DE69130333T2 - Harze für die Feststoff-Peptidsynthese - Google Patents

Harze für die Feststoff-Peptidsynthese

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Description

    Allgemeiner Stand der Technik
  • Spacerarme spielen in vielen Bereichen der modernen Biochemie eine wichtige Rolle. Sie lassen sich als Moleküle definieren, die ein Molekül mit einem anderen oder einem inerten Träger verbinden. Polyethylenglykol ist zum Beispiel vorteilhaft für die Bindung von Enzymen an unlösliche Träger und andere Biomoleküle, wobei die Enzymaktivität erhalten bleibt (siehe Stark, M. und Holmberg, K., Biotech. and Bioeng., 34 (1989), S. 942-950). Diese Möglichkeit hat weitreichende Folgen für industrielle Verfahren, in denen immobilisierte Enzyme verwendet werden, z. B. in der Affinitätschromatographie und für diagnostische Analysen, z. B. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay). Zwei weitere Bereiche, in denen Polyethylenglykolspacerarme verwendet werden, sind die Peptidsynthese und -sequenzierung. Die Kopplung geschützter Nucleotid- und Aminosäurereste an inerte Träger, z. B. Siliciumdioxid-, Membran- und Polystyrolträger, nimmt häufig in dem Maße zu wie der Reaktionsort vom Trägergerüst getrennt wird. Ähnliche Effekte zeigten sich bei der Sequenzierung von Proben immobilisierter Festphasen (siehe Inman, J. K., et al., Solid-Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Previero and Coletti-Previero (Hrsg.), Elsevier, North-Holland Biomed. Press, 1977, S. 81-94).
  • Die Effektivität der Festphasen-Nukleinsäure- oder -Peptidsynthese bzw. -sequenzanalyse wird durch die Festphase oder den Träger beeinträchtigt, auf dem die Reaktionsorte fixiert sind. Polystyrolgele oder poröses Glas werden zum Beispiel als feste Träger in der Peptidsequenzierung verwendet. In einer Reihe von Anwendungen können die für das Verfahren verwendeten Lösemittel Volumenveränderungen der Polystyrolpartikel verursachen, wodurch die Reaktionssäule verstopft und sich ein Rückstau bildet. Poröses Glas ist hingegen völlig starr und ändert sein Volumen nicht. Allerdings lassen sich die chemischen Eigenschaften von porösen Glasderivaten nicht reproduzieren. Polymerpartikel, z. B. Polystyrolpartikel, von denen Derivate gebildet wurden, an denen reaktive Gruppen befestigt werden können, haben sich für viele Anwendungen als nützlich erwiesen. Polyethylenglykolstrukturen werden als chemisch inerte Spacerarme verwendet, da sie mit einer Vielzahl von Lösemitteln verträglich sind (siehe oben, Inman et al.). Durch Verwendung von Polyethylenglykolspacerarmen werden die durch den Träger verursachten sterischen Effekte minimiert. Polyethylenglykolspacerarme haben noch eine weitere nützliche Funktion bei der Veränderung der Beschaffenheit der Porenzwischenräume, so daß der an den Träger gebundene, reaktive Teil mit einer größeren Zahl Lösemittel und Reagenzien kompatibel ist.
  • Polyethylenglykol-modifizierte Polystyrolharze (PEG-PS- Harze) wurden für den Einsatz in der Festphasen-Peptidsequenzierung beschrieben (siehe oben, Inman et al.) Diese Harze werden auch als Phasentransferkatalysatoren verwendet (siehe McKenzie, W. M. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1978), S. 541-543; Regen, S. L. et al., J. Amer. Chem. Soc., 101 (1979), S. 116-120; Heffernan, J. G. et al., J. Chem. Soc. Perkin II (1981), S. 514-517; Kimura, Y. et al., J. Org. Chem., 48 (1983), S. 385-386; Tomoi M. et al., Reactive Polymers, 10 (1989), S. 27-36). PEG-PS-Harze wurden als Träger für die Festphasen-Peptidsynthese beschrieben (siehe Becker et al., Makromol. Chem. Rapid Commun., 3 (1982), S. 217-223; Hellermann, H. et al., Makromol. Chem., 184 (1983), S. 2603-2617).
  • Die nach den hier zitierten Verfahren hergestellten PEG- PS-Harze haben jedoch einige Nachteile. Die Reaktionen verlaufen unbefriedigend, wobei hochmolekulares Polyethylenglykol, z. B. mit mehr als 400 Dalton, und symmetrisches, bifunktionelles Polyethylenglykol zur Vernetzung neigen. Diese Probleme konnten durch anionische Polymerisation von Ethylenoxid unmittelbar auf vernetztes Polystyrol verringert werden (siehe Bayer et al., Peptides: Structure and Function, Hruby, V. J. und Rich, D. H. (Hrsg.), Proc. Bth Am. Peptide Symp. (1983), S. 87-90, Pierce Chem. Co., Rockford, IL; Bayer und Rapp, Deutsches Patent DE 35 00 180 A1 (1986). Mit diesem Verfahren sind jedoch die PEG-Kettenlängen schwer zu regulieren, und eine Gleichförmigkeit der PEG-Polymere kann nicht garantiert werden. Ein weiteres Problem bei diesem Verfahren ist die Funktionalisierung des Polystyrols mit Chlormethylether. Chlormethylether ist hochgiftig, und Reste der Chlormethylgruppen können während der Peptidsynthese Nebenreaktionen verursachen.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von PEG-Pfropfcopolymeren wurde von Zalipsky et al. beschrieben (siehe Peptides: Structure and Function, Deber, C. M., Hruby, V. J. und Kopple, K. D. (Hrsg.), Proc. 9th Am. Pep. Symp. (1985), S. 257-260, Pierce Chem. Co., Rockford, IL. In diesem Verfahren werden bestimmte heterobifunktionelle PEG-Derivate mit bestimmten Molekulargewichten verwendet, z. B. 2000 bis 4000 Dalton. Diese Derivate sind jedoch nicht leicht erhältlich, was ihre Vermarktung erschwert.
  • Ein Verfahren zur Herstellung nichtgiftiger, leistungsstarker, fester Träger, die für eine große Anzahl Lösemittel geeignet sind, wäre für die Festphasensynthese oder Sequenzierung von Peptiden oder Nukleinsäuren oder für andere Festphasenanwendungen wertvoll.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf von Polyethylenglykol hergeleitete Pfropfträger. Es werden Verfahren zur Herstellung dieser Träger und deren Verwendung für die Festphasensynthese von Peptiden offengelegt. Die erfindungsgemäßen PEG-Pfropfträger umfassen funktionalisierte PEG-Derivate, die an die festen Träger kovalent gebunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Harz für die Festphasen-Peptidsynthese bereit, das so beschaffen ist, daß die Peptidsynthese an anderer Stelle als am endständigen PEG erfolgt. Dieses Harz ist in Abb. 1 und außerdem durch die allgemeine Formel I dargestellt
    • Formel I
  • worin Y ein Diaminomonocarbonsäurerest ist, der wahlweise durch eine Nω-Schutzgruppe geschützt sein kann; n eine ganze Zahl von 5 bis 150 ist; SS ein fester Träger ist; A eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, z. B. Methylen, Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen und Isobutylen; und R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl- und Arylgruppen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt mehrere kompakte, wirtschaftliche Wege zur Herstellung funktionalisierter, inerter Träger für Festphasen-Anwendungen unter Verwendung von monofunktionellem oder homobifunktionellem Polyethylenglykol als Ausgangsmaterial bereit. Die vorliegenden PEG-Pfropfträger haben vorteilhafte physikalische und mechanische Eigenschaften für die Festphasen-Peptidsynthese, Nukleinsäuresynthese und andere Einsatzgebiete, in denen immobilisierte Moleküle verwendet werden.
    • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • In Abb. 1 ist die allgemeine Struktur eines Polyethylenglykol-Polystyrol(PEG-PS)-Pfropfträgers dargestellt, worin X die Stelle anzeigt, ab der die Biopolymerkette zu wachsen beginnt.
  • Abb. 4 ist eine schematische Darstellung einer Reaktionsreihe, aus der ein PEG-PS-Pfropfträger entsteht, wobei das Biopolymer aus dem Ornrest synthetisiert werden kann.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Harze, die ein funktionalisiertes Polyethylenglykolderivat aufweisen, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist. Wie in der Hauptanmeldung EPA 91 91 6082.0 offengelegt und beansprucht, enthält der Pfropfträger ein an den Träger gebundenes, symmetrisches Poly(oxyethylen)diaminderivat, das folgender Formel entspricht
  • worin n eine ganze Zahl von 5 bis 150 ist; R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff (H) und einfachen Alkyl- oder Arylgruppen wie Methyl, Ethyl oder Phenyl; SS ein fester Träger ist; X gleich H oder H&sub2;N-B-NH-C(O)-A-C(O)- ist; A und B unabhängig voneinander eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe, z. B. Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, Isobutylen oder ähnliche Gruppen mit Kettenlängen von bis zu C&sub1;&sub0; (z. B. A von Bernstein-, Glutar-, Adipinsäure oder vergleichbaren Säuren und B von Ethylendiamin oder anderen aliphatischen Diaminen hergeleitet), eine CH-CH Gruppe (z. B. A von Maleinsäure hergeleitet) oder eine aromatische Gruppe (z. B. A von Phthalsäure und B von Phenylendiamin hergeleitet) ist. Der Kern der Formel, d. h. der in Klammern stehende Teil, entspricht einer Polyoxyethylendiaminpolymerreihe. Die Aminogruppe(n) kann (können) wahlweise durch bekannte Nω- Schutzgruppen geschützt sein.
  • Ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfträgern gemäß der oben genannten Formel besteht aus der Bildung carboxylfunktioneller Moleküle durch Reaktion amino-funktionalisierter Kernpolymere mit Dicarbonsäurederivaten, einschließlich Anhydriden. Nach diesem Verfahren wird das Diaminpolymer mit mindestens zwei Äquivalenten des aktivierten Dicarbonsäurederivates reagiert. Zu den für dieses Verfahren geeigneten Dicarbonsäuren gehören Alkyldisäuren mit bis zu ca. 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Malein-, Bernstein-, Glutar- oder Adipinsäure; Anhydride wie Maleinsäure-, Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid; oder aromatische Anhydride, z. B. Phthalsäureanhydrid. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird das Diaminpolymer mit Bernsteinsäure-, Maleinsäure- oder Glutarsäureanhydrid zu den beanspruchten Verbindungen reagiert, und zwar bis(succinyliertem), bis(maleyliertem) oder bis(glutaryliertem) Polyethylenglykol.
  • Die PEG-Pfropfträger gemäß EPA 91 91 6082.0 ermöglichen das Zusammensetzen von Biopolymeren an endständigem PEG (siehe Abb. 1 der zitierten Anmeldung). Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Harze jedoch so aufgebaut, daß die Peptidsynthese an anderer Stelle als am endständigen PEG erfolgen kann. Diese Harze sind in Abb. I und durch die allgemeine Formel I dargestellt
    • Formel I
  • worin Y ein Diaminomonocarbonsäurerest ist, der wahlweise durch eine Nω-Schutzgruppe geschützt sein kann; n eine ganze Zahl von 5 bis 150 ist; SS ein fester Träger ist; A eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe ist, z. B. Methylen, Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen und Isobutylen; und R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl- und Arylgruppen.
  • Ein PEG-Pfropfträger dieser Art (Formel I) wird durch Verwendung eines monofunktionalisierten Polyethylenglykolderivats synthetisiert, zum Beispiel PEG-Monoamin oder PEG-Monomethylether. Im Handel erhältliche PEG-Ausgangsstoffe sind entweder monofunktionelle Jeffamine® oder PEG-Monomethylether mit Methoxy- und Hydroxylendgruppen. Eine Aminogruppe am PEG kann wie bereits oben in Zusammenhang mit dem in EPA 91 91 6082.0 beschriebenen Harz mit einer Dicarbonsäure oder einem Anhydrid reagiert werden. Alternativ können durch Reaktion mit Ethylbromacetat, 4-Bromvalerat oder Isocyanacetat mit anschließender Verseifung carboxylfunktionalisierte Derivate von MPEG hergestellt werden, wie z. B. in folgender Gleichung dargestellt:
  • Abb. 2 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines PEG-Harzes gemäß Formel I. Nach diesem Verfahren wird ein Nα-Fmoc (Nα-9-fluorenylmethyloxycarbonyl), Nδ-Boc-Orn-PS (Nδ-tert-butyloxycarbonyl-ornithin-PS)-Harz (oder eine Permutation davon) selektiv entblockt, und durch Ankoppeln einer monofunktionellen PEG-Säure wird ein Zweig gebildet, der in Relation zur endgültigen Ausrichtung der Biopolymerkette orthogonal angeordnet ist. Ein Ornithinrest (siehe Abb. 2) dient dazu, das PEG- Derivat an den festen Träger zu binden. Es können jedoch auch andere chemische Anteile, die eine Carboxylgruppe und zwei Aminogruppen aufweisen, verwendet werden.
  • Die nach den hier veröffentlichten Verfahren hergestellten Polyethylenglykol-Polystyrol-Pfropfträger sind besonders hilfreich. Die mit Hilfe der vorliegenden PEG-Deri vate hergestellten PEG-PS Träger haben mehrere Eigenschaften, die für Festphasenanwendungen erwünscht sind: sie quellen in einer Reihe von Lösemitteln, sind unter den für die meisten Festphasensynthesen üblichen Bedingungen stabil und verhalten sich gut in den für Festphasenanwendungen gebräuchlichen Batch- und Säulenreaktoren, insbesondere in der Festphasen-Peptidsynthese.
  • Die Festphasen-Peptidsynthese beginnt normalerweise mit der kovalenten Bindung des endständigen Carboxyls einer ersten Aminosäure an den festen Träger. Die Carboxylgruppe einer Nα-geschützten Aminosäure wird kovalent an einen Henkel gebunden, der an anderer Stelle als das endständige PEG befestigt ist (siehe Abb. 1 und 2). Ein 'Henkel' ist ein bifunktioneller Spacer, der dazu dient, den ersten Aminosäurerest am polymeren Träger zu befestigen. An einem Ende des Henkels befindet sich eine leicht abzuspaltende Schutzgruppe, während das andere Ende des Henkels an den funktionalisierten, festen Träger gekoppelt ist. Henkel, die mit den vorliegenden Spacerarmen in der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden können, sind z. B. säureempfindliche p-Alkoxybenzyl(PAB)- Henkel, lichtempfindliche o-Nitrobenzylesterhenkel und die von Albericio et al. beschriebenen Henkel (s. J. Org. Chem., 55 (1990), S. 3730-3743, sowie die darin zitierten Referenzen). Die geeigneten Henkel werden in einem einzigen Schritt quantitativ auf den aminofunktionalisierten Trägern befestigt, um genau definierte Strukturen als allgemeinen Ausgangspunkt für das Zusammenfügen der Peptidkette bereitzustellen. Die den Henkel schützende Gruppe wird entfernt, und der C-terminale Rest der ersten Nα-geschützten Aminosäure wird quantitativ an den Henkel gekoppelt. Sobald der Henkel an die feste Phase und die erste Aminosäure oder das Peptid am Henkel befestigt sind, erfolgt der allgemeine Synthesezyklus. Der Synthesezyklus besteht im allgemeinen aus der Entfernung des Schutzes der Nα-Aminogruppe der Aminosäure oder des Peptids am Harz, Spülung und gegebenenfalls Neutralisation mit anschließender Umsetzung mit einer carboxylaktivierten Form der nächsten Nα-geschützten Aminosäure. Der Zyklus wird wiederholt bis das gewünschte Peptid oder Protein gebildet ist. Festphasen-Peptidsynthesen, in denen funktionalisierte, unlösliche Träger verwendet werden, sind seit langem bekannt (siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 (1963), Seite 2149; Barany und Merrifield, Peptides, Vol. 2 (1979), S. 1-284; Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30 (1987), S. 705-739.
  • Die hier beschriebenen PEG-Derivate sind besonders als Spacerarme nützlich, die den inerten Träger von den reagierenden Aminosäuren trennen, die während der Synthese die Peptidkette aufbauen. Die richtige Auswahl des abstandhaltenden Spacerarms ist für Festphasenanwendungen äußerst wichtig.
  • In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene PEG-Spacerarme mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 2000 Dalton zwischen aminofunktionelle Gruppen auf einem Polystyrolgerüst und dem Befestigungspunkt der entsprechenden Henkel eingefügt. Die so erhaltenen PEG-PS-Pfropfträger enthielten ungefähr die gleichen Gewichtsteile PEG und PS. Diese Träger hatten deutliche Vorteile gegenüber Polystyrolträgern im Hinblick auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften, z. B. das Quellen, sowie in der Synthese von Modellpeptiden. Die erfindungsgemäßen PEG-PS Träger ermöglichen die Durchführung der Peptidsynthese mit Acetonitril als Lösemittel in allen Reaktionsschritten und Spülungen. In Vergleichsversuchen mit Polystyrol und Acetonitril als Lösemittel konnten keine Peptide gebildet werden.
  • In einem anderen Ausführungsbeispiel wurden Vergleichsversuche durchgeführt, in denen die schwierige Acylträgerprotein 65-74 dekapeptidsequenz mit Hilfe von Fmoc- Aminosäuren synthetisiert wurde. Auf dem neuen PEG-PS- Träger wurde das Peptid in größerer Reinheit als auf Polystyrol, Tentagel® (Rapp Chem., Tübingen, Deutschland) oder Pepsyn® K (Cambridge Research Biochem., Cambridge, England) erhalten. Das PEG-PS-Material erwies sich als sehr geeignet für kontinuierliche und diskontinuierliche Synthesen. Es wurde ein unbedeutender Rückstau beobachtet, der sich selbst bei hohen Durchflußmengen bildete.
  • Die allgemeine Verwendbarkeit der PEG-PS-Pfropfträger wurde durch etliche Synthesen bewiesen, in denen zahlreiche große (z. B. mit ca. 30 bis 60 Resten) und komplexe Peptidsequenzen gebildet wurden wie beispielsweise Cecropinanaloga, Calcitonin, β-Endorphin, Corticotropinfreisetzender Faktor, zwei zinkfingerbindende Sequenzen sowie verschiedene Teilsequenzen des HIV-1-tat-Proteins. Die Verbesserungen in der Synthese, die durch Verwendung der vorliegenden PEG-PS-Linker erreicht wurden, scheinen auf einen oder mehrere der folgenden Umstände zurückzuführen sein: (i) Wirkung des Spacerarms, der die Reaktionsorte aus der näheren Umgebung des Polymergerüstes entfernt; (ii) Wirkung der allgemeinen Umgebung, wodurch die hydrophobe Eigenschaft des Harzes verändert und gleichzeitig die Reaktionsgeschwindigkeit positiv beeinflußt wird; (iii) besondere Wirkung auf schwer anzuordnende Kopplungen aufgrund der schwächeren Sekundärstruktur (Bildung der Wasserstoffbindung).
  • Die PEG-Derivate können ebenfalls in der Nukleinsäuresynthese oder -sequenzierung als Spacerarm oder Linkers zwischen einem inerten Träger und dem reagierenden Nukleotid oder der Nukleinsäure verwendet werden. Die Derivate können beispielsweise wie oben beschrieben an die Polystyrolharze gebunden und in einer durch Amidit gesteuerten DNA-Synthese verwendet werden. Das PEG-PS- Harz quillt in Acetonitiril, das bei der Amiditkopplung als Lösemittel dient.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
    • Beispiel 1 Darstellung eines Carboxymethylderivats von Polyethylenglykolmethylether (MPEG)
  • Eine Lösung aus Polyethylenglykolmethylether (MPEG) (Mw 2000, 100 g, 50 mmol) in 500 mL Toluol wurde über Nacht unter Rückfluß gehalten und azeotrop getrocknet, wobei das Wasser mit Hilfe eines Abscheiders (Dean-Stark) entfernt wurde. Die Lösung wurde auf 80ºC gekühlt und mit Kalium-tert-butoxid (11,2 g, 0,1 Mol) behandelt. Anschließend wurde ein Gemisch aus Ethylbromacetat (11 mL, 0,1 Mol) und Toluol (10 mL) über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben. Die Reaktion dauerte 8 Stunden bei 90ºC. Das Gemisch wurde dann in einem Rotationsverdampfer zu einer braunen, viskosen Masse eingeengt. Für die Extraktion des Polymers wurde Dichlormethan (500 mL) zugegeben. Außerdem wurden 200 g Aktivtonerde beigemischt. Nach 30 Minuten wurde die organische Phase abfiltriert, teilweise eingeengt (auf ~ 100 mL), mit Ethylether (700 mL) vereinigt und mehrere Stunden auf -20ºC gehalten. Das gefällte Polymer wurde abfiltriert, an der Luft getrocknet und in wäßrigem Natriumhydroxid (1 N, 500 mL) aufgenommen (3 Stunden, 25ºC). Diese Verseifungsreaktion wurde durch Ansäuerung (auf pH 3) mit konzentriertem, wäßrigem Chlorwasserstoff abgebrochen, und das Produkt wurde in Dichlormethan (3 · 250 mL) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;), teilweise eingeengt (auf ~ 100 mL), mit 700 mL Ethylether vereinigt und mehrere Stunden auf -20ºC gehalten. Das Endprodukt wurde abfiltriert und mehrere Tage im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Ausbeute: 75 g (73%), Titration von Carboxylgruppen 94% der Theorie. NMR- und Elementaranalysenwerte stimmten mit der Struktur überein.
    • Beispiel 2 Darstellung von PEG-Orn(Boc)-PS-Harz
  • Ein Aminomethylpolystyrolharzträger (6,0 g, 0,95 mmol/g, 5,7 mmol) wurde nach den üblichen Methoden mit Nα-Fmoc, Nδ- Boc-ornithin derivatisiert. Das Harz wurde gequellt, mit Dichlormethan gespült, mit 5% DIEA in Dichlormethan neutralisiert (1 · 5 Min. und 3 · 10 Min.) und mit Dichlor methan gespült. Die Kopplung des Orn-Derivats wurde durch N,N'-diisopropylcarbodiimid (DIPCDI)/HOBt in DMF erreicht (jeweils 3 Äquivalente, 15 Min. Voraktivierung, 40 mL Reaktionsvolumen, 3 Stunden). Anschließend wurde mit DMF und Dichlormethan gespült. Ein Ninhydrintest an einer Probe war fast negativ, jedoch wurden nicht umgesetzte Stellen durch Verkappung mit saurem Anhydrid (4,5 mL, 5 Äquivalente) und Triethylamin (7,0 mL, 5 Äquivalente) in DMF (20 mL), 30 Minuten, blockiert. Das geschützte Orn-PS-Harz (0,78 mmol/g, entspricht der theoretischen Ladung, bezogen auf die erwartete Gewichtzunahme) wurde mit DMF und Dichlormethan gespült und mit Piperidin-DMF (1 : 4, v/v) (2 + 10 Min.) behandelt, um die Nα-Fmoc- Gruppe selektiv zu entfernen. Durch weitere Spülungen mit DMF, Dichlormethan, 2-Propanol und DMF-Dichlormethan (3 : 7, v/v) wurde das Harz auf die Kopplung mit dem MPEG-Säure-Derivat, dessen Darstellung in Beispiel 1 beschrieben ist, vorbereitet. Eine Lösung der MPEG-Säure (37 g, 18 mmol) in DMF-Dichlormethan (3 : 7 v/v, 75 mL) wurde mit HOBt (2,75 g, 18 mmol) und DIPCDI (2,83 mL, 18 mmol) vereinigt (15 Minuten) und anschließend dem H-Orn(Boc)-PS-Harz beigemischt. Die Kopplung dauerte 5 Stunden. Der Ninhydrintest war leicht positiv. Im Anschluß daran wurde eine zweite Kopplung mit geringeren Mengen MPEG-Säure-Derivat und Aktivierungsmitteln (9 mmol Maß) durchgeführt. Die Acetylierung folgte nach bekannten Verfahren. Das endgültige MPEG-Orn(Boc)-PS-Harz wurde mit Dichlormethan, DMF, Dichlormethan und Methanol gespült und 48 Stunden im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet. Es wurden 16,9 g Harz erhalten (ausgezeichnete Übereinstimmung mit der theoretischen Gewichtzunahme), das mit 0,31 mmol/g beladen war (PEG : PS : Orn = 0,57 : 0,36 : 0,07 Gewicht laut Elementar- und Aminosäureanalyse). Ähnliche Ergeb nisse wurden erhalten, wenn für die Aktivierung und Kopplung BOP/HOBt/NMM in DMF-Protokollen verwendet wurden.
    • Beispiel 3 Kontinuierliche Peptidsynthese mit Polyethylenglykol- Polystyrol-Pfropf (PEG-PS)
  • Das in Beispiel 2 dargestellte PEG-Orn(Boc)-PS wurde mit TFA-Dichlormethan (1 : 1) (5 + 25 Minuten) behandelt, um die Nδ-Boc-Gruppe selektiv zu entfernen. Anschließend wurde mit Dichlormethan gespült und mit 5% DIEA in Dichlormethan sowie mit Dichlormethan neutralisiert. Ein Fmoc-PAL-Henkel wurde zugefügt, und unter Verwendung eines MilliGen/Biosearch Peptid-Synthesizers (Modell 9050) mit DIPCDI + HOBt Kopplungsprotokoll (Konzentrationen: 0,05 M) wurde die schwierige Deka-alanylvalin- Sequenz dargestellt. In einem anschließenden Lauf wurde die gleiche Sequenz mit einem normalen Polystyrolträger dargestellt. Das Peptid hatte eine Reinheit von 77% (bestimmt durch HPLC), wenn PEG-PS verwendet wurde, während mit PS nur 53% erreicht wurden.

Claims (3)

1. Harz für die Festphasen-Peptid-Synthese der allgemeinen Formel:
worin Y ein Diaminomonocarbonsäure-Rest ist, der wahlweise geschützt werden kann durch eine Nω-Schutzgruppe; n eine ganze Zahl von 5 bis 150 ist; SS ein fester Träger ist; A eine geradkettige oder verzweigte C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkyl-Gruppe ist; und R¹, R² und R³ unabhängig von einander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl- Gruppen und Aryl-Gruppen.
2. Harz nach Anspruch 1, worin der feste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aminofunktionalen Membranen, porösem Glas, Siliciumdioxid, Polystyrolen, Polydimethylacrylamiden, Baumwolle und Papier.
3. Harz nach Anspruch 2, worin das Polystyrol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminopolystyrol, Aminomethylpolystyrol, Aminoacylpolystyrol und p-Methylbenzhydrylaminpolystyrol.
DE69130333T 1990-08-31 1991-08-27 Harze für die Feststoff-Peptidsynthese Expired - Lifetime DE69130333T2 (de)

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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5545698A (en) * 1990-08-31 1996-08-13 University Of Minnesota Polyethylene glycol derivatives for solid-phase applications
AU7113594A (en) * 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
JPH10502102A (ja) * 1994-06-14 1998-02-24 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 固体合成用樹脂
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5656707A (en) * 1995-06-16 1997-08-12 Regents Of The University Of Minnesota Highly cross-linked polymeric supports
US5858534A (en) * 1995-09-05 1999-01-12 Solid Phase Sciences Corp. Method of making and using derivatized paramagnetic polymer beads
DE19781535T1 (de) * 1996-01-23 1999-01-28 Argonaut Technologies Inc Hoch-funktionalisierte, mit Polyethylenglycol bepfropfte Polystyrol-Träger
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US6281245B1 (en) 1996-10-28 2001-08-28 Versicor, Inc. Methods for solid-phase synthesis of hydroxylamine compounds and derivatives, and combinatorial libraries thereof
AU5426398A (en) 1996-10-28 1998-05-22 Versicor Inc Methods for solid-phase synthesis of hydroxylamine compounds and derivatives, and combinatorial libraries thereof
US6060240A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
CA2285175A1 (en) * 1997-03-28 1998-10-08 Smithkline Beecham Corporation Rink-chloride linker for solid phase organic synthesis of organic molecules
EP0981554A4 (de) * 1997-05-08 2005-11-09 Smithkline Beecham Corp Chloridverbinder für die organische synthese in der festphase
GB9717173D0 (en) * 1997-08-13 1997-10-22 Akzo Nobel Nv Solid phase supports
GB9718415D0 (en) * 1997-08-29 1997-11-05 Smithkline Beecham Plc Formulation
CA2223114A1 (en) * 1997-11-28 1999-05-28 Brent R. Stranix Functional polymers with carbon-linked functional groups
GB9727126D0 (en) * 1997-12-22 1998-02-25 Zeneca Ltd Process
GB9814876D0 (en) * 1998-07-10 1998-09-09 Zeneca Ltd Polymer
AU5855699A (en) * 1998-08-28 2000-03-21 Jerini Biotools Gmbh Method for producing polymeric solid phase supporting materials
AU2942100A (en) * 1999-03-11 2000-09-28 Kuraray Co., Ltd. Vitamin d derivatives and process for the preparation thereof
AU2008201460B2 (en) * 1999-03-22 2010-02-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Amino group containing support matrices, their use and manufacture
US6335438B1 (en) 1999-03-22 2002-01-01 Geir Fonnum Method for the manufacture of amino group containing support matrices, support matrices prepared by the method, and use of the support matrices
SE9902133D0 (sv) * 1999-06-06 1999-06-06 Amersham Pharm Biotech Ab A method for surface modification, a novel support matrix and the use of the matrix
KR100453185B1 (ko) * 2001-11-24 2004-10-15 이은규 고정상 칼럼을 이용한 단백질-폴리머 접합체의 제조방법
SE526038C2 (sv) * 2002-07-08 2005-06-21 Gambro Lundia Ab Polymeraffinitetsmatris, förfarande för framställning därav och anvädning därav
KR100936536B1 (ko) 2003-01-18 2010-01-13 주식회사 바이오인프라 목표 부위 이외의 아민이 보호된 펩타이드, 그 제조방법및 이를 이용한 ｐｅｇ가 선택적으로 접합된 펩타이드의제조방법
ES2868452T3 (es) 2004-07-02 2021-10-21 Geron Corp Síntesis de monómeros nucleosídicos 5'fosforamidita 3’ aminoprotegidos
KR101088579B1 (ko) * 2004-10-04 2011-12-05 재단법인서울대학교산학협력재단 젤 타입의 코어-쉘 수지
EP2159228A1 (de) * 2008-08-28 2010-03-03 Polymer Laboratories Limited Amphiphiler fester Träger
GB0818074D0 (en) * 2008-10-02 2008-11-05 Lytix Biopharma As Treatment of biofilms
EA035885B1 (ru) 2015-04-23 2020-08-27 Джерон Корпорейшн Способы получения полинуклеотидов с использованием композиций солей поливалентных катионов
KR101978446B1 (ko) * 2017-02-28 2019-05-14 주식회사 비드테크 고체상 응용을 위한 에틸렌글리콜 유도체 및 코어-쉘형 그라프트 지지체
CN113248352A (zh) * 2021-05-18 2021-08-13 湖南华腾制药有限公司 一种固相合成七甘醇单甲醚的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH602822A5 (en) * 1974-07-16 1978-08-15 Hoffmann La Roche Polyethylene glycol] chloromethyl- or hydroxymethyl-benzoate
GB1559610A (en) * 1975-10-31 1980-01-23 Armour Pharma Synthesis of peptides
DE3500180A1 (de) * 1985-01-04 1986-07-10 Ernst Prof. Dr. 7400 Tübingen Bayer Pfropfcopolymerisate aus vernetzten polymeren und polyoxyethylen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4831084A (en) * 1987-05-18 1989-05-16 Bachem Feinchemikalien A.G. Resin-linker combination for the solid-phase synthesis of peptides and intermediates
EP0347145A3 (de) * 1988-06-14 1990-10-24 University Of Utah Research Foundation Heterogene interpenetrierende Polymernetzwerke zur gesteuerten Arzneistofffreisetzung

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Publication number Publication date
JP3266600B2 (ja) 2002-03-18
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JPH06500331A (ja) 1994-01-13

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