DE68923746T2

DE68923746T2 - Protein-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE68923746T2
Application number: DE68923746T
Authority: DE
Inventors: Robin Ewart Offord; Keith Rose
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2009-08-26
Also published as: EP0359428A1; JP2778775B2; ATE126236T1; AU637326B2; AU4190689A; GR3017089T3; JPH03501623A; WO1990002136A1; ES2077582T3; GB8820378D0; EP0359428B1; DE68923746D1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protein-Derivaten und Protein-Konjugaten, die in der Medizin Verwendung finden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Hydrazid-Derivaten von Proteinen durch Enzymkatalysierte reverse Proteolyse.

Hintergrund der Erfindung

Es besteht in der Medizin ein deutliches Interesse an der Verwendung von Protein-Konjugaten, sowohl für die Therapie als auch für die Diognose. Das Konjugat umfaßt im allgemeinen ein Protein, wie etwa einen Antikörper, an welchen eine Effektoroder eine Reportergruppe, zum Beispiel ein zytotoxisches Mittel oder eine Gruppe, die radioaktiv gekennzeichnet werden kann, gebunden ist.
Im allgemeinen erfolgt die Bindung von Effektor- oder Reportergruppen an Proteine durch gruppenspezifische, jedoch nicht bereichsspezifische Reaktionen (z.B. durch Jodierung von Tyrosinresten oder Acylierung von Lysinresten). Als Ergebnis ist sogar mono-umgesetztes Material im allgemeinen selbst heterogen, da es eine Mischung von Spezies ist, von denen jede mit einer Gruppe an einen von mehreren Resten des an der Modifikationsreaktion beteiligten Typs gebunden ist.
Für ein zur Verwendung in der Medizin gedachtes Protein-Konjugat besteht ein großer Gewinn darin, daß das Produkt der stellenspezifischen Bindung einer interessierenden Gruppe homogen ist, im Gegensatz zu dem Produkt, das durch die oben beschriebenen nicht-bereichsspezifischen Verfahren gewonnen wird. Daher wurden die Vorteile von stellenspezifischer Modifikation von Antikörpern des IgG-Typs berichtet [Murayama, A. et al., Immunochemistry 15, 523-528, (1978); Rodwell, J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2632-2636, (1986) und Europäische Patentschrift Nr. 88695]. In diesem Fall wurde Bereichsspezifität durch Oxidation des Kohlenhydrats der IgG-Moleküle und anschließende reduktive Alkylierung erreicht. Der Erfolg eines solchen Unternehmens hängt von dem Vorliegen einer geeigneten Glykosylierung ab, sodaß es nicht allgemein auf andere Polypeptidklassen anwendbar ist, und da sogar manche IgG-Moleküle mehr als eine Glykosylierungsstelle aufweisen, ist es möglich, daß das Verfahren nicht immer stellenspezifisch sein ist. Die internationale Patentanmeldung W085/05638 beschreibt die nicht-bereichsspezifische chemische Derivatisierung von Enzymen mit Hydraziden.
Die Spezifität von Proteasen, die in reverser Weise arbeiten, wurde zur Fixierung aktivierender Gruppen ausschließlich an dem Carboxyl-Ende von Polypeptiden ausgenützt [Offord, R.E. und Rose, K. in Protides of the Biological Fluids (H. Peeters, Hg.) Pergamon, Oxford, S. 35-38 (1986); Offord, R.E. et al. im Peptides 1986 (D.Theodoropoulos, Hg.) W. de Gruyter, Berlin, S. 279-281, (1986); Rose, K. et al. in Peptides 1986 (ibid), S. 219-222, (1986); Rose, K. et al., Biochem. J. 249, 83-88, (1988); und Europäische Patentschrift Nr. 243929]. Bei einer anschließenden chemischen Reaktion kann eine Effektor- oder Reportergruppe spezifisch an die aktivierte Gruppe des modifizierten Polypeptids gerichtet werden. (In der Regel ist es aus Gründen der Enzym-Spezifität und wegen des großen Überschusses von Amino-Bestandteil, der im allgemeinen erforderlich ist, um die enzymatische Kupplung zu einer hohen Ausbeute zu bringen, nicht möglich oder wünschenswert, die interessierende Gruppe direkt enzymatisch an die Polypeptidkette zu fixieren.) Die Spezifität der Konjugationsreaktion zwischen der Effektor- oder Reportergruppe und dem aktivierten Polypeptid kann durch chemische Komplementarität der reagierenden Gruppen in dem Effektor- oder Reportermolekül und dem Polypeptid oder für den Fall, daß das Effektor- oder Reportermolekül selbst ein Polypeptidfragment ist, durch gestaltmäßige Unterstützung erreicht werden.
Es wurden aktivierende Gruppen, die aromatische Aldehyde, aliphatische Aldehyde oder aromatische Amine sind, zur Verwendung in Protease-gelenkten Reaktionen der obigen Art beschrieben. Die Konjugation wurde über Bildung und Reduktion einer Schiff'schen Base (reduktive Alkylierung) erreicht und Spezifität wurde mit Hilfe der relativen Reaktivitäten der aromatischen im Verhältnis zu den aliphatischen Aminen bei niedrigem pH-Wert erzielt.
Wir haben nun gefunden, daß es möglich ist, Enzym-katalysierte reverse Proteolyse zur spezifischen Bindung von Hydrazidgruppen an die Carboxyl-Termini von Proteinen zu verwenden. Es ist kein Seitenketten-Schutz erforderlich und die Kupplung findet vorteilhafterweise unter sehr milden Bedingungen und in wässerigen lösungen statt, wo die Denaturierung des Proteins auf einem Minimum gehalten werden kann. Die Hydrazidgruppen werden normalerweise nicht in Proteinen gefunden und stellenspezifische Konjugationen können dadurch erreicht werden, daß geeignet modifizierte Effektor- oder Reportergmppen an die Hydrazidgruppe gelenkt werden, wenn diese letztgenannten enzymatisch an das Protein gebunden wurden. Das entstehende Konjugat bedarf keiner weiteren Behandlung im Gegensatz zu früheren Berichten über stellenspezifische Bindung (Murayama, A. et al., Rodwell, J.D. et al., Offord, R.E. und Rose, K., Offord, R.E. et al., ibid.), wo eine reduktive Stabilisierung einer Schiffschen Base notwendig ist. Da eine solche Reduktion für die irreversible Bildung von unerwünschten inter- und intramolekularen Bindungen verantwortlich sein kann, kann somit eine höhere Spezifität durch Verwendung einer Konjugation über die Hydrazon-Bildung erreicht werden.
Die nicht-spezifische Bindung von Hydrazidgruppen an Proteine unter Verwendung chemischer Reagenzien wurde bereits früher beschrieben und die Protein- Konjugate wurden uber Hydrazon Bildung erzeugt [King, T.P. et al., Biochemistry 25, 5774-5779 (1986)].

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1)
A-CO-N(R¹)N(R²)-Z¹- -Z²-N(R³)NHR&sup4; (1)
worin
A-CO- für den Rest eines Proteins oder Peptids A-CO&sub2;H steht, in welchem -CO&sub2;H die C- terminale Carboxylgruppe des Proteins oder Peptids ist;
R¹, R², R³ und R&sup4;, die gleich oder verschieden sein können, stehen jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe;
Z¹ und Z², die gleich oder verschieden und anwesend oder abwesend sein können, bedeuten jeweils eine Abstandsgruppe;
X ist ein Sauerstoff- oder Schwefelatom; sowie der Salze derselben zur Verfügung, bei welchem Verfahren eine Verbindung der Formel (2):
A-CO&sub2;H (2)
oder ein aktiviertes Derivat derselben mit einer Verbindung der Formel (3):
R¹NHN(R²)-Z¹- -Z²-N(R³)NHR&sup4; (3)
in Gegenwart eines Enzyms, das zur Katalysierung der Bildung einer Peptidbindung befähigt ist, kondensiert wird.
In den Verbindungen der Formel (1) kann der Rest eines Proteins oder Peptids ACO&sub2;H, der durch A-CO- dargestellt ist, der Rest eines beliebigen natürlich vorkommenden synthetischen oder halb-synthetischen Proteins oder Peptids sein, inklusive von Proteinen und Peptiden, die durch Hybridom- und rekombinante DNA-Verfahren hergestellt sind. Spezielle Beispiele umfassen Reste von Plasma-Proteinen, wie etwa Immunglobulinen, (z.B. polyklonale, monoklonale und rekombinante Antikörper und Fragmente derselben), Fibrinogen, Albumin und Transferrin, Hormone, zum Beispiel Steroidhormone, wie etwa Östrogene, Insulin, Erythropoietin und Somatrotropin, Lymphokine, wie etwa Interleukin 1 oder Interleukin 2, Zytokine, wie etwa Tumornekrosefaktor, industriell und therapeutisch wertvolle Enzyme, wie etwa Gewebe-Plasminogen-Aktivator, und Enzym-Inhibitoren, wie etwa Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen.
Wenn die Gruppe R¹, R², R³ oder R&sup4; in den Verbindungen der Formel (1) eine Alkylgruppe bedeutet, kann diese zum Beispiel eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe, wie etwa eine Methyl oder Ethylgruppe, sein. Beispiele von Arylgruppen, die durch R¹, R², R³ oder R&sup4; dargestellt werden, sind C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylgruppen, zum Beispiel Phenylgruppen. Aralkylgruppen, die durch R¹, R², R³ oder R&sup4; dargestellt sind, umfassen ArC&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, z.B. Phen-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, wie etwa Benzyl oder Phenethyl.
Wenn Z¹ oder Z² in den Verbindungen der Formel (1) eine Abstandsgruppe ist, kann diese zum Beispiel eine gegebenenfalls substituierte aliphatische Kohlenwasserstoffkette, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Hetero-Atome unterbrochen ist, die ausgewählt sind aus -O- oder -S- oder eine oder mehrere -N(R&sup5;)-Gruppen (worin R&sup5; für ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht), oder eine zykloaliphatische oder aromatische Gruppe sein.
Somit können insbesondere Z¹ oder Z² eine gegebenenfalls substituierte gerade oder verzweigte C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylen-, C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Alkenylen- oder C&sub2;&submin;&sub1;&sub0;-Alkinylenkette darstellen, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen ist, die ausgewählt sind aus -O- oder -S- oder eine oder mehrere -N(R&sup5;) [z.B. -NH- oder -N(CH&sub3;)-] zykloaliphatische (z.B. C&sub3;&submin;&sub8;-Zykloalkylen, wie etwa Zyklohexylen) oder aromatische (z.B. C&sub6;&submin;&sub1;&sub2;-Arylen-, wie etwa Phenylen-) Gruppen.
Spezielle Beispiele von Z¹ oder Z² umfassen -CH&sub2;-, -(CH&sub2;)&sub2;-, -CH&sub2;OCH&sub2;-, -CH&sub2;SCH&sub2;, -(CH&sub2;)&sub3;- oder -(CH&sub2;)&sub4;.
Salze der Verbindungen der Formel (1) umfassen Salze mit Säuren und Basen, zum Beispiel Säureadditionssalze, wie etwa Hydrochloride oder Hydrobromide, oder Alkalimetallsalze, wie etwa Natrium- oder Kaliumsalze.
A-CO- in den Verbindungen der Formel (1) ist der Rest eines Proteins oder Peptids A-CO&sub2;H, worin -CO&sub2;H die C-terminale Carboxylgruppe des Proteins oder Peptids ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (1) sind jene, in welchen A-CO- der Rest eines Plasma-Proteins, wie etwa von Fibrinogen oder einem Immunglobulin oder einem Fragment desselben, einem Hormon, wie etwa Insulin, einem Zytokin, wie etwa Tumornekrosefaktor, oder einem therapeutisch verwendbare Enzym, wie etwa Gewebe-Plasminogen-Aktivator, ist.
Insbesondere ist A-CO- vorzugsweise der Rest eines Immunglobulins oder eines Fragments desselben. Das Immunglobulin oder Immunglobulin-Fragrnent kann im allgemeinen zu einer beliebigen Immunglobulin-Klasse gehören. So kann es zum Beispiel ein Antikörper sein, der zu einer Klasse von Immunglobulin M gehört, oder insbesondere ein Antikörper, der zu einer Klasse von Immunglobulin G gehört. Der Antikörper oder das Fragment desselben kann von einem Tier, zum Beispiel von einem Säugetier, stammen und kann zum Beispiel von Maus, Ratte oder Mensch stammen. Es kann ein natürlicher Antikörper oder ein Fragment desselben oder gewünschtenfalls ein rekombinanter Antikörper oder ein Antikörper-Fragment sein, d.h. ein Antikörper oder Antikörper- Fragment, die durch Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wurden.
Spezielle rekombinante Antikörper oder Antikörper-Fragmente umfassen (1) jene, die eine Antigen-Bindungsstelle aufweisen, von der zumindest ein Teil von einem unterschiedlichen Antikörper stammt, rum Beispiel solche, in welchen die hypervariablen oder komplementaritätsbestimmenden Regionen eines Antikörpers auf die variablen Rahmenregionen eines zweiten unterschiedlichen Antikörpers aufgepfropft wurden (wie in der Europäischen Patentschrift Nr. 239400 beschrieben); (2) rekombinante Antikörper oder Fragmente, in welchen nicht-Fv-Sequenzen durch nicht-Fv-Sequenzen anderer unterschiedlicher Antikörper substituiert wurden (wie in den europäischen Patentschriften Nr. 171496, 173494 und 194276 beschrieben); oder (3) rekombinante Antikörper oder Fragmente, die im wesentlichen die Struktur eines natürlichen Immunglobulins besitzen, in welchen jedoch die Angelregion eine unterschiedliche Anzahl von Cysteinresten aufweist als jene, die in dem natürlichen Immunglobulin gefunden wird, oder worin ein oder mehrere Cysteinreste in einer Oberfiächentasche des rekombinanten Antikörpers oder -Fragments an der Stelle eines anderen Aminosäurerests in dem natürlichen Immunglobulin vorliegt (wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB 88/00730 bzw. PCT/GB 88/00729 beschrieben ist).
Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann von einem polyklonalen oder vorzugsweise monoklonalen Ursprung stammen. Er kann für eine beliebige Anzahl antigener Determinanten spezifisch sein, ist vorzugsweise jedoch für eine spezifisch. Die antigene Determinante kann ein beliebiges Hapten oder eine antigene Determinante sein, die mit Tieren, z.B. Menschen [zum Beispiel mit normalem tierischem Gewebe oder Organzellen assoziierte Antigene, Tumorzellen-assoziierte Antigene (zum Beispiel onkofetale Antigene, wie etwa karzinoembryonisches Antigen oder Alphafetoprotein, plazentale Antigene, wie etwa chorionisches Gonadotropin und plazentale alkalische Phosphatase, sowie prostatische Antigene, wie etwa Prostatic-Säure-Phosphatase und Prostataspezifisches Antigen) sowie Antigene, die mit Bestandteilen von Körperfluiden assoziiert sind, wie etwa mit Fibrin oder Plättchen], Viren, Bakterien und Pilzen assoziiert ist.
Antikörperfragmente umfassen zum Beispiel Fragmente, die durch proteolytische Spaltung eines ganzen Antikörpers entstehen, wie etwa F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab- Fragmente, oder Fragmente, die durch rekombinante DNA-Verfahren gewonnen wurden, zum Beispiel Fv-Fragmente (wie sie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB 88/00747 beschrieben sind).
R¹, R², R³ und R&sup4; in den Verbindungen der Formel (1) sind vorzugsweise Wasserstoffatome oder Alkyl-, insbesondere Methylgruppen. Verbindungen der Formel (1), in welcher R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils für ein Wasserstoffatom stehen, sind besonders bevorzugt.
Eine weitere allgemein bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (1) sind jene, in welchen Z¹ und Z² beide fehlen oder beide anwesend sind und die gleiche Bedeutung haben.
Wenn Z¹ und Z² in den Verbindungen der Formel (1) vorliegen, sind sie vorzugsweise C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylenketten, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere -O- oder -5-Atome oder -N(R&sup5;)-Gruppen unterbrochen sind.
X in den Verbindungen der Formel (1) ist vorzugsweise ein Sauerstoffatom.
Eine besonders wertvolle Gruppe von Verbindungen gemäß der Erfindung hat die Formel (1a):
A-CO-N(R¹)N(R²)- -N(R³)NHR&sup4; (1a)
worin A-CO-, R¹, R², R³, R&sup4; und X die für Formel (1) angegebene Bedeutung haben, sowie die Salze derselben.
Besonders wertvolle Verbindungen dieser Art haben die Formel (1b):
A-CO-NHNH NHNH&sub2; (1b)
worin A-CO- die für Formel (1) angegebene Bedeutung hat, sowie die Salze derselben.
Die Verbindungen der Formeln (1a) und (1b), worin A-CO- der Rest eines Proteins oder Peptids A-CO&sub2;H ist, worin -CO&sub2;H die C-terminale Carboxylgruppe des Proteins oder Peptids ist, sind besonders bevorzugt. Verbindungen dieser Art, in welchen A-CO- der Rest eines Immunglobulins oder eines Fragments desselben ist, sind besonders wertvoll.
Die Verbindungen der Formel (1) können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden, in welchen A-CO-, R¹, R², R³, R&sup4;, Z¹, Z² und X, wenn nicht anders angegeben, die für die Formel (1) angegebenen Bedeutungen haben.
Somit stellen wir ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1) zur Verfügung, welches die Kondensation einer Verbindung der Formel (2):
A-CO&sub2;H (2)
oder eines aktivierten Derivats derselben mit einer Verbindung der Formel (3):
R¹NHN(R²)-Z¹-C-Z²-N(R³)N]R&sup4; (3)
in einem Lösungsmittel, zum Beispiel einem wässerigen Lösungsmittel, bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel etwa Raumtemperatur, umfaßt.
Wo es erwünscht ist, eine Verbindung der Formel (1) herzustellen, in welcher Z¹ und Z² nicht die gleichen sind, kann es notwendig sein, die Gruppe -N(R³)NHR&sup4; vor der Reaktion zu schützen. Es können übliche Schutzverfahren verwendet werden und die Grippe kann von der Schutzgruppe befreit werden, sobald die Verbindung der Formel (1) erhalten wurde, wobei übliche Verfahren zur Abspaltung von Schutzgruppen eingesetzt werden.
Geeignete Enzyme zur Verwendung gemäß dieser Erfindung umfassen Proteasen, insbesondere Endopeptidasen, wie etwa Serin-Proteinasen, z.B. Trypsin oder Chymotrypsin, oder Lysyl-Endopeptidase, oder Exopeptidasen, zum Beispiel Carboxypeptidasen, wie etwa Carboxypeptidase Y.
Im allgemeinen kann die Reaktion unter vorteilhaft milden Bedingungen durchgeführt werden, die so ausgewählt werden, daß die Kondensation der Verbindung der Formel (2) mit der Verbindung der Formel (3) begünstigt wird. Die genauen eingesetzten Bedingungen werden von dem verwendeten Enzym abhängen. Somit kann die Reaktion zum Beispiel, wenn Trypsin als das Enzym verwendet wird, in Anwesenheit eines Lösungsmittels, insbesondere eines wässerigen Lösungsmittels, zum Beispiel von Wasser oder eines wässerigen organischen Lösungsmittels, zum Beispiel wässerigem Dimethylsulfoxid oder wässerigem Butan-I,4-diol, bei einem geeigneten pH, zum Beispiel im Bereich von pH 4-8, bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel etwa Raumtemperatur, durchgeführt werden.
Andere Enzyme können in dem Verfahren unter Einsatz der gleichen oder ähnlicher Bedingungen verwendet werden, wobei deren exakte Natur empirisch unter Verwendung geeigneter Tests in kleinem Maßstab in Übereinstimmung mit der üblichen Praxis bestimmt werden kann, bevor die Kondensationsreaktion ausgeführt wird.
Salze der Verbindungen der Formel (1) können durch Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden, zum Beispiel durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (1) mit einer Säure oder Base in einem wässerigen Lösungsmittel.
Die Proteine oder Peptide der Formel (2) sind leicht zugänglich oder können unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden.
Zwischenverbindungen der Formel (3) sind entweder bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Ausgangsmaterialien unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die analog jenen sind, die zur Herstellung bekannter Verbindungen verwendet werden.
Verbindungen der Formel (1) sind für die Herstellung von Protein-Konjugaten verwendbar, in welchen ein Protein an ein weiteres interessierendes Molekül gebunden ist, zum Beispiel ein anderes Protein oder ein Peptid, oder ein Effektor- oder Reportermolekül, wobei die Verbindung eine -N(R¹)N(R²)-Z¹C(-X)Z²-N(R³)N= Gruppe umfaßt.
In Konjugaten dieser Art sind die Gruppen R¹, R², R³, Z¹, Z² und X so wie sie für Formel (1) definiert sind und die verschiedenen für bestimmte Typen dieser Gruppen in Verbindung mit Formel (1) ausgedrückten Preferenzen sind so zu verstehen, daß sie auch für Protein-Konjugate gemäß diesem Aspekt der Erfindung gelten. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung einer Verbindung der Formel (4):
A-CO-N(R¹)N(R²)Z¹- -Z²-N(R³)-Y-R (4)
worin A-CO-, R¹, R², R³, Z¹, Z² und X die für Formel (1) angegebene Bedeutung haben, R ein Protein oder ein Peptid oder eine Effektor- oder Reportergruppe darstellt und Y eine Verbindungsgruppe ist, die durch Kupplung einer -NHR&sup4;-Gruppe, worin R&sup4; die für die Formel (1) angegebene Bedeutung hat, mit einer reaktiven Gruppe in der Gruppe R gebildet wurde, wobei die Herstellung einer Verbindung der Formel (1) gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung sowie die Kupplung dieser Verbindung der Formel (1) mit einem Protein oder einem Peptid oder einer Effektor- oder Reportergruppe umfaßt ist.
Spezielle Beispiele von Verbindungen der Formel (4) umfassen Verbindungen der Formel (5):
A-CO-N(R¹)N(R²)-Z¹- -Z²-N(R³)N=CH-R (5)
worin A-CO-, R¹, R², R³, Z¹, Z², X und R wie soeben definiert sind.
In den Verbindungen der Formeln (4) und (5) kann R zum Beispiel für ein Protein oder Peptid, wie etwa oben für A-CO- angegeben, oder für eine Effektor- oder eine Reportergruppe stehen. Effektorgruppen umfassen zum Beispiel beliebige physiologisch aktive Substanzen, antibakterielle, antivirale oder antifungale Verbindungen. Besondere physiologisch aktive Substanzen umfassen antineoplastische Mittel, inklusive zytotoxische und zytostatische Mittel, Toxine, Hormone, entzündungshemmende Verbindungen und Substanzen, die als kardiovaskuläre, z.B. fibrinolytische, Mittel und Mittel für das Zentralnervensystem wirksam sind. Reportergruppen umfassen zum Beispiel eine Gruppe, die durch analytische Mittel in vitro und/oder in vivo feststellbar sind, wie etwa eine Gruppe, die radioaktiv gekennzeichnet werden kann, eine fluoreszierende Gruppe oder eine Gruppe, die durch NMR- oder ESR-Spektroskopie überwacht werden kann.
Es ist ersichtlich, daß bei der Bildung der Verbindungen der Formel (4) und (5) das Ausgangsmaterial R eine Gruppe aufweisen muß, die zur Reaktion mit der Hydrazidgruppe der Verbindung der Formel (1) befähigt sein muß. Solche Gruppen sind leicht zu identifizieren und umfassen insbesondere Aldehydgruppen. Die geeignete Gruppe kann bereits in dem Ausgangsmaterial vorliegen oder sie kann erforderlichenfalls durch Einsatz üblicher Verfahren eingeführt werden, wie zum Beispiel in den folgenden Beispielen beschrieben wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Erfindung wird weiters in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen unter Bezugnahme auf die angeschlossene Zeichnung erläutert, in welcher
Figur 1 das Ergebnis von isokratischer HPLC-Analyse an einer Probe zeigt, die aus der Umsetzung von Des(AlaB30)-Insulin (DAI) und 1,1-Carbonyldihydrazid in Anwesenheit von Lysyl-Endopeptidase gewonnen wurde, und die Trennung von DAI-NHNHCONHNH&sub2;, einer erfindungsgemäßen Verbindung, von dem DAI-Ausgangsmaterial angibt.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

Kupplung von 1,1-Carbonyldihydrazid an DesAlaB30-Insulin (DAI)

Herstellung von DAI-NHNHCONNNH&sub2;

Des(AlaB30) Insulin (DAI) wurde nach früherer Beschreibung hergestellt (Morihara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 92 1980 396-402). Zu 1,1-Carbonyldihydrazid (180 mg - Fluka) wurden 2 ml destilliertes Wasser und anschließend 2 ml Dimethylsulfoxid (Fluka, puriss.) sowie 12 ul Essigsäure (Fluka, puriss.) zugesetzt. Der sichtbare pH wurde unter Verwendung einer Glaselektrode (Modell GK2421 C, Radiometer, Kopenhagen) nach Kalibrierung mit wässerigen Standards (Merck) gemessen, wobei keine Korrektur angebracht wurde. Der pH wurde auf einen gemessenen Wert von 5,5 durch Zusatz von etwa 12,5 ul 98-100%iger Ameisensäure (Merck) abgesenkt. DAI (30 mg) wurde in 1,5 ml der obigen Lösung gelöst und dann wurden 0,5 mg Lysyl-Endopeptidase (von Achromobacter; Wako Gmbh) in 30 ul Wasser zugesetzt. Eine analytische und anschließend eine präparative HPLC wurden an System 1 vorgenommen:

System 1: Beckman Gold System.

Die Säule war Machery Nagel Nukleosil 300A 5 um C8 25 cm x 4 mm i.d., die mit 0,6 ml/Minute betrieben wurde. Lösungsmittel A war 0,3 M Ammoniumsulfat und Lösungsmittel B war 0,3 M Ammoniumsulfat in 35%igem Acetonitril. Die beiden Lösungsmittel wurden hergestellt unter Verwendung von Ansatzlösungen aus 3 M Ammoniumsulfat, die auf einen angezeigten pH von 2 (Glas-Elektrode) durch sorgfältigen Zusatz von konzentrierter Schwefelsäure eingestellt worden waren. Die Bestimmung erfolgte für analytische Messungen bei 214 nm und für präparative Durchläufe bei 254 nm.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis der isokratischen HPLC-Analyse an System 1. DAI wurde deutlich in etwa 90%iger Ausbeute in eine hydrophilere (früher-eluierende) Verbindung umgewandelt (identifiziert als DAI-NHNHCONHNH&sub2;, vgl. unten). Die präparative Auftrennung wurde unter den gleichen Bedingungen erreicht, wobei die Probe ansatzweise entsprechend 5 mg des ursprünglichen DAI eingespritzt wurde und die Fraktionen händisch aufgefangen wurden. Nach der Verdünnung mit Wasser wurde das Protein an einer C18 SepPak (Waters) gewonnen, die gemäß den Anleitungen des Herstellers eingesetzt wurde (Methanol-Wäsche, Äquilibrierung mit 0,1%iger Trifiuoressigsäure (TFA), Probenauftrag nach erster Verdünnung mit einem gleichen Volumen Wasser, Waschen mit 0,1 % TFA/20 % Acetonitril, Eluierung mit 0,1 % TFA/40 % Acetonitril. Die Lösungsmittel wurden in einer Vakuumzentrifuge abgetrennt (SpeedVac Concentrator, Savant), wobei die Heizung abgedreht war.
Das Produkt, DAI-NHNHCONHNH&sub2;, wurde durch Elektrophorese, Peptid-Kartierung, Umkehrphasen-HPLC und durch spezifische Konjugierung mit 2,4- Dihydroxybenzaldehyd charakterisiert. Bei der Elektrophorese auf Zelluloseacetat bei pH 8 (System beschrieben von Rose et al., J. Chromatogr. 210 1981, 301-309) verhielt sich das Produkt wie ein Insulin-Derivat, das eine einzige negative Ladung verloren hatte (vgl. Rose et al., Biochem. J. 211 1983, 671-676). Dies entspricht der Erwartung für die Struktur, da die Carboxylgruppe von LysB29 des DAI zu einer Hydrazidgruppe geworden war, die bei pH 8 ungeladen ist. Beim Abbau unter Verwendung einer Protease, die aus Armillaria mellea isoliert wurde und die an der N-terminalen Seite von Lys-Resten spaltet (vgl. z.B. Rose et al., in Peptides 1984, Ragnarsson, U., Hg., S. 235-238, Almqvist und Wiksell International, Stockholm, 1984) wurde Des(LysB29-AlaB30)-Insulin (identifiziert durch HPLC und Elektrophorese auf Zelluloseacetat durch Vergleich mit authentischem Material) gemeinsam mit einem kleinen Fragment in Freiheit gesetzt, das die erwarteten Eigenschaften (bei Hochspannungs-Papierelektrophorese) von Lys-Ala- NNNHCONHNH&sub2; aufwies. Bei der Umkehrphasen-HPLC in System 1 (Fig. 1) eluierte das DAI-NHNHCONHNH&sub2; früher als DAI oder natives Insulin (DAI und natives Insulin eluieren bei diesem System gleichzeitig), in Übereinstimmung mit dem Produkt, das eine extrapositive Ladung bei niedrigem pH aufweist. Im Hinblick auf die obigen Daten und das Syntheseverfahren (vgl. Rose et al., Biochem. J. 2111983, 671-676) hatte das Produkt die erwartete Struktur von DAI-NHNHCONHNH&sub2;, wobei die Hydrazidgruppe über die Carboxylgruppe des LysB29 gebunden ist.
Zink-freies Schweine-Insulin (Vergleich) und DAI-NNNHCONHNH&sub2; wurden getrennt bei einer Konzentration von 100 uM in 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH 4,6 und 22ºC in Anwesenheit und Abwesenheit von 500 uM 2,4-Dihydroxybenzaldehyd (Fluka) inkubiert. In Intervallen wurden 10 ul aliquote Anteile durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, daß Insulin nicht mit dem Aldehyd reagierte, daß DAI-NHNHCONHNH&sub2; in Abwesenheit von Aldehyd stabil war, daß der Aldehyd stabil war und daß DAI-NHNHCONHNH&sub2; sauber unter Bildung eines einzigen hydrophoberen Konjugates reagierte. Unter ahnlichen Bedingungen reagierte DAI NHNHCONHNH&sub2; mit 4-Carboxybenzaldehyd (Fluka), um ein hydrophoberes Produkt bei der HPLC zu ergeben, das eine negativere Ladung (als DAI-NHNHCONHNH&sub2;) bei der Elektrophorese bei pH 8 aufwies, wahrend keine Reaktion mit unmodifiziertem Insulin stattfand.

Beispiel 2

Umsetzung von DAI-NHNHCONHNH&sub2; mit HCO-CO-Ferrioxamin, das mit &sup5;&sup5;Fe gekennzeichnet war.

In 0,2 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,6, wurde DAI- NHNHCONHNH&sub2; (hergestellt und gereinigt nach Beispiel 1) bei 22ºC mit einer Konzentration von 100 uM mit 560 uM HCO-CO-Ferrioxamin inkubiert (handelsübliches Deferoxamin wurde mit Boc-L-SerONsu acyliert, die Schutzgruppen abgetrennt, dann mit etwa 10&sup6;dpm &sup5;&sup5;Fe pro 112nMol gekennzeichnet und anschließend zur HCO-CO-Form unter Verwendung von Periodat in Ethylenglykol oxidiert; das Präparat wurde zur erforderlichen spezifischen Aktivität verdünnt). Nach 24 Stunden wurde die Probe einer Gel- Filtration auf einer Sephadex G50 Fein-Säule in 0,1 M Natriumacetat-Puffer unterworfen, worauf eine Flüssig-Scintillationszählung aller Fraktionen erfolgte. Die Ergebnisse zeigten praktisch die erwartete Aufnahme der Radioaktivität in die Proteinfraktion (14,3 % der Radioaktivität waren aufgenommen; im Hinblick auf das überschüssige Ferrioxamin- Reagens sollte die theoretische maximale Aufnahme bei 17,8 % liegen). Eine Kontroll- Inkubation von gekennzeichnetem HCO-CO-Ferrioxamin mit unmodifiziertem Insulin zeigte keine Aufnahme von Radioaktivität in die Protein-Fraktion.

Beispiel 3

Kupplung von 1,1-Carbonyldihydrazid an Des(pentapeptidB26-30)-Insulin unter Verwendung von Chymotrypsin.

1,1-Carbonyldihydrazid wurde an Des(pentapeptidB26-30-Insulin (DPI; hergestellt nach bekanntem Verfahren unter Verwendung von mildem peptischem Abbau von Schweine-Insulin und Reinigung durch Ionentauscher-Chromatographie über DFAE A25 in harnstoffhaltigem Tris-Puffer) unter Verwendung von Alpha-Chymotrypsin (Sigma Chemical Co.) unter den Bedingungen von Beispiel 1 gekuppelt mit Ausnahme dessen, daß die Stufe 5 mg betrug und die Reaktionszeit 24 Stunden dauerte. Die Analyse durch HPLC zeigte eindeutige Umwandlung (in etwa 62%iger Ausbeute) in ein früher eluierendes Produkt, das durch Elektrophorese auf Zelluloseacetat sowie seine Fähigkeit zur Bindung an ein Gel mit kovalent gebundenen Aldehydgruppen als das erwartete DPI- NHNHCONHNH&sub2; identifiziert wurde (unmodifiziertes Insulin band nicht an die Aldehydsäule).

Beispiel 4

Herstellung eines Carbonyldihydrazid-Derivats von IgG, das in der Größe einem F(ab')&sub2;- Fragment entsprach.

Zu 0,2 ml einer Lösung von IgG (10 mg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung) wurden 0,8 ml einer Lösung von 1,1-Carbonyldihydrazid (2,5 M, pH 5,5: hergestellt durch Auflösen von 50 g des Carbonyldihydrazids in 210 ml Wasser, Zusatz von 1,2 ml Eisessig und anschließend 1,5 ml Ameisensäure und Auffüllen auf 220 ml mit Wasser) zugesetzt. Festes Trypsin (Schweine-Trypsin, 2 mg) wurde zugesetzt und die Mischung bei 20ºC stehengelassen. Die Elektrophorese von kleinen Proben in einem System von Standard SDS-Acrylamid-Gel zeigte, daß ein zunehmender Abbau des IgG erfolgte. Ein Fragment, das die scheinbare Molekularmasse eines F(ab')&sub2; Moleküls hatte, war vorherrschend bei einem Abbau zwischen rund 24 Stunden bis 72 Stunden. Nach 72 Stunden war nur wenig IgG übrig. Die modifizierten Fragmente wurden durch Gel-Filtration auf einer 25 x 0,8 cm Säule (f.p.l.c.) Superose 12 von dem Trypsin isoliert. Der Säulenpuffer wurde durch Verdünnung der 2,5 M Carbonyldihydrazid-Lösung auf 2 M mit Wasser hergestellt. Die Strömungsgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/Minute.
Der Peak, der dem F(ab')&sub2; entsprach, war von dem des Trypsin fast vollständig getrennt und wurde auf der gleichen Säule in dem gleichen Puffer bis zur vollständigen Abtrennung des Enzyms rezykliert. Der Säulenpuffer wurde dann auf 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; geändert und es wurde 1 ml einer 2 mg/ml Lösung von Sojabohnen-Trypsin- Inhibitor durch das System laufen gelassen. Dann wurde das Carbonyldihydrazid von dem F(ab')&sub2;-artigen Material auf dieser Säule abgetrennt.
Das Produkt eines 24-stündigen Abbaus unter den obigen Bedingungen wurde wie oben angegeben isoliert und es zeigte sich, daß ein Einbau des Hydrazids von 0,06 Mol/Mol IgG stattgefunden hatte.

Beispiel 5

Herstellung eines Konjugates aus Fab-artigem IgG und Ferrioxamin

Zu einer Probe von IgG-Antikörper (0,5 ml, 23,3 mg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung, von dem es bekannt war, daß er bei Trypsin-Abbau Fab-artige Fragmente ergibt) wurden 50ul Trypsin (Schweine-Trypsin, TPCK-behandelt 15 mg/ml in 10&supmin;³M HCl) zugesetzt und die Mischung wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Weitere 100ul der Trypsin-Lösung wurden dann zugesetzt und der Abbau weitere 21,5 Stunden vor sich gehen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt hatte sich ein weißer Niederschlag gebildet. Es wurde festes 1,1-Carbonyldihydrazid (155 mg) zu dem Abbau zugesetzt und nach 1 Stunde und 20 Minuten wurde die Reaktion durch Zusatz von 200ul pankreatischem Trypsin-Inhibitor (Bayer, 13 mg/ml) abgebrochen.
Nach einer entsprechenden Aufarbeitung und Kupplung an aldehydisches Ferrioxamin (hergestellt nach der Beschreibung in Beispiel 2) wurde gefunden, daß etwa 20 % der Fab-artigen IgG-Moleküle gekennzeichnet waren. Etwa 90 % dieser Radioaktivität war in einem anschließenden Trypsin-Abbau entfernbar, was erläutert, daß die Kennzeichnung im wesentlichen an Trypsin-empfindlichen Stellen an dem C-Terminus stattgefunden hatte.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1)

A-CO-N(R¹)N(R²) -Z¹- -Z²-N(R³)NHR&sup4; (1)

worin A-CO- für den Rest eines Proteins oder Peptids A-CO&sub2;H steht, in welchem -CO&sub2;H die C-terminale Carboxylgruppe des Proteins oder Peptids ist;

R¹, R², R³ und R&sup4;, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe stehen;

Z¹ und Z², die gleich oder verschieden und anwesend oder abwesend sein können, jeweils eine Abstandsgruppe darstellen;

X für ein Sauerstoff- oder Sehwefelatom steht;

und der Salze derselben,

bei welchem Verfahren eine Verbindung der Formel (2):

A-CO&sub2;H (2)

oder ein aktiviertes Derivat derselben mit einer Verbindung der Formel (3)

R¹NHN(R²) -Z¹- -Z²-N(R³)NHR&sup4; (3)

in Gegenwart eines Enzyms, das zur Katalysierung der Bildung einer Peptidbindung befähigt ist, kondensiert wird.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem Z¹ und Z² fehlen.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils für ein Wasserstoffatom stehen.

4. Ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem X für ein Sauerstoffatom steht.

5. Ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem A-CO der Rest eines Immunglobulins oder eines Fragmentes desselben ist.

6. Ein Verfahren-nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils für Wasserstoff stehen, Z¹ und Z² fehlen und X ein Sauerstoffatom bedeutet.

7. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (4):

A-CO-N(R¹) N(R²) -Z¹- -Z²-N(R³)-Y-R (4)

worin A-CO, R¹, R², R³, Z¹, Z² und X die in einem der Ansprüche 1 bis 6 genannte Bedeutung haben,

R ein Protein oder ein Peptid oder eine Effektor- oder Reportergruppe darstellt und

Y eine Verbindungsgruppe bedeutet, die gebildet ist durch Kopplung der Gruppe -NHR4 in der Formel (1) (in welcher R&sup4; für ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe steht) mit einer reaktiven Gruppe in der Gruppe R,

welches Verfahren die Herstellung einer Verbindung der Formel (1):

A-CO-N(R¹)N(R²)-Z¹- -Z²-N(R³)NHR&sup4; (1)

nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und die Kopplung der genannten Verbindung der Formel (1) mit einem Protein oder Peptid oder einer Effektor- oder Reportergruppe, die eine zur Reaktion mit der Gruppe -NHR&sup4; befähigte Gruppe besitzt, umfaßt.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem das Protein oder das Peptid oder die Effektor- oder Reportergruppe eine Aldehydgruppe besitzt.