacto directo com a luz, i. e., a superfície exterior da esfera. As esferas parcialmente desprotegidas resultantes são lavadas exaustivamente e feitas reagir com um precursor do composto de teste sintético contendo um grupo protector estável à luz. Por exemplo, no caso da síntese de uma biblioteca codificada de poliamidas, este precursor pode ser um aminoácido protegido com Boc, que através de ciclos sintéticos adicionais é convertido no composto de teste sintético de poliamida. No seguimento da reacção com o precursor do composto de teste sintético, as esferas são submetidas a fotólise quantitativa para remover os restantes grupos protectores sensíveis à luz, expondo assim os grupos funcionais em ambientes menos acessíveis à luz, e. g., o interior de uma esfera de resina. Após esta fotólise quantitativa, as partículas de suporte são ainda derivatizadas com um precursor protegido ortogonalmente da molécula codificante, e. g., aminoácido protegido com Fmoc. A esfera de suporte sólido resultante irá em última análise conter composto de teste sintético segregado principalmente na superfície exterior e moléculas codificantes localizadas no interior da esfera de suporte de fase sólida.

Uma técnica fotolítica alternativa para segregar moléculas codificantes e composto de teste sintético num suporte envolve a derivatização do suporte com um ligante ramificado, um ramo do qual é fotoclivável, e ligando o precursor da molécula codificante ao ramo fotossensível do ligante. Após conclusão da síntese, as esferas de suporte são organizadas numa formação em monocamada e fotolisadas como acima descrito. Esta fotólise proporciona esferas que contêm segmentos de moléculas de composto de teste sintético para rastreio selectivo com interferência mínima das moléculas codificantes. 28 (ii) Derivatização selectiva de superfícies de suporte sólido utilizando abordagens químicas ou bioquímicas. A eficácia destas derivatizações químicas e bioquímicas depende da capacidade de grupos funcionais da superfície exterior, que estão expostos, para reagir mais rapidamente do que outros grupos no interior que não estão expostos. Foi observado, por exemplo, que os anticorpos não se podem ligar a ligandos peptídicos no interior de um suporte de fase sólida de resina. Deste modo, utilizando diferenças de impedimento estérico impostas pela estrutura do suporte ou por modulação do aumento de volume de uma esfera através de escolha do solvente de reacção, os grupos reactivos no exterior da esfera que estão acessíveis às macromoléculas ou a determinados reagentes podem ser feitos reagir selectivamente, relativamente a grupos reactivos no interior da esfera. Deste modo, os grupos reactivos no exterior da esfera podem ser modificados para a síntese do composto de teste sintético, enquanto os grupos reactivos interiores podem ser modificados para extensão das moléculas codificantes, ou de ambas as moléculas codificantes e o composto de teste sintético. Uma vez que o número de grupos reactivos dentro de uma esfera de resina é muito maior do que o número de grupos na superfície exterior, o número real de moléculas codificantes será muito grande, proporcionando moléculas codificantes suficientes para rigorosa análise de sequência, e assim a descodificação da estrutura do composto de teste sintético. Estão contempladas uma variedade de abordagens químicas e bioquímicas, incluindo o seguinte: (a) Utilização de agentes desprotectores poliméricos para desprotegerem selectivamente partes do exterior de uma esfera de suporte sólido contendo grupos funcionais protegidos. Os grupos funcionais desprotegidos são utilizados como âncoras para o composto de teste sintético. Os grupos funcionais que permanecem protegidos são subsequentemente desprotegidos utilizando um 29 agente desprotector não polimérico e utilizados como âncoras para a ligação das moléculas codificantes. Numa forma de realização especifica, este método envolve a utilização de enzimas para activar selectivamente grupos localizados no exterior de esferas que foram derivatizadas com um substrato enzimático adequado. Devido ao seu tamanho, as enzimas são

excluídas do interior da esfera. Num exemplo, infra, uma enzima remove completamente um substrato da superfície de uma esfera de resina, sem afectar significativamente a quantidade total de substrato ligado à esfera, i. e., o interior da esfera. A remoção do substrato expõe, e assim activa, um local reactivo sobre a esfera. Os grupos modificados por enzima do suporte sólido são utilizados para ancoramento do composto de teste sintético e aqueles grupos que escaparam à modificação são utilizados para ancoramento da maioria das moléculas codificantes. (b) Utilização de um grupo protector polimérico para bloquear selectivamente grupos funcionais desprotegidos expostos no exterior de uma esfera de suporte. Os grupos funcionais desprotegidos no interior do suporte são utilizados para ancoramento da molécula codificante. Os restantes grupos funcionais protegidos são depois desprotegidos e utilizados como âncoras para o composto de teste sintético da biblioteca. Num exemplo específico, infra, o polímero de ácido poliglutâmico de MM de 30 kd bloqueia completamente os grupos funcionais acessíveis à superfície sem afectar a quantidade total de péptido ligado à esfera. Se o polímero utilizado para o bloqueamento for ligado através do seu grupo α-carboxilo, então uma degradação de Edman de passo único realizada após desprotecção do grupo α-amino do polímero, pode regenerar os grupos amino de superfície. 30 (c) Criação de um estado diferente no interior da esfera, e. g., por congelamento de água dentro das esferas, depois fazendo reagir as esferas num solvente orgânico a temperatura baixa para manter a água congelada. Assim, a superfície da esfera, mas não o interior, pode ser feito reagir especificamente.

5.4 ESTRATÉGIA PARA REALIZAR SÍNTESES ALTERNATIVAS DAS MOLÉCULAS CODIFICANTES E DOS COMPOSTOS DE TESTE SINTÉTICOS DURANTE A PRODUÇÃO DE BIBLIOTECAS CODIFICADAS

Uma operação sintética importante durante a síntese de uma biblioteca codificada envolve a utilização de grupos protectores ortogonais. Para a síntese eficiente das moléculas codificantes em paralelo com a síntese do composto de teste sintético da biblioteca na mesma partícula de suporte sólido, os grupos protectores utilizados para cada síntese devem ser ortogonais, í. e., durante todas as operações sintéticas numa molécula os grupos protectores na outra molécula devem permanecer intactos.

Podem ser utilizadas diversas combinações ortogonais de grupos protectores para a montagem do composto de teste sintético e das moléculas codificantes de uma biblioteca molecular. Os grupos protectores úteis são descritos em Geiger e Konig, 1981, "The Peptides" (Gross e Meinhofer, eds.) pp. 3-101, Academic Press: Nova Iorque). Uma combinação muito útil envolve grupos protectores cliváveis por ácido e base. Por exemplo, para a síntese de uma biblioteca codificada de poliamidas, o grupo protector sensível a base N“-[(9-fluorenilmetil)oxi]carbonilo (Fmoc-) pode ser utilizado para montar as moléculas de composto de teste sintético, e o grupo protector lábil ao ácido N“-[[2-(3,5-dimetoxifenil)prop-2-il]oxi]carbonilo (Ddz) pode ser utilizado para montar as moléculas peptídicas codificantes. Os 31 grupos protectores Fmoc e a sua utilização em sintese peptidica foram descritos por Carpino e Han (1972, J. Org. Chem. 37:34 03 — 3409) e grupos protectores Ddz foram descritos por Voss e Birr (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1981, 362, 717-725) . Ambos os tipos de grupos protectores têm sido tradicionalmente utilizados para bloquear os grupos α-amino de α-aminoácidos durante a sintese peptidica; contudo, outros grupos amino adequados podem ser protegidos por estes grupos durante a sintese de uma poliamida. Se as poliamidas de interesse contiverem cadeias laterais com grupos funcionais reactivos, pode ser útil a protecção dos grupos reactivos como derivados de t-butoxicarbonilo (Boc) e t-butilo (t-Bu) ou de um modo preferido, como os derivados mais estáveis a ácido, benzilo e benziloxicarbonilo. Se os grupos reactivos da cadeia lateral forem protegidos utilizando grupos de tipo t-butilo, o péptido codificante pode ser sintetizado utilizando um grupo protector que é mais lábil ao ácido do que Ddz, tal como Nps (Zervas et al., 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:3660) ou Trt (Zervas et al., 1956, J. Am. Chem. Soc. 78:1359)

Uma combinação alternativa de grupos protectores ortogonais na sintese de uma biblioteca codificada de poliamidas envolve a utilização de Fmoc ou de outros grupos lábeis a base para montar os péptidos codificantes e Ddz ou outros grupos lábeis a ácido para montar os candidatos de ligação a ligando.

Uma combinação ortogonal alternativa de grupos protectores para a síntese alternada e paralela de moléculas codificantes e de composto de teste sintético, envolve tricloroetoxicarbonilo como um grupo protector de amina e tricloroetilo como um grupo protector de hidroxilo, que podem ser removidos utilizando um agente redutor, tal como zinco em ácido acético, para a síntese de, e. g., poliésteres numa biblioteca codificada de 32 poliésteres, e Boc e t-Bu ou outro grupo clivável por ácido para a síntese de péptidos codificantes. Como anteriormente, os dois conjuntos de grupos protectores ortogonais podem ser permutáveis, i. e., são utilizados aminoácidos protegidos por N“-tricloroetoxicarbonilo para preparar os péptidos codificantes e são utilizados monómeros protegidos por N“-Boc para preparar as poliamidas de composto de teste sintético.

Uma combinação útil adicional de grupos protectores ortogonais envolve o grupo trimetilsililetoxicarbonilo que pode ser removido através de iões fluoreto, e um grupo protector altamente sensível a ácido, tal como Ddz ou Bpoc (2-Bifenil-2-propoxicarbonilo) . Pode ser utilizado ambos os tipos de grupo protector para N-protecção durante a montagem da poliamida numa síntese de biblioteca de poliamida codificada ou do péptido codificante.

Para a síntese das moléculas codificantes do péptido em bibliotecas codificadas preferidas, irão ser utilizadas as técnicas bem conhecidas de síntese peptídica de fase sólida, incluindo estratégias adequadas de grupo protector. A técnica anterior publicada relevante de síntese peptídica é bastante extensa e inclui entre outros Stewart e Young, 1984, "Solid Phase Synthesis", Segunda Edição, Pierce Chemical Co., Rockford II.; Bodanszky, Y. Klausner, e M. Ondetti, "Peptide Synthesis", Segunda Edição, Wiley, Nova Iorque, 1976; E. Gross e J. Meienhofer (editores), "The Peptides", vol. 1, séries de continuação, Academic Press, Nova Iorque, 1979.

5.5 BIBLIOTECAS ESPECÍFICAS DE COMPOSTOS DE TESTE E MÉTODOS DE SÍNTESE DAS MESMAS 33

Os tipos específicos de ligações para as bibliotecas listadas na secção 5 são descritos abaixo, assim como reacções sintéticas que podem ser utilizadas para produzir estas bibliotecas, i. e., reacções que são utilizadas para realizar o passo (ii) do processo geral para a produção de bibliotecas (ver secção 5.2). Como pode ser prontamente entendido por um especialista na técnica, a partir da discussão anterior e do seguinte material exemplificativo, qualquer das numerosas reacções de condensação conhecidas na química sintética que pode prosseguir de uma forma progressiva com grupos protectores apropriados pode ser utilizada para preparar as bibliotecas da invenção. A lista de subunidades que podem ser utilizadas para preparar essas bibliotecas é vasta; muitos reagentes adequados podem ser obtidos comercialmente ou sintetizados utilizando protocolos bem conhecidos. Uma lista parcial de estruturas de subunidades adequadas é mostrada na Figura 5. Os exemplos de reacções sintéticas são descritas nas seguintes subsecções e Esquemas.

Nestes Esquemas, Z é qualquer grupo alquilo, arilo, heteroalquilo ou heteroarilo, contendo um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a, H, -NH2, -OH, C02H, -C02R, -CONHR, e semelhantes. Alquilo significa um hidrocarboneto saturado ou insaturado de C2 a C20. Arilo significa um hidrocarboneto aromático de C5 a C20. P com um círculo refere-se a um suporte de fase separada, e. g., uma esfera de resina. P (sem um círculo) refere-se a um grupo protector. Os símbolos restantes têm o seu significado convencional.

Estas estratégias podem ser utilizadas para preparar bibliotecas codificadas através da utilização de grupos protectores ortogonais adequados, como acima descrito. 34

5.5.1 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES AMIDA COM SUBUNIDADES DIFERENTES DE a-AMINOÁCIDOS

Estão contempladas uma variedade de bibliotecas contendo uma ou mais ligações amida, incluindo bibliotecas de poliamidas cujas estruturas contêm aminoácidos diferentes de α-aminoácidos. 0 Esquema 1 mostra uma estratégia sintética para poliamidas:

ESQUEMA I 35 2ο

ο η2ν-®

Η

PlOjC-Z-COjH/ DCC/HOBt Desprotecção í. p2-nh-z-nh2/dcc/hobc 2. Desprotecção 1 r 0 o

Η H

1- P1O3C-Z-CO2H/ DCC/HOBt 2 - Desprotecção Η H

O O JL-z-V®

H

Um suporte sólido adequado, tal como um dos suportes descritos na secção 5.2, é acoplado com um anidrido de ácido carboxilico num solvente adequado para produzir um suporte de amida de ácido carboxilico. 0 suporte ácido-amida é ainda alongado através de activação do grupo carboxilo, utilizando um composto, tal como diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), na presença de hidroxibenzotriazole (HOBt), seguido por condensação com uma 36 diamina contendo um grupo amino protegido; a desprotecção do produto de condensação produz uma diamida-amina no suporte sólido. A repetição deste ciclo sintético, isto é, reacção sequencial com um anidrido, condensação com uma única diamina protegida, e desprotecção, produz uma poliamida crescente no suporte sólido. Se a sequência de poliamida terminada contiver grupos protectores, esta é desprotegida sem destacamento do suporte sólido.

Uma abordagem sintética alternativa para poliamidas envolve a modificação da sintese acima por substituição do anidrido com um ácido dicarboxilico parcialmente protegido, e. g., um meio éster de ácido dicarboxilico adequado. A resina de amida do éster resultante é desprotegida e activada com, e. g., DCC/HOBt antes da condensação com a diamina.

Para a sintese de poliamidas de composto de teste sintético cujas estruturas contêm α-aminoácidos, tais como péptidos e miméticos peptidicos, podem ser utilizadas as técnicas de sintese peptídica descritas anteriormente.

Numa forma de realização, pode ser incluído piroglutamato como o resíduo do N-terminal das poliamidas de teste sintéticas da biblioteca.

Numa forma de realização adicional, as subunidades que conferem propriedades estruturais e químicas úteis serão escolhidas para incorporação numa sequência de poliamida de teste sintética. Em particular, a presente invenção considera a preparação de bibliotecas de poliamidas que têm propriedades estruturais mais bem definidas do que péptidos nativos. Noutra forma de realização, pode ser produzida uma biblioteca de poliamida que incorpore uma ligação peptídica reduzida, i. e., Ri-CH2-NH-R2, em que Ri e R2 são sequências ou resíduos de 37 aminoácidos. Uma ligação peptídica reduzida pode ser introduzida como uma subunidade de dipéptido. Essa molécula poderia ser resistente a hidrólise da ligação peptídica, e. g., actividade de protease. Essas bibliotecas poderiam proporcionar ligandos com função única e actividade comparada com aquelas de péptidos nativos correspondentes, tais como semi-vidas prolongados in vivo devido a resistência à degradação metabólica ou actividade de protease.

Uma poliamida cíclica ou rígida confinada pode ser preparada de acordo com o método descrito anteriormente, desde que em, pelo menos, duas posições na sequência de todos os compostos de teste sintéticos, sejam introduzidas subunidades, e. g., aminoácidos, que proporcionam grupos funcionais químicos capazes de reticulação para confinar, ciclizar ou tornar rígida a poliamida após tratamento para formar uma ligação cruzada. Os exemplos de aminoácidos capazes de reticulação de um péptido são cisteínas para formar dissulfuretos, ácido aspártico para formar uma lactona ou uma lactama, e um quelante, tal como ácido γ-carboxil-glutâmico (Gla) (comercialmente disponível, e. g., a partir da Bachem) para quelar um metal de transição e formar uma ligação cruzada. 0 ácido γ-carboxil-glutâmico protegido pode ser preparado por modificação da síntese descrita por Zee-Cheng e Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132). Uma biblioteca em que a sequência de poliamida compreende, pelo menos, duas subunidades capazes de reticulação pode ser tratada, e. g., através de oxidação de resíduos de cisteína para formar um dissulfureto ou adição de um ião metálico para formar um quelato, de modo a reticular o péptido e formar um péptido confinado, cíclico ou rígido. Os motivos cíclicos são divulgados em detalhe no Pedido U.S. N° de Série 07/717454, apresentado em 19 de Junho de 1991. 38

Alguns aminoácidos simples que podem ser utilizados como subunidades para incorporação numa biblioteca incluem os seguintes:

Os aminoácidos não clássicos podem ser utilizados durante a síntese de poliamidas. Os seguintes aminoácidos não clássicos podem ser incorporados numa biblioteca de poliamida de modo a introduzirem motivos conformacionais particulares: 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolino-3-carboxilato (Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-metil-fenilalanina, (2S, 3R)-metil-fenilalanina, (2R, 3S)-metil-fenilalanina e (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski e Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); ácido 2-aminotetra-hidronaftaleno-2-carboxílico (Landis, 1989, Tese de Doutoramento, University of arizona); hidroxi-1,2,3, 4-tetra-hidroisoquinolino-3-carboxilato (Miyake et al., 1984, J. Takeda Res. Labs. 43:53—76); β-carbolina (D e L) (Kazmierski, 1988, Tese de Doutoramento, University of arizona); HIC (ácido carboxílico de isoquinolino-histidina) (Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 38:131-138) .

Os seguintes análogos de aminoácidos e miméticos peptídicos podem ser incorporados na biblioteca de composto de teste sintético para induzir ou favorecer estruturas secundárias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidone-6-carboxílico), análogo de dipéptido indutor de volta β (Kemp et 39 al., 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838); análogos indutores de folha β (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5081—5082); análogos indutores de volta β (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5057-5060); análogos indutores de hélices α (Kemp et ai., 1988, Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); análogos indutores de volta γ (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem. 54:109:115); e análogos proporcionados pelas seguintes referências: Nagai e Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. p. 1687; também um análogo de volta Gly-Ala (Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett. 30:2317); isóstero de ligação amida (Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); tretrazol (Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509); e análogos ensinados em Olson et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:323-333 e Garvey et ai., 1990, J. Org. Chem. 56:436. A presente invenção proporciona ainda para modificação ou derivatização de poliamidas de composto de teste sintético numa biblioteca, tal como descrita no Pedido U.S. N° de Série 07/717454, apresentado em 19 de Junho de 1991. As modificações de péptidos são bem conhecidas dos especialistas, e incluem fosforilação, sulfatação, carboximetilação e acilação. As modificações podem ser efectuadas através de meios químicos ou enzimáticos. Uma vez que essas modificações podem resultar em péptidos não sequenciáveis, é preferida a utilização de uma molécula codificante nessas bibliotecas.

Noutro aspecto, podem ser preparados derivados de péptidos gordos acilados ou glicosilados. A preparação de péptidos gordos acilados ou glicosilados é bem conhecida na técnica (ver, e. g., Pedido U.S. N° de Série 07/717454). 40

Também podem ser preparados derivados de ácidos gordos de poliamida. Por exemplo, e não a titulo limitativo, um grupo amino livre pode ser acilado, e. g., miristoilado. Este e outros conjugados de ácido gordo-péptido adequados para utilização na presente invenção são divulgados na Patente U.K. GB-8809162.4, Pedido de Patente Internacional PCT/AU89/00166.

5.5.2 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES DE CARBAMATO A presente invenção abrange compostos de teste sintéticos que incluem uma ou mais ligações de carbamato (i. e., poliuretano), incluindo policarbamatos. Duas estratégias para formar carbamatos são mostradas no Esquema II.

ESQUEMA II H2N-® COCIj 0=C=N-®

0

1. Pi-NH-Z-OH 2. Desprotecção H2N"z'0^'N'®

H 1. COCl2

2. Pi-KH-Z-OH 3 - Desprotecção 41 coci2 0=C=N-®

η2ν-© H0"R'0'^'N'®

H

1. Pj-NH-Z-NCO 2. Desprotecção O o

Η H 1. C0C12

2. Ρχ-0-R-OH 3. Desprotecção

Para a síntese dos dois tipos diferentes de carbamatos, podem ser utilizados acoplamentos de isocianatos e dióis ou aminoálcoois. Por exemplo, uma resina adequada, tal como a resina funcionalizada utilizada para a síntese de poliamidas acima, é convertida no isocianato por reacção com fosgénio, e o isocianato é depois acoplado com um aminoálcool amino-protegido para produzir o carbamato protegido. A desprotecção da resina de uretano fornece uma resina de aminouretano que é utilizada para repetir o mesmo ciclo sintético produzindo um poliuretano, í. e., reacção com fosgénio seguido por acoplamento com um aminoálcool N-protegido e a desprotecção produz uma resina de aminodiuretano, etc. 42

Um segundo tipo de carbamato suportado é produzido por modificação do processo sintético acima, como se segue. A resina de amino inicial é convertida no isocianato, o isocianato é convertido num carbamato protegido por reacção com diol parcialmente protegido, a resina de carbamato protegida é desprotegida para produzir um hidroxicarbamato, o hidroxicarbamato é convertido num aminodicarbamato por reacção com um aminoalquilisocianato amino-protegido que é seguida por desprotecção.

5.5.3 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES DE UREIA

Uma estratégia para a sintese de uma variedade de estruturas contendo ligações de ureia é mostrada no Esquema III. 43

ESQUEMA. III COCI2

HjN-© -- 0=C=N-<g>

Η H

H2N 1. C0C12 2. P-NH-Z-NHj 2. Desprotecção O 0

Η Η Η H 1. C0C12 2. P-NH-Z-NH2 3. Desprotecção 0 0 0

h2N'-z''N^N'z-n-^'N"z'-n'^n-® Η Η Η Η Η H

Uma resina adequada, funcionalizada com grupos isocianato, tal como a resina utilizada na sintese dos carbamatos acima descrita, é convertida numa aminoureia por reacção com uma diamina parcialmente protegida seguida por desprotecção, e a resina de aminoureia num isocianato utilizando fosgénio. A resina de isocianatoureia é submetida ao ciclo sintético de três passos acima, o número de vezes desejado produzindo poliureias. 44

5.5.4 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES ÉSTER

Uma estratégia para a síntese de bibliotecas contendo ligações éster é mostrada no Esquema IV.

ESQUEMA IV HO-0

1. Pi-O-Z-COOH 2. Desprotecção

1. P2-O-Z-0H 2. Desprotecção HO'z

To^zI0D O o o

Uma resina adequada, tal como a resina de hidroxialquilo utilizada na síntese peptídica de fase sólida de Merrifield, num solvente que aumenta de volume, tal como cloreto de metileno, é condensada com um ácido hidroxicarboxílico, apropriadamente protegido, de um modo preferido na presença de um agente de condensação, tal como DCC, para produzir após desprotecção um hidroxiéster suportado que é depois alongado utilizando os mesmos ciclos de acilação-desprotecção. 45

5.5.5 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES DE AMINA

Uma estratégia para a síntese de aminas é mostrada no esquema V:

ESQUEMA V

HaN-© 1. 2. no2-z-cho Redução

P'N-Z--Ν-Θ H 1. Desprotecção 2. Prot-NH-R-CKO 3 · Redução moderada 1. Redução 2. N0S-CH0 3. Redução

—N-Z-Ν'© H

H _ ρ^ν-ζ^_ν-ζ.—-N-© Η H HíN"2

Uma resina adequada, tal como a resina utilizada na síntese de amida acima, é convertida numa resina de nitroalquilamina através de aminação redutiva utilizando um nitroaldeído, e adicionalmente reduzida na amina primária, utilizando uma das muitas reacções conhecidas para reduzir nitroalcaminas a aminas primárias (e. g., redução através de hidreto de alumínio e 46 lítio). A amina primária na resina é alongada através de repetição da sequência de reduçâo-alquilaçâo-redutiva, produzindo a poliamina desejável. A redução de uma resina de nitroalquilamina no processo acima pode ser evitada através de substituição do nitroaldeido da aminaçâo redutiva com um aminoaldeido N-protegido e removendo o grupo protector do produto resultante num passo sintético separado.

5.5.6 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES SULFURETO E DISSULFURETO

Uma estratégia para a síntese de uma variedade de estruturas de polissulfureto e polidissulfureto é mostrada no esquema VI:

ESQUEMA VI HS-®

HS'Z~S-® 1. Pi-S-Z-L 2. Desprotecção HS^Z^g-Z-g-© 1. Pj-S-Z-S-Act 2. Desprotecção 47

Uma resina adequada, e. g., uma resina utilizada na síntese peptídica de fase sólida de Merrifield, é funcionalizada para ter grupos tiol livres. A resina de tiol é alquilada com um halogeneto de tioalquilo protegido e o produto desprotegido para produzir um sulfureto de resina de tioalquilo. A cadeia do tioalquilsulfido suportada é alongada adicionalmente por repetição do ciclo de alquilação-desprotecção para fornecer um polissulfureto suportado. A síntese acima pode produzir dissulfuretos suportados se o halogeneto de tioalquilo protegido for substituído por um tioalquilclorossulfonato ou tioalquilmetoxicarbonilsulfonato protegido.

5.5.7 BIBLIOTECAS CONTENDO LIGAÇÕES CARBONO-CARBONO É contemplada uma variedade de polialcanos, polialcenos, poli-haloalceno e polióis. As estratégias para a síntese de dessas bibliotecas são mostradas no Esquema VII:

ESQUEMA VII 48 Η

1. Γ >~Z-PPh3*)C 2. Desprotecção Η Η r"° ι. Γ >-ζ-ρρη3+χ· Ο 2. Desprotecção i i Y-—.z Oí^-Z^Zs-^© Halogenação s i á

Η Η H x ã O (O Φ 2 Qi <0

HO

OH OH HO-Z-Z_©

OH OH

Uma resina adequada é funcionalizada com grupos carbonilo, (e. g., através de oxidação controlada de grupos hidroxialquilo de suporte), condensada com um reagente de Wittig, preparado a partir de trifenilfosfina e um haloalquildialquilacetal, e desprotegida para produzir uma resina contendo uma cadeia insaturada de aldeído. Esta cadeia pode ser alongada num aldeído de polieno utilizando a mesma sequência de Wittig-condensação-desprotecção. 0 tratamento do polieno suportado com um halogéneo molecular, tal como cloro ou bromo, produz um haloalcano numa resina. É também contemplada a conversão destes haloalcanos nos seus derivados reduzidos totalmente desalogenados por reacção com hidreto de tributilestanho ou um metal electropositivo, tal como zinco, na presença de um ácido fraco. 0 tratamento cuidadoso do polieno suportado com um agente oxidante, e. g., permanganato ou periodato, produz polióis. Outros polióis podem ser produzidos por submissão do polieno a uma sequência de hidroboração-oxidação, uma sequência de epoxidação (através de um perácido, tal como a ácido m-cloroperbenzóico)-hidrólise, ou uma sequência de mercúrico-acetato-alcalino-alcalino-boro-hidreto.

5.5.8 BIBLIOTECAS DE COMPOSTOS POLICÍCLICOS E COMPOSTOS POLICÍCLICOS FUNCIONALIZADOS É contemplada uma variedade de compostos policíclicos e policiclicos funcionalizados. As estratégias para a síntese de policíclicos e estruturas relacionadas são mostradas no Esquema III, em que Ri, R2 e R3 se referem a vários grupos alquilo ou arilo substituídos, como acima definidos:

ESQUEMA VIII 50

r2

1. CH3PPh3+X* -Q r\ r r !· 3. Hídrogenação 4. Desprotecção 0*

0 esquema VIII mostra a preparação de um hidrocarboneto saturado. Alternativamente, podem também ser preparadas estruturas insaturadas. Uma resina adequada, tal como a resina de carbonilo acima descrita, é convertida numa resina de alceno, e. g., através de uma condensação de Wittig, e esta resina é utilizada numa reacção de periciclicos de tipo Diels-Alder com um dimetilacetal de dieno, e. g., electrofilico, apropriadamente activado para produzir, após hidrólise do grupo acetal, um aldeído de ciclo-hexenilo funcionalizado suportado. Esta estrutura suportada pode ser adicionalmente alongada por repetição da sequência de Wittig-condensação-Cicloadição-desprotecção produzindo um aldeído de policiclo-hexeno suportado que pode ser adicionalmente funcionalizado como se segue (i) por 51 halogenação, e. g., brominação ou cloração, para produzir um aldeído de poli-halociclo-hexanilo, (ii) por redução do aldeído de poli-halociclo-hexanilo, e. g., utilizando hidreto de tributilestanho ou um metal electropositivo (e. g., Zn) e um ácido fraco, produzindo um aldeído ou álcool de policiclo-hexano, e (iii) por oxidação controlada do aldeído de policiclo-hexano utilizando permanganato, uma sequência de hidroboração-oxidação, uma sequência de epoxidaçâo-hidrólise ou uma sequência de epoxidação-redução (e. g., epoxidação por ácido m-cloroperbenzóico seguida por redução através de hidreto de alumínio e lítio) produzindo um poliol funcionalizado.

Outro exemplo de uma biblioteca cíclica é mostrado na Figura 6. Esta biblioteca é preparada por ligação de ácido bromopropiónico a um suporte, e ligando o éster metílico de cisteína protegido com Boc ao suporte através de substituição de bromo com a cadeia lateral de enxofre para formar uma ligação de sulfureto. Podem ser adicionados ácidos diamino protegidos com Boc/Fmoc, tais como ácido diaminobutírico ou lisina. A desprotecção de um grupo protector permite a substituição com qualquer ácido carboxílico. A desprotecção do outro grupo amino permite a adição de um outro ácido diamino. Esta sequência de passos é repetida o número de vezes desejado. Finalmente, o grupo do éster metílico é hidrolisado da cisteína, permitindo a reacção com o grupo amino desprotegido para ciclizar a estrutura.

5.5.9 BIBLIOTECAS DE ESTRUTURAS DE ANEL POLISSUBSTITUÍDO CAPAZES DE SERVIR COMO UM ANDAIME 52 É contemplada uma variedade de estruturas polissubstituídas capazes de servir como um andaime. Uma estratégia geral para a síntese dessa estrutura é mostrada no Esquema IX:

ESQUEMA IX

P I 1 COOP3

P2 NHP4 1. Desprotecção 1 2. Acoplamento 3. Desprotecção 2 4. Acoplamento 5. Desprotecção 3 6. Acoplamento 7. Desprotecção 4 8. Acoplamento OR, C00R4

Zr0 SR2 nhr3 53

Fx ✓ p,

Fx' P2

Fx

Fx p3 % Pa 1. Desprotecção 1 2. Acoplamento R, 3. Desprotecção 2 4. Acoplamento R2 5. Desprotecção 3 6. Acoplamento R3 7. Desprotecção 4 8. Acoplamento R^

Fx% Fx r3

Pk

Uma estratégia geral para preparação de um tipo especifico de bibliotecas de andaime é mostrada no Esquema X: 54

ESQUEMA X

Fx = Grupo funcional (OH, SH, NN2! COOH,...)

Pral, Fx

t. Desprotecção 1 2. Acoplamento R1 3. Desprotecção 2 4. Unidade 2 de acoplamento

Cta··* rlDi h A Fi Fx a-A^e-A'

Prot,

FxV®

C A—Protj

Prolj·

Γχ «f

Esqueleto

Fx Fx

R, H

Os andaimes adequados incluem, mas não estão limitados a, ciclopentano, triácido de Kemp (Kemp e Petrakis, 1981, J. Org. Chem. 46:5140-5143), uma construção ramificada preparada através de acoplamento consecutivo de ácidos diaminocarboxilicos, moldes cíclicos, tal como são descritos por Mutter, et al. (1992, J. Am. Chem. Soc. 114-1463-1470), esteróides, benzodiazepinas e semelhantes. 55

Uma abordagem para ligação de um derivado de ácido cis-1,3,5-ciclo-hexanotricarboxílico a uma resina de tipo Merrifield seguida por derivatização de cada um dos três grupos carboxilo do triácido é descrita na Secção 9, infra, como um exemplo de uma síntese de uma estrutura de anel polissubstituido suportado capaz de servir como um andaime (ver Esquema XIV, infra) .

Como um segundo exemplo de uma síntese de uma estrutura de anel polissubstituido capaz de servir como um andaime, é apresentado abaixo a montagem e derivatização de 1,4-benzodiazepinas, baseado no trabalho publicado de Ellman e Bunin (Chemical & Engineering News, 18 de Janeiro de 1993, p. 33) . Numa forma de realização específica, uma resina adequada, tal como uma resina de tipo Merrifield funcionalizada com um ligante de ácido 4-hidroximetilfenoxiacético, é funcionalizada adicionalmente com uma 2-amino-4'-hidroxibenzofenona, cujo grupo amino está protegido com o grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Após remoção de Fmoc, o acoplamento da anilina resultante com um aminoácido protegido com Fmoc, para produzir uma anilida, a remoção de Fmoc da anilida e ciclizaçâo , é produzida uma 1,4-benzodiazepina suportado que pode ser adicionalmente alquilada no azoto da anilida, utilizando uma variedade de electrófilos, para produzir uma variedade de derivados de benzodiazepina para posterior estudo.

Uma das mais pequenas estruturas de anel possíveis para utilização como um andaime é o anel de ciclopentano (Figura 7). São formas de realização preferidas as versões codificadas das bibliotecas de estruturas de anel polissubstituido acima descritas. São muito preferidas as bibliotecas codificadas em que as moléculas codificantes são péptidos. Para a síntese das bibliotecas codificadas por péptido, é utilizado o processo 56 geral da secção 5.1 e as estratégias sintéticas delineadas nas secções 5.2 e 5.3.

5.5.10 BIBLIOTECAS BASEADAS EM ANDAIMES CONSTRUÍDOS A PARTIR DE AMINOÁCIDOS

Mapeando um maior espaço conformacional, um andaime, que é uma simples ligação ramificada, é construído por acoplamento consecutivo de ácidos diaminocarboxílicos (ver Figura 3) . Os vários tipos de andaime que mapeiam um extenso espaço são andaimes cíclicos ou ramificados flexíveis. Os princípios destas bibliotecas são ilustrados na Figura 3. Como um exemplo de construção de uma biblioteca, é aqui mostrada a síntese de biblioteca ramificada (Esquema XV, Secção 9, infra) .

5.6 MÉTODOS DE DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LIGANDOS EM BIBLIOTECAS DE COMPOSTOS DE TESTE

Para além de proporcionar bibliotecas de uma grande variedade de estruturas químicas como composto de teste sintético, e métodos de síntese das mesmas, a presente invenção compreende adicionalmente métodos de rastreio dos compostos de teste de uma biblioteca para identificar ligandos dentro da biblioteca que demonstram uma actividade biológica de interesse, tal como ligação, estimulação, inibição, toxicidade, sabor, etc. Outras bibliotecas podem ser rastreadas de acordo com os métodos descritos infra para a actividade enzimática, actividade inibidora de enzima, e propriedades químicas e físicas de interesse. Muitos ensaios de rastreio são bem conhecidos na técnica; são também descritos numerosos ensaios de rastreio no 57

Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/717454, apresentado em 19 de Junho de 1991) .

Os ligandos descobertos durante um rastreio inicial podem não ser os ligandos óptimos. De facto, é frequentemente preferível sintetizar uma segunda biblioteca baseada nas estruturas dos ligandos seleccionados durante o primeiro rastreio. Deste modo, pode-se identificar ligandos de actividade mais elevada.

5.6.1 ENSAIOS DE LIGAÇÃO A presente invenção permite a identificação do composto de teste sintético que se liga às moléculas aceitadoras. Como aqui utilizado, o termo "molécula aceitadora" refere-se a qualquer molécula que se liga a um ligando. As moléculas aceitadoras podem ser macromoléculas biológicas, tais como anticorpos, receptores, enzimas, ácidos nucleicos, ou moléculas mais pequenas, tais como determinados hidratos de carbono, lípidos, compostos orgânicos que servem como fármacos, metais, etc. O composto de teste sintético em bibliotecas da invenção pode potencialmente interactuar com muitas moléculas aceitadoras diferentes. Através da identificação da espécie particular de ligando à qual se liga uma molécula aceitadora específica, torna-se possível isolar fisicamente a espécie de ligando de interesse.

Porque apenas um pequeno número de esferas de suporte sólido irá ser removido durante cada passo de rastreio/detecçâo/isolamento, a maioria das esferas permanecerá no agrupamento de esferas. Deste modo, a biblioteca pode ser reutilizada múltiplas vezes. Se forem utilizados diferentes 58 esquemas de cor ou identificação para as moléculas aceitadoras diferentes (e. g., com grupos repórter fluorescentes, tais como fluoresceina (verde), Texas Red (vermelho), DAPI (azul) e BODIPI marcados nos aceitadores), e com filtros de excitação adequados no microscópio de fluorescência ou detector de fluorescência, podem ser adicionados diferentes aceitadores (receptores) a uma biblioteca e avaliados simultaneamente para facilitar o rastreio rápido para alvos específicos. Estas estratégias não reduzem apenas o custo, mas aumentam também o número de moléculas aceitadoras que podem ser seleccionadas.

No método da invenção, uma molécula aceitadora de interesse é introduzida na biblioteca onde irá reconhecer e ligar a uma ou mais espécies de ligando dentro da biblioteca. Cada espécie de ligando, à qual a molécula aceitadora se liga, irá ser encontrada num único suporte de fase sólida de modo que o suporte, e assim o ligando, possa ser prontamente identificado e isolado. 0 ligando desejado pode ser isolado através de qualquer meio convencional conhecido dos especialistas na técnica e a invenção não está limitada pelo método de isolamento. Por exemplo, e não a título limitativo, é possível isolar fisicamente uma combinação de ligando de suporte-sólido-esfera que apresente a interacção físico-química mais forte com a molécula aceitadora específica. Numa forma de realização, uma solução de moléculas aceitadoras específicas é adicionada a uma biblioteca que contém 105 a 107 esferas de suporte de fase sólida. A molécula aceitadora é incubada com as esferas durante um tempo suficiente para permitir que ocorra a ligação. Posteriormente, é isolado o complexo da molécula aceitadora e do ligando ligado a esfera de suporte. Mais formas de realização específicas são apresentadas nos seguintes métodos, que descrevem a utilização de um anticorpo monoclonal, como uma molécula aceitadora solúvel para 59 ligar um ligando que é um péptido. Será claro que estes métodos são prontamente adaptáveis para detectar a ligação de qualquer molécula aceitadora.

Para além da utilização de moléculas aceitadoras solúveis, noutra forma de realização é possível detectar ligandos que se ligam a receptores de superfície celular utilizando células intactas. A utilização de células intactas é preferida para utilização com receptores que têm multi-subunidades ou são lábeis ou com receptores que requerem o domínio lipídico da membrana celular para serem funcionais. As células utilizadas nesta técnica podem ser células vivas ou fixas. As células serão incubadas com a biblioteca e irão ligar-se a determinados péptidos na biblioteca para formar uma "roseta" entre as células alvo e a esfera-péptido relevante. A roseta poder ser posteriormente isolada através de centrifugação diferencial ou removida fisicamente sob um microscópio de dissecação.

Alternativamente, pode-se rastrear a biblioteca utilizando um processo de aderência celular a uma superfície sólida com linhas celulares, tais como (i) uma linha celular "parental" onde o receptor de interesse esteja ausente na sua superfície celular, e (ii) uma linha celular positiva para o receptor, e. g., uma linha celular que é derivada por transfecção da linha parental com gene codificador para o receptor de interesse. É depois possível rastrear a biblioteca através da seguinte estratégia: (i) primeiro esgotar a biblioteca das suas esferas não específicas que se irão ligar às células que carecem do receptor através de introdução de um monocamada da linha celular parental através da "técnica de aderência celular a uma superfície sólida" convencional para deixar esferas não ligantes específicas de receptor, ou esferas não ligantes irrelevantes 60 (ii) remover as esferas não ligantes que irão incluir tanto esferas especificas de receptor como irrelevantes e o carregamento das mesmas numa monocamada de linha celular positiva para o receptor, em que a esfera especifica de receptor irá ligar-se à linha celular positiva para o receptor, (iii) remoção das restantes esferas não ligantes irrelevantes através de lavagem suave e decantação, e (iv) remoção da(s) esfera (s) especifica (s) de receptor com um micromanipulador, tal como um micropipeta.

Como uma alternativa aos ensaios de células inteiras para receptores ligados à membrana ou receptores que requerem que o dominio lipidico da membrana celular esteja funcional, as moléculas do receptor podem ser reconstituídas em lipossomas onde pode ser ligado um grupo repórter ou enzima.

Os exemplos anteriores referem-se ao composto de teste sintético, e quaisquer dos compostos descritos nas Secções, supra, podem ser utilizados na prática da presente invenção. Assim, uma molécula aceitadora pode-se ligar a uma de uma variedade de poliamidas, poliuretanos, poliésteres, estrutura polifuncionalizada capaz de actuar como um andaime, etc.

Numa forma de realização, a molécula aceitadora pode ser marcada directamente. Noutra forma de realização, pode ser utilizado um reagente secundário marcado para detectar a ligação de uma molécula aceitadora a uma partícula de suporte de fase sólida contendo um ligando de interesse. A ligação pode ser detectada por formação in situ de um cromóforo através de um marcador enzimático. As enzimas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina e peroxidase de rábano. Numa forma de realização adicional pode ser utilizado um ensaio de duas cores, utilizando dois substratos cromogénicos com dois marcadores enzimáticos em diferentes moléculas aceitadoras de 61 interesse. Podem ser identificados ligandos de reacção cruzada ou de reacção única com um ensaio de duas cores.

Outros marcadores para utilização na invenção incluem esferas coloridas de látex, esferas magnéticas, marcadores fluorescentes (e. g., isotiocianato de fluoresceina (FITC), ficoeritrina (PE), Texas Red (TR), rodamina, sais livres ou quelados da série dos lantanideos, especialmente Eu3+, para mencionar alguns fluoróforos), moléculas quimioluminescentes, radioisótopos ou marcadores de imagiologia de ressonância magnética. Os ensaios de duas cores podem ser realizados com duas ou mais esferas coloridas de látex, ou fluoróforos que emitem em comprimentos de onda diferentes. As esferas marcadas podem ser isoladas manualmente ou por meios mecânicos. Os meios mecânicos incluem triagem activada por fluorescência, i. e., análoga da FACS, e meios de remoção por micromanipulador.

Em exemplos específicos, infra, são utilizados marcadores de enzima-cromogénio e marcadores fluorescentes (FITC) .

As esferas reactivas podem ser isoladas na base da intensidade do marcador, e. g., intensidade de cor, intensidade de fluorescência, força magnética ou radioactividade, para mencionar alguns critérios. Podem ser seleccionadas as esferas mais intensamente marcadas e o ligando ligado à esfera pode ser estruturalmente caracterizado directamente, e. g., através de sequenciação de Edman ou por análise de espectro de massa, se aplicável, ou indirectamente através da sequenciação do péptido codificante correspondente ao ligando de interesse. Noutra forma de realização, uma selecção aleatória de esferas com uma intensidade de marcador acima de um limite de corte arbitrário pode ser seleccionada e submetida a análise estrutural. Pode-se potencialmente utilizar microscopia moderna de análise de imagem para quantificar a intensidade de cor, e assim definir 62 precisamente a afinidade relativa do ligando para a molécula aceitadora antes da análise estrutural do ligando de esfera. De modo semelhante, pode ser aplicada microscopia de imunofluorescência quantitativa se o aceitador for marcado com uma marcador fluorescente. Ainda noutra forma de realização, são seleccionadas esferas demonstrando uma determinada intensidade de marcador para análise composicional, e. g., análise de composição de aminoácidos no caso de ligandos peptídicos. Pode ser depois preparada e rastreada uma biblioteca de refinamento compreendendo um conjunto restrito de subunidades de aminoácidos identificadas como importantes a partir da análise de aminoácidos.

Noutra forma de realização, o(s) ligando (s) com a maior afinidade de ligação pode(m) ser identificado(s) através de progressiva diluição da molécula aceitadora de interesse até ser detectada ligação a apenas algumas esferas de suporte de fase sólida da biblioteca. Alternativamente, pode ser aumentada a restringência da ligação com a molécula aceitadora. Um especialista compreende que a restringência de ligação pode ser aumentada por (i) aumento da força iónica da solução; (ii) aumento da concentração de compostos desnaturantes, tais como ureia; (iii) aumento ou diminuição do pH da solução de ensaio; (iii) utilização de uma molécula aceitadora monovalente; (iv) inclusão de uma concentração definida de competidor conhecido na mistura de reacção; e (v) diminuição da concentração de aceitador. São bem conhecidos na técnica outros meios de mudar os componentes da solução para alterar as interacções de ligação.

Noutra forma de realização, podem ser de interesse ligandos que demonstram ligação de baixa afinidade. Estes podem ser seleccionados através, primeiro da remoção de todos os ligandos 63 de elevada afinidade e depois, detecção da ligação sob baixa restringência ou condições menos diluídas.

Numa forma de realização preferida, pode ser utilizado um ensaio de duplo marcador. 0 primeiro marcador pode ser utilizado para detectar ligação não específica de uma molécula aceitadora de interesse a esferas, na presença de ligando solúvel. As esferas marcadas são depois removidas da biblioteca, e é removido o ligando solúvel. Depois é detectada a molécula aceitadora de ligação específica às restantes esferas. Pode-se esperar que os ligandos nessas esferas se liguem à molécula aceitadora no mesmo local de ligação como o ligando de interesse, e assim mimetizar o ligando de interesse. 0 ensaio de duplo marcador proporciona a vantagem da molécula aceitadora de interesse não necessitar de ser purificada, uma vez que o primeiro passo do ensaio permite a remoção de esferas de reacçâo positiva não específica. Numa forma de realização preferida, podem ser utilizadas moléculas aceitadoras marcadas com fluorescência como uma sonda para rastreio de uma biblioteca de teste sintético, e. g., utilizando FACS.

5.6.2 ENSAIOS DE BIOACTIVIDADE A presente invenção proporciona ainda ensaios para a actividade biológica de um ligando-candidato a partir de uma biblioteca tratada de modo a remover quaisquer moléculas tóxicas restantes da síntese, e. g., através de neutralização e lavagem exaustiva com o solvente, água estéril e meio de cultura. As actividades biológicas que podem ser ensaiadas, incluem toxicidade e morte, estimulação e promoção do crescimento, transdução de sinal, alterações bioquímicas e biofísicas, e alteração fisiológica. 64

Numa forma de realização preferida, o composto de teste sintético da biblioteca é selectivamente clivável do suporte de fase sólida, também aqui referido como "esfera". De um modo preferido, o composto de teste sintético é ligado ao suporte de fase separada através de ligantes cliváveis múltiplos para permitir mais do que um ensaio de libertação e rastreio. Numa forma de realização, as esferas são preparadas de modo que apenas uma fracção de composto de teste sintético seja selectivamente clivável. Os ligandos-candidatos, ligantes e esferas selectivamente cliváveis são discutidos na Secção 5.3.2, supra. Uma biblioteca é tratada com um agente de clivagem de modo que ocorra clivagem de uma fracção de composto de teste sintético. Os exemplos de agentes de clivagem incluem, mas não estão limitados a, luz UV, ácido, base, enzima ou catalisador. Numa forma de realização, a biblioteca é tratada de modo que sejam libertados 10-90% de composto de teste sintético. Numa forma de realização mais preferida, são libertados 25-50% de composto de teste sintético. Quando todas as moléculas de composto de teste sintético são cliváveis, a clivagem não quantitativa é efectuada por limitação do agente de clivagem. Num aspecto, o tempo de exposição e a intensidade da luz UV é limitada. Noutra forma de realização, a concentração do reagente é limitada. Após tratamento para efectuar a clivagem, a biblioteca pode ser tratada adicionalmente, e. g., através de neutralização, para torná-la biologicamente compatível com o ensaio desejado. Na prática, um especialista seria capaz de prontamente determinar as condições de clivagem apropriadas para a clivagem parcial quando todas as moléculas de composto de teste sintético da biblioteca são ligadas à fase sólida através de ligantes ou ligações cliváveis. Um especialista compreenderia ainda que a concentração relativa do composto de teste sintético libertado pode ser afectada por variação das condições de clivagem. 65

Uma vez que as esferas da biblioteca são imobilizadas, irá formar-se um gradiente de concentração de um ligando-candidato particular. As concentrações elevadas de composto de teste sintético serão encontradas na proximidade da esfera da qual foi libertado. Assim, a evidência de actividade biológica de interesse, na proximidade a uma esfera, permitirá a identificação e isolamento da esfera, e caracterização estrutural através de sequenciação da molécula codificante correspondente ao composto de teste sintético, ou outra técnica. A identificação do composto de teste sintético é possível porque irá ser deixado suficiente na esfera após clivagem parcial para sequenciação ou outra caracterização. Noutra forma de realização, as esferas podem ser submetidas a partição em poços de microtitulação (e. g., 10 esferas/poço) e uma fracção de ligando-candidato libertada e testada para a actividade biológica, eliminando assim o potencial problema da difusão. As diferentes porções do composto de teste sintético podem ser ligadas ao suporte de fase sólida ou esfera através de diferentes ligantes cliváveis para ensaios sequenciais. Dentro destes exemplos, o termo "esfera" refere-se a uma partícula de suporte de fase separada.

Estão também abrangidos ensaios biológicos com composto de teste sintético não clivado. A actividade biológica de esferas revestidas com composto de teste sintético inteiro pode ser depois rastreada. Num aspecto, pode ser introduzida uma biblioteca num animal. As esferas de interesse podem ser isoladas a partir de um tecido específico. Podem ser isoladas esferas que foram especificamente absorvidas após administração oral, nasal ou cutânea. Numa forma de realização preferida, essas esferas são magnéticas, ou tem alguma outra característica identificadora, e assim são prontamente isoladas a partir do tecido. Noutra forma de realização, o ligando imobilizado pode 66 ele próprio provocar alterações bioquímicas com receptores de superfície apropriados.

Será ainda compreendido por um especialista na técnica que qualquer célula que possa ser mantida em cultura de tecidos, por um curto ou longo prazo, pode ser utilizada num ensaio biológico. 0 termo "célula" como aqui utilizado pretende incluir células procarióticas (e. g., bacterianas) e eucarióticas, levedura, bolor e fungos. Podem ser utilizadas células ou linhas primárias mantidas em cultura. Além disso, a requerente considera que os ensaios biológicos em vírus podem ser realizados através de infecção ou transformação de células com vírus. Por exemplo, e não a título limitativo, a capacidade de um ligando para inibir a actividade lisogénica do bacteriófago lambda pode ser ensaiada por identificação de colónias de E. coli transfectadas que não formam placas límpidas quando infectadas.

Os métodos da presente invenção para ensaiar a actividade de uma molécula de composto de teste sintético de uma biblioteca não estão limitados aos exemplos anteriores; a requerente considera que qualquer sistema de ensaio pode ser modificado para incorporar a invenção presentemente divulgada. A requerente considera que esses estão dentro do âmbito da sua invenção.

5.6.3 MIMÉTICO ENZIMÁTICO/INIBIDORES ENZIMÁTICOS A presente invenção compreende ainda bibliotecas que são capazes de catalizar reacções, i. e., bibliotecas enzimáticas; bibliotecas de moléculas que servem como coenzimas; e bibliotecas de moléculas que podem inibir reacções enzimáticas. Assim, a invenção também proporciona métodos a serem utilizados 67 para ensaiar a actividade enzimática e coenzimática ou para a inibição da actividade enzimática. A actividade enzimática pode ser observada através da formação de um produto de reacção detectável. Numa forma de realização particular, uma enzima de uma biblioteca enzimática catalisa a reacção catalizada pela fosfatase alcalina, e. g., a hidrólise de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoilo (BCIP) e forma um produto de reacção azul, insolúvel, no suporte de fase sólida (ver Exemplo 13, infra) .

Noutra forma de realização, uma zona de produto observável, e. g., cor ou fluorescência, pode ser formada numa matriz semi-sólida. Uma biblioteca é depositada numa matriz semi-sólida, e. g., gel de agarose, e é adicionado um substrato cromogénico ou outro indicador. Onde um complexo enzima-esfera de uma biblioteca enzimática mostra a actividade enzimática desejável, irá formar-se uma zona de produto. Por exemplo, e não a titulo limitativo, uma molécula de uma biblioteca que é um análogo da peroxidase de rábano pode ser identificada por adição de uma solução de aminoantipireno (0,25 mg/mL; Kodak), fenol (8 mg/mL) e H202 (0,005%) em 0,1 M de tampão de fosfato, pH 7,0. As esferas com actividade enzimática irão formar uma zona de cor roxa. Noutra forma de realização, as esferas com actividade de protease podem ser identificadas através da adição dos substratos de protease colorimétricos bem conhecidos. A actividade coenzimática pode ser observada por ensaio da actividade enzimática mediada por uma coenzima, onde está ausente a coenzima natural ou comum. A actividade inibidora de enzima pode ser detectada com um composto de teste sintético parcialmente libertado. Num exemplo, e não a titulo limitativo, uma biblioteca é depositada numa 68 matriz semi-sólida que contém uma enzima. A biblioteca é tratada para libertar parcialmente moléculas de ligando-candidato. Onde a molécula inibe a actividade enzimática, pode ser identificada uma zona que carece de produto. Numa forma de realização, o substrato enzimático é cromogénico, e é formado um produto corado. Assim, a presença de um inibidor de enzima produziria uma zona sem cor. Noutra forma de realização, a inibição da proteólise da hemoglobina ou de uma enzima indicadora, tal como a fosfatase alcalina, pode ser detectada através da presença de uma zona opaca na matriz semi-sólida. Isto é porque a presença de inibidor de proteólise vai prevenir a degradação da hemoglobina ou enzima indicadora.

Será bem conhecido pelo especialista que uma molécula de composto de teste sintético que demonstre actividade enzimática, actividade coenzimática ou que iniba a actividade enzimática, pode ser um péptido, um mimético peptidico, um de uma variedade de polímeros ou quaisquer dos compostos descritos na Secção 5. São de particular interesse os polímeros confinados, incluindo mas não limitados, a estruturas cíclicas, bicíclicas ou tricíclicas, ou estruturas confinadas com determinado andaime que podem criar um bolso ou superfície de ligação catalítica única.

5.6.4 SEGREGAÇÃO TOPQLÓGICA A invenção abrange ainda um método de segregação da molécula codificante no interior do suporte sólido e o composto de teste no exterior, acessível a uma molécula aceitadora macromolecular de interesse. 0 método abrange os passos de síntese de um ligante, que na forma de realização preferida é um péptido. 0 ligante contém uma sequência que pode ser hidrolisada por uma enzima convenientemente disponível, tal como quimotripsina ou 69 outra endopeptidase. Numa forma de realização, a enzima é quimotripsina e o ligante contém uma fenilalanina. Após o ligante ser sintetizado, a função N“-amino é deixada protegida e o suporte é exposto à endopeptidase. A endopeptidase actua apenas em ligantes que estariam acessíveis a outras macromoléculas, tais como aceitadores.

Após a hidrólise enzimática do ligante peptídico, o composto de teste e os compostos codificantes podem ser sintetizados utilizando quaisquer grupos protectores ortogonais.

5.7 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DE UM COMPOSTO DE TESTE SINTÉTICO DE UMA BIBLIOTECA

Assim que um suporte contendo um ligando de interesse é seleccionado de acordo com qualquer dos métodos da Secção 5.6, supra, a presente invenção proporciona meios para determinação da estrutura do ligando.

Existem duas abordagens gerais para determinação da estrutura de um composto de teste: a estrutura do polímero pode ser analisada directamente através de técnicas convencionais, e. g.f degradação de Edman ou espectrometria de massa; alternativamente, pode ser sintetizada uma segundo molécula ou grupo de moléculas durante a construção da biblioteca de modo que a(s) estruturas (s) da segunda espécie molecular indique inequivocamente (codifica) a estrutura do composto de teste ligado ao mesmo suporte. Através desta segunda técnica, pode ser prontamente determinada a estrutura de polímeros que não são eles próprios susceptíveis de sequenciação. 70

Contudo, uma outra forma de realização da presente invenção abrange uma terceira técnica codificante, denominada "codificação fraccionária" que difere das formas de realização anteriores visto que não existe uma molécula codificante distinta diferente do composto de teste. A codificação funcional é utilizada quando subunidades específicas do composto de teste não são resolúveis em análises convencionais, e. g., os estereoisómeros D e L de um aminoácido. A codificação fraccionária proporciona um método por meio do qual as subunidades podem ser distinguidas por mistura de uma pequena quantidade de uma diferente subunidade um, caso contrário não utilizada na construção da biblioteca, no momento em que é sintetizada a biblioteca. Assim, a codificação fraccionária cria um menor grau detectável de heterogeneidade do composto de teste do suporte quando é utilizada uma das duas subunidades indistinguíveis. Para os objectivos da presente invenção, esse grau de heterogeneidade, tipicamente cerca de 5%, é compatível com o ensinamento do pedido de que existe apenas uma espécie de composto de teste em cada suporte.

5.7.1 CARACTERIZAÇÃO ATRAVÉS DE CÓDIGOS SEQUENCIAIS SIMPLES E MÚLTIPLOS

Numa forma de realização preferida de bibliotecas

moleculares codificadas, o suporte de fase separada contendo o composto de teste sintético de interesse também contém uma molécula, de um modo preferido um péptido, cuja sequência codifica a estrutura do ligando, e. g., a determinação da sequência do péptido codificante revela a identidade do ligando. Um método preferido de determinar a sequencia peptídica é a degradação de Edman. Um método particularmente preferido utiliza o Sequenciador de Proteína 477A da Applied Biosystems. A 71 sequência de aminoácidos de péptidos pode também ser determinada por espectroscopia de massa de bombardeamento com átomos rápidos (FAB-MS) ou utilizar outras técnicas analíticas.

Os péptidos codificantes podem ser sequenciados ligados ou clivados do suporte sólido. Para clivar os péptidos, as esferas isoladas são tratadas com agentes clivantes tradicionais conhecidos dos especialistas na técnica para separar péptidos de suportes de fase sólida. A escolha do agente clivante seleccionado vai depender do suporte de fase sólida utilizado.

Alternativamente, noutra forma de realização dentro do âmbito da invenção, é possível isolar uma única partícula de suporte de fase sólida, tal como uma esfera, com a sua sequência de péptido codificante ligada e introduzir a esfera num sequenciador para sequenciação peptídica sem previamente clivar o péptido codificante da esfera. É estimado que uma única esfera de resina de diâmetro 100 ym com 0,5 mEq/grama de locais funcionalizáveis contém aproximadamente 100 pmole de péptido, se metade dos locais forem utilizados para ligar péptidos codificantes. Para um grau semelhante de substituição com péptidos codificantes, uma única esfera de resina PAM de diâmetro 250 ym com 0,5 mEq/grama de resina de locais funcionalizáveis contém aproximadamente 1500 pmole de péptido codificante. Com um sequenciador de péptidos de ponta, é requerido apenas 5-10 pmole para sequenciação adequada. Deste modo, para uma resina PAM convencional, uma única esfera de diâmetro 100 ym pode ser carregada de modo a conter mais do que uma quantidade adequada de péptido codificante para a sequenciação.

Para além da sequenciação de Edman, a espectrometria de massa de bombardeamento de iões rápidos é uma ferramenta analítica muito poderosa e pode ser frequentemente utilizada 72 eficazmente para analisar as estruturas de péptidos e de uma variedade de outras moléculas. A espectrometria de massa de electrospray de elevado desempenho é também muito útil na análise estrutural. De um modo preferido, a espectrometria de massa para determinar a estrutura de uma molécula codificante é realizada como descrito no Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/939811, apresentado em 3 de Setembro de 1992.

Os especialistas na técnica irão entender que por vezes o número de espécies de subunidades em qualquer posição do composto de teste é maior do que o número de monómeros utilizados para construir o polímero codificante. Por exemplo, pode ser construído um péptido codificante com um conjunto limitado de aminoácidos que são prontamente distinguidos após degradação de Edman. Sob estas circunstâncias, a molécula codificante pode ser construída através de introdução de uma mistura de aminoácidos numa dada posição. Por exemplo, um código simples/duplo, í. e., tendo uma ou duas unidades codificantes por posição do composto de teste, em que o polipéptido codificante contém apenas 8 aminoácidos pode codificar até 36 subunidades; um código triplo/duplo/simples com o mesmo número de unidades codifica 84 subunidade por posição. A análise dos produtos da degradação de Edman desses péptidos codificantes irá revelar um ou dois, ou um, dois ou três aminoácidos em cada posição da sequência codificante.

5.7.2 CARACTERIZAÇÃO ATRAVÉS DE UM CÓDIGO NÃO SEQUENCIAL

Uma forma de realização preferida alternativa, denominada codificação não sequencial permite a "leitura" da molécula codificante sem uma determinação da sequência das suas subunidades. Os códigos sequenciais são inerentemente laboriosos 73 para descodificar. A sequenciação de uma molécula requer passos degradativos reiterados. Por contraste, a análise da composição de uma molécula polimérica pode ser realizada através de uma única degradação e uma única análise das subunidades resultantes ou dos seus derivados.

Adicionalmente, o mais moroso dos passos requeridos para sequenciar uma molécula codificante peptidica é a análise cromatográfica de cada um das feniltio-hidantoínas clivadas. Embora toda a informação resida no especifico tempo de retenção do único pico eluido, deve ser realizado um passo cromatográfico separado nos produtos de cada degradação progressiva. Assim, a maioria do tempo da análise de gradiente é "desperdiçada" na espera do aparecimento do único pico correspondente ao resíduo nessa posição. 0 processo não é claramente tão eficiente quanto possível. Se em vez da degradação de Edman sequencial seguida por análise de HPLC fosse possível clivar simultaneamente todas as subunidades codificantes, distingui-las entre si numa única operação de HPLC, e depois descodificar os resultados para determinar a identidade do composto de teste, o processo poderia ser extremamente acelerado. A leitura de um código não sequencial requer apenas determinar se um dado sinal está ou não presente. A resolução da linha de base de dois picos que diferem em cerca de 0,3 minutos no tempo de retenção pode ser conseguida utilizando análise de HPLC de fase reversa convencional com eluição de gradiente. Deste modo, um gradiente de 45 minutos pode discriminar de entre 150 compostos. Uma molécula codificante consistindo de subunidades seleccionadas de um grupo de 150 unidades codificantes diferentes é equivalente a um número binário de 150 dígitos. Por isso, 2150 ou cerca de 1045 espécies diferentes de composto de teste poderiam ser assim codificadas. Assim, os códigos não sequenciais são facilmente adequados para codificar 74 tanto a sequência como a identidade das subunidades dos compostos de teste, mesmo das maiores bibliotecas práticas.

Um código não sequencial pode ser construído como se segue. Considere-se C000 a C099 como os elementos do conjunto de 100 unidades codificantes para serem utilizadas para codificar a estrutura de um composto de teste que tem até 20 resíduos seleccionados a partir de até 32 subunidades diferentes, aqui denominados S00-S31. Neste esquema, a identidade do resíduo na primeira posição é determinada pela presença ou ausência dos elementos codificantes C000-C004; se nenhum estiver presente, SOO está presente na primeira posição do composto de teste, se todos estiverem presentes, S31 está presente na posição 1. As posições sucessivas são codificadas através das unidades C005-C009, C010-C014... C095-C099. Os especialistas irão entender que no caso frequente em que são requeridas bibliotecas consideravelmente menores do que a capacidade codificante máxima de um código de 100 dígitos, a fidelidade do código pode ser aumentada quer através de redução do tamanho do conjunto de moléculas codificantes, i. e., aumentando o intervalo entre unidades na análise cromatográfica, ou através da utilização de codificação redundante, e. g., pode ser introduzida uma unidade de "paridade" no código para cada posição codificada.

Muito frequentemente, serão requeridas entre 4 e 8 unidades codificantes, correspondentes a entre 16 subunidades e 128 subunidades mais uma unidade de paridade, para codificar cada posição no composto de teste.

As unidades codificantes necessitam de ser organizadas na estrutura codificante para permitir a sua clivagem e análise simultânea. Uma possibilidade óbvia é a hidrólise total, seguida por modificação selectiva e análise da mistura. Neste caso, a estrutura do composto codificante não é importante. As unidades 75 codificantes podem ser ligadas entre si ou ligadas a ramificações separadas de uma estrutura ramificada ou qualquer combinação, desde que a ligação a cada unidade seja hidrolisável. Esta abordagem, contudo, pode ser comprometida pela presença de produtos hidroliticos do composto de teste. Deste modo, a utilização de um método de degradação muito selectivo concebido por Edman, 1950, ACTA CHEM SCAND, 4:283-293; Edman, et al., 1967, EURO J BIOCHEM, 1:80-91, parece a escolha óptima. A degradação de Edman cliva selectivamente o aminoácido do N-terminal da cadeia peptidica. Se pudesse ser identificado um número razoável de aminoácidos e derivados de aminoácidos que satisfizessem os requesitos cromatográficos definidos acima, e fossem sintetizados como uma estrutura codificante num arranjo permitindo a sua clivagem simultânea, seria possível analisar a composição de uma estrutura não peptidica em apenas um ciclo da degradação de Edman e análise de HPLC. 0 tempo de retenção de feniltio-hidantoínas aminoacídicas em fase reversa segue a lipofilicidade da cadeia lateral do aminoácido. Assim, para conceber um conjunto de derivados de aminoácidos com os tempos de retenção apropriados é apenas necessário conceber a cadeia lateral de cada com diferenças apropriadas na lipofilicidade. Um modo simples de conseguir as diferenças apropriadas é substituir o grupo funcional das cadeias laterais de aminoácidos trifuncionais por substituintes apropriados. Consequentemente, explora-se o efeito de acilação do grupo amino da cadeia lateral de ácidos diaminocarboxílicos -ácido diaminopropiónico, ácido diaminobutírico, ornitina e lisina. Serão prontamente evidentes aos especialistas na técnica, conjuntos alternativos de unidades codificantes, tais como derivados de ácidos dicarboxiamino e aminoácidos contendo SH. A unidade acima descrita é preferida visto que pode ser 76 conveniente sintetizada por aqueles que têm pronto acesso a síntese peptídica de fase sólida.

Uma forma de realização para conseguir a clivagem simultânea de unidades codificantes proporciona que cada unidade codificante seja um α-aminoácido, ligado como um aminoácido de N-terminal com o seu grupo amino livre. A estrutura básica dessa estrutura codificante pode ser construída a partir de aminoácidos dicarboxílicos de ácidos diaminocarboxílicos (Daa) ou outras subunidades trifuncionais. Os grupos amino destes aminoácidos são acilados através dos aminoácidos N-protegidos utilizados para a codificação. A acilação é realizada utilizando uma mistura das unidades definidas como o código para a dada subunidade e sua posição no composto de teste. Como ilustrado no Esquema XIC, infra, a química posicionai das reacções dos ácidos diaminocarboxílicos não necessita ser especificada. 0 polímero e as unidades codificantes podem ser acopladas a ambos os grupos amino dos diaminoácidos que formam o polímero da molécula codificante.

No caso dos ácidos diaminocarboxílicos substituídos descritos no Exemplo 13, infra e ilustrado, as reactividades de acoplamento foram independentes das substituições da cadeia lateral. Contudo, se forem utilizadas outras subunidades codificantes, existem dois métodos que podem conseguir incorporação equimolar das unidades codificantes embora possam ter reactividades significativamente diferentes, e. g., alanina e isoleucina. 0 primeiro método é baseado na compensação das diferenças em reactividade através da utilização de uma concentração mais elevada do aminoácido de reacção mais lenta (e. g., Eichler J. & Houghten, R., 1993, Biochemistry 32:11035; Rutter Pat. U.S. N° 5010175). Alternativamente, pode ser utilizada repetitivamente uma quantidade subequimolar da mistura de modo que embora uma unidade possa reagir mais rapidamente, 77 permaneçam suficientes locais de acoplamento para que o aminoácido de reacção mais lenta possa acoplar, até que após suficientes repetições de acoplamento estejam consumidos todos os locais reactivos. Andrews et al.r 1994, TECHNIQUES IN PROTEIN CHEMISTRY, 5:485-492.

Existem diversas estratégias básicas para a construção de uma molécula codificante como acima descrito. Duas delas são ilustradas no esquema ΧΙΑ. A primeira é baseada na utilização do grupo protector Alloc (Loffet A. & Zhang H., 1993, Int. Pep. & Prot. Res. 42:346); (Stevens & Watanabe, J. 1950 Am. Chem. Soc. 72:725); (Guibe, F. & Y. De Saint M'Leux, 1981, Tet. Lett. 21:3591) para construir a estrutura codificante e o grupo Fmoc ou semelhante a Fmoc (Carpino & Han, J. 1972 Org. Chem. 37:3404) para a protecção de grupos funcionais no composto de teste. Neste caso, o grupo Boc pode ser utilizado como o grupo protector permanente tanto para a síntese de composto de teste como para a síntese codificante. É vantajoso utilizar subunidades codificantes pré-formadas da forma geral de "bloco A" descrita no esquema XIA. Alternativamente, se não forem utilizadas subunidades codificantes pré-formadas, é requerido outro nível de ortogonalidade durante a síntese. Isto pode ser conseguido através da utilização de ácidos diaminocarboxílicos protegidos com Alloc/Ddz para construir a estrutura básica codificante, uma vez que o grupo Ddz é selectivamente clivável por 2% de ácido trifluoroacético em diclorometano (Birr C., et al.r 1972, Liebig's Ann. Chem. 763:162-73) . Contudo, esta abordagem é complicada pela necessidade de compensar para diferentes reactividades de acoplamento dos aminoácidos codificantes ligados como uma mistura. Uma segunda estratégia é baseada na utilização de uma combinação de grupos Fmoc e Boc para protecção ortogonal temporária de grupos funcionais no composto de teste e nas 78 moléculas codificantes, e na utilização de benzoxicarbonilo (Z) ou grupos semelhantes a Z para protecção permanente. A subunidade codificante pode ser construída durante a síntese utilizando ácidos diaminocarboxílicos protegidos com Fmoc/Dde (ou Fmoc/Alloc, ou Fmoc/Ddz) uma vez que o grupo Dde é clivado por uma solução de hidrazina em dimetilformamida e é estável sob condições utilizadas para remoção do grupo Boc ou Fmoc (Hone, N. D. et al., Póster P63 no 2o Eur. Pept. Symp., Interlaken, Suiça, Setembro de 1992).

Uma abordagem alternativa para a codificação é ilustrada no Esquema XIB. Neste caso, uma fracção dos grupos amino disponíveis para a codificação é acilada pela mistura codificante e os grupos amino restantes são reprotegidos através de um grupo ortogonalmente clivável (e. g., Alloc) antes de ser realizado o passo seguinte de aleatorização. Neste esquema é vantajoso acoplar a mistura codificante antes da subunidade de composto de teste uma vez que a desprotecção de Alloc pode ser realizada na fase recombinada.

Uma terceira forma de realização alternativa é proporcionada através do Esquema XIC. Neste esquema, os elementos codificantes não necessitam ser pré-formados com uma estrutura básica de ácido diaminocarboxílico como no Esquema XIA, nem existe a necessidade de bloqueamentos e desbloqueamentos repetitivos como no Esquema XIB. 0 esquema proporciona um composto de teste protegido com Fmoc e uma molécula codificante protegida com Alloc, com os grupos reactivos tanto de codificação como dos compostos de teste permanentemente protegidos durante a síntese com Boc. A molécula codificante é sintetizada através dos passos sucessivos de remoção da protecção de Alloc de ambas as funcionalidades Na e Νε da lisina; a adição e acoplamento de uma mistura de elementos codificantes Boc-Caan e Boc-Caai2, cada um na quantidade de 0,5 equivalentes, a adição e acoplamento de 79 1,0 equivalente de Alloc-Lys (Alloc) . Deve ser notado que nesta forma de realização os elementos codificantes, i. e., os Boc-Caa podem acoplar N“ e/ou Νε de qualquer lisina particular na estrutura básica da molécula codificante. Mesmo assim, nem a estereoquimica nem a estequiometria de acoplamento afectam a operabilidade da forma de realização porque para todos os objectivos da invenção as funcionalidades N“ e Νε da lisina são equivalentes.

Ainda, outra forma de realização alternativa da invenção abrange a leitura de um código não sequencial por espectroscopia de massa. As moléculas codificantes são libertadas do suporte de fase sólida através de clivagem especifica de um ligante. As moléculas podem ser ainda fragmentadas através de electrospray ou bombardeamento iónico e as unidades codificantes individuais identificadas através dos seus pesos moleculares.

Os especialistas na técnica entenderão que a utilização de espectroscopia de massa para ler um código não sequencial implica que as unidades codificantes possam estar ligadas a moléculas codificantes através de uma variedade de ligações quimicas diferentes daquelas susceptiveis a degradação especifica, tais como ligações peptídicas.

Seguem-se os esquemas ΧΙΑ, XIB e XIC: 80

Fl νη2· 1) Separação 2) Acoplamento de bloco A de codificação 3) Desprotecção de Fmoc 4) Acoplamento de bloco X de rastreio 5} Mistura (800-A1)—j ABoo4)U' 1) Desprotecção de Atloc 2) Separação 3} Acoplamento de bloco de codificação 4) Desprotecção de Fmoc 5) Acoplamento de bloco de rastreio 6) Mistura (Boc-A1>—i AJtoc-D**-OH StoceAdecoiISraçi»

Qdí- n Atoe-0 *a

FmooNI

1) Desprotecção de Ddz 2) Separação 2) Acoplamento de bloco A de codificação 3) Desprotecção de Fmoc 4) Acoplamento dé bloco X de rastreio 5) Mistura_ ^

81

82

5.7.3 BIBLIOTECAS NÃO CODIFICADAS

Para a análise da estrutura de ligandos seleccionados de bibliotecas que não contêm moléculas codificantes, a técnica utilizada para analisar a estrutura de péptidos codificantes (acima descritos) pode ser utilizada quando aplicável. Alternativamente, pode ser utilizada espectrometria de massa, particularmente utilizando as técnicas descritas no Pedido U.S. N° de Série 07/939811 apresentado em 3 de Setembro de 1992 ou outras técnicas analíticas (cromatografia de camada fina, HPLC, 83 RMN, IV, análise elementar e semelhantes) para determinar a estrutura de um composto de teste sintético seleccionado de acordo com a presente invenção. 5.8 AGENTES TERAPÊUTICOS E DIAGNÓSTICOS DE BIBLIOTECAS DE Composto de teste sintético

Uma vez determinada a estrutura de um ligando seleccionado, pode ser sintetizada quimicamente ou biologicamente uma grande quantidade do composto para confirmação dos resultados das experiências estruturais e de rastreio, e outros estudos. Uma vez identificada a estrutura molecular de interesse através de rastreio da biblioteca e análise estrutural de ligandos activos, a presente invenção proporciona moléculas que compreendem a estrutura molecular para utilização no tratamento ou diagnóstico da doença. A molécula identificada através apenas de rastreio pode proporcionar um agente diagnóstico ou terapêutico ou pode ser incorporada numa molécula maior. Uma molécula compreendendo uma estrutura com actividade biológica ou de ligação pode ser denominada uma "molécula efectora." A invenção proporciona ainda bibliotecas para utilização em várias aplicações. A função "efectora" da referida molécula efectora pode ser qualquer uma das funções aqui descritas ou conhecidas na técnica. 0 método aqui descrito proporciona não apenas uma nova ferramenta para a procura de ligandos específicos de potencial valor diagnóstico ou terapêutico, mas também proporciona importante informação numa série de ligandos de estrutura diferente, potencialmente vasta que, contudo, é capaz de interagir com a mesma molécula aceitadora. A integração dessa informação com modelação molecular e técnicas computacionais modernas é provável que proporcione nova compreensão fundamental das interacções ligando-receptor. 84

Os agentes terapêuticos da invenção compreendem moléculas efectoras que se irão ligar ao local biologicamente activo de citocinas, factores de crescimento ou agentes hormonais e assim intensificar ou neutralizar a sua acção e que irá bloquear ou intensificar a transcrição e/ou tradução.

Os agentes terapêuticos da invenção incluem, por exemplo, moléculas efectoras que se ligam a um receptor de interesse farmacológico, tal como receptores de factores de crescimento, receptores de neurotransmissores ou receptores de hormonas. Estas moléculas efectoras podem ser utilizadas como agonistas ou antagonistas da acção do ligando do receptor natural.

Outra aplicação de moléculas efectoras que se ligam a receptores seria a utilização da ligação para bloquear a ligação de vírus ou micróbios que ganham acesso a um célula por ligação a um receptor celular normal e consequente interiorização. Os exemplos deste fenómeno incluem a ligação do vírus da imunodeficiência humana ao receptor CD4 e do vírus herpes simplex ao receptor do factor de crescimento do fibroblasto. As moléculas efectoras que ocupam o receptor poderiam ser utilizadas como agentes farmacológicos para bloquear a infecção virai de células alvo. A invasão parasitária de células poderia ser igualmente inibida após serem identificadas moléculas efectoras adequadas de acordo com esta invenção.

Noutra forma de realização, uma molécula efectora compreendendo uma estrutura que se liga a uma molécula aceitadora de interesse pode ser utilizada para se direccionar a um fármaco ou toxina. Numa forma de realização preferida, a molécula aceitadora de interesse é um receptor ou antigénio encontrado na superfície de uma célula tumoral, parasita animal, ou micróbio, e. g., bactéria, vírus, parasita unicelular, 85 patogénio unicelular, fungo ou bolor. Noutra forma de realização, a entidade vidada é um receptor intracelular.

Além disso, é possível que alguns dos milhões de moléculas de composto de teste sintético no agrupamento possam proporcionar estruturas que têm actividade biológica. Pode-se isolar moléculas que possuem actividades antitumorais, antiparasita animal ou antimicrobiana, e. g., anti-erva daninha, antiparasita vegetal, antifúngica, antibacteriana, antiparasita unicelular, antipatogénio unicelular ou antiviral. Além disso alguns destes ligandos podem actuar como agonistas ou antagonistas de factores de crescimento, e. g., eritropoietina, factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento do fibroblasto, factores de crescimento tumorais, para mencionar apenas alguns, assim como hormonas, neurotransmissores, agonistas para os receptores, imunomoduladores ou outras moléculas reguladoras.

Os agentes terapêuticos da invenção também incluem moléculas efectoras compreendendo uma estrutura que tem uma elevada afinidade para fármacos, e. g., digoxina, benzodiazepam, heroína, cocaína, ou teofilina. Essas moléculas podem ser utilizadas como um antídoto para overdoses desses fármacos. De modo semelhante, os agentes terapêuticos incluem moléculas efectoras que se ligam a pequenas moléculas ou iões metálicos, incluindo metais pesados. As moléculas com elevada afinidade para a bilirrubina serão úteis no tratamento de neonatos com hiperbilirrubinemia.

Em geral, a presente invenção pretende proporcionar métodos para identificar moléculas para terapia de doenças ou enfermidades tais como são listadas no Product Category índex do The Physicians Desk Reference (PDR, 1993, 47a Edição, Medicai

Economics Data: Oradell, NJ, pp. 201-202). Por exemplo, pode ser 86 identificada uma molécula efectora com actividade anticancerigena, antiparasita, anticoagulante, antagonista de anticoagulante, de agente antidiabético, anticonvulsiva, antidepressiva, antidiarreica, antidota, antigonadotrofina, anti-histamina, anti-hipertensiva, anti-inflamatória, antináuseas, antienxaquecas, antiparkinsonismo, antiplaquetas, antipruriginosa, antipsicótica, antipirética, antitoxina (e. g., antivenina), dilatadora brônquica, vasodilatadora, de agente quelante, contraceptiva, relaxante muscular, de agente antiglaucoma ou sedativa.

Os agentes terapêuticos da invenção podem também conter veículos, diluentes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis apropriados. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Podem também ser utilizadas soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, estearato de sódio, monostearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó magro, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e semelhantes. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Essas composições irão conter uma quantidade terapêutica eficaz do composto activo conjuntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a proporcionar a forma para administração 87 apropriada ao doente. Embora a injecção intravenosa seja uma forma muito eficaz de administração, podem ser utilizados outros modos, tais como por injecção ou por administração oral, nasal ou parentérica.

Uma molécula compreendendo uma estrutura determinada de acordo com esta invenção também pode ser utilizada para formar agentes diagnósticos. 0 agente diagnóstico também pode ser uma molécula compreendendo uma ou mais estruturas identificadas como resultado de rastreio da biblioteca, e. g., mais do que uma sequência de poliamida ou sequência de polialcano. Além disso, o agente diagnóstico pode conter qualquer um dos veiculos acima descritos para agentes terapêuticos.

Como aqui utilizado, "agente diagnóstico" refere-se a um agente que pode ser utilizado para a detecção de estados, tais como, mas não limitados a, cancro, tal como linfoma da célula T ou B, e doenças infecciosas como apresentadas acima. A detecção é utilizada no seu sentido mais vasto para abranger a indicação da existência de um estado, localização da parte do corpo envolvida no estado ou indicação da gravidade do estado. Por exemplo, pode ser utilizado um complexo de péptido-imunoperoxidase de rábano ou agente imuno-histoquímico relacionado para detectar e quantificar moléculas de anticorpo ou receptor especifico em tecidos, soro ou fluidos corporais. Os agentes diagnósticos podem ser adequados para a utilização in vitro ou in vivo. Particularmente, a presente invenção vai proporcionar reagentes diagnósticos úteis para utilização em imunoensaios, hibridação de Southern ou Northern e em ensaios in situ.

Além disso, o agente diagnóstico pode conter um ou mais marcadores, tais como, mas não limitados a, radioisótopos, marcadores fluorescentes, substâncias paramagnéticas ou outros 88 agentes intensificadores de imagem. Os especialistas na técnica estarão familiarizados com a gama de marcadores e métodos para incorporá-los no agente para formar agentes diagnósticos.

Os agentes terapêuticos e os agentes diagnósticos da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou diagnóstico de animais, e de um modo mais preferido, mamíferos incluindo humanos, cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, porquinhos-da-índia, murganhos e ratos. Os agentes terapêuticos ou diagnósticos também podem ser utilizados para tratar e/ou diagnosticar doenças de plantas.

As doenças e estados susceptíveis a terapia ou diagnóstico com moléculas descobertas de acordo com a presente invenção são tão variadas e numa gama vasta quanto as permutações de estruturas numa biblioteca.

Noutra forma de realização, podem ser seleccionadas esferas de ligação de baixa afinidade, e preparada uma biblioteca limitada com base na estrutura dos ligandos nas esferas. Noutra forma de realização, um suporte de baixa afinidade ou elevada afinidade, feito por medida, compreendendo um ou mais ligandos identificados a partir dos milhões de compostos de teste sintético proporcionados pela invenção podem ser utilizados em separações cromatográficas. A invenção será ainda clarificada através dos seguintes exemplos que pretendem ser puramente exemplificativos da invenção.

6. EXEMPLO:UMA BIBLIOTECA CODIFICADA MODELO 89 0 presente Exemplo demonstra que duas moléculas, um "composto de teste sintético" e uma "molécula codificadora", podem ser preparados simultaneamente num única esfera de resina. Além disso, pode ser preparada uma biblioteca desses compostos, em que cada esfera de resina na biblioteca contém uma única espécie do "composto de teste sintético" e uma única espécie de "molécula codificadora". Neste exemplo, estão presentes num proporção molar de 2:1, respectivamente. A sequência da "molécula codificadora" corresponde à sequência do "composto de teste sintético".

Para este sistema de modelo, o "composto de teste sintético" e a "molécula codificadora" eram péptidos. A síntese paralela do péptido de teste e do péptido codificante prosseguiu com a utilização de grupos bloqueadores ortogonais Boc e Fmoc.

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS A síntese de fase sólida foi realizada manualmente em seringas de polipropileno como descrito por Krchnak e Vagner (1990, Peptide Res. 3:102-193). As sínteses foram realizadas em TentaGel (TG) (Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha, 130 ou 80 ym, 0,23 mmol/g) modificado com ligante SCAL (Patek e Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894) (ligante de amida de segurança), ou com um ligante apropriado. As clivagens de grupos protectores Fmoc foram realizadas com 50% de piperidina/DMF durante 1x10 min. O grupo protector Boc foi clivado com 30% de TFA/DCM contendo 3% de anisole durante 20 minutos. Uma solução de DIEA/DCM (10%) foi utilizada para a neutralização após a clivagem de Boc. Uma mistura de BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 eq) em DMF foi utilizada para a activação de ambos os aminoácidos Να-Fmoc e Boc. Foi verificada se cada reacção de condensação foi completa (1,5 - 40 horas) através do teste de ninidrina ou do teste de 90 cloranilo nos casos de acoplamento a grupos amino secundários. 0 protocolo de acoplamento incluiu lavagem com DMF (6-8 vezes) (seguido por lavagem com DCM no caso de aminoácidos protegidos com Boc) entre acoplamento e desprotecção e entre desprotecção e acoplamento. A redução do ligante SCAL foi realizada por 20% de (EtO)2P(S)SH em DMPU durante 2 horas. A clivagem final foi realizada através da mistura 95% de TFA - 5% de água.

Os solventes de grau comercial foram utilizados sem purificação adicional. Os aminoácidos protegidos foram obtidos da Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) ou Propeptide (Vert-le-Petit, França).

6.2 RESULTADOS

6.2.1 SÍNTESE DA BIBLIOTECA MODELO E DESPROTECÇÃO DE AMBOS OS GRUPOS PROTECTORES O Boc-Lys(Fmoc)-OH foi acoplado como um primeiro aminoácido a SCAL-TG, o grupo Νε-Fmoc foi desprotegido e o Fmoc-Lys(Fmoc)-OH foi acoplado à cadeia lateral da primeira lisina. Os grupos Na- e Νε-Fmoc da lisina foram clivados e a resina foi dividida em três partes. Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH e Fmoc-Val-OH, respectivamente, foram acoplados a cada porção da resina. Os aminoácidos Boc correspondentes (Gly, Tyr e Leu - Boc-Tyr-OH foi utilizado com grupo hidroxilo desprotegido) foram acoplados no passo seguinte ao grupo α-amino da lisina após desprotecção de Boc, enquanto que o "ramo Fmoc" foi deixado protegido. Após conclusão das condensações de aminoácidos Boc, todas as três porções da resina foram combinadas e o "ramo Fmoc" foi desprotegido. A seguinte aleatorização foi realizada exactamente do mesmo modo como a primeira, após divisão da resina em três porções iguais. Após aleatorização de três posições (acoplamento 91 de três aminoácidos diferentes em cada posição), a resina foi dividida em porções separadas para análise subsequente.

Duas esferas completamente desprotegidas seleccionadas aleatoriamente foram submetidas separadamente para análises de sequência. Os aminoácidos "complementares" correctos foram encontrados em todos os três ciclos na proporção esperada de 2:1. Resultados (valores em pmoles): Ia esfera: Io ciclo: V 251, L 146, 2o ciclo: V 244, L 147, 3o ciclo: V 245, L 119; 2a esfera: 1° ciclo: 3o ciclo: F 125, Y 50. A 102, G 39, 2° ciclo: V 121, L 59,

Parte da resina (cerca de 100 mg) foi tratada com 20% de dietilditiofosfato em DMPU (2 x 1 h agitando) para reduzir o ligante SCAL. A mistura de péptidos foi clivada do SCAL reduzido com TFA/H20 (95:5) durante 1 h. A mistura de clivagem foi concentrada in vácuo e precipitada com Et20. O precipitado foi recolhido através de centrifugação e seco. A mistura de péptidos foi dissolvida em 0,1% de TFA/H20 e analisada através de HPLC. Um gradiente lento de 0-50% de acetonitrilo e 0,1% de TFA durante 200 min eluiu 27 picos esperados. Foram adicionalmente identificados diversos picos menores, cuja formação foi atribuída à utilização de tirosina de cadeia lateral desprotegida durante a síntese. Uma vez que existia o perigo de eliminação (ou pelo menos de diminuição do conteúdo) de algumas sequências por precipitação de éter, a segundo clivagem da mistura evitou este passo. A mistura de clivagem de TFA e água foi diluída através de mais água, concentrada numa centrifugadora com vácuo e liofilizada. A avaliação por HPLC da mistura demonstrou uma representação equimolar aproximada de todos os picos esperados. 92

6.2.2 DESPROTECÇÃO DO GRUPO FMOC DO N-TERMINAL E ACETILAÇÃO DO "RAMO FMOC" A desprotecção do grupo Fmoc foi seguida por acetilação de grupos amino do N-terminal livre. A acetilação foi realizada com uma solução de 0,3 M de N-acetilimidazole em DMF durante 20 minutos (teste da ninidrina negativo). Os grupos Boc do N-terminal no outro ramo foram desprotegidos após acetilação. Três esferas aleatoriamente escolhidas foram sequenciadas e proporcionaram as seguintes leituras (valores em pmoles): Io ciclo: Y 213 (esfera 1), G 161 (esfera 2), Y 201 (esfera 3), 2o ciclo: L 165 (1), Y 166 (2), Y 205 (3), 3o ciclo: Y 188 (1), L 128 (2), G 162 (3) . As leituras não foram contaminadas pelos aminoácidos presentes no braço acetilado.

Uma parte das esferas acetiladas (cerca de 100 mg) foi tratada como acima descrito (precipitação da mistura por éter etílico e/ou evaporação da mistura de clivagem e liofilização) para reduzir o ligante e clivar os péptidos acetilados. A análise de HPLC sob as mesmas condições mostrou que durante a precipitação de éter, uma proporção significativa da biblioteca foi perdida devido à sua solubilidade em éter. A amostra evaporada e liofilizada proporcionou o mesmo número de picos, aproximadamente do mesmo perfil como no caso da biblioteca desprotegida, embora os tempos de retenção se tenham deslocados para valores mais elevados devido a acetilação do "ramo" Fmoc.

6.2.3 SUBSTITUIÇÃO DO GRUPO PROTECTOR BOC COM O GRUPO TFA O grupo trifluoroacetilo substituiu o grupo Boc no N-terminal de modo a permitir uma experiência de sequenciação progressiva. Primeiro, o grupo Boc do N-terminal foi clivado de 93 uma amostra de resina (50 mg) enquanto o "ramo Fmoc" foi deixado protegido. Os grupos amino livres foram protegidos com trifluoroacetilo através de tratamento com 10 equivalentes (0,14 mmol, 21 pL) de anidrido do ácido trifluroacético em diclorometano (0,5 mL) na presença de DIEA (0,16 mmol, 28 pL). A reacção estava completa após 1 h (teste da ninidrina negativo). Após a trifluoroacetilaçâo, o grupo Fmoc no outro ramo foi removido e três esferas foram submetidas para sequenciação. Foi determinada a sequência do ramo Fmoc. Após sequenciação do ramo Fmoc, a esfera que foi sequenciada foi removida do sequenciador, e a esfera foi tratada com uma solução de 0,2 M de NaOH (3 h, 20 °C), seca, e submetida a três ciclos adicionais de sequenciação. Foram obtidas as sequências apropriadas do ramo Boc previstas a partir da sequenciação do ramo Fmoc. Ia esfera (valores em pmoles) : 1. F (735), 2. V (643), 3. A (837); após remoção de TFA: 1. Y (207), 2. L (187), 3. G (76), sequência FVA/YLG; 2a esfera: 1. A (215), 2. A (230), 3. F (193); após remoção de TFA: 1. G (88), 2. G (86), 3. Y (80), sequência AAF/GGY; 3a esfera: 1. F (63), 2. F (67), 3. V (41); após remoção de TFA: 1. Y (15), 2. Y (12), 3. L (4), sequência FFV/YYL.

6.2.4 CLIVAGEM DE UM PÉPTIDO A PARTIR DE UMA ESFERA

Diversas esferas de resina contendo sequências totalmente desprotegidas no ligante SCAL reduzido foram colocadas separadamente em pequenos frascos de vidro e tratadas de um dia para o outro com 30 pL de TFA. Foram retiradas fracções (3 pL) e diluídas com o H20 até ao volume total de 20 pL e analisadas por HPLC em HPLC microbore (Dispositivo Michrom) (gradiente 5-60% de acetonitrilo em 0,1% de TFA em água durante 20 min). Os cálculos com base no coeficiente de extinção médio de péptidos operando a 94 215 mostraram que cerca de 100-200 pmoles de péptido foram libertados a partir de uma esfera polimérica.

6.3 DISCUSSÃO A biblioteca codificada modelo é ilustrada na Figura 2. Um ligante ramificado liga o péptido do composto de teste sintético e o péptido codificante ao suporte de fase sólida. Geralmente, o composto de teste sintético pode ser um composto que não sofra degradação de Edman, assim a informação de sequência a partir da sequência codificante proporciona a determinação da estrutura do composto de teste. Cada uma das subunidades do composto de teste sintético é inequivocamente associada com um aminoácido no braço codificante, de um modo específico de posição, permitindo assim análise de estrutura.

Existem diversas abordagens para construir a sequência codificante. Um processo (Figura IA) utiliza uma distribuição estatística de ambas as estruturas na esfera polimérica. Neste caso, pode ser alcançada qualquer proporção possível, e a possibilidade de produzir um efeito cooperativo de ambas as sequências é minimizada. No segundo processo (Figura 1B), ambas as estruturas de rastreio e codificantes são construídas na ligação ramificada ao suporte sólido, realizada por exemplo através de um ácido diaminocarboxílico (lisina). Ambas as "sequências" estão presentes na proporção molar definida e um arranjo especial definido acessível à molécula aceitadora a ser rastreada. Nas aplicações em que é utilizada a libertação do péptido rastreado para a solução, a localização do composto de rastreio e codificante na esfera não é preocupante, uma vez que devido à utilização de ligantes diferentes, a sequência codificante nunca é libertada para a solução. 95

Foi prosseguido um esquema simples para demonstrar conclusivamente a síntese química do composto de teste sintético e da sequência codificante. 0 "composto de teste sintético" foi construído a partir de A, Fe V. Estes aminoácidos foram codificados com G, Y e L, respectivamente, na sequência "codificante". Os compostos de teste sintético foram construídos em ramificações de "teste", i. e., ambos os grupos amino da lisina ligados numa outra cadeia lateral da lisina utilizando química Fmoc (ver Figura 2) . A resina foi dividida em três partes e os aminoácidos Να-Fmoc protegidos foram acoplados nas ramificações de teste e deixados no estado protegido. Os aminoácidos Να-Boc (codificantes) correspondentes foram acoplados no ramo codificante. Todo o suporte de resina foi misturado conjuntamente e dividido novamente em três partes. A desprotecção do grupo Να-Fmoc e acoplamento do subsequente aminoácido Να-Fmoc foi realizada na presença da protecção Boc no outro ramo. 0 grupo protector Boc é estável sob aquelas condições. No passo seguinte, o grupo Να-Boc foi clivado e o aminoácido Να-Boc correspondente ao aminoácido Fmoc acoplado ao ramo de teste foi acoplado no ramo codificante em cada reacção. 0 processo de mistura, divisão e acoplamento separado de aminoácidos Fmoc e Boc foi repetido uma vez mais. A síntese foi realizada num ligante SCAL que é estável sob condições de ambas as estratégias Boc e Fmoc. Este ligante pode, contudo, ser clivado sob condições acidolíticas relativamente suaves após redução das suas unidades sulfóxido (Patek e Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894). A sequenciação das esferas preparados deste modo demonstrou uma proporção molar de 2:1 de sequência de rastreio para codificante e a correspondência apropriada de aminoácidos particulares (Figura 2A) . Utilizando uma fracção de esferas, a sequência de "rastreio" foi acetilada e foi obtida uma leitura de sequência limpa a partir da sequência "codificante" 96 (Figura 2B) . Utilizando uma fracção diferente de esferas, a sequência "codificante" foi bloqueada através de um grupo trifluoroacetilo, foi realizada sequenciação do ramo de "rastreio", o grupo trifluoroacetilo foi clivado das esferas sequenciadas e a sequência do péptido "codificante" foi determinada, confirmando os resultados da sequenciação do péptido de "rastreio" (Figura 2C) .

Para verificar que a estratégia sintética gera a proporção equimolar prevista do número definido de estruturas, a "minibiblioteca" representada numa fracção foi clivada do suporte. A HPLC de fase reversa confirmou a presença de 27 péptidos diferentes. Os picos identificados no registo foram recolhidos e submetidos a análise de sequência, que confirmou a pureza de cada péptido e a sua composição. A clivagem de péptidos foi também realizada a partir de esferas únicas e foi confirmada a praticabilidade da análise de péptidos libertados a partir apenas de uma esfera.

7. EXEMPLO: BIBLIOTECAS NÃO PEPTÍDICAS CODIFICADAS POR UMA ESTRUTURA PEPTÍDICA

Este Exemplo demonstra que uma molécula codificante de péptido pode codificar inequivocamente um composto de teste não peptidilo quando cada um é sintetizado em paralelo num única esfera. Neste Exemplo, as subunidades do composto de teste foram escolhidas de modo que cada composto tivesse um peso molecular único. A comparação do peso molecular observado do composto de teste com a sequência do péptido codificante mostra que um péptido codificante codifica para um composto de teste.

7.1 MATERIAIS E MÉTODOS 97

Os acoplamentos dos aminoácidos foram realizados através de um método manual utilizando protocolo convencional à temperatura ambiente; o aminoácido protegido (3 eq) em DMF foi misturado com DIC (3 eq), ou DIC e HOBT (3 eq cada) com a resina e o acoplamento foi seguido por testes analíticos. Foram utilizados anidridos simétricos onde especificado.

As subunidades utilizadas para preparar a biblioteca não peptídica são mostradas no Esquema XII:

ESQUEMA XII

B

1 0

,°H 3

©ο* £T r1

SH . Fmoc 6 0 ligante Fmoc-SCAL e Boc-Lys(Fmoc) foram acoplados primeiro à resina (TentaGel s NH2, 1 g) utilizando DIC e HOBT. Após clivagem do grupo Fmoc, o Fmoc-Trp foi acoplado e o novo grupo Fmoc foi desprotegido. 0 péptido-resina foi dividido em três 98 porção iguais, e foram acoplados três bromoácidos diferentes (um em cada vaso reaccional, 3 eqs cada) através da utilização de DIC em DMF (3 eqs) . Os três ácidos eram o ácido a-bromoacético, α-bromovalérico e bromotoluico. 0 acoplamento do último ácido foi repetido por causa da sua baixa reactividade, utilizando um excesso de 6 vezes tanto do ácido como DIC. A protecção Boc do grupo α-amino de Lys foi removida através de TFA e os primeiros aminoácidos Boc protegidos de sequência codificante (Gly, Ala, Leu) foram acoplados através de DIC. Os aminoácidos codificantes foram escolhidos de acordo com o peso molecular dos blocos de construção não peptídicos, de modo que o bloco mais leve (neste caso ácido bromoacético) foi codificado por Gly, o mais pesado (bromotoluico) foi codificado por Leu e o médio (α-bromovalérico) foi codificado por Ala.

As três partes de resina foram reunidas conjuntamente, lavadas exaustivamente com DCM e desprotegidas através de TFA/DCM na preparação para o acoplamento dos seguintes aminoácidos codificantes. Após desprotecção, a resina foi dividida novamente em três porções. Os acoplamentos de aminoácidos protegidos com Boc (novamente Gly, Ala e Leu) foram realizados como habitualmente através de DIC. Após acoplamento dos aminoácidos do péptido codificante, foram adicionadas as subunidades não peptidilo. Duas partes da resina foram tratadas com soluções a 2 M de aminas (benzilamina e l-amino-4-metilpiperazina) em DMF de um dia para o outro. A terceira parte foi tratada com solução a 2 M de fluorenilmetiloxicarbonilaminoetiltiol, e após conclusão da reacção foi removido o grupo Fmoc. A codificação de aminas foi baseada novamente nos seus pesos moleculares. A resina foi reunida conjuntamente uma vez mais, misturada e dividida em três porções para os acoplamentos finais. Os ácidos carboxilicos (ácido ciclo-hexilacético, ácido feniloxiacético e 99 ácido 4-piridiltioacético) foram acoplados às aminas obtidas (primária e secundária) através de DIC e as reacções de acoplamento foram repetidas duas vezes utilizando anidridos simétricos pré-formados em excesso de 3-5 vezes. Após obtenção de um teste de cloranilo negativo, os três lotes de resina foram tratados separadamente através de TFA, neutralizados, e os últimos aminoácidos codificantes protegidos com Boc foram acoplados utilizando DIC e HOBT. A codificação dos últimos ácidos carboxilicos foi baseada no mesmo esquema como anteriormente. Finalmente, toda a resina foi reunida conjuntamente.

As medições de espectroscopia de massa de bombardeamento de átomos rápidos (FAB) foram realizadas num espectrómetro ZAB EQ (VG Analytical Ltd, Manchester, Reino Unido). Os espectros de RMN de 1H foram obtidos num instrumento Geral Electric QE 300. A sequenciação por degradação de Edman foi realizada num sequenciador de proteína ABI 4778 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e no instrumento Porton PI 3010 (Porton Instruments, Tarzana, CA) . Foram realizadas HPLC analítica e preparativa num sistema Waters 625 LC com um Detector Programável de Múltiplos Comprimentos de Onda Waters 490E utilizando colunas Vydac Peptide e Protein C18 analíticas (0,46x250 mm, 5 ym, 1 mL/min) e preparativas (10x250 mm, 10 ym, 3 mL/min), respectivamente. As análises de misturas libertadas de uma esfera foram realizadas num Analisador Ultrafast Microprotein (Michrom BioResources, Pleasanton, CA) utilizando uma coluna Reliasil C18 (5 ym, 300 A, 1x150 mm) . Todos os espectros foram descritos em ppm relativamente a tetrametilsilano (δ) usando quer CDC13 ou CD3SOCD3 como solventes. Os espectros de absorção UV/VIS foram registados num espectrofotómetro Hewlett Packard HP 8452A com sistema de díodos utilizando uma cuvete de quartzo de 1 cm. As análises de aminoácidos foram realizadas num sistema D-500 (Durrum Corp., Paio Alto, CA) . 100

7.2 RESULTADOS

7.2.1 SÍNTESE DE DUAS FORMAS DE BIBLIOTECA CODIFICADA

Dois formatos para as bibliotecas foram terminados utilizando esta abordagem geral. As únicas diferenças entre esses dois é a localização do ligante SCAL como mostrado no Esquema XIII. 101

ESQUEMA XIII

: C Hi______________ .............. R( *H X2 = ν^ηγ0 ‘ C KCH2-ch2'ch3 R1*CH3 RI *CKCH2CH<CH3>2 X2 = X 2 r N—t/ Yl-CH, \_( nhch2-ch2-s r2 =ch3 X3* —^ r3«h R2 *CH-CH2-CHCH3)2 r3 *=ch3 r2 *h Xl- R3 «ΟΗ-ΟΗ^^Ο^ 102 A primeira biblioteca (A) continha o ligante SCAL no Ν-ε da Lys, o qual foi ligado directamente à resina, e deste modo a Trp-amida foi o último aminoácido em todos os compostos desta biblioteca. Nesta biblioteca, os péptidos codificantes permaneceram em esferas de resina após a clivagem. Na segunda biblioteca (B) o ligante SCAL foi ligado à resina, e o último aminoácido em todos os compostos foi Lys. Cada um dos compostos libertados a partir desta biblioteca incluiu o composto sintético e o péptido de sequência codificante.

Os blocos de construção não aminoacidicos utilizados para construir o composto de teste sintético são acima mostrados no Esquema XII. Estes blocos de construção foram escolhidos para formar compostos de teste de peso molecular único. Os compostos de teste, pesos moleculares e sequências codificante são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

Combinação na Construção de Blocos de Construção Utilizados de uma Biblioteca Não peptidica Modelo P.M. Sem Codificação Com Sequência Combinação Codificação* codificante

167 444,6 743, 9 GGG 168 454,5 767, 9 AGG 169 471, 6 827,0 LGG 147 474,6 787, 9 GAG 148 484,5 811, 9 AAG 149 501,6 871,1 LAG 157 482,6 838,0 GLG 158 492,6 862,0 ALG (continuação) 103 159 509, 6 921,2 LLG 267 486,7 800,0 GGA 268 4 96,6 824,0 AGA 269 513,7 883,1 LGA 247 516,7 844,1 GAA 248 526,6 868,0 Aaa 249 543,7 927,2 LAA 257 524,7 894,1 GLA 258 534,7 918,1 ALA 259 551,7 977,3 LLA 367 520,7 876,1 GGL 368 530,6 900,1 AGL 369 547,7 959,2 LGL 347 550,7 920,1 GAL 348 560,6 944,1 AAL 349 577,7 1003,3 LAL 357 558,7 970,2 GLL 358 568,7 994,2 ALL 359 585,7 1053,3 LLL do composto ramificado contendo o composto de teste péptido codificante.

As esferas da primeira biblioteca (Esquema XIII, Painel Superior) foram tratadas com agente redutor e as esferas individuais foram recolhidas para análises separadas de clivagem e sequência. Foram estudadas cinco esferas. Após clivagem da parte não peptidica, as esferas foram sequenciadas com sucesso (ver Tabela 2) e pode ser deduzida a estrutura do composto não peptidico. As soluções contendo os compostos clivados foram analisadas em sistema de micro HPLC.

Tabela 2 104

Estruturas Contidas em Esferas Seleccionadas Aleatoriamente a partir de uma Biblioteca de Estruturas Não Peptidicas

Aminoácido Detectado (pmol)

Esfera N° Combinação de Subunidade P.M. (m/z) 1° Ciclo 2o Ciclo 3o Ciclo 1 149 501,6 L (50) A (55) G (72) 2 169 471,6 L (34) G (31) G (29) 3 258 534,7 A (101) L (83) A (98) 4 147 474 ,6 G (45) A (41) G (25) 5 157 444 ,6 G (39) G (30) G (22)

Uma amostra (800 mg) da segunda biblioteca (Esquema XIII, Painel Inferior) foi tratada com 95% de TFA após redução do ligante SCAL, liofilizada, dissolvida em água, e separada numa coluna de HPLC semi-preparativa em 44 picos utilizando um gradiente 0-60% de acetonitrilo em 0,1% de TFA em água durante 200 min. As fracções foram liofilizadas e os diversos picos foram analisados por FAB MS e sequenciação para mostrar a correspondência entre a estrutura prevista a partir da sequência de aminoácidos codificantes e o peso molecular da construção. Os exemplos de picos escolhidos aleatoriamente para uma análise adicional seguem-se: Pico 4: RT 25,31 min, sequenciação: 1. Leu (364 pmol), 2. Gly (139), 3. Gly (422); FAB MS - 827,0 (combinação 169 de bloco de construção); Pico 8: RT 28,69 min, sequenciação: 1. Gly (261), 2. Leu (176), 3. Ala (225); FAB MS -770,2 (combinação 257 de bloco de construção sem o bloco 7); Pico 13: RT 31,47 min, sequenciação: 1. Leu (792), 2. Leu (551), 3. Gly (128); FAB MS - 921,0 (combinação 159 de bloco de construção); Pico 14: RT 32,27 min, sequenciação: 1. Leu (7930), 2. Gly (1810), 3. Ala (1763); FAB MS - 883,0 (combinação 269 de bloco de construção); Pico 15: RT 32,77 min, sequenciação: 1. Leu (784), 2. Ala (447), 3. Ala (360); FAB MS - 776,2 (combinação 249 de bloco de construção sem o bloco 9); Pico 16: 105 RT 33,16 min, sequenciação: 1. Leu (1286), 2. Ala (918), 3. Ala (688);FAB MS - 776,2 (combinação 249 de bloco de construção sem o bloco 9); Pico 17: RT 33,51 min, sequenciação: 1. Leu (298), 2. Leu (280), 3. Ala (202); FAB MS - 826,2 (combinação 259 de bloco de construção sem o bloco 9); Pico 19: RT 34,80 min, sequenciação: 1. Leu (641), 2. Gly (412), 3. Ala (460); FAB MS -883,1 (combinação 269 de bloco de construção); Pico 20: RT 36, 66 min, sequenciação: 1. Leu (150), 2. Leu (119), 3. Leu (80); FAB MS - 902,2 (combinação 359 de bloco de construção sem o bloco 9); Pico 26: RT 41,77 min, sequenciação: 1. Gly (39), 2. Gly (38), 3. Gly (23); FAB MS - 744,1 (combinação 167 de bloco de construção); Pico 31: RT 48,86 min, sequenciação: 1. Ala (180), 2. Gly (98), 3. Ala (106); FAB MS - 824,0 (combinação 268 de bloco de construção); Pico 32: RT 49,46 min, sequenciação: 1. Leu (234), 2. Leu (320), 3. Ala (277); FAB MS - 826,1 (combinação 259 de bloco de construção sem o bloco 9); Pico 33: RT 50,70 min, sequenciação: 1. Gly (152), 2. Gly (120), 3. Ala (94); FAB MS - 800,1 (combinação 267 de bloco de construção).

7.2.2 SÍNTESE DE COMPOSTOS REPRESENTATIVOS A PARTIR DE UMA. BIBLIOTECA NÃO PEPTÍDICA

Um componente da primeira biblioteca (A), composto I:

foi sintetizado em 0,23 g de resina Knorr (0,5 meq/g). O Fmoc-Trp foi acoplado primeiro de acordo com o protocolo geral, 106 utilizando DIC e HOBT. Após desprotecção do grupo amino, o ácido a-bromoacético (50 mg) foi acoplado utilizando DIC (50 yL) em DMF (0,5 mL) . Foi dissolvida benzilamina (100 pL) em 0,5 mL de DMSO e a bromo-resina foi tratada com esta solução de um dia para o outro. 0 ácido carboxilico final, ácido 4-piridiltioacético (80 mg), foi dissolvido em 0,85 mL de DMPT e pré-activado com DIC (80 pL) e HOBT (80 mg) e acoplado à amino-resina durante 10 horas. O acoplamento foi repetido utilizando PyBrop e DIEA para a activação. A clivagem do composto I foi realizada em 95% de TFA. Após clivagem, o TFA foi evaporado in vacuo e o resíduo foi dissolvido em 30% de acetonitrilo aquoso e liofilizado. O produto obtido após secagem foi redissolvido em acetonitrilo puro e precipitado através de éter. Esta operação foi repetida duas vezes e foi obtido um precipitado quase branco. O produto mostrou dois picos em HPLC de fase reversa (RP) . O segundo pico deu o espectro de massa esperado do composto I. O rendimento do componente I após purificação em HPLC RP semipreparativa foi 18 mg. Fórmula: C27H27N5O3S, MS esperado 501,6, MS encontrado - 502,2 (M+H) + . Dados de RMN de :H (DMSO-d6) : 10,804 d (1H, N em Η) ; B. 49 d (2H, piridilo C2H e C6H) ; 8,35 d (1H, NH) ; 7,62 d (2H, piridilo C3H e C5H); 6,9 - 7,7 mm (protões aromáticos de Bzl e Trp); 4,59 m (1H, Trp C“H) ; 3,75 - 4,65 m (protões alifáticos) ; 3,19 dd e 2,91 dd (2H, Trp CPH).

Um segundo componente da primeira biblioteca (Esquema XII, A), composto II:

107 foi sintetizado de acordo com o mesmo esquema que o composto I, utilizando ácido a-bromovalérico (40 pL) , 4-metil-aminopiperazina (100 pL) e ácido ciclo-hexilacético (80 mg) como subunidades. Fórmula: C29H44N6O3, MS esperado - 524,7, MS encontrado - 525,3 (M+H)+, 558,2 (M+Na)+ e 573,2 (M+K)+. O terceiro componente da primeira biblioteca (A) , composto III:

foi sintetizado de acordo com o esquema semelhante do composto I, utilizando ácido a-bromotoluico (120 mg), fluorenilmetiloxicarbonilaminoetilmercaptano (280 mg) (desprotecção após acoplamento com piperidina/DMF) e ácido fenoxiacético (80 mg) como blocos de construção. Fórmula: C29H30N4O4S, MS esperado 530,6, MS encontrado - 553,0 (M+Na) + .

7.3 DISCUSSÃO

Este exemplo demonstra a capacidade para construir estruturas não peptídicas em paralelo com a sequência codificante. A diferença nas bibliotecas foi na colocação do ligante SCAL, permitindo a clivagem selectiva do produto. No primeiro caso, (Painel Superior do Esquema XIII), a clivagem do 108 ligante conduz à libertação do composto X3-X2-Xi-Trp não peptídico (o Trp está ligado para objectivos de monitorização espectroscópica) ligado à sua estrutura peptídica codificante através de uma unidade de lisina. A clivagem do ligante no segundo caso (Esquema XIII, Painel Inferior) conduz à libertação do composto X3-X2-Xi-Trp não peptídico sem nenhum péptido codificante ligado. A construção do composto não peptídico envolveu (i) ligação de ácido carboxílico α-bromo-substituído ou ácido bromometilbenzóico ao grupo amino disponível no veículo sólido, (ii) alquilação de um amino (Zuckerman et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:10646-10647) ou grupo tiol de uma amina ou aminomercaptano N-protegido, e (iii) acilação de um grupo amino produzido através de um derivado de ácido carboxílico. Seleccionou-se os blocos de construção para esta experiência de um modo que permite a atribuição da estrutura das moléculas de rastreio construídas com base unicamente no peso molecular da construção (ver Tabela I) . A introdução de um bloco de construção muito artificial na estrutura de rastreio foi seguida (ou precedida) pelo acoplamento de um aminoácido codificante ao outro braço da molécula. Utilizou-se apenas glicina, alanina e leucina para a codificação (deste modo, estes aminoácidos codificaram um elemento estrutural diferente em cada passo da aleatorização). A atribuição destes aminoácidos ao elemento estrutural particular é dada no Esquema IX. A alquilação de aminas ou tiol utilizados nesta experiência através de ácido 2-bromopentanóico ligado à matriz polimérica conduz à produção de compostos com um centro quiral, deste modo o número de combinações estruturais é 36 em vez de 27. Contudo, são produzidos apenas 27 tipos diferentes de esferas (com sequências de rastreio de pesos molecular diferentes), 9 dos quais contêm uma mistura de compostos diastereoisoméricos. Para simplificar a análise das misturas e para demonstrar a capacidade para realizar este tipo de síntese no veículo polimérico, três das possíveis estruturas foram re-sintetizadas como compostos 109 individuais, utilizando a mesma quimica e suporte polimérico como na síntese da biblioteca modelo.

As misturas produzidas foram clivadas do veículo após a redução do ligante SCAL, e analisadas através de HPLC de fase reversa. 0 número de picos obtidos corresponde aproximadamente ao número previsto de 36. Foram recolhidos os picos individuais a partir do primeiro tipo de biblioteca. Parte de cada fracção recolhida foi submetida a degradação de Edman e parte foi analisada através de espectroscopia de massa. Os resultados obtidos confirmam a correlação da determinação de sequência com a determinação de peso molecular através de espectroscopia de massa, confirmando a viabilidade do princípio de codificação através de sequência peptídica (Tabela 2).

Foi realizada uma análise alternativa em esferas seleccionadas aleatoriamente a partir da segunda biblioteca. As esferas individuais foram tratadas com um agente redutor para tornar lábil o ligante SCAL e a estrutura não peptídica foi clivada através de uma mistura TFA/água. Após este tratamento, as esferas foram sequenciadas com sucesso (ver Tabela II) e a estrutura do composto não peptídico pode ser deduzida. Os compostos clivados foram analisados num sistema de micro HPLC.

8. EXEMPLO: BIBLIOTECA: XXXX-Lys(XXXX)-Lys(ZZ)-gAla-Gly-8Ala-Gly-TG 0 presente Exemplo demonstra a utilização de um péptido codificante para codificar simultaneamente uma porção não sequenciável de um péptido com a porção sequenciável do péptido do composto de teste. 110

8.1 MATERIAIS E MÉTODOS

8.1.1 SÍNTESE DA BIBLIOTECA A biblioteca foi sintetizada de acordo com o seguinte protocolo. 1. Acoplamento de Fmoc-Lys(Boc) a H-pAla-Gly-pAla-Gly-TG; 2. Clivagem de Fmoc; 3. Acoplamento de Fmoc-Lys(Fmoc); 4. Clivagem de Boc; 5. Após divisão da resina em 9 porções e os seguintes aminoácidos protegidos com Ddz foram acoplados em reacções separadas: A, D, I, K, Μ, N, S, T, V; 6. Clivagem de Fmoc; 7. Acoplamento de nove aminoácidos protegidos com Fmoc: Y, G, F, L, Η, P, Q, R, E (Y foi acoplado a essa parte da resina que já tinha ligado a A, etc.); 8. Resina combinada e Ddz clivado; 9. Repetir passos 5-7; 10. Clivagem de Fmoc; 11. Acoplamento de nove aminoácidos protegidos com Fmoc: Y, G, F, L, Η, P, Q, R, E; 12. Repetir passos 10-11; 13. Clivagem de Fmoc; 14. Grupos protectores de cadeia lateral e Ddz removidos pela mistura K (King et al., 1990, Int. J. Pep. Protein Res. 36:255— 266) .

Uma esfera foi submetida a quatro ciclos de degradação de Edman: Io ciclo: Arg (64), Ile (67); 2o ciclo: Gly (45), Thr (14); 3o ciclo: Phe (42); 4o ciclo: Arg (35). A Ile foi protegida com Ddz para o acoplamento e encontrada no primeiro ciclo. Esta codificou para Phe, que foi detectada no terceiro ciclo. No segundo ciclo a Thr foi detectada como o aminoácido que tinha sido acoplado protegido com Ddz. A Arg que codificou para Thr, foi por conseguinte encontrada no quarto ciclo da sequenciação.

8.1.2 PROTOCOLO DE RASTREIO DA BIBLIOTECA 111 A biblioteca peptídica foi rastreada de acordo com processos publicados (Lam e Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15). As esferas peptidicas foram misturadas primeiro com água bidestilada para remover o DMF. Após lavagem exaustiva com PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 4,3 mM de Na2HP04, 1,4 mM de KH2P04, pH 7,2), as esferas foram revestidas com 0,05% de gelatina (p/v) para bloquear qualquer ligação não especifica. As esferas foram depois incubadas com uma diluição de 1:100000 de estreptavidina-fosfatase alcalina a 2 mg/mL (Pierce; Rockford, IL) em 2x PBS/Tween/gelatina (2x PBS, 0,1% de Tween-20 (v/v), e 0,05% de gelatina (p/v)). As esferas foram depois lavadas exaustivamente com TBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 25 mM de Tris base, pH 7,4) e foi adicionado o substrato padrão de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. As esferas, conjuntamente com o substrato, foram depois transferidas para placas de petri para a revelação da cor. Após 30 minutos até 1 hora, as esferas coloridas foram recolhidas, com a ajuda de uma micropipeta, lavadas com cloridrato de guanidina a 6 M, pH 1,0, e submetidas a sequenciação como descrito. A biblioteca restante de esferas incolores foi depois reciclada com cloridrato de guanidina a 8 M, pH 2,0, lavadas exaustivamente com PBS, e incubadas com 60 pM de anti-β-endorfina biotinilada (clone 3-E 7, Boehringer Mannheim) em 2 x PBS/Tween/gelatina de um dia para o outro. Após lavagem exaustiva, foi adicionada estreptavidina-fosfatase alcalina. Uma hora mais tarde, as esferas foram lavadas, foi adicionado substrato e a revelação da cor prosseguiu como acima descrito. As esferas de cor foram depois isoladas fisicamente e submetidas a sequenciação. Nestas duas experiências, apenas as esferas mais escuras foram sequenciadas.

8.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO 112

As secções 6 e 7, supra, mostram que um "composto de teste" pode ser codificado por uma sequência peptídica "codificante". Este principio pode ser também utilizado para a determinação da estrutura de péptidos contendo um componente não sequenciável dentro da cadeia peptídica. Neste caso é necessário codificar apenas para os resíduos de aminoácidos localizados no terminal carboxilo da molécula, após a parte não sequenciável. Construiu-se uma biblioteca que mimetiza esta situação, embora o "composto de teste" não contenha de facto um componente não sequenciável. A estrutura da biblioteca é dada no Esquema XIV.

ESQUEMA. XIV

XsYGFLHPQRE

ZSAD 1KMNSTV

Os resíduos de aminoácidos X4 e X3, no braço do "composto de teste" não são codificados através de qualquer correspondente no braço "codificador". Os aminoácidos Ζχ e Z2 codificam para os resíduos Χχ e X2 e estão presentes em metade da concentração dos aminoácidos na sequência de "teste". Dois ciclos de degradação de Edman podem revelar a estrutura do péptido de interesse. 0 aminoácido detectado na maior quantidade é o resíduo da posição 1 ou 2 da sequência de "teste". 0 aminoácido detectado numa menor quantidade é o resíduo que codifica a posição 4 ou 3 desta sequência. 0 aminoácido codificante pode ser o mesmo como aquele 113 para o qual está a codificar ou pode ser diferente. 0 conjunto codificante e de rastreio dos aminoácidos utilizados neste exemplo é apresentado no Esquema XIV.

Tabela 3

Resultados de Sequenciação 1° Ciclo 2o Ciclo Sequência Deduzida Alvo Y, D G,I YGGF anti-β-endorfina Y,N G,I YGPF anti-β-endorfina Y, D G, K YGGL (3x) anti-β-endorfina H, S p,i HPQF (5x) estreptavidina A sintese da biblioteca foi realizada com a utilização de uma combinação de três grupos protectores de amino. A protecção temporária do grupo α-amino na sequência de "rastreio" foi proporcionada através do grupo Fmoc, que é clivável através de piperidina em dimetilformamida. A protecção temporária da sequência "codificante" foi conseguida através da utilização do grupo Ddz (Birr et al.r 1972, Liebig's Ann. Chem. 763:162-173), clivável com ácido trifluoroacético diluido (2%) . Os grupos funcionais da cadeia lateral foram protegidos através de grupos protectores do tipo terc-butilo cliváveis através de ácido trifluoroacético de concentração mais elevada (50%) . Um ciclo de aleatorização com marcação de sequência consistiu em (i) divisão da resina no número de vasos reaccionais correspondentes ao número de aminoácidos aleatorizados neste passo, (ii) acoplamento de aminoácidos protegidos com Fmoc (Y, G, F, L, H, P, Q, R, E), (iii) lavagem, clivagem do grupo Ddz e 114 neutralização, (iv) acoplamento de aminoácidos protegidos com Ddz correspondentes (A, D, I, K, Μ, N, S, T, V) , (v) mistura do suporte sólido e desprotecção do grupo Fmoc.

Esta biblioteca foi utilizada no rastreio contra dois alvos modelo, anticorpo monoclonal anti-p-endorfina, e estreptavidina. As esferas positivas foram identificadas através da técnica de coloração convencional (Lam e Lebl, 1992, Immunomethods. 1:11-15; Lam et al., 1991, Nature 354:82-85), e as esferas (5 para cada alvo) identificadas neste rastreio foram submetidas a dois ciclos de degradação de Edman. Os resultados de dois ciclos de degradação de Edman são dados na Tabela 3. Como pode ser observado, as esferas positivas de estreptavidina deram em todos os casos Η (Χχ) e S (Zx) (codificando para Q, X3) no primeiro ciclo, e P (X2) e I (Z2) (codificando para F, X4) no segundo ciclo. Deste modo, a sequência do braço HPQF de rastreio pode ser facilmente descodificado. As esferas identificadas no rastreio anti-p-endorfina deram resultados mais variados. Além de Y (Xi) e D (Zi) (codificando para G, X3), N (Zi) (codificando para P, X3) foi também encontrado no primeiro ciclo, e G (X2) e I (Z2) (codificando para F, X4) e K (Z2) (codificando para L, X4) foram encontrados no segundo ciclo. Deste modo, as sequências YGGL (3x), YGGF, e YGPF poderiam ser construídas a partir destes dados. Estas sequências estão de acordo com os dados obtidos anteriormente (Lam e Lebl, supra; Lam et al., 1991, supra; Lam et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:419-429).

Estas experiências estabelecem claramente que podem ser utilizados péptidos para codificar outras estruturas, que são parcialmente ou totalmente insequenciáveis. Esta tecnologia irá ter um grande significado por causa da sua ampla aplicabilidade ao estudo de interacções moleculares ligando-aceitador e para o desenvolvimento de fármacos. As bibliotecas codificadas abrem a 115 porta para a aplicação de abordagens paralelas amplas para a síntese de fármacos e rastreio de bibliotecas não peptidicas.

9. EXEMPLO: BIBLIOTECAS DE ESTRUTURAS NÃO PEPTIDICAS BASEADAS EM QUÍMICA DE SÍNTESE PEPTÍDICA EM FASE SÓLIDA 0 presente Exemplo combina a simplicidade da síntese de estruturas peptidicas com a diversidade disponível utilizando subunidades alternativas para além de aminoácidos convencionais. As subunidades mais simples para a construção da biblioteca são discutidas na Secção 5.5.9, supra. A síntese da presente biblioteca envolve a utilização de aminoácidos trifuncionais e modificação de uma cadeia lateral para conseguir multiplicidade estrutural. Os aminoácidos como ácido diaminobutirico, ácido aspártico, cistina e/ou ácido iminodiacético são as menores subunidades sobre as quais podem ser ligadas cadeias laterais de ácidos carboxilicos, aminas, isocianatos ou halogenetos (alifáticos, aromáticos, heterocíclicos). Estes aminoácidos podem eles próprios actuar como um andaime para derivatização adicional.

Para conseguir uma ligação razoável a um aceitador (e. g., receptor, anticorpo, enzima, ácido nucleico, etc.) deve ser realizado o arranjo espacial apropriado das estruturas interactuantes. A apresentação linear de cadeias laterais de aminoácidos em bibliotecas peptidicas pode não ser um formato óptimo para a selecção das melhores estruturas de ligação. A estratégia óptima para a apresentação das estruturas interactuantes pode ser a sua colocação num andaime molecular, que iria mapear o espaço conformacional apropriado. As interrelações dos mesmos blocos de construção individuais no 116 arranjo do andaime pode variar utilizando andaimes diferentes assim como cadeias laterais diferentes.

9.1 MATERIAIS E MÉTODOS

9.1.1 INSTRUMENTOS

As medições de espectroscopia de massa de bombardeamento de átomos rápidos (FAB) foram realizadas num espectrómetro ZAB EQ (VG Analytical Ltd, Manchester, Reino Unido). Os espectros de RMN de 1E foram obtidos num instrumento Geral Electric QE 300. A sequenciação por degradação de Edman foi realizada num sequenciador de proteína ABI 4778 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e no instrumento Porton PI 3010 (Porton Instruments, Tarzana, CA). A HPLC analítica e preparativa foram ambas realizadas num sistema Waters 625 LC com um Detector Programável de Múltiplos Comprimentos de Onda Waters 490E utilizando colunas Vydac Peptide e Protein C18 analíticas (0,46x250 mm, 5 ym, 1 mL/min) e preparativas (10x250 mm, 10 ym, 3 mL/min), respectivamente. As análises de misturas libertadas de uma esfera foram realizadas num Analisador Ultrafast Microprotein (Michrom BioResources, Pleasanton, CA) utilizando uma coluna Reliasil C18 (5 ym, 300 A, 1x150 mm) . Todos os espectros foram descritos em ppm, relativamente a tetrametilsilano (δ) usando quer CDC13 ou CD3SOCD3 como solventes. Os espectros de absorção UV/VIS foram registados num espectrofotómetro Hewlett Packard HP 8452A com sistema de díodos utilizando uma cuvete de quartzo de 1 cm. As análises de aminoácidos foram realizadas num sistema D-500 (Durrum Corp., Paio Alto, CA).

9.1.2 PROCESSOS 117 A síntese de fase sólida foi realizada manualmente em seringas de polipropileno como descrito por Krchnak e Vagner (1990, Peptide Res. 3:182-193). As sínteses foram realizadas em resina TentaGel S NH2 (TG) (Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha, 130 ou 80 pm, 0,23 mmol/g) modificada com ligante SCAL (Patek e Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894) (ligante de amida de segurança) ou com um ligante apropriado. Os grupos protectores Fmoc foram clivados com 50% de piperidina/DMF durante 1x10 min, os grupos Tfa através de tratamento repetido (3x 1 min + 90 min) com 10% de piperidina/água. Os grupos Npys foram removidos por a 0,3 M de solução de HC1 em dioxano durante 5 + 30 min, o grupo Aloc por (Ph3P)4Pd em DMF/AcOH/N-Me-Morfolina (10:2:1), os grupos Boc foram clivados com 30% de TFA/DCM contendo 3% de anisole durante 20 min. Uma solução de DIEA/DCM (10%) foi utilizada para neutralização após clivagem de Boc. Uma mistura de BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 q) em DMF foi utilizada para a activação de ambos os aminoácidos Να-Fmoc e Boc. Foi verificada se cada reacção de condensação foi completa (1,5 - 40 horas) através do teste de ninidrina ou do teste de cloranilo nos casos de acoplamento a grupos amino secundários. O protocolo de acoplamento incluiu lavagem com DMF (6-8 vezes) (seguido por lavagem com DCM no caso de aminoácidos protegidos com Boc) entre acoplamento e desprotecção e entre desprotecção e acoplamento. A redução do ligante SCAL foi realizada por 20% de (EtO)2P(S)SH em DMPU durante 2 horas. A clivagem final foi realizada através da mistura 95% de TFA - 5% de água.

9.1.3 REAGENTES

Os solventes de grau comercial foram utilizados sem purificação adicional. Os aminoácidos protegidos foram obtidos da Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) ou 118

Propeptide (Vert-le-Petit, França) . As aminas e ácidos carboxílicos foram obtidas da Aldrich (Milwaukee, WI).

9.1.4 SÍNTESE DE UMA BIBLIOTECA NÃO PEPTÍDICA SOBRE ANDAIME NÃO PEPTÍDICO

Mono terc.butiloxicarboniletilenodiamina. Este composto foi preparado como descrito anteriormente (Krapcho et al., 1990, Synthetic Commun. 20:2559-2564). Resumidamente, uma solução de dicarbonato de terc.butilo (5,0 g, 0,023 mol) em dioxano (50 mL) foi adicionada lentamente a etilenodiamina (11,0 mL, 0,165 mol) em dioxano (60 mL) . Após 24 horas de agitação, o solvente foi evaporado e o resíduo foi dissolvido em água (80 mL), o subproduto insolúvel foi removido por filtração e o filtrado foi extraído com diclorometano (3x100 mL). Após a evaporação do solvente, o produto foi cristalizado a partir de uma mistura de solventes de dietiléter - éter de petróleo ou acetato de etilo -éter de petróleo. Rendimento 2,6 g (71%). RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 1,39 (s, 9H, tBu) , 2,83 (m, 2H, CaH2) , 3,16 (q, 2H,

CbH2) , 6,93 (t, 1H, NH), 7,77 (br, 2H, NH2) . P.f. 75 °C N-terc.butiloxicarbonil-N'-fluorenilmetiloxicarboniletileno-diamina. Uma solução de carbonato de fluorenilmetilsuccinimidilo (31,0 g, 0,092 mol) em acetonitrilo (300,0 mL) foi adicionada lentamente a mono terc-butiloxicarboniletilenodiamina (10,0 g, 0,063 mol) dissolvida em 10% de Na2C03aq (250 mL). O acetonitrilo foi evaporado e o produto foi extraído com acetato de etilo, a fase orgânica foi seca sobre Na2C03, concentrada e o produto foi deixado a cristalizar através da adição de éter de petróleo. O produto foi recolhido sobre filtro, lavado com éter de petróleo. Rendimento 20,0 g (84%). TLC, éter de petróleo - dietiléter 88:12, Rf 0,64. RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 1,37 (s, 9H, 119 tBu), 2,99 (m, 4H, CH2CH2) , 4,20-4,29 (m, 3H, Fmoc OCH2CH-) , 6,76 (t, 1H, NH), 7,25 (t, 1H, NH) , 7,33-7, 89 (m, 8H, Fmoc). P.f. 146-148 °C.

Trifluoroacetato de mono N-fluorenilmetiloxicarboniletileno-diamina. A N-terc-butiloxicarbonil-N'-fluorenilmetiloxi- carboniletileno-diamina (20,0 g, 0,052 mol) foi tratada com ácido trifluoroacético e anisole em diclorometano (10:10:1) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi cristalizado a partir de uma mistura de solventes de acetato de etilo-n-hexano. Rendimento 15,0 g (73%). RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 2,85 (m, 2H, CaH2) , 3,22 (m, 2H, CbH2) , 4,23-4,36 (m, 3H, Fmoc OCH2CH-) , 7,37 (m, 1H, NH) , 7,34-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,77 (br, 2H, NH2) . P.f. 128-129 °C.

Anidrido cis,cis-1,3,5-trimetilciclo-hexano-5-ácido carbocíclico-1,3-dicarboxílico (1). 0 composto (1) foi preparado como descrito (Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090). Resumidamente; o ácido cis,cis-1,3,5-trimetilciclo-hexano-1,3,5-tricarboxílico (1,0 g, 0,004 mol) foi submetido a refluxo em xileno (50 mL) durante 19 h sob azoto utilizando a válvula de Firestone e a armadilha de Dean-Stark. A solução resultante foi concentrada in vacuo e o produto foi deixado a cristalizar. Após recolha sobre filtro, o produto foi seco in vacuo a 70 °C durante 1 hora. Rendimento 0,78 g (82%). RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 1,10 (s, 3H, CH3) , 1,16 (s, 6H, 2CH3) , 1,33, 2,39 (d,d, 4H, 2CH2), 1,33, 2,15 (d,d, 2H, CH2), 12,60 (s, 1H, COOH). P.f. 252-253 °C, lit.(32) p.f. 252-254 °C. Ácido 5-(N-terc.butiloxicarbonilaminoetilcarboxamido)-

cis,cis-1,3,5-trimetilciclo-hexano-l,3-dicarboxílico (2). O

anidrido ácido (1) (0,5 g, 0,002 mol) foi dissolvido em DMF 120 (4 mL) e foi adicionado mono terc.butiloxicarboniletilenodiamina (0,33 g, 0,002 mol) dissolvido em DMF (4 mL) sob azoto. A mistura de reacção foi agitada cerca de 5 horas (monitorização por TLC) e depois o DMF foi evaporado. O produto foi cristalizado a partir de uma a mistura de solventes de acetato de etilo - éter de petróleo. Rendimento 0,38 g (47%). RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 1,08 (s, 3H, CH3) , 1,13 (s, 6H, 2CH3) , 1,34 (s, 9H, tBu) , 1,07, 2,51 (d,d, 4H, 2CH2) , 2,43 (d, 2H, CH2) , 2,96 (m, 4H, 2CH2) , 6,70 (t, lh, NH), 7,71 (t, 1H, NH), 12,10 (s, 1H, COOH). P.f. 161-164 °C.

Anidrido 5-(N-terc.butiloxicarbonilaminoetilcarboxamido)- cis,cis-l,3,5-trimetilciclo-hexano-l,3-dicarboxílico (3). Foi adicionada diciclo-hexilcarbodiimida (0,55 g, 0,002 mol) à solução de diácido (2) (1,0 g, 0, 0025 mol) em DCM (70 mL) sob azoto. Após 4 horas de agitação, a mistura de reacção foi concentrada e a diciclo-hexilureia foi removida por filtração. O filtrado foi evaporado até à secura e o resíduo foi cristalizado a partir de uma a mistura de solventes de acetato de etilo -éter de petróleo, seco em excicador (KOH, P205) in vácuo. Rendimento 0,9 g (95%) Ácido 5-(N-terc.butiloxicarbonilaminoetilcarboxamido)-3-(N-fluorenilmetiloxicarbonilaminoetilcarboxamido)-cis,cis-1,3,5-trimetilciclo-hexano-l-carboxílico (4). O anidrido (3) (0,85 g, 0,002 mol) foi dissolvido em DMF (10 mL) e foi adicionado solução de trifluoroacetato de mono N-fluorenilmetiloxi-carboniletileno-diamina (0,88 g, 0,002 mol) em DMF (15 mL) na presença de trietilamina (pH ajustado a 8,5) sob azoto. A mistura de reacção foi agitada durante 4 horas (monitorização por TLC) e depois evaporada até à secura. O produto em bruto foi submetido a cromatografia flash (Sílica gel Merck 60, malha de 230-400) num sistema de solventes DCM-MeOH 25:1. As fracções 121 contendo p produto puro foram combinadas, evaporadas até à secura e o produto foi cristalizado a partir de uma a mistura de solventes de acetato de etilo - éter de petróleo. Rendimento 0,32 g (24%). RMN (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C) d: 1,08 (s, 6H, 2CH3) , 1,14 (s, 3H, CH3), 1,35 (s, 9H, tBu) , 4,25 (m, 3H, Fmoc OCH2CH-), 6,86 (t, 1H, NH), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc). P.f. 118-121

Biblioteca não peptídica sobre andaime não peptidico. O composto (4) foi utilizado como andaime para uma biblioteca não peptidica. Foi submetido TentaGel S NH2 (0,4 g, substituição de 0,21 mequiv NH2/g) a síntese de fase sólida utilizando o seguinte protocolo:

Passo Reagente Tempo 1 5% de DIEA/DMF 2x5 min 2 Lavagem de DMF 10x2 min 3 Fmoc-Lys(Boc)/BOP até 0 teste da ninidrina ser negativo 4 repetir 0 passo 2 5 DCM 10x2 min 6 TFA/DCM/anisole 1x30 min (continuação) 7 repetir 0 passo 5 8 5% de DIEA/DCM 3x2 min 9 repetir 0 passo 2 10 resina foi dividida em 20 porções e os ácidos definidos abaixo acoplados. Os anidridos foram utilizados como tal, outros ácidos carboxílicos foram acoplados utilizando reagente BOP. 122 ácido piválico ácido fenilacético ácido difenilacético ácido 1-adamantanoacético Z-Gly CIZ-p-Ala ácido CIZ-aminocapróico ácido diBoc-guanidinoacético ácido diBoc-e-guanidinopentanóico ácido succinâmico ácido 2-furóico ácido p-hidroxibenzóico ácido isonicoinico ácido 4-fenilbutirico anidrido acético anidrido n-butírico anidrido n-capróico anidrido benzóico anidrido succinico anidrido glutárico 11 repetir o passo 2 12 50% de piperidina/DMF 10 min 13 repetir o passo 2 (continuação) 14a Composto 4/DIC/HOBt 30 min (pré-activação) 14b produto do passo 14a até o teste de

Kaiser ser negativo 15 repetir o passo 11-13 123 16 17 18 19 25 26 27 28 29 30 31 32 33

resina dividida em 20 porções e os ácidos definidos no passo 10 acoplados. Os anidridos foram utilizados como tal, outros ácidos carboxilicos foram primeiro pré-activados por mistura de DIC/HOBt. Lavagem de DMF DCM TFA/DCM/anisole DCM 5% de DIEA/DCM Lavagem de DMF resina dividida em 20 porções e os ácidos definidos no passo 10 acoplados. Os anidridos foram utilizados como tal, outros ácidos carboxilicos foram primeiro pré- activados por mistura de DIC/HOBt. Lavagem de DMF Lavagem de DCM TFA/TFMSA/TA Lavagem de DCM Lavagem de DMF 10x2 min 3x2 min 1x30 min 5x2 min 3x2 min 4x2 min 10x2 min 3x2 min 30 min 3x2 min 5x2 min

9.1.5 BIBLIOTECA RAMIFICADA EM TENTAGEL

TentaGel S NH2 (5 g, 0,23 mmol/g, tamanho de esfera de 130 ym) foi pré-inchado em DMF e a biblioteca ramificada foi construída de acordo com o seguinte protocolo: (1) acoplamento do ligante SCAL; (2) Desprotecção de Fmoc; (3) Acoplamento de Fmoc-Lys(Tfa); (4) Desprotecção de Fmoc; (5) Acoplamento de 124

Fmoc-p-Ala; (6) Desprotecção de Fmoc; (7) Fmoc-Lys(Boc); (8) Desprotecção de Fmoc; (9) Fmoc-3-Ala; (10) Desprotecção de Boc; aleatorização; aleatorização; Fmoc-Lys(Tfa); Fmoc-p-Ala; aleatorização; aleatorização; aleatorização

Acoplamento de Acoplamento de (11) Primeira (13) Segunda Acoplamento de (12) Desprotecção de Fmoc; (14) Desprotecção de Tfa; (15 (16) Desprotecção de Fmoc; (17) Acoplamento de (18) Desprotecção de Fmoc; (19) Terceira (20) Desprotecção de Tfa; (22) Desprotecção de os seguintes ácidos (21)

Quarta cadeia lateral. Em cada foram acoplados: ácido acético, n-butirico, piválico, n-capróico, benzóico, fenilacético, 4-fenilbutírico, difenilacético, 1-adamantanoacético, succinico, glutárico, glicina, β-alanina, epsilon-amino-n-capróico, guanidoacético, gama- guanidinobutírico, succinâmico, p-hidroxibenzóico, 2-furóico e isonicotinico. Estas subunidades, e o correspondente código de aminoácido para cada subunidade, são listadas na Tabela 4. Os aminoácidos foram acoplados como anidridos quando comercialmente disponíveis (10 eq de anidrido, 1,2 eq de DIEA), ou foram pré-activados durante 20 min (12 eq de ácido, 10 eq de DIC, 10 eq de HOBt) . Devido à sua solubilidade muito baixa em DMF, os ácidos guanidino (12 eq) foram dissolvidos em DMF contendo HOBt e LiCl e activados por DIC. Contudo, numa experiência de controlo apenas cerca de 70 a 80% de acoplamento foi observado sob aquelas condições. Após terminada a síntese, a biblioteca foi lavada com TFA (3x) , DCM (5x) , DMF (5x) , DMF/0,1% de HC1 (1:1) (3x) e 0,02% de HC1.

Tabela 4

Esquema de Protecção, Activação e Codificação para Ácidos

Acido

Prot.

Activ.

Codificado por ácido acético anidr.

Ala 125 ácido n-butírico anidr. Asn ácido piválico anidr. Asp ácido n-capróico anidr. Glu ácido benzóico anidr. Gin ácido fenilacético DIC, HOBt Gly ácido 4-fenilbutirico DIC, HOBt His ácido difenilacético DIC, HOBt Ile ácido 1-adamantanoacético DIC, HOBt Leu ácido succinico anidr. Lys ácido glutárico anidr. Met glicina Boc DIC, HOBt Orn beta-alanina Boc DIC, HOBt Phe ácido ε-amino-n-capróico Boc DIC, HOBt Pro ácido guanidoacético diBoc DIC, HOBt Ser ácido y-guanidinopentanóico diBoc DIC, HOBt Thr ácido succinâmico DIC, HOBt Trp ácido p-hidroxibenzóico DIC, HOBt Tyr ácido 2-furóico DIC, HOBt Vai ácido isonicotinico DIC, HOBtl Nva

9.1.6 BIBLIOTECA CODIFICADA RAMIFICADA EM TENTAGEL

TentaGel S NH2 (5 g, 0,23 mmol/g, tamanho de esfera de 130 ym) foi pré-inchado em DMF e a biblioteca ramificada com sequência codificante foi construída de acordo com o seguinte protocolo: (1) Acoplamento de Fmoc-Lys(Ddz-Gly); (2) Desprotecção de Fmoc; (3) Acoplamento de Fmoc-Lys(Tfa); (4) Desprotecção de Fmoc; (5) Acoplamento de Fmoc-p-Ala; (6) Desprotecção de Fmoc; (7) Acoplamento de Fmoc-Lys(Npys); (8) Desprotecção de Fmoc; (9) Acoplamento de Fmoc-p-Ala; (10) Desprotecção de Fmoc; (11) Primeira aleatorização; (12) Desprotecção de Ddz em cada vaso reaccional separadamente; (13) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com 126

Fmoc;(14) Desprotecção de Npys; (15) Segunda aleatorização; (16) Desprotecção de Fmoc em cada vaso reaccional separadamente; (17) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc; (18) Desprotecção de Fmoc do braço codificante; (19) Acoplamento de Ddz-Phe; (20) Desprotecção de Tfa; (21) Acoplamento de

Fmoc-Lys(Npys); (22) Desprotecção de Fmoc; (23) Acoplamento de

Fmoc-p-Ala; (24) Desprotecção de Fmoc; (25) Terceira aleatorização; (26) Desprotecção de Ddz em cada vaso reaccional separadamente; (27) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc; (28) Desprotecção de Npys; (29) Quarta aleatorização; (30) desprotecção de Fmoc em cada vaso reaccional separadamente; (31) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc; (32) Desprotecção de Fmoc; (33) Desprotecção de cadeia lateral. A biblioteca foi lavada com TFA (3x), DCM (5x), DMF (5x), DMF/0,1% de HC1 (1:1) (3x) e 0,02% de HC1. 9.1.7 BIBLIOTECA RAMIFICADA COM CODIFICAÇÃO EM SEPHAROSE DE FLUXO RÁPIDO (FFS) A FFS foi peneirada para obter uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita (tamanho de esfera de 85-125 um), colocada num vaso reaccional para a síntese peptídica e lavada 10 vezes com DMF. O Fmoc-Gly (2,97 g) em DMF foi activado por DIC (1,57 mL) e HOBt (1,35 g) e adicionado a 10 mL de FFS. A reacção foi catalisada por 0,25 g de dimetilaminopiridina e a suspensão foi agitada de um dia para o outro. O Fmoc-Gly-FFS foi lavado 10 vezes com DMF, o Fmoc foi clivado, a resina foi lavada com DMF e a substituição calculada de acordo com a absorvência da solução desprotectora a 302 nm. A substituição típica foi 0,1 mmol/mL. Depois a mistura de Fmoc-p-Ala e Βοο-β-Ala (proporção molar de 3:1) foi activada por DIC e HOBt e acoplada a Gly-FFS num excesso molar de 3. A FFS foi lavada 10 vezes com DMF, os grupos Fmoc removidos e os grupos amino livres 127

acetilados com AC20/Py (1:1) durante 10 min. Após lavagem 10 vezes com DMF e DCM, o Boc foi removido por TFA/DCM/anisole (45:45:10) durante 5+30 min, a FFS foi lavada com DCM (10 vezes) , neutralizada com 2% de DIEA/DCM (3 vezes 1 min) e lavada 10 vezes com DMF. A biblioteca ramificada com sequência codificante foi construída de acordo com o seguinte protocolo: (1) Acoplamento de Fmoc-Lys(Ddz-Gly); (2) Desprotecção de Fmoc; (3) Acoplamento de Fmoc-Lys(Alloc); (4) Desprotecção de Fmoc; (5) Acoplamento de

Fmoc-p-Ala; (6) Desprotecção de Fmoc; (7) Acoplamento de

Fmoc-Lys(Npys); (8) Desprotecção de Fmoc; (9) Acoplamento de

Fmoc-p-Ala; (10) Desprotecção de Fmoc; (11) Primeira aleatorização; (12) Desprotecção de Ddz em cada vaso reaccional separadamente, (13) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc, (14) Desprotecção de Npys; (15) Segunda aleatorização; (16) Desprotecção de Fmoc em cada vaso reaccional separadamente, (17) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc, (18) Desprotecção de Fmoc do braço codificante, (19) Acoplamento de Ddz-Phe, (20) Desprotecção de Alloc; (21) Acoplamento de Fmoc-Lys(Npys); (22) Desprotecção de

Fmoc; (23) Acoplamento de Fmoc-p-Ala; (24) Desprotecção de Fmoc; (25) Terceira aleatorização; (26) Desprotecção de Ddz em cada vaso reaccional separadamente, (27) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc, (28) Desprotecção de Npys; (29) Quarta aleatorização; (30) desprotecção de Fmoc em cada vaso reaccional separadamente, (31) Acoplamento de aminoácido codificante protegido com Fmoc, (32) Desprotecção de Fmoc, (33) Desprotecção de cadeia lateral. A biblioteca foi lavada com TFA (3x) , DCM (5x) , DMF (5x) , DMF/0,1% de HCl (1:1) (3x) , e 0,02% de HCl. 128

9.1.8 BIBLIOTECA DE PÉPTIDO MISTO E SUBUNIDADES NÃO

PEPTÍDICAS A biblioteca foi sintetizada em TentaGel S NH2, 90 ym, (Rapp Polymere, Alemanha) (2 g, substituição de 0,25 mmol/g, 0,5 mmol) . Primeiro, a sequência Gly-pAla-Gly^Ala-Gly-Lys (Tfa) -TG idêntica para todas as sequências foi sintetizada utilizando um excesso de 5 eq de aminoácidos-Fmoc activados (activação de DIC/HOBt). Após desprotecção de Fmoc do N-terminal, a resina foi dividida em 9 porções na proporção de 17:8:5:1:1:1:1:1:1 (36 partes, 0,014 mmol por parte). As estruturas das subunidades utilizadas nesta biblioteca são mostradas na Figura 8, juntamente com o código dipeptidico de aminoácido para cada uma das subunidades. As subunidades que foram adicionadas a cada porção são indicadas em parênteses. Estas porções foram ainda tratadas como se segue:

Porção da parte 17 (X2 = 1-17): O Fmoc-Dab (Boc)-OH foi acoplado (excesso de 5 eq), o grupo protector da cadeia lateral Boc foi removido por TFA/DCM/anisole (50:50:2, 15 min) e após os passos de lavagem, esta porção foi dividida em 17 partes. Os ácidos correspondentes foram acoplados ao grupo amino da cadeia lateral livre através de activação DIC/HOBt convencional.

Porção da parte 8 (X2 = 18-25): O Fmoc-Asp (OBu11)-OH foi acoplado (excesso de 5 eq), o grupo protector da cadeia lateral bu1 foi removido por TFA/DCM/anisole (50:50:2, 15 min) e após os passos de lavagem, esta porção foi dividida em 8 partes. As aminas correspondentes foram acopladas à cadeia lateral de acordo com o processo descrito abaixo.

Porção da parte 5 (X2 = 30-34): Uma solução de Fmoc-IDA-anidrido (10 eq, 0,7 mmol em 2 mL de DMF) foi adicionada à resina e agitada durante 30 min. O processo foi repetido mais 129 uma vez, a resina lavada com DMF e dividida em 5 partes. As aminas foram acopladas de acordo com o seguinte processo.

Segue-se o processo geral para acoplamento de aminas na cadeia lateral, utilizado para ligação das estruturas 18-25 e 30-34: Os grupos carboxilo ligados à resina (0,014 mmol por parte) foram activados por uma mistura de DIC/HOBt (10 eq) em 0,4 mL de DMF durante 30 min. Esta mistura foi removida sem lavagem e foram adicionados 30 eq da amina apropriada em 0,2 mL de DMF. No caso de p-toluidina, foi adicionada uma quantidade equimolar de DIEA para neutralização do cloridrato. A resina foi agitada durante 1 hora e lavada com DMF.

Porções da parte 1 (únicas) (X2 = 26-29, 35, 36): As monoamidas N-protegidas com Fmoc de ácido iminodiacético (para estruturas 26-29) (10 eq, 0,014 mmol por parte) e

Fmoc-Cys(Bzl)-OH e Fmoc-D-Pen(Bzl)-OH (5 eq, 0,07 mmol) foram acoplados por activaçâo de DIC/HOBt às partes únicas, respectivamente.

Processos adicionais para todas as 36 porções: O grupo Fmoc do N-terminal foi clivado por piperidina/DMF. Às subunidades 1-25, 35, 36, foi acoplado Boc-Gly-OH por activaçâo de DIC/HOBt (5 eq, 0,07 mmol por parte). As subunidades 26-34 foram feitas reagir com anidrido simétrico de Boc-Gly-OH (10 eq., 0,12 mmol por parte) em DMF de um dia para o outro. O processo de codificação: Clivagem do grupo protector Lys(Tfa) (idêntico para todas as 36 partes) : A resina foi lavada com água e tratada com 20% de piperidina/H20 (duas vezes, 10+30 min) . As resinas foram depois lavadas com água e DMF. Subsequentemente, o marcador para todas as sequências foi sintetizado por estratégia de Fmoc (activaçâo de DIC/HOBt, 10 eq, 0,14 nmol por parte) sem clivagem do grupo Fmoc protector 130 do N-terminal do marcador. As sequências codificantes para o marcador são mostradas na Figura 8. Todas as 36 porções foram depois recolhidas, misturadas e divididas em duas partes. A apenas uma metade, foi acoplado Boc-Gly após a desprotecção do grupo Boc na cadeia principal. Ambas as partes foram misturadas, grupo protector Boc foi removido e a resina dividida em 13 porções. Os Fmoc-Tyr(Bufc)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr (Bufc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Ser (Bufc)-OH, Fmoc-Glu (OBu1) -OH, Fmoc-Asp (OBut)-OH e Fmoc-Gln-OH (10 eq, 0,38 mmol) foram acoplados por activação de DlC/HOBt a essas 13 porções. Desprotecção da cadeia lateral: os grupos protectores da cadeia lateral Boc- e bufc- foram clivados oir TFA/DCM/anisole (50:50:2) (exposição de 15 min) , o grupo Trt foi clivado pela mesma mistura com adição de 1 gota de 1Pr3SiH durante 15 min. O grupo Pmc foi clivado por mistura K durante 1 hora. Após os passos de lavagem e neutralização (DCM, 7% de DIEA/DCM, DMF), todas as 13 porções foram recolhidas e o grupo Fmoc do N-terminal foi clivado. A biblioteca foi depois lavada com DMF e transferida em 0,1% de HC1 aquoso.

9.1.9 PROTOCOLO DE RASTREIO DA BIBLIOTECA A biblioteca peptídica foi rastreada de acordo com o processo publicado (Lam e Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15). As esferas de péptido foram primeiro misturadas com água bidestilada para remover o DMF. Após lavagem exaustiva com PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM KC1, 4,3 mM de Na2HP04, 1,4 mM de KH2P04, pH 7,2), as esferas foram revestidas de 0,05% de gelatina (p/v) para bloquear todas as ligação não especificas. As esferas foram depois incubadas com 60 pM de anticorpo anti-p-endorfina biotinilado (clone 3-E 7, Boehringer Mannheim) em 2 x PBS/Tween/gelatina de um dia para o outro. Após lavagem 131 exaustiva, foi adicionada estreptavidina-fosfatase alcalina. Uma hora mais tarde, as esferas foram lavadas, o substrato foi adicionado e a revelação da cor prosseguiu como acima descrito. As esferas coloridas foram depois fisicamente isoladas e submetidas a sequenciação.

9.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um andaime não peptidico alternativo é baseado na utilização do triácido de Kemp (Kemp e Petrakis, 1981, J. Org. Chem. 46:5140-5143) (Esquema XV).

ESQUEMA XV 132 COOH ÇOOH ’CH,

CHS

V Ç00* CHj

CH BocNH

(3)

(D

Fmoc

(4)

Fnoc Λ

BocNH

CHj

CHj

Nesta estrutura os três grupos carboxilo estão confinados à conformação triaxial. 0 anidrido ácido 1_ foi preparado por processo de desidratação (Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090) utilizando uma armadilha de Dean-Stark sob azoto. Este anidrido ácido foi aberto através de ataque nucleofilico pela terc-butiloxicarboniletilenodiamina mono produzindo o amidodiácido 2_. O mesmo método para desidratação não é aplicável para este amidodiácido por causa da instabilidade do grupo 133 protector Boc sob estas condições. Uma alternativa suave para preparação do anidrido 3_ de amida, peculiar à química peptídica, foi a utilização do processo comum de diciclo-hexilcarbodiimida em cloreto de metileno. 0 anidrido _3 de amida foi depois aberto através de fluorenilmetiloxicarbonil-etilenodiamina no correspondente diamidoácido £. As etilenodiaminas monoprotegidas foram preparadas partindo de Boc-etilenodiamina que foi preparada por bocilação de etilenodiamina utilizando dicarbonato de terc-butilo (Krapcho et al.r 1990, Synthesis Commun. 20:2559-2564) . A Boc-etilenodiamina mono foi utilizada como tal e também serviu como composto inicial para a preparação do trifluoroacetato de fluorenilmetiloxicarbonil-etilenodiamina mono através de N-Boc-N'-Fmoc-etilenodiamina. O diamidoácido 4_ pode ser utilizado para a síntese de andaime comportando a terceira cadeia contendo grupo protector ortogonal (Ddz, Alloc) e a função carboxilo ou ele próprio como andaime desde que a terceira aleatorização seja feita separadamente. Foi escolhida a utilização de 1 como um andaime para sintetizar a biblioteca totalmente não peptídica. A primeira aleatorização foi feita na cadeia lateral da lisina embora qualquer aminoácido trifuncional possa ser utilizado para este objectivo, e a segunda e terceira aleatorização foram realizadas no andaime. Utilizando este andaime conformacionalmente confinado, foi construída uma biblioteca aleatorizada de não péptido com 20 ácidos carboxílicos diferentes.

Um andaime que mapeia um espaço conformacional maior é uma ligação ramificada simples construída através de acoplamento consecutivo de ácidos diaminocarboxílicos. Os vários tipos de andaime que mapeiam um extenso espaço são andaimes cíclicos ou ramificados flexíveis. Os princípios destas bibliotecas são 134 ilustrados geralmente na Figura 4. 0 Esquema XVI mostra um exemplo especifico dessa biblioteca:

ESQUEMA. XVI fía

Fmoc— CAla—Lys· ‘1 J NpysJ Fmoc — CAla— Lys — Lys-TG,J TTa-

1 CAla—Lys-Lys-TGJ

Dctr- D*- R1— CSAIa-Lys- *1 J Rl— UMa— Lys— CAla— Lys — Lys-TG • J Pmnr_AA1-j

Ί CAla-Lys-Lys-TG J

Fmoc-AA2-AAT

Mpys

Fmoc-AAI-1 Nfys 1

Fmoc— GAla— Lys

Tfe-i R-j — CAla— Lys — CAla— Lys-Lys-TG

RV *3 R1-

' I J CAla — Lys — CAla — Lys — Lys-TG r2j Ddz-PheAA2-AAl~' RJ Ddz-Phe-AA2-AAt-^

Npys-j R3— CAla— Lys -1

CAla— Lys -1 J

R-j — CAla— Lys — (Wa— Lys-Lys-TG CAla— Lys — CAla— Lys — Lys-TG R J AA4-AA3-PheV\A2-AAf-^

I I

R^-J Fmoc-AA3-Pbe-AA2-AA'H A síntese deste andaime requereu a utilização de quatro grupos protectores (ortogonais) independentes. Testou-se a utilização do grupo trifluoroacetilo introduzido na química peptídica nos anos 50 (Schallenbert e Calvin, 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:2779), mas que não foi utilizado devido às duras condições requeridas para a sua desprotecção, assim como devido 135 à sua ineficácia na protecção contra racemização quando utilizado como protecção do grupo α-amino. Verificou-se que este grupo não é clivado durante a desprotecção de Fmoc utilizando 50% de piperidina em dimetilformamida, mas é totalmente clivado por 1 - 2 h de exposição à solução de piperidina (20%) em água, que, contudo, também cliva o grupo Fmoc. A estratégia utilizada na construção desta biblioteca é clara a partir do Esquema XV.

As subunidades não aminoacidicas podem ser combinadas com aminoácidos convencionais. Mostrou-se que esta abordagem pode produzir estruturas de ligação razoáveis através de construção da minibiblioteca de 936 membros, possuindo aminoácidos seleccionados aleatorizados na posição 1, uma ou duas glicinas na posição 2 e 3 e um conjunto de aminas aromáticas acopladas ao grupo β-carboxilo do ácido aspártico ou ácido iminodicarboxílico de cadeia lateral modificada, ou ácidos aromáticos acoplados à cadeia lateral do ácido diaminobutirico na posição 4, ou benzil-halogenetos acoplados à cadeia lateral de aminoácidos contendo enxofre (cisteina e penicilamina). A estrutura da biblioteca é mostrada no Esquema XVII:

ESQUEMA XVII 136 X1-(G)1 _2-X2-<3-pGpG-K-{TÕ (X 2)1-<X2)2 - Xt = Tyr, Trp, Lys, Thr, Hís, Pro, Phef Arg, Asn, Ser, Gfu, Asp, Gin - X2 « Blocos de construção 1-36 - (X2)1*2 ~ Sequência codificante Número total de permutações: 936 A posição 4 que contém a subunidade não aminoacídica, pode criar problemas durante a sequenciação e, deste modo, esta posição foi codificada. Uma vez que foram utilizados mais de 20 blocos de construção na aleatorização, foi utilizado uma estratégia de duplo aminoácido codificante (Figura 8). Para evitar complicações na determinação estrutural, os aminoácidos utilizados para codificação não se sobrepõem ao conjunto utilizado para a aleatorização da posição 1 e aminoácido na posição 2. Utilizando um codão duplo de 6 aminoácidos, podiam ser codificados até 36 blocos de construção diferentes.

Esta minibiblioteca foi rastreada contra um sistema modelo, anticorpo monoclonal anti-p-endorfina. As esferas que reagiram positivamente foram submetidas a três ciclos de degradação de Edman, e as estruturas de interacção deduzidas a partir dos dados obtidos são apresentadas no Esquema XVII. A estrutura do ligando natural para o anticorpo monoclonal anti-p-endorfina é também mostrado no Esquema XVIII: 137

ESQUEMA XVII

Os compostos que foram seleccionados na base da ligação com o anticorpo monoclonal anti^-endorf ina foram sintetizados ligados às esferas e na forma livre e foram determinadas as suas afinidades de ligação. As sequências de esferas ligadas têm 138 mostrado ligação específica (competível por encefalina de leucina) . Como pode ser observado (Esquema XVIII), a ligação ao anticorpo requer dois grupos aromáticos na distância apropriada. A estrutura que liga esses dois grupos aromáticos é, não obstante, muito importante para a afinidade de ligação.

10. EXEMPLO: ACTIVAÇÃO SELECTIVA DE GRUPOS FUNCIONAIS DE SUPERFÍCIE SOBRE UMA ESFERA DE RESINA 0 presente exemplo descreve a preparação de uma partícula de suporte de fase sólida possuindo uma "superfície" da partícula fisicamente separada do "interior" do veículo, e a síntese da estrutura de rastreio na superfície e a molécula codificante dentro da esfera. A superfície neste sentido deve ser compreendida como a porção da esfera acessível à molécula aceitadora macromolecular. A superfície disponível da esfera corresponde aproximadamente à área de superfície calculada com base nas dimensões da esfera para uma molécula aceitadora de peso molecular extremamente elevado. Alternativamente, a área de superfície pode ser determinada através de vários métodos que utilizam a penetração num material (incluindo a superfície interna de todos os poros na esfera polimérica) para moléculas aceitadoras com peso molecular baixo. Compreensivelmente, as moléculas aceitadoras que penetram livremente a rede polimérica não irão reconhecer qualquer diferença entre a superfície e o interior da partícula polimérica. A superfície disponível da partícula inclui também um componente dinâmico.

10.1 MATERIAIS E MÉTODOS

10.1.1 REMOÇÃO DO CONTEÚDO DE SUPERFÍCIE DO PÉPTIDO DA ESFERA DE FASE SÓLIDA 139

Os péptidos modelo (YGGFL, LHPQF, LHPQFYG) foram sintetizados em TentaGel AM (Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha, 0,21 mmol/g) tendo o ligante p-Ala-Gly-p-Ala-Gly ligado a ele. A síntese foi realizada através de técnica de fase sólida convencional utilizando aminoácidos protegidos com Fmoc e diisopropilcarbodiimida na presença de N-hidroxibenzotriazole como um reagente de acoplamento. Os péptidos foram desprotegidos em dois passos utilizando ácido trifluoroacético com captadores (etanoditiol, água e tioanisole), e piperidina (20%) em dimetilformamida. As esferas foram lavadas cuidadosamente e transferidas para tampão de carbonato de amónio a 0,1 M pH 7,7. Foi adicionada quimotripsina (1 mg) e a suspensão foi agitada a 37 °C durante 20 horas. O mesmo tratamento foi repetido duas vezes durante 4 horas. A sequenciação de esferas aleatoriamente seleccionadas de cada grupo mostrou que o conteúdo de péptido sobre as esferas não mudou significativamente.

10.1.2 SÍNTESE DE DIFERENTES PÉPTIDOS NA SUPERFÍCIE E INTERIOR DA ESFERA POLIMÉRICA A resina TentaGel AM (0,21 mmol/g, 1 g) foi modificada através de condensação Boc-Phe. A resina foi lavada e transferida ao tampão de carbonato de amónio a 0,1 M pH 7,7. O tratamento de quimotripsina foi realizado do mesmo modo como acima descrito. Após lavagem cuidadosa pelo mesmo tampão e água, a resina foi lavada com dimetilformamida e foi utilizado o esquema sintético de fase sólida convencional utilizando grupos protectores Fmoc e diisopropilcarbodiimida e N-hidroxibenzotriazole como reagente de acoplamento para a síntese da sequência YGGFL. Após acoplamento de Fmoc-Tyr(But) no último passo de acoplamento, o grupo Fmoc não foi removido e a resina foi tratada com 50% de ácido trifluoroacético em 140 diclorometano. Nos passos sintéticos seguintes, foram utilizados aminoácidos protegidos com Boc. 0 acoplamento foi realizado utilizando o mesmo reagente que acima, o grupo Boc foi removido após cada passo através de 50% de ácido trifluoroacético e o grupo amino protonado foi tornado disponível para o acoplamento através de tratamento com solução de diisopropiletilamina em dimetilformamida (5%) . Os péptidos foram desprotegidos em dois passos utilizando ácido trifluoroacético com captadores (etanoditiol, água e tioanisole), e piperidina (20%) em dimetilformamida. As esferas foram lavadas cuidadosamente e preparadas para coloração com anti-p-endorfina como descrito anteriormente. A coloração das esferas era indistinguível da coloração das esferas contendo apenas a sequência YGGFL.

10.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foi utilizada uma enzima para clivar selectivamente um péptido da superfície de uma esfera. As sequências de teste YGGFL e LHPQFYG foram preparadas e incubadas com quimotripsina e a reactividade das esferas foi testada.

As esferas tratadas foram testadas para ligação a anti-β-endorfina e estreptavidina. Os resultados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

Ligação às Esferas Após Tratamento com Quimotripsina

Ligação a 141 Péptido sobre a Esfera

Anticorpo Sem CT 3+

Estreptavidina + CT Sem CT

+ CT

YGGFL

LHPQF 3+ 2+ 3+

LHPQFYG CT = quimotripsina

As esferas com YGGFL perderam totalmente a actividade de ligação ao anticorpo anti-p-endorfina (Tabela 5) . As esferas contendo LHPQF-YG também perderam totalmente a actividade com estreptavidina. Contudo, a diminuição na quantidade total de LHPQF-YG ou YGGFL foi minima, indicando nenhum efeito no interior da esfera. Neste caso, uma vez que LHFQF era um substrato pobre para a quimotripsina foi utilizado o ligante YG. A degradação de Edman mostrou que o conteúdo do péptido sobre as esferas não mudou significativamente.

Com base nestes resultados preliminares, a quimotripsina foi utilizada como um reagente desprotector selectivo. Um substrato simples para a quimotripsina, Boc-Phe, foi sintetizado em todos os grupos amino disponíveis do veículo sólido. A incubação desta resina modificada sob várias condições conduziu à libertação de aproximadamente a mesma quantidade de Boc-Phe: 1,1%. 0 grupo amino desprotegido foi utilizado para a síntese de YGGFL utilizando a estratégia Fmoc. A síntese foi seguida por medição quantitativa da libertação de Fmoc, e as leituras confirmaram que aproximadamente 1% de grupos amino disponíveis foram utilizados para a síntese. 0 grupo protector Boc dos restantes grupos amino em cada esfera foi clivado por TFA e a sequência LHPQF foi montada utilizando a síntese Boc. Todos os grupos protectores foram removidos e o teste revelou reacção positiva tanto com anti-p-endorfina como estreptavidina. 142

As esferas aleatoriamente seleccionadas foram submetidas a degradação de Edman e os seguintes resultados foram obtidos (valores em pmoles) : Io ciclo: L 114, Y <1; 2o ciclo: H 86, G <1; 3o ciclo: P 94, G <1; 4o ciclo: Q 78, F 4 (previsão); 5o ciclo: F 73, L <1. A análise de degradação de Edman mostra a sequência LHPQF no nivel de 100-120 pmoles por ciclo, e conteúdo insignificante de aminoácidos esperados para a sequência YGGFL. Isto significa que embora YGGFL não esteja presente no interior da esfera, este está disponível na superfície da esfera para interacção com o aceitador relevante. LHPQF está também ainda disponível para interacção com estreptavidina. Isto é devido provavelmente ao baixo peso molecular da estreptavidina, permitindo que esta penetre dentro da esfera polimérica.

10.3 DISCUSSÃO O presente Exemplo demonstra claramente que uma enzima pode desproteger selectivamente a superfície, mas não o interior, de uma esfera de resina. Neste caso, a clivagem pela quimotripsina da sequência LHPQFYG prosseguiu eficientemente. A ligação da estreptavidina, que é específica para LHPQF, foi totalmente repelida.

Experiências subsequentes com esferas derivatizadas com substrato Boc-Phe mostraram que dois péptidos diferentes podem ser sintetizados numa esfera, com um péptido segregado principalmente à superfície e o outro péptido segregado principalmente no interior. 143

11. EXEMPLO: BLOQUEAMENTO PREFERIDO DOS GRUPOS AMINO LIVRES NA SUPERFÍCIE DE UMA ESFERA DE TENTAGEL 0 presente Exemplo demonstra a praticabilidade do bloqueamento da superfície de uma esfera de resina enquanto se deixa os grupos funcionais no interior da esfera livres para reacção e síntese de um composto, por exemplo, uma molécula codificante.

11.1 MATERIAIS E MÉTODOS A resina de amida TentaGel AM (substituição de 0,3 meq/grama) foi hidratada em H20 durante diversas horas, e lavada com tampão de ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico (MES) a 0,1 M, pH 5,7. Uma quantidade variável (0 a 10 mg) de ácido poliglutâmico (Mr. 30.000, Sigma Chemical) foi adicionada a cada um dos 0,2 mL de esfera depositada. Foram depois adicionados sessenta mg de l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida-HCl (EDC) a cada tubo. As misturas de reacção foram agitadas cuidadosamente de um dia para o outro. As esferas foram depois lavadas em H20 bidestilada (dd) e foram adicionados 0,24 mmol de etanolamina mais 60 mg de EDC em tampão MES a cada amostra. Após 4 horas de agitação suave, a resina foi lavada exaustivamente com dd H20. A resina foi depois liofilizada até à secura. A resina tratada foi inchada em dimetilformamida (DMF). Utilizando química Fmoc, o péptido YGGFLGGG foi sintetizado em cada uma das amostras tratadas de resina utilizando técnicas convencionais. O grupo Fmoc do N-terminal e grupos protegidos da cadeia lateral foram removidos com piperidina e ácido trifluoracético como descrito (Lam et al., 1991, Nature 354:82-84). Após neutralização com diisopropiletilamina (DIEA), as esferas de resina foram lavadas exaustivamente e as esferas preparadas para 144 coloração com anti-p-endorfina como descrito na Secção 10. supra. 11.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO A capacidade para bloquear grupos funcionais de superfície numa esfera de resina com ácido poliglutâmico foi directamente proporcional à quantidade de ácido poliglutâmico utilizada (Tabela 6). Significativamente, a resina bloqueada com ácido poliglutâmico corou apenas levemente, sugerindo que a maioria dos grupos amino de superfície foram bloqueados antes da do péptido YGGFLGGG. Mais importante, contudo, foi que a quantidade de péptido tanto na resina bloqueada como não bloqueada foi aproximadamente a mesma (Tabela 7) indicando que o bloqueamento do ácido poliglutâmico ocorreu apenas na superfície da esfera, e que os grupos amino livres dentro das esferas permaneceram intactos para síntese peptídica subsequente.

Tabela 6

Coloração Semi-Quantitativa de Péptido-Esferas

Extensão de

Marcação com Biotinil- Marcação apenas

Bloqueamento: Ácido Anti-p-Endorfina Poliglutâmico, mg por Seguida por 0,2 mL de Resina Estreptavidina-AP com

Estreptavidina-AP 0 3+ 0,016 3+ 145 0,08 2+ - 0,04 1+ - 2,0 1+ - 10 Vestígios — Tabela 7

Micro-Sequenciação pmole de aminoácido (10 esferas/experiência)* Y G G F L G G G Ácido Poliglutâmico I 609, 609, 692, 665, 579, 657, 675, 655 (10 mg) II 996, 885, 839, 772, 696, 522, 550, 506 Sem I 876 752, 752, 774, 680, 733, 707, 717 Bloqueamento II 519, 534, 332, 559, 471, 540, 550, 335

Experiências adicionais envolveram o acoplamento reversível de polímero sobre o qual Boc-Glu foi ligado através do seu grupo α-carboxilo. Após o acoplamento deste polímero modificado na superfície da esfera e modificação apropriada do grupo amino "interior", foi clivado o grupo Boc do ácido glutâmico. As esferas foram depois tratadas com um ciclo de degradação de Edman que regenerou grupos amino que tinham sido protegidos pelo reagente polimérica de ácido glutâmico. Foram sintetizados péptidos diferentes em partes separadas da esfera, í. e., na superfície e interior. A presente invenção não é para estar limitada no âmbito pelas formas de realização específicas aqui descritas. De facto, 146 várias modificações da invenção para além daquelas aqui descritas tornar-se-ão evidentes aos especialistas na técnica a partir da descrição anterior e figuras anexas. Essas modificações pretendem enquadrar-se dentro do âmbito das reivindicações anexas. São aqui citadas várias publicações, cujas divulgações são incorporadas na sua totalidade por referência.

12. EXEMPLO: SUBUNIDADES ADEQUADAS PARA A CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS NÃO PEPTÍDICAS A construção de bibliotecas não peptidicas requer a selecção de subunidades adequadas para inclusão na síntese de fase sólida. 0 presente exemplo é relativo à selecção de subunidades adequadas para três metodologias químicas diferentes.

12.1 ACILAÇÃO DE GRUPO AMINO PRIMÁRIO

Protocolo Experimental: Um mmol de ácido foi dissolvido em 2 mL de DMF, 0,5 mmol de DIC adicionado (1 mmol na caso de ácidos dicarboxílicos) e feitos reagir com aproximadamente 100 mg de Trp-RAM-TG de um dia para o outro. A conclusão da reacção foi avaliada através do teste de Kaiser. A resina foi depois lavada com DMF, DCM, seca. O produto foi clivado por exposição de uma hora a 1 mL de 95% de TFA, 5% de água. A 147 mistura de reacção foi depois diluida com 5 mL de água e analisada por HPLC e MS.

Os requisitos para aceitação eram que os produtos tivessem o P.M. previsto e que o conteúdo do principal produto numa mistura em bruto fosse mais de 80% da área total sob a curva do cromatograma de HPLC e que o principal produto tivesse o peso molecular previsto. A Tabela 8 apresenta os resultados dos testes de 33 ácidos. Dos 33, 7 foram rejeitados como inadequados para utilização. Mais dois compostos, ácido 4-hidroxibenzóico e ácido 4-hidroxifenilacético, eram incompatíveis com mono-síntese utilizando triptofano mas verificou-se serem úteis em experiências de modelos diferentes utilizando o grupo N“-amino da lisina (Fmoc). TABELA 8 - Acilação de Grupo Amino Primário Ácido Solubi lidade Kaiser HPLC PM MS Selec- cionado γ-Guanidinobutírico Boa Boa 330 Boa Sim Succinâmico Boa Boa 302 Boa Sim 1-Naftilacético Boa Boa 371 Boa Sim Difenilacético Boa 2 picos 397 Boa Sim Bifenilacético Boa Boa 397 Boa Sim Pentafluorofenilacético Boa “ Boa 411 Boa Sim (continuação) TABELA 8 - Acilação de Grupo Amino Primário Ácido Solubi- Kaiser HPLC PM MS Selec- lidade cionado 4-Trifluorometilbenzóico Boa “ Boa 375 Boa Sim 4-Hidroxibenzóico Boa (+) 323 Não Sim boa 4-Hidroxifenilacético Boa - Boa 337 Não Sim boa 148 3-Nitrofenilacético Boa + 2 picos 366 Boa Sim 4-Metoxibenzóico Boa 2 picos 337 Boa Não 2-Nitro-4,5-dimetoxibenzóico Boa Boa 412 Boa Sim 3-(3,4,5-trimetoxifenil)-propiónico Boa Boa 425 Boa Sim 4-Guanidinobenzóico Boa ++ 2 picos 364 Boa Sim 4-Dimetilaminobenzóico Boa + Boa 350 Boa Sim 4-(Pirrolo-l-il)benzóico Boa Não boa 372 Não boa Não 4-(3-Metil-5-oxo-2-pirazolin-l-il)benzóico calor Verme lho Boa 403 Boa Sim 2-Pirrolocarboxílico Boa ( + ) Boa 296 Não boa Não l-Metil-2- pirrolocarboxílico HOBt, calor ++ Não boa 310 Não 1,4-Dimetil-2,3-pirrolodicarboxílico Boa ( + ) Boa 382 Boa Sim 2-Metil-4-nitro-l- imidazolopropiónico Boa Boa 384 Boa Sim 2-Amino-l- imidazoloacético HOBt, calor ++ Não boa 328 Sim 2-Pirazolocarboxilico Boa Não boa 297 Não 3-amino-l,2,4-triazolo-5- carboxílico 313 Sim 4-imidazoloacético calor ++ Boa 311 Boa Sim (continuação) TABELA 8 - Acilação de Grupo Amino Primário Ácido Solubi lidade Kaiser HPLC PM MS Selec- cionado i-nicotinico HOBt, calor* 308 Não 2-Hidroxi-i-nicotínico Boa ( + ) Não boa 324 Não 149 2,3-Piridinodicarboxílico Boa 2 picos 352 Boa Sim 2-Pirazinocarboxílico calor Boa 309 Boa Sim 2,3-Pirazinodicarboxílico Boa Boa 353 Boa Sim l-Metilindolo-2-carboxílico Boa Boa 360 Boa Sim 2-Metil-3-indoloacético Boa Boa 374 Boa Sim Indolo-4-carboxílico Boa ” Boa 346 Boa Sim * Precipitado após arrefecimento

12.2 DESLOCAMENTO NUCLEOFÍLICO DE HALOGÉNEO POR AMINAS

Protocolo Experimental: 0 ácido bromoacético (excesso molar de 5x) foi acoplado através de anidridos simétricos a TG130 durante 10 min, reacoplado durante 10 min. utilizando o mesmo método. A amina de teste foi acoplada utilizando uma solução a 1 M em DMSO, de um dia para o outro. Após lavagem adequada o Fmoc-Gly foi acoplado (HOBt, DIC) durante 1 hora, o grupo Fmoc removido, e a libertação de Fmoc calculada e comparada com uma libertação teórica de 45 ymol/mL. Num segundo conjunto de experiências, a pureza e identidade dos produtos foram testadas através da síntese de compostos modelo R-NH-CH2-CO-Gly-Trp-RAM-TG, sintetizados através de um protocolo semelhante e clivados da resina com 1 mL de 95% de TFA, 5% de água durante 1 hora, seguido por diluição com cerca de 5 mL de água para realizar HPLC e MS analítica.

Um total de 33 aminas foram testadas, das quais 21 se verificou serem aceitáveis para incorporação na síntese de fase sólida. Os resultados destes estudos são apresentados abaixo. TABELA. 9 - Deslocamento Nucleofílico de Halogénio por Aminas

Amina PM Fmoc HPLC MS Selec- cionada 150

Etilamina 45,08 31 Boa Boa Sim i-Propilamina 59,11 27 Boa Boa Sim Butilamina 73,14 41 Boa Boa Sim i-Butilamina 73,14 24 Boa Boa Sim t-Butilamina 73,14 4 * * Não Ciclopentilamina 85,15 28 Boa Boa Sim Ciclo-hexilamina 99,18 24 Boa Boa Sim 2-Amino-norbonano 111,19 35 Boa Boa Não Etanolamina 61,08 31 Boa Boa Sim 3-Aminopropanol 75,11 40 Boa Boa Sim l-Amino-2-propanol 75,11 43 Boa Boa Sim 2-Metoxietilamina 75,11 26 Boa Boa Sim Tetra-hidrofurfurilamina 101,15 27 Boa Boa Não B-Ala-OtBu 181,6 22 Boa Boa Sim Etilenodiamina(Boc) 120 29 Boa Boa Sim 2-(2-Aminoetil)-1- 128,1 35 Boa Boa Sim metilpirrolidina 1-Aminopiperidina 100,17 2,2 -k -k Não l-Amino-4-metilpiperizina 115,0 20 Não Não Não boa boa 4-Aminomorfolina 101,14 3 ~k ~k Não Benzo-hidrilamina 183,25 12,5 Não Não Não boa boa Nafataleno-metilamina 157,22 24,7 Boa Boa Sim 2-Aminoindano 169,96 0 ~k ~k Não 4-(Trifluorometil)-benzilamina 175,16 29 Boa Boa Sim 2-Amino-l-fenil-etanol 137,18 29 Boa Boa Sim Tiramina 137,18 27 Boa Boa Sim 4-Metoxi-benzilamina 137,18 34 Boa Boa Sim 3,5-Dimetoxi-benzilamina 167,21 31 Boa Boa Sim (continuação) TABELA 9 - Deslocamento Nucleofílico de Halogénio por Aminas Amina PM Fmoc HPLC MS Selec- cionada 4-(Dimetilamino)-benzilamina 150,22 Não solúvel em DMSO Não 2,4-Dinitrofenil-hidrazina 198,0 5 ~k ~k Não 151

Anilina 93,18 1,2 * * Não p-Toluidina 143,0 7,0 ★ * Não p-Anisidina 123,15 2,8 •k -k Não * Amina, com baixa libertação de Fmoc. A experiência foi repetida e se a baixa libertação de Fmoc voltou a ocorrer, a amina foi excluída de mais experiências.

12.3 ALQUILAÇÃO REDUTIVA

12.3.1 MÉTODOS GENERALIZADOS

Protocolo Experimental: foi adicionado um excesso molar de 20 de aldeídos de teste a cerca de 100 mg de (Exp. A) H-Gly-RAM-TG ou (Exp. B) H^Ala-Gly-Trp-RAM-TG inchado em 1 mL de MeOH-DCM-AcOH 40:10:1, e a reacção foi deixada prosseguir de um dia para o outro. A resina foi lavada com 1% de AcOH em DMF e depois re-exposta a um excesso molar de 20 de aldeído de teste de um dia para o outro. Posteriormente, a resina foi lavada com MeOH-DCM-AcOH 40:10:1, e a 1 mL desta mistura foi adicionado um excesso molar de 20 de NaBH3CN e deixada reagir de um dia para o outro. A resina foi depois lavada com DMF/1% de AcOH, e foi adicionado um segundo excesso molar de 20 de NaBH3CN para uma reacção de um dia para o outro. Após lavagem, todas as amostras foram aciladas com Fmoc-Gly. Na Exp. A, após remoção do Fmoc, o produto foi acilado com Fmoc-Trp. A resina foi depois tratada para remover o Fmoc, lavada com DMF, DCM, seca, o produto foi depois clivado com 1 mL de 95% de TFA, 5% de água durante 1 hora. Após diluição com cerca de 5 mL de água, foram realizadas HPLC e MS analíticas.

Foi testado um total de 31 aldeídos de teste para determinar a sua adequabilidade para inclusão na síntese de fase sólida. Os 152 resultados, apresentados na Tabela 10 indicam que 19 destes eram aceitáveis. TABELA 10 - Alquilação Redutiva Aldeído Kaiser HPLC PM MS Selec- cionado Experiência "A" Butiraldeído castanho Não boa Não 2-Metilbutiraldeído azul claro Boa 387 Boa Sim 2-Etilbutiraldeído castanho Boa 401 Boa Sim Trimetilacetaldeído castanho Boa 387 Boa Sim i-Valeraldeído castanho Não boa Não 2-Metilvaleraldeído azul claro Boa 401 Boa Sim 3-Metiltiopropionaldeído azul claro Não boa Não Ciclo-hexanocarboxialdeído azul claro Boa 413 Boa Sim 5-Noorborneno-2- carboxialdeído castanho Não boa Não Benzaldeído castanho Boa 407 Boa Sim 4-Nitrobenzaldeído castanho Boa 452 Boa Sim 4-Hidroxibenzaldeído azul claro Boa 423 Boa Sim Hidrocinamaldeído castanho Não boa Não Vanilina castanho Boa 453 Boa Sim 2-Tiofenocarboxialdeído azul claro Boa 413 Boa Sim Imidazolo-2-carboxialdeído castanho Não Boa Não Piridina-4-carboxialdeído castanho Boa 408 Boa Sim a,a,c(-Trifluoro-o- tolualdeído castanho Boa 475 Boa Sim TABELA 10 - Alquilação Redutiva (continuação) Aldeído Kaiser HPLC PM MS Selec- cionado Experiência "B" 4-Dimetilaminobenzaldeído castanho Não boa Não 4-Metoxibenzaldeído castanho Boa 507 Boa Sim 153 2,4,6-Trimetoxibenzaldeído castanho Não boa Não Indolo-3-carboxialdeído castanho Não boa Não l-Acetilindolo-2- carboxialdeído castanho Boa 559 nd Sim 4-Carboxibenzaldeído azul claro Boa 522 Não boa Não β-naftaldeído castanho Boa 528 Boa Sim Fenilacetaldeído castanho Não boa Não 4-Fenilbenzaldeído castanho Boa 554 Boa Sim 3-Fenoxibenzaldeído castanho Boa 570 Boa Sim Pirrolo-2-carboxialdeído castanho Não boa Não 2-Hidroxibenzaldeído castanho Boa 494 Boa Sim Quinolino-4-carboxialdeído azul Não boa Não

12.3.2 MÉTODOS ESPECÍFICOS O que se segue proporciona processos especificamente adequados para a subunidade a ser adicionada. A sequência β-Ala-Gly-Trp foi montada RAM-TG (subst. 0,2 mmol/g). O grupo amino terminal foi depois alquilado utilizando o processo de aminação redutiva com um conjunto de aldeídos alifáticos, aromáticos e heterocíclicos. Os péptidos N-alquilados foram separados da resina utilizando 95% de TFA - 5% de H20 e a pureza e o correcto peso molecular dos compostos resultantes foram confirmados utilizando HPLC e espectroscopia de massa.

Processo 1

Mistura de solventes 1 diclorometano-metanol-ácido acético a 80:20:1

Mistura de solventes 2 dimetilformamida-ácido acético a 100:1 154

Formação da base de Schiff: A 50 mg de Η-β-Ala-Gly-Trp-TentaGel S RAM lavada 3x com mistura de solventes 1 foram adicionados 200 pL desta mistura e 0,2 mmol de aldeído. A resina foi agitada durante 2 horas, depois lavada 3x com mistura de solventes 2. Foram adicionados mais 0,2 mmol de aldeído conjuntamente com 200 pL de mistura de solventes 2 e após 2 horas a agitar, a resina foi lavada 3x com mistura de solventes 2 e 3x com mistura de solventes 1.

Redução da base de Schiff: A uma péptido-resina lavada foram adicionados 200 pL de mistura de solventes 1 e 200 pL de solução a 1 M de NaBH3CN em dimetilformamida. A resina foi agitada durante duas 2 horas, depois lavada com mistura de solventes 2 e a redução repetida nesta mistura com 200 pL de solução a 1 M de NaBH3CN em DMF durante mais 2 horas. A resina foi depois lavada com DMF, DCM, seca e o péptido foi clivado utilizando TFA-5% de h2o.

Protocolo 1 lavar 3x com mistura de solventes 1 adicionar 200 pL de mistura de solventes 1 adicionar 0,2 mmol de aldeído agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 adicionar 200 pL de mistura de solventes 2 adicionar 0,2 mmol de aldeído agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 lavar 3x com mistura de solventes 1 adicionar 200 pL de mistura de solventes 1

adicionar 200 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF 155 agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 adicionar 200 pL de mistura de solventes 2 adicionar 200 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF agitar durante 2 horas

Processo 2 A formação da base de Schiff segue o processo A. A redução da base de Schiff segue o processo A, com a diferença que durante ambos o passo de redução foi adicionado 0,01 mmol de aldeido conjuntamente com reagente de redução.

Protocolo 2

Lavar 3x com mistura de solventes 1 adicionar 200 pL de mistura de solventes 1 adicionar 0,2 mmol de aldeido agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 adicionar 200 pL de mistura de solventes 2 adicionar 0,2 mmol de aldeido agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 lavar 3x com mistura de solventes 1 adicionar 200 pL de mistura de solventes 1

adicionar 200 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF adicionar 0,01 mmol de aldeido agitar durante 2 horas lavar 3x com mistura de solventes 2 adicionar o 200 pL de mistura de solventes 2

adicionar o 200 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF 156 adicionar 0,01 mmol de aldeído agitar durante 2 horas

Processo 3 (reacção num só vaso) A 50 mg de péptido-resina lavada com mistura de solventes 2 foi adicionado 200 pL desta mistura e 0,05 mmol de aldeído. Após 1 hora de agitação, foram adicionados 50 pL de solução a 1 M de NaBHs em DMF e a resina foi deixada a agitar durante 2 horas. Depois, foram adicionados mais 50 pL do reagente redutor e após 2 horas a agitar foi adicionada uma terceira porção (50 pL) de solução a 1 M de NaBH3CN em DMF. A resina foi agitada de um dia para o outro e depois processada como acima.

Protocolo 3 lavar 3x com mistura de solventes 2 adicionar 200 pL de mistura de solventes 2 adicionar 0,05 mmol de aldeído agitar durante 1 hora

adicionar 50 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF agitar durante 2 horas

adicionar 50 pL de NaBH3CN a 1 M em DMF agitar durante 2 horas

adicionar 50 pL de NaBH3CN a 1 M agitar de um dia para o outro TABELA. 11 - Aminação Redutiva Aldeído (P.M.) Protoc. MS (MH+) benzaldeído (421,2) 1 Boa (422,2) 2-hidroxibenzaldeído (437,2) 1 Boa (438,2) 157 4-hidroxibenzaldeído (437,2) 1 Boa (438,2) 4-hidroxibenzaldeído (451,2) 3 Boa (438,2) 3-metoxi-4-hidroxibenzaldeído (467,2) 1 Boa (468,2) 4-nitrobenzaldeído (466,3) 1 Boa 467,3) 2-naftaldeído (471,3) 1 Boa (472,3) 3-fenoxibenzaldeído (513,3) 1 Boa (514,3) 4-fenilbenzaldeído (497,3) 1 Boa (498,3) 2-tolualdeído (435,2) 1 Boa (436,2) 2-trifluorometil-benzaldeído (489,3) 2 Boa (490,3) 1,3,5-trimetoxibenzaldeído (511,3) 1 Boa (512,3) ciclo-hexanocarboxialdeído (427,2) 2 Boa (428,2) 2-etilbutiraldeído (415,2) 2 Boa (416,2) 2-metilbutiraldeído (401,2) 2 Boa (402,2) 2-metilpropionaldeído (387,2) 2 Boa (388,2) 2-metilvaleraldeído (415,2) 2 Boa (416,2) trimetilacetaldeído (401,2) 2 Boa (402,2) quinolino-4-carboxialdeído (472,3) 3 Boa (402,2) tiofeno-2-carboxialdeído (427,2) 3 Boa (428,2)

13. EXEMPLO: CODIFICAÇÃO NÃO SEQUENCIAL DE UMA BIBLIOTECA

Testou-se a codificação não sequencial utilizando tanto um composto de teste modelo como através da construção de uma biblioteca não peptidica.

13.1 INSTROMENTOS, MATERIAIS E PROCESSOS

Instrumentação: Foram realizadas HPLC analítica e preparativa num sistema modular Hitachi utilizando colunas C-18 Vydac (0,46 x 250 mm, 5 ym, caudal 1 mL/min) e Vydac (10 x 250 mm, 10 ym, caudal 3 mL/min), respectivamente. 158

Materiais: Salvo indicação em contrário, foram utilizados solventes de grau comercial sem purificação adicional. A resina TentaGel (TG) (0,21 mmol/g) foi recebida da Rapp-Polymere (Tubingen). Os aminoácidos protegidos foram obtidos da Bachem (Torrance, Califórnia), Advanced ChemTech (Louisville, Kentucky) ou Propeptide (Vert-le-Petit, França).

Mais de 100 subunidades codificantes foram sintetizadas no suporte de fase sólida. Foram utilizados como blocos de construção básicos a lisina, ornitina, ácidos diaminobutirico e diaminopropiónico. O Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Orn(Boc), Fmoc-Dab (Boc) e Boc-Dap(Fmoc) foram acoplados primeiro a amino TentaGel (0,21 mmol/g) através do processo habitual de DIC/HOBt. Após remoção da protecção da cadeia lateral, os ácidos carboxilicos modificados foram acoplados às cadeias laterais desprotegidas utilizando o processo de DIC/HOBt, anidridos simétricos ou cloretos de acilo. Todos os novos aminoácidos codificantes sintetizados foram totalmente desprotegidos e submetidos a degradação de Edman num Sequenciador de Proteína da Applied Biosystems ABI 477A. Os tempos de retenção de novos PTH-AA foram determinados utilizando um Analisador da Applied Biosystems ABI 120A com uma coluna Brownlee PTH-222 (PTH C-18, 5 mícron, 220 x 2,1 mm) . Tampões de HPLC: A - 0,01 M de NaOAc, B - acetonitrilo; gradiente: 0,0-0,4 min - 8% de B, 0,4- -38,0 min - 8-60% de B, 38,0-40,0 min - 60-90% de B; caudal 230 pL/min. Os picos foram detectados a 269 nm. A tabela 14 lista as subunidades codificantes individuais e indica 0 sistema de numeração através do qual são aqui referidas.

13.2 SÍNTESE DE SEQUÊNCIAS MODELO

As sequências de composto de teste preparadas foram Tyr-Gly-Ala-Phe e Phe-Gly-Ala-Phe, codificadas por aminoácidos duplos 159 (ver Esquema XIC), e Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu e Phe(Cl)-Gly-Gly-Phe-Leu (codificadas por codificação do Esquema XIB). Estas sequências foram seleccionadas porque Tyr-Gly-Ala-Phe pode ser detectada utilizando um anticorpo anti-p-endorfina como a molécula aceitadora e Phe-Gly-Ala-Phe é um controlo negativo. Além disso, a fidelidade e codificação puderam ser confirmadas através de sequenciação directa dos péptidos de teste.

13.2.1 MATERIAIS E MÉTODOS 0 objectivo da sintese de péptidos modelo não foi para demonstrar um método de sintese de biblioteca, mas antes para demonstrar a fidelidade da codificação. Deste modo, a sintese não foi realizada em passos sucessivos de acoplamento da subunidade de teste AA seguida por um par de subunidades codificantes, mas utilizando antes o esquema mais conveniente descrito abaixo. 0 veiculo polimérico (TentaGel, 100 mg, 0,21 mmol/g, tamanho de partícula médio de 90 um) sobre o qual a sequência Boc-Ala-Gly-Val-Phe-bAla-Gly-bAla-Gly foi previamente sintetizada e que se tinha submetido a tratamento de quimotripsina para diferenciar a superfície do interior através de clivagem de Phe (7 mg de quimotripsina em 30 mL de tampão Tris a 0,1 M, pH 7,6 em 0,1 M de CaCl2, 14 horas a 37 °C) foi inchado em dimetilformamida (DMF) (volume inchado de 0,5 mL), dividido em duas seringas de polipropileno equipadas com discos fritados de polipropileno (Krchnak & Vagner, 1990, J. Pept. Res. 3:182-193), foi acoplado Fmoc-Phe (3 equivalentes relativamente a todos os grupos amino teoricamente disponíveis) através de diisopropilcarbodiimida (DIC) (3 equivalentes) na presença de N-hidroxibenzotriazole (HOBT) (3 equivalentes) em DMF. Após o desaparecimento da coloração azul (Krchnák et al., 1988 Coll.

Czech. Chem. Commun. 53:2542), a resina foi lavada (5x DMF) e o grupo Fmoc foi removido através do tratamento de 50% de 160 piperidina em DMF (10 min) . Após lavagem por DMF (5x) e 2% de HOBT em DMF (lx), foi acoplado o aminoácido seguinte. Desta forma, a alanina, glicina e tirosina foram ligadas à resina na primeira seringa, e a alanina, glicina e fenilalanina foram ligadas à resina na segunda seringa. O grupo Fmoc foi removido como acima e após lavagem com DMF, a resina foi tratada com a solução (0,4 M) de 2-clorobenziloxicarbonilsuccinimida em DMF de um dia para o outro (após 3 h, foi adicionado um equivalente de diisopropiletilamina) . O grupo Boc foi clivado com 50% de ácido trifluoroacético (TFA) em DCM (1 mais 20 min) . Após lavagem com DCM (3x) e DMF (4x), a resina foi neutralizada por lavagem com 10% de diisopropiletilamina em DMF, lavada por DMF (3x) e foi acoplado Fmoc-Lys (Dde) (3 eq) por acção de DIC e HOBT (3 eq cada) em DMF (2 h) . A resina foi lavada com DMF (5x) e o grupo Fmoc foi clivado por 50% de piperidina em DMF (20 min) , e a resina foi lavado por DMF (3x). A mistura de aminoácidos codificando para a fenilalanina na posição quatro da estrutura do composto de teste (Boc-Sar e Boc-Asp(OBzl) numa proporção molar de 1:1 (reflectindo a sua reactividade de acoplamento relativamente equivalente que tinha sido previamente determinada experimentalmente) foi acoplada utilizando DIC e HOBT (3 eq cada). A reacção foi monitorizada através do método do azul de bromofenol. A resina foi lavada por DMF (5x) e o grupo Dde foi desprotegido por 2% de hidrato de hidrazina em DMF (10 min) . A resina foi lavada por DMF (5x) , 2% de HOBT em DMF, e Fmoc-Lys (Dde) foi acoplado, e o grupo Fmoc removido. O processo de acoplamento de misturas de aminoácidos Boc e Fmoc-Lys(Dde) foi repetido duas vezes (acoplando as misturas de subunidade codificante de Ile e Vai (2:1) e Lys(ClZ) e Glu(OBzl) (1,5:1)) e após desprotecção do grupo Dde, foi acoplado Boc-Lys(Fmoc) à resina em ambos as seringas. O grupo Fmoc foi desprotegido como acima e após lavagem por DMF (5x) , a mistura de anidridos butirico e propiónico (1:1 na presença de um equivalente de trietilamina) foi utilizada para acilação do grupo amino livre 161 na primeira seringa e a mistura de ácido 4-fenilbutírico e ácido 3-fenilpropiónico foi acoplada à resina na segunda seringa por acção de DIC e HOBT. A resina foi depois desprotegida por aplicação da mistura de TFA (82,5%), p-cresole (5%), tioanisole (5%), água (5%) e etanoditiol (2,5%) (mistura K, (King, D. et ai., 1990, Int. J. Pep. Prot. Res. 36:255-266) durante 2 horas e lavada por DMF (4x) e 0,1% de HC1 em água (5x) .

13.2.2 COMPOSTOS MODELO YGAF E FGAF CONSTRUÍDOS COM CODIFICADOR

Os dois péptidos modelo foram sintetizados na superfície de um suporte de fase sólida de poliestireno, enxertado com polioxietileno "raspado" (TentaGel). As moléculas codificantes foram sintetizadas no interior do suporte TentaGel e, deste modo, não se podiam ligar ao anticorpo anti-p-endorfina. A ligação diferencial selectiva do composto de teste de controlo positivo foi validada utilizando cada construção de composto de teste/esfera isoladamente, ou como uma mistura de ambas as sequências, ou após adição de um pequeno número de esferas específicas a uma biblioteca de compostos.

Foi construído um código não sequencial numa estrutura básica de polilisina. O código foi como se segue:

Passo Subunidade Unidade codificante 4 Phe butiril-lisina, proprionil-lisina 4 Tyr φ-butiril-lisina, cp-propionyl-lisina 3 Gly Glu, Lys 2 Ala Vai, Ile 162 1

Phe

Asp, Sar

Os suportes positivos foram seleccionados após exposição ao anticorpo anti-p-endorfina. Um ciclo de degradação de Edman identificou as esferas positivas como YGAF devido à libertação de derivados de cp-butiril-lisina, φ-propionyl-lisina. Uma vez que a sequência do composto de teste estava presente apenas na superfície da esfera, e isto atingiu aproximadamente 2% da quantidade total de moléculas ligadas à esfera, o sinal da tirosina detectado no primeiro ciclo (em que todas as subunidades de aminoácidos codificantes foram também clivadas) foi extremamente pequeno. Para confirmar que se tinha de facto detectado as esferas apropriadas, a sequenciação foi repetida com 30 esferas reunidas para amplificar o sinal. Neste caso quatro ciclos de sequenciação revelaram directamente a sequência do composto de teste YGAF.

13.3 SÍNTESE DA BIBLIOTECA BASEADA EM ÁCIDO DIAMINOBENZÓICO COM CODIFICAÇÃO DIGITAL

Uma biblioteca baseada no ácido diaminobenzóico foi sintetizada e codificada com um código não sequencial. O esquema sintético desta biblioteca é apresentado no Esquema abaixo. Uma lista de aminoácidos utilizados no primeiro passo de acoplamento e dos ácidos utilizados nos passos, dois e três, de acoplamento aos grupos amino do andaime de ácido diaminobenzóico é apresentada na Tabelas 12 e 13, respectivamente. Cada tabela proporciona também as unidades codificantes correspondentes a 163 cada espécie de subunidade de composto de teste. As unidades codificantes na Tabela 13 são indicadas através de dois dígitos, e. g., 3/1, cujos significados químicos são definidos na Tabela 14 . A sequenciação de diversas esferas aleatoriamente escolhidas desta biblioteca confirma a possibilidade de um passo de descodificação por degradação de Edman.

13.3.1 MATERIAIS E MÉTODOS A síntese foi realizada em resina TentaGel (90 ym, 0,2 mmol/g). Desprotecçâo de Fmoc: 50% de piperidina em DMF, 10 min, lavagem com DMF 6 vezes, recolher todas as lavagens, medir a absorvência a 302 nm, calcular a libertação de Fmoc.

Desprotecçâo de Alloc: Lavagem 3X com DMF (2 min cada) . Adicionar mistura de DMF/AcOH/NMM (5 mL, 1 mL, 0,5 mL) e borbulhar sob Árgon durante 15 min. Adicionar 150 mg de tetraquis(trifenilfospina)paládio e borbulhar Árgon durante 3 horas. Lavar 3X com DMF. Lavar 5X com DCM.

Desprotecçâo de Dde: A resina peptídica lavada foi tratada com 3% de solução de hidrazina em DMF durante 5 min e 30 min e seguida por lavagem com DMF.

Desprotecçâo de Ddz: A péptido-resina foi lavada com DMF depois com DCM e pré-tratada com 3% de TFA em DCM durante 5 min, duas vezes. O terceiro tratamento com 3% de TFA/DCM é realizado durante 30 min. A lavagem exaustiva com DCM é seguida por neutralização por 5% de DIEA em DCM e depois lavagem com DCM e DMF. 164

Desprotecção de Npys: A resina peptídica lavada foi tratada com 0,3 M de HC1 em dioxano durante 5 min e depois 30 min. A péptido-resina desprotegida foi lavada com dioxano, DCM, neutralizada com 5% de DIEA em DCM, e lavada por DCM e DMF.

Acoplamento de aminoácidos: activar um excesso molar de 3, de aminoácido protegido através de BOP (proporção molar de 1:1) em DMF. Verificar se cada reacção de condensação foi completa (1,5 - 40 horas) através do teste de ninidrina, ou por teste de cloranilo nos casos de acoplamento a grupos amino secundários.

Desprotecção da cadeia lateral: Lavar 3 vezes com DCM, e desproteger utilizando mistura K (82,5% de TFA, 5% de p-cresol, 5% de tioanisole, 5% de água, 2,5% de etanoditiol) durante 5 + 120 min.

Lavagens finais: TFA puro (3x), DCM (5x), DMF (lOx), DMF/0,1% de HC1 (5x), 0,1% de HC1 (3x) e 0,01% de HC1 (4x) .

13.3.2 SÍNTESE DA BIBLIOTECA

Sintese: TentaGel S NH2 (10 g) foi pré-inchada em DMF e lavada 5 vezes com DMF e submetida a sintese de fase sólida utilizando o seguinte protocolo que é representado esquematicamente:

Passo Reagente

1 5% de DIEA/DMF

2 Lavagem de DMF

3 Fmoc-Lys(Dde)/BOP 2x5 min 10x2 min até teste de Ninidrina ser negativo 165 4 50% de piperidina/DMF 10 min 5 Fmoc-Lys(Alloc)/BOP até teste de Ninidrina ser negativo 6 repetir o passo 4 7 Boc-Gly/BOP até teste de Ninidrina ser negativo 8 Catalisador de paládio 9 repetir o passo 7 10 Fmoc-Gly/BOP até teste de Ninidrina ser negativo 11 repetir o passo 4 12 Fmoc-p-Ala/BOP até teste de Ninidrina ser negativo 13 repetir o passo 4 14 repetir o passo 10 15 repetir o passo 4 (continuação) 16 repetir o passo 12 17 TFA/DCM 18 aleatorização e código (tabela 3) aminoácidos/BOP 1 19 repetir o passo 4 20 Ddz-Gly/BOP 21 3% de hidrazina/DMF 22 Fmoc-Lys(Dde)/BOP até teste de Ninidrina ser negativo 23 Cloroformato de alilo até teste de Ninidrina ser negativo 166

24 3% de TFA/DCM

25 Fmoc-aminoácidos R1/B0P (tabela 3) 26 repetir o passo 4 27 andaime I/TBTU até teste de Ninidrina ser negativo 28 Catalisador de paládio 29 aleatorização + código 2 (tabela 4)/BOP 30 HC1/dioxano 31 47 ácidos R 2 (tabela 4)/ anidridos sim. 32 repetir o passo 4 33 aleatorização + código 3 34 50 ácidos R 3 (tabela 4)/ anidridos sim. 35 repetir o passo 21 (continuação)

36 código 3 (tabela 4)/B0P

37 mistura K 38 lavagem final A biblioteca protegida foi armazenada em DMA/0,3% de HOBt, a biblioteca desprotegido em 0,01% de HC1 aquoso. 167 ESQUEMA 5

Esquema da síntese da biblioteca de ácido Diaminobenzóico (DABA) com código digital 168

Fmoo-Lys(Dde}-Tg I -Fmoc y +Fmoo-Lya(AHoc)

Fmoo-Lys-Lys-TG

I I ABoc [Me | -Fmoc τ +Fmool.ys(Aíoc)

Boo-Gly-Lys-Lys-TG

I I

Alloc Dde 1 -Alloc {um lote)

r Fmoo-p-aie-Qly-P-^a-CV

Boo-Gly-Lys-Lys-TG

Fmoo-Ma-giy-P-^le-sV We -Boc

Aleatorização +BOO-CODE1 (1o conjunto de 9 aminoácídos de código)

Boc-CODE1-G(y-Lys-Lys-TG Fmoo-p-ela-gly-p-ela-gly Dde -Fmoc +Ddz-gty •Dde

+Fmoc-K(dde) -Fmoc τ +AIIOC

BooCODEI-Gly-Lys..................Lys-TG

Ddz-gbgbg Alloc-Lys

Dde -Ddz +Fmoo-AA (aminoácídos +AA invulgares) (R1) 169

B0C-CODE1 -Gly-Lys....................Lys-TG

Fmoc-R1-gbgbg Alloc-Lys

I

Dde -Fmoc y +DABA (Fmoc,Npys)

Boo-CODEI-Gly-Lys....................Lys-TG

I I

Fmoo-DABA-R1 -gbgbg Alioc-Lys

Npys (Boc) Dde -Alloc

Aleatorização +BOO-CODE2 -Npys V +R2 (47 ácidos)

Boc-CODE1-Gly-Lys....................Lys-TG

Fmoc-DABA-R1-gbgbg AIloo-Lys ^2 (Loc) Dele

I (Boc) -Fmoc

Aleatorização +R3 {50 ácidos)

Dde j +BOO-CODE3

Boo-CODEI-Gly-Lys....................Lys-TG

I I (Boc)-R3-DABA-R1-gbgbg Boo-CODE-Lys R2 (Boc) B00-CODE3 (Boc)

Desprotecção final CODE1-Gly-Lys R3-DABA-R1-gbgbg R2

...........Lys-TG CODE2-Lys

I CODE3 170

Rastreio da Biblioteca Codificada com Barra A biblioteca foi rastreada de acordo com um processo publicado (Lam & Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15). As esferas da biblioteca foram primeiro misturadas com água bidestilada aumentado de forma incrementada. Após lavagem exaustiva com PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 4,3 de Na2HP04, 1,4 mM de KH2P04, pH 7,2) com 0,1% de Tween-20, as esferas foram incubadas em 0,05% de gelatina (p/v) para bloquear todas as ligações não especificas. As esferas foram depois incubadas com 60 pM de anti-p-endorfina biotinilada (clone 3-E 7, Boehringer Mannheim) em 2 x PBS/Tween/gelatina de um dia para o outro. Após lavagem exaustiva, foi adicionada estreptavidina-fosfatase alcalina. Uma hora mais tarde, as esferas foram lavadas, e foi adicionado o substrato convencional para a fosfatase alcalina, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. As esferas conjuntamente com o substrato foram depois transferidos para placas de petri para revelação da cor. Após 30 min a 1 hora, as esferas coradas positivamente foram recolhidas utilizando um micropipeta, lavadas com cloridrato de guanidina a 6 M, pH 1,0, e submetidas a sequenciação do código de barra.

Tabela 12

Aminoácidos Duplos Utilizados para Codificar o Bloco RI RI = 29 Aminoácidos

Aminoácido Elementos de Código Gly Ala Phe Ala Ala Ile Dap Aib Vai Pro Aib Phe (continuação) 171

Vai Aib Ile Aminoácido Elementos de Código Ácido pipecólico Vai Phe Leu Vai Ile Asn Phe Ile Asp Asn Gin Orn Asn Gly Gin Asn Ala Glu Asn Aib 2-Piridil-Ala Asn Vai Chg Asn Phe Phe Asn Ile Cha Gin Gly Arg Gin Ala Citrulina Gin Aib Ácido tetra-hidroisoquinolino-carboxílico Gin Vai homoPhe Gin Phe N-Me-Gly Gin Ile Phe (p-F) Gly Ala Phe (p-Cl) Gly Aib Trp Gly Vai Phe (p-N02) Gly Phe Ala(1-Naph) Gly Ile 3, 4-dicloro-Phe Ala Aib Lys(TFA) Ala Vai Phe(p-Bz) Ala Phe

Aib = ácido aminoisobutírico 172

Tabela 13 Ácidos utilizados para aleatorizações de posições R2 e R3 (ver esquema 1) R2 = 47 Ácidos (este conjunto menos A16, A28 & A47) R3 = 50 Ácidos

Subunidades de Composto de Teste Aminoácidos Codificantes A01 Ácido acético 1/2 1/3 A02 Ácido propiónico 1/2 3/1 AO 3 Ácido hexanóico 1/2 3/3 AO 4 Ácido isobutírico 1/2 3/4 AO 5 Ácido trimetilacético 1/2 NVal AO 6 Ácido ciclopentanocarboxílico 1/2 Leu AO 7 Ácido ciclo-hexanocarboxílico 1/2 Nle AO 8 Ácido ciclo-hexilacético 1/2 PheCl A9 Ácido 1-adamantanoacético 1/2 15/4 AIO Glicina 1/2 2'Nal All β-Alanina 1/3 3/1 A12 Ácido ε-aminocapróico 1/3 3/3 Ai 3 Ácido y-guanidinobutírico 1/3 3/4 Ai 4 Serina 1/3 NVal Ai 5 Treonina 1/3 Leu Ai 6 Cys(SMe) 1/3 Nle Ai 7 Ácido succínico 1/3 PheCl Ai 8 Ácido glutárico 1/3 15/4 AI 9 Ácido cis-1,2-ciclo-hexanodicarboxílico 1/3 2'Nal A20 Ácido succinâmico 3/1 3/3 A21 Ácido benzóico 3/1 3/4 A22 Ácido 1-naftilacético 3/1 NVal (continuação) 173

Subunidades de Composto de Teste Aminoácidos Codificantes A23 Ácido bifenilacético 3/1 Leu A24 Ácido difenilacético 3/1 Nle A25 Ácido 4-aminobenzóico 3/1 PheCl A26 Ácido 4-dimetilaminobenzóico 3/1 15/4 A27 Ácido 4-guanidinobenzóico 3/1 2'Nal A28 3,4-diclorofenilalanina 3/3 3/4 A29 Ácido 4-nitrofenilacético 3/3 Nval A30 Ácido 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzóico 3/3 Leu A31 Ácido 4-clorobenzóico 3/3 Nle A32 Ácido a,a,a-trifluoro-p-toluico 3/3 PheCl A33 Ácido 4-hidroxibenzóico 3/3 15/4 A34 Ácido 4-hidroxifenilacético 3/3 2'Nal A35 Ácido 3-(3,4,5-trimetoxifenil)-propiónico 3/4 Nval A36 Ácido 4-(3-metil-5-oxo-2-pirazolin-l-il)benzóico 3/4 Leu A37 Prolina 3/4 Nle A38 Ácido 3-carboxilo-l,4-dimetil-2-pirroloacético 3/4 PheCl A39 Ácido 2-metil-4-nitro-l-imidazolopropiónico 3/4 15/4 A4 0 Ácido 2-amino-l-imidazoloacético 3/4 2'Nal A41 Ácido 3-amino-l,2,4-triazolo-5-carboxílico NVal Leu A42 Ácido 4-imidizoloacético NVal Nle A4 3 Ácido isonicotinico NVal PheCl A4 4 Ácido 2,3-piridinodicarboxílico NVal 15/4 A4 5 Ácido 2-pirazinocarboxilico NVal 2'Nal A4 6 Ácido 2,3-pirazinodicarboxílico Leu Nle (continuação) 174

Subunidades de Composto de Teste Aminoácidos Codificantes A4 7 Ácido pipecólico Leu PheCl A48 Ácido l-metilindole-2-carboxílico Leu 15/4 A4 9 Acido 2-metil-3-indoloacético Leu 2'Nal A50 Ácido indolo-4-carboxílico Nle PheCl

Tabela 14

Matriz de Aminoácido e Ácido Carboxílico

Espécie N° Ácido α,β-diamino-propiónico (D Ácido a, β- diamino- butírico (2) ornitina (3) lisina (4) Derivados 1 * * * * acetilo 2 * * * * propionilo 3 * * * * butirilo 4 * * * * valerilo 5 * * * * caproílo 6 * * * * pivaloílo 7 * * * c-hexanoílo 8 * * * tricloroacetilo 10 * * * fenilacetilo 11 * * * 2,2-difenilacetilo 12 * * * fenilbutirilo 13 * * * 1-naftilacetilo 14 * * * 2-naftilacetilo (continuação) 175

Espécie N° Ácido α,β-diamino-propiónico (D Ácido α, β“ diamino- butírico (2) ornitina (3) lisina (4) Derivados 15 * * * * 1-adamantil- carbonilo 16 * * * 1-adamantilacetilo 17 * * * tosilglicilo 18 * * * dansilglicilo 19 * * * * benzoilo 20 * * * * succinamilo 21 * * * succinilo 22 * * * glutarilo 23 * * * * isobutirilo 24 * * * 4-Clorobenzoílo 25 * * * 2, 2-difenil-propionilo 26 * * * N,N-dimetil-glicilo 27 * * * * heptanoílo 28 * * * * octanoilo 29 * * * * 3,3-di-f-propionilo 30 * * * N,N-dimetilamino-butirilo 31 * * * * 3-f-propionilo 32 * * * * 4-bi-f-carbonilo 33 * * * * 4-bi-f-acetilo 34 * * * * crotonoilo (* significa que o derivado foi sintetizado e analisado) 176

Explicação de Código: e. g. . 19/4 significa Lys(benzoil)

14. EXEMPLO: ANDAIMES MOLECULARES 0 ESQUEMA XIX proporciona as estruturas químicas de 19 compostos que podem ser utilizados para construir compostos de teste. 0 esquema indica o local de ligação das subunidades dos compostos de teste através de Rn.

ESQUEMA. XIX 1. 2.

177

178 13. 14.

179 18. 19.

ΝΗ— Polímero

Vnh >ΝΗ >-ΝΗ ο

χ Polímero A Tabela 15 abaixo proporciona orientação relativamente aos tipos de subunidades e à química da sua ligação ao andaime molecular.

Andaime N°

Subunidades 1. Aminoácido Aldeído / Organo-metal 2. Diceto-piperazina 3. Tioprolina Substituída 4. Triazina Substituída aminoácido aldeído de homoserina alquil- ou arilmetal aminoácidos aminoácidos N-alquilo aminoácidos cisteína aldeído de aminoácidos ácidos alquilo ou arilo aminoácido triclorotriazina aminas alquilo ou arilo

Química de Acoplamento acoplamento CO-NH formação de ligação C-C acoplamento CO-NH aminação redutiva acoplamento CO-NH aminação redutiva acoplamento CO-NH aminação redutiva 180 5. Dióxido de Tioprolina Substituída 6. Polietileno-Diamina Acilada 7. Ácido Benzenotri-carboxílico 8. 2-S-alquil (aril)isoindol 9. Ciclopentano 10. Ácido Diamino-Diacildialquílico 11. Triácido de Kemps Prolongado 12. Triácido de Kemps (continuação) aminoácidos aminoácidos N-alquilo cisteína aldeído, cetona aminoácidos glicinal ácidos alquilo ou arilo aminoácidos aminoácidos N-alquilo ácido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico anidrido ftálico subst. aminas alquilo ou arilo mercaptanos alquilo ou arilo aminoácidos N-alquilo amina prim. ou sec. ácido ciclopenta-tricarboxílico aminoácidos aldeídos ácidos alquilo ou arilo aminoácidos triácido de Kemp diaminas protegidas Aminoácidos triácido de Kemp ácidos alquilo ou arilo

acoplamento CO-NH formação de tioaminal oxidação C-alquilação acoplamento CO-NH aminação redutiva acoplamento CO-NH

síntese de isoindol acoplamento CO-NH

acoplamento CO-NH aminação redutiva acoplamento CO-NH acoplamento CO-NH 181 (continuação) 13. Aquil-Acil- aminoácidos acoplamento CO-NH Aminoácido aldeídos ácidos alquilo ou arilo 14 . Ácido aminoácidos acoplamento CO-NH Diaminobenzóico ácido 3,5-diamino- benzóico ácidos alquilo ou arilo 15. Esteróide esqueleto esteróide aminação redutiva aldeídos acoplamento CO-NH 16. Ácido Bis- glicina Iminodiacético t-butilbromoacetato aminas alquilo ou arilo 17. Ácido ácido diaminobutanóico acoplamento CO-NH Iminodiacético t-butilbromoacetato N-alquilação N-alquilado aminas alquilo ou arilo 18. α, β, γ diaminoácidos acoplamento CO-NH Peptidomimético ácidos alquilo ou arilo 19. Peptidomimético aminoácidos acoplamento CO-NH de Glicina aldeídos aminação redutiva N-Substituída

Lisboa, 14 de Agosto de 2007 182

Claims (49)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Biblioteca para identificar e analisar um ligando de um aceitador de interesse compreendendo: uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada; a cada um dos quais estão ligados: a) uma espécie de composto de teste, compreendendo o referido composto de teste uma sequência de subunidades, em que a espécie de um composto de teste está ligada a cada suporte através de um ligante clivável; e b) uma ou mais espécies de moléculas codificantes, em que as moléculas codificantes estão ligadas a cada referido suporte através de um ligante não clivável ou separadamente clivável, e são compreendidas de alfa-aminoácidos; e estão topologicamente segregadas do composto de teste que está ligado ao suporte de modo que a molécula codificante esteja no interior do suporte e o composto de teste esteja no exterior do suporte; em que, em cada referido suporte: cada espécie de molécula codificante é diferente da espécie de composto de teste; a sequência das subunidades do composto de teste é codificada através das espécies de moléculas codificantes; e as moléculas codificantes têm subunidades organizadas num código não sequencial.
2. 2. Biblioteca da reivindicação 1, em que o composto de teste não é sequenciável.
3. 3. Biblioteca da reivindicação 2, em que o composto de teste é um polímero. 1
4. 4. Biblioteca da reivindicação 3, em que o composto de teste é um polímero seleccionado do grupo consistindo de poliamida, poliéster, poliureia, poliuretano, policarbonato, poliamina, polialcano, polialceno, poliálcool, polissulfureto e polidissulfureto.
5. 5. Biblioteca da reivindicação 2, em que as subunidades do composto de teste estão ligadas através de ligações químicas seleccionadas do grupo consistindo de ligações amida, éster, ureia, uretano, carbonato, amina, alcano, alceno, sulfureto e dissulfureto.
6. 6. Biblioteca da reivindicação 2, em que o composto de teste é um andaime molecular.
7. 7. Biblioteca da reivindicação 6, em que o andaime molecular é seleccionado do grupo consistindo de uma estrutura esteróide, um açúcar, uma estrutura heterocíclica e um composto poliaromático.
8. 8. Biblioteca da reivindicação 6, em que o andaime molecular é um Aminoácido Aldeído/Organo-metal, uma Dicetopiperazina, uma Tioprolina Substituída, uma Triazina Substituída, um Dióxido de Tioprolina Substituída, uma Polietileno-Diamina Acilada, um Ácido Benzenotricarboxílico, um 2-S-alquil(aril)isoindol, um Ciclopentano, um Ácido Diamino-Diacildialquílico, um Triácido de Kemps Prolongado, um Triácido de Kemps, um Aquil-Acil-Aminoácido, um Ácido Diaminobenzóico, um Esteróde, um Ácido Bis-Iminodiacético, um Ácido Iminodiacético N-alquilado, um Peptidomimético alfa, beta, gama ou um Peptidomimético de Glicina N-Substituída. 2
9. 9. Biblioteca da reivindicação 1, em que a molécula codificante é um polipéptido ramificado.
10. 10. Biblioteca da reivindicação 1, em que, em cada referido suporte, a estrutura do composto de teste é codificada por uma pluralidade de espécies de moléculas codificantes.
11. 11. Biblioteca da reivindicação 1, em que a molécula codificante compreende um polímero de diaminoácidos, tendo uma primeira e segunda unidade amino, em que: a) a primeira unidade amino forma uma ligação peptídica ligando os referidos diaminoácidos entre si; e b) a segunda unidade amino é acoplada a uma de uma multiplicidade de espécies de alfa-aminoácidos.
12. 12. Biblioteca da reivindicação 1, em que as moléculas codificantes são compreendidas de um derivado de ácido alfa,beta-diaminopropiónico, ácido alfa,gama- diaminobutírico, ornitina e lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína ou penicilamina, em que o derivado é formado por reacção de um ácido carboxílico com uma unidade amino N-beta, N-gama ou N-epsilon.
13. 13. Biblioteca da reivindicação 12, em que o derivado é seleccionado do grupo consistindo de acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproílo, pivaloílo, c-hexilo, tricloroacetilo, fenilacetilo, 2,2-difenilacetilo, fenilbutirilo, 1-naftilacetilo, 2-naftilacetilo, 1-adamantilcarbonilo, 1-adamantilacetilo, tosilglicilo, dansilglicilo, benzoílo, succinamilo, succinilo, glutarilo, isobutirilo, 4-clorobenzoílo, 2,2-difenilpropionilo, N,N-dimetilglicilo, heptanoílo, octanoílo, 3,3-di-f- 3 propionilo, N, N-dimetilaminobutirilo, 3-f-propionilo, 4-bi-f-carbonilo, 4-bi-f-acetilo e crotonilo.
14. 14. Biblioteca da reivindicação 2, em que uma subunidade da espécie do composto de teste é ligada através de deslocamento nucleofilico e é seleccionada do grupo consistindo de Etilamina, i-Propilamina, Butilamina, 1- Butilamina, Ciclopentilamina, Ciclo-hexilamina, Etanolamina, 3-Aminopropanol, l-Amino-2-propanol, 2- Metoxietilamina, Beta-Ala-OtBu, Etilenodiamina(Boc), 2—(2— Aminoetil)1-metilpirrolidina, Benzilamina, Naftaleno-metilamina, 4-(Trifluorometil)-benzilamina, 2-Amino-l-fenil-etanol, Tiramina, 4-Metoxi-benzilamina, 3,5-Dimetoxi-benzilamina e 4-(Dimetilamino)-benzilamina.
15. 15. Biblioteca da reivindicação 2, em que uma subunidade da espécie do composto de teste é ligada através de acilação de uma amina primária e é seleccionada do grupo consistindo de gama-Guanidinobutírico, Succinâmico, 1-Naftilacético, Difenilacético, Bifenilacético, Pentafluorofenilacético, 4-Trifluorometilbenzóico, 4-Hidroxibenzóico, 4-Hidroxifenilacético, 4-Aminofenilacético, 3- Nitrofenilacético, 2-Nitro-4,5,-dimetoxibenzóico, 3- (3,4,5-trimetoxifenil)propiónico, 4-Guanidinobenzóico, 4- Dimetilaminobenzóico, 4-(3-Metil-5-oxo-2-pirazolin-l- il)benzóico, 1,4-Dimetil-2,3-pirrolodicarboxílico, 2-Metil-4-nitro-l-imidazolopropiónico, 2-Amino-l-imidazoloacético, 3-amino-l,2,4-triazolo-5-carboxílico, 4-Imidazoloacético, 2.3- Piridinodicarboxilico, 2-Pirazinocarboxilico, 2.3- Pirazinodicarboxilico, l-Metilindolo-2-carboxilico, 2-Metil-3-indoloacético e Indolo-4-carboxilico.
16. 16. Biblioteca da reivindicação 2, em que uma subunidade da espécie do composto de teste é ligada através de alquilação 4 redutiva e é seleccionada do grupo consistindo de 2-metilbutiraldeído, 2-etilbutiraldeído, trimetilacetaldeído, 2-metilvaleraldeído, ciclo-hexanocarboxialdeído, benzaldeído, 4-nitrobenzaldeído, 4-hidroxibenzaldeído, vanilina, 2-tiofenocarboxialdeído, piridino-4-carboxialdeído, alfa,alfa,alfa-trifluoro-o-tolualdeído, 4-metoxibenzaldeido, l-acetilindolo-3-Carboxialdeído, 4-Carboxibenzaldeído, beta-naftaldeido, 4-fenilbenzaldeido, 3-fenoxibenzaldeido e 2-hidroxibenzaldeido.
17. 17. Biblioteca para identificar um ligando ou um aceitador de interesse, compreendendo a biblioteca uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada, possuindo a superfície de cada suporte ligado um ligante compreendendo uma única espécie de composto de teste tendo uma sequência de subunidades, e tendo o interior de cada suporte ligado uma molécula codificante que codifica a sequência de subunidades de composto de teste, tendo o ligante uma ligação que é clivável por uma enzima que não cliva uma ligação da molécula codificante e compreendendo a molécula codificante alfa-aminoácidos.
18. 18. Biblioteca da reivindicação 17, em que o ligante é um péptido.
19. 19. Biblioteca da reivindicação 17, em que o ligante compreende fenilalanina.
20. 20. Biblioteca da reivindicação 17, em que a enzima é uma endopeptidase.
21. 21. Biblioteca da reivindicação 20, em que a endopeptidase é quimotripsina. 5
22. 22. Biblioteca da reivindicação 17, em que o composto de teste é um polímero.
23. 23. Biblioteca da reivindicação 22, em que o polímero é seleccionado do grupo consistindo de poliamida, poliéster, poliureia, poliuretano, policarbonato, poliamina, polialcano, polialceno, poliálcool, polissulfureto e polidissulfureto.
24. 24. Biblioteca da reivindicação 17, em que as subunidades do composto de teste estão ligadas através de ligações químicas seleccionadas do grupo consistindo de ligações amida, éster, ureia, uretano, carbonato, amina, alcano, alceno, sulfureto e dissulfureto.
25. 25. Biblioteca da reivindicação 17, em que o composto de teste compreende ainda um andaime molecular.
26. 26. Biblioteca da reivindicação 25, em que o andaime molecular é seleccionado do grupo consistindo de uma estrutura esteróide, um açúcar, uma estrutura heterocíclica e um composto poliaromático.
27. 27. Biblioteca da reivindicação 25, em que o andaime molecular é um Aminoácido Aldeído/Organo-metal, uma Dicetopiperazina, uma Tioprolina Substituída, uma Triazina Substituída, um Dióxido de Tioprolina Substituída, uma Polietileno-Diamina Acilada, um Ácido Benzenotricarboxílico, um 2-S-alquil(aril)isoindol, um Ciclopentano, um Ácido Diamino-Diacildialquílico, um Triácido de Kemps Prolongado, um Triácido de Kemps, um Alquil-Acil-Aminoácido, um Ácido Diaminobenzóico, um Esteróde, um Ácido Bis-Iminodiacético, um Ácido Iminodiacético N-alquilado, um Peptidomimético 6 alfa, beta, gama ou um Peptidomimético de Glicina N-Substituída.
28. 28. Biblioteca da reivindicação 17, em que a molécula codificante é um polipéptido ramificado.
29. 29. Biblioteca da reivindicação 17, em que a molécula codificante compreende um polímero de diaminoácidos, tendo uma primeira e segunda unidade amino, em que: a) a primeira unidade amino forma uma ligação peptídica ligando os referidos diaminoácidos entre si; e b) a segunda unidade amino é acoplada a uma de uma multiplicidade de espécies de alfa-aminoácidos.
30. 30. Biblioteca da reivindicação 17, em que a molécula codificante compreende um derivado de cada de ácido alfa,beta-diaminopropiónico, ácido alfa,gama-diaminobutírico e ornitina.
31. 31. Biblioteca da reivindicação 30, em que o derivado é formado por reacção de um ácido carboxílico com um grupo amino N-beta, N-gama, N-delta ou N-epsilon para formar um grupo acilo seleccionado do grupo consistindo de acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproílo, pivaloílo, c-hexilo, tricloroacetilo, fenilacetilo, 2,2-difenilacetilo, fenilbutirilo, 1-naftilacetilo, 2-naftilacetilo, 1-adamantilcarbonilo, 1-adamantilacetilo, tosilglicilo, dansilglicilo, benzoílo, succinamilo, succinilo, glutarilo, isobutirilo, 4-clorobenzoílo, 2,2-difenilpropionilo, N, N-dimetilglicilo, heptanoílo, octanoílo, 3,3-di-f-propionilo, N, N-dimetilaminobutirilo, 3-f-propionilo, 4-bi-f-carbonilo, 4-bi-f-acetilo e crotonilo. 7
32. 32. Biblioteca da reivindicação 17, em que uma das subunidades é seleccionada do grupo consistindo de Etilamina, 1- Propilamina, Butilamina, i-Butilamina, Ciclopentilamina, Ciclo-hexilamina, Etanolamina, 3-Aminopropanol, l-Amino-2-propanol, 2-Metoxietilamina, Beta-Ala-OtBu, Etilenodiamina(Boc), 2-(2-Aminoetil-l-metilpirrolidina, Benzilamina, Naftaleno-metilamina, 4-(Trifluorometil)- benzilamina, 2-Amino-l-fenil-etanol, Tiramina, 4-Metoxi-benzilamina, 3,5-Dimetoxi-benzilamina e 4-(Dimetilamino)-benzilamina.
33. 33. Biblioteca da reivindicação 17, em que uma das subunidades é um ácido seleccionado do grupo consistindo de ácido gama-Guanidinobutirico, Succinâmico, 1-Naftilacético, Difenilacético, Bifenilacético, Pentafluorofenilacético, 4-Trifluorometilbenzóico, 4-Hidroxibenzóico, 4-Hidroxifenilacético, 4-Aminofenilacético, 3- Nitrofenilacético, 2-Nitro-4,5-dimetoxibenzóico, 3-(3,4,5- trimetoxifenil)propiónico, 4-Guanidinobenzóico, 4- Dimetilaminobenzóico, 4-(3-Metil-5-oxo-2-pirazolin-l- il)benzóico, 1,4-Dimetil-2,3-pirrolodicarboxilico, 2-Metil-4-nitro-l-imidazolopropiónico, 2-Amino-l-imidazoloacético, 3-amino-l,2,4-triazolo-5-carboxilico, 4-Imidazoloacético, 2.3- Piridinodicarboxilico, 2-Pirazinocarboxilico, 2.3- Pirazinodicarboxilico, l-Metilindolo-2-carboxilico, 2- Metil-3-indoloacético e Indolo-4-carboxilico.
34. 34. Biblioteca da reivindicação 17, em que uma das subunidades é seleccionada do grupo consistindo de 2-metilbutiraldeído, 2-etilbutiraldeido, trimetilacetaldeído, 2-metilvaleraldeido, ciclo-hexanocarboxialdeído, benzaldeido, 4-nitrobenzaldeído, 4-hidroxibenzaldeído, vanilina, 2-tiofenocarboxialdeído, piridino-4- carboxialdeído, alfa,alfa,alfa-trifluoro-o-tolualdeído, 8 4-metoxibenzaldeído, l-acetilindolo-3-carboxialdeído, 4-carboxibenzaldeído, beta-naftaldeído, 4-fenilbenzaldeído, 3-fenoxibenzaldeído e 2-hidroxibenzaldeído.
35. 35. Biblioteca para identificar um ligando ou um aceitador de interesse, compreendendo a biblioteca uma multiplicidade de suportes de fase sólida separada, possuindo a superfície de cada suporte ligado um ligante compreendendo uma única espécie de composto de teste, compreendendo uma sequência de subunidades à qual é ligado um primeiro grupo protector, e tendo o interior de cada suporte ligado uma molécula codificante que codifica a sequência de subunidades e à qual é ligado um segundo grupo protector, sendo o primeiro grupo protector diferente do segundo grupo protector e compreendendo a molécula codificante alfa-aminoácidos.
36. 36. Biblioteca da reivindicação 35, em que o ligante é um péptido.
37. 37. Biblioteca da reivindicação 35, em que o composto de teste é um polímero.
38. 38. Biblioteca da reivindicação 37, em que o polímero é seleccionado do grupo consistindo de poliamida, poliéster, poliureia, poliuretano, policarbonato, poliamina, polialcano, polialceno, poliálcool, polissulfureto e polidissulfureto.
39. 39. Biblioteca da reivindicação 35, em que as subunidades do composto de teste estão ligadas através ligações químicas seleccionadas do grupo consistindo de ligações amida, éster, ureia, uretano, carbonato, amina, alcano, alceno, sulfureto e dissulfureto. 9
40. 40. Biblioteca da reivindicação 35, em que o composto de teste compreende ainda um andaime molecular.
41. 41. Biblioteca da reivindicação 40, em que o andaime molecular é seleccionado do grupo consistindo de uma estrutura esteróide, um açúcar, uma estrutura heterocíclica e um composto poliaromático.
42. 42. Biblioteca da reivindicação 40, em que o andaime molecular é um Aminoácido Aldeído/Organo-metal, uma Dicetopiperazina, uma Tioprolina Substituída, uma Triazina Substituída, um Dióxido de Tioprolina Substituída, uma Polietileno-Diamina Acilada, um Ácido Benzenotricarboxílico, um 2-S-alquil(aril)isoindol, um Ciclopentano, um Ácido Diamino-Diacildialquílico, um Triácido de Kemps Prolongado, um Triácido de Kemps, um Aquil-Acil-Aminoácido, um Ácido Diaminobenzóico, um Esteróde, um Ácido Bis-Iminodiacético, um Ácido Iminodiacético N-alquilado, um Peptidomimético alfa, beta, gama ou um Peptidomimético de Glicina N-Substituída.
43. 43. Biblioteca da reivindicação 35, em que a molécula codificante é um polipéptido ramificado.
44. 44. Biblioteca da reivindicação 35, em que a molécula codificante compreende um polímero de diaminoácidos, tendo uma primeira e segunda unidade amino, em que: a) a primeira unidade amino forma uma ligação peptídica ligando os referidos diaminoácidos entre si; e b) a segunda unidade amino é acoplada a uma de uma multiplicidade de espécies de alfa-aminoácidos.
45. 45. Biblioteca da reivindicação 35, em que a molécula codificante compreende um derivado de cada de ácido 10 alfa,beta-diaminopropiónico, ácido alfa,gama-diaminobutírico e ornitina.
46. 46. Biblioteca da reivindicação 45, em que o derivado é formado por reacção de um ácido carboxilico com um grupo amino N-beta, N-gama, N-delta ou N-epsilon para formar um grupo acilo seleccionado do grupo consistindo de acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproilo, pivaloilo, c-hexilo, tricloroacetilo, fenilacetilo, 2,2-difenilacetilo, fenilbutirilo, 1-naftilacetilo, 2-naftilacetilo, 1-adamantilcarbonilo, 1-adamantilacetilo, tosilglicilo, dansilglicilo, benzoilo, succinamilo, succinilo, glutarilo, isobutirilo, 4-clorobenzoilo, 2,2-difenilpropionilo, N, N-dimetilglicilo, heptanoilo, octanoilo, 3,3-di-f-propionilo, N, N-dimetilaminobutirilo, 3-f-propionilo, 4-bi-f-Carbonilo, 4-bi-f-acetilo e crotonilo.
47. 47. Biblioteca da reivindicação 35, em que uma das subunidades é seleccionada do grupo consistindo de Etilamina, i-Propilamina, Butilamina, i-Butilamina, Ciclopentilamina, Ciclo-hexilamina, Etanolamina, 3-Aminopropanol, l-Amino-2-propanol, 2-Metoxietilamina, Beta-Ala-OtBu, Etilenodiamina(Boc), 2-(2-Aminoetil)1-metilpirrolidina, Benzilamina, Naftaleno-metilamina, 4-(Trifluorometil)-benzilamina, 2-Amino-l-fenil-etanol, Tiramina, 4-Metoxi-benzilamina, 3,5-Dimetoxi-benzilamina e 4-(Dimetilamino)-benzilamina.
48. 48. Biblioteca da reivindicação 35, em que uma das subunidades é seleccionada do grupo consistindo de ácido gama-Guanidinobutírico, Succinâmico, 1-Naftilacético, Difenilacético, Bifenilacético, Pentafluorofenilacético, 4-Trifluorometilbenzóico, 4-Hidroxibenzóico, 4-Hidroxifenilacético, 4-Aminofenilacético, 11 3-Nitrofenilacético, 2-Nitro-4,5,-dimetoxibenzóico, 3- (3,4,5-trimetoxifenil)propiónico, 4-Guanidinobenzóico, 4- Dimetilaminobenzóico, 4-(3-Metil-5-oxo-2-pirazolin-l-il-benzóico, 1,4-Dimetil-2,3-pirrolodicarboxílico, 2-Metil-4-nitro-l-imidazolopropiónico, 2-Amino-l-imidazoloacético, 3- amino-l,2,4-triazolo-5-carboxílico, 4-Imidazoloacético, 2.3- Piridinodicarboxílico, 2-Pirazinocarboxílico, 2.3- Pirazinodicarboxílico, l-Metilindolo-2-carboxílico, 2-Metil-3-indoloacético e Indolo-4-carboxílico.
49. 49. Biblioteca da reivindicação 35, em que uma das subunidades é seleccionada do grupo consistindo de 2-metilbutiraldeído, 2-etilbutiraldeído, trimetilacetaldeido, 2- metilvaleraldeído, ciclo-hexanocarboxialdeído, benzaldeido, 4-nitrobenzaldeído, 4-hidroxibenzaldeido, vanilina, 2-tiofenocarboxialdeido, piridino-4- carboxialdeído, alfa,alfa,alfa-trifluoro-o-tolualdeido, 4- metoxibenzaldeido, l-acetilindolo-3-carboxialdeido, 4-Carboxibenzaldeído, beta-naftaldeido, 4-fenilbenzaldeido, 3- fenoxibenzaldeido e 2-hidroxibenzaldeido. Lisboa, 14 de Agosto de 2007 12