DE3751537T2

DE3751537T2 - Polypeptid- und Proteinderivate und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE3751537T2
Application number: DE3751537T
Authority: DE
Inventors: Robin Ewart Offord; Keith Rose
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-04-30
Filing date: 1987-04-28
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2007-04-29
Also published as: US20070037967A1; JP2528464B2; JPS62267300A; GB8610551D0; US7538182B2; EP0243929B1; JP2900992B2; DE3751537D1; EP0243929A2; CA1341053C; EP0243929A3; JPH08259600A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptid- und Proteinderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung und neue Zwischenprodukte von ihnen. Die neuen Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Polypeptide und Proteine, welche über eine Zwischengruppe, die mindestens einen Rest der Formel -C(R)=N- (oder - N=C(R)-) oder -CH(R)-NH- (oder -NH-CH(R)-) enthält, worin R Wasserstoff, eine aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche substituiert sein kann, mit sich oder untereinander mit einem anderen Polypeptid oder Protein oder mit einer Reportergruppe oder einem zytotoxischen Mittel konjugiert sind. Diese Verbindungen werden durch Kondensation von zwei Reaktanten erhalten, von welchen einer ein Aldehyd (oder acetalisierter Aldehyd) oder Keton und der andere eine Aminoverbindung ist, wobei so eine Schiffsche Base oder eine Verbindung vom Azomethin-Typus erhalten wird, welche, falls erwünscht oder notwendig, in einer weiteren Reaktion stabilisiert werden kann, z. B. durch eine Reduktion des Restes -C(R)=N- (oder -N=C(R)-) zu einem Rest -CH(R)-NH- (oder -NH-CH(R)-).
Bei der Diagnose von vielen Krankheitsformen sowie beim Verfolgen der Wirkungen der Behandlung ist es oft erwünscht, markierte Proteine zu verwenden, welche an spezifische Target-Strukturen im Körper binden. Wenn zum Beispiel Krebs diagnostiziert oder behandelt wird, wäre es zweckmäßig, wenn sowohl primäre Tumore als auch Metastasen unter Verwendung markierter, tumorspezifischer Antikörper nachgewiesen werden könnten. Es sind viele Berichte über das Markieren von Proteinen und Antikörpern durch statistischen chemischen Angriff auf ihre Seitenketten erschienen. In einem solchen Verfahren werden am häufigsten die Seitenketten der Tyrosine jodiert (Mach et al., Cancer Research 43 5593-5600 [1983]), oder werden die Seitenketten der Lysine acyliert. In diesem letzteren Fall geschieht die Acylierung oft durch Gruppen, welche Metalle chelatisieren (z. B. Hnatowich et al., Science 220, 613-615 [1983]. Anschließend können die chelatisierenden Gruppen verwendet werden, radioaktive Metalle zu binden. Es wurde auch vorgeschlagen, jedoch bis heute nicht zufriedenstellend geprüft, paramagnetische Ionen für ein Abbilden mittels kernmagnetischer Resonsanz (NMR) an solche Moleküle zu binden (Brady et al., Magnetic Resonance in Medicine 1 286 [1984]). Die europäische Patentanmeldung EP-A2-0088695 offenbart eine kovalente Anbringung von Konjugatpartnern über Kohlehydratketten von Antikörpern. Das Markieren von Proteinen, insbesondere Antikörpern, wurde jedoch bis heute stets auf eine mehr oder weniger statistische Weise bewirkt.
Statistische Substitutionen an biologisch aktiven Proteinen, zum Beispiel statistische Substitutionen an Antikörper-Molekülen, können eine Reihe von Nachteilen aufweisen:
1. Falls zufällig eine besonders reaktive Stelle in der aktiven Stelle des Proteins vorhanden ist, würde eine Substitution an dieser Stelle das Protein möglicherweise inaktivieren, z. B. ein besonders wertvoller monoklonaler Antikörper könnte vollständig unbrauchbar gemacht werden, falls zufällig eine Seitenkette, die für eine Substitution besonders reaktiv ist, in der Antigenbindungsstelle liegt. Die Substitution würde daher den Antikörper inaktivieren.
2. Sogar wenn die aktive Stelle des Proteins (z. B. ein Antikörper) nicht ernsthaft beschädigt wird, könnte eine große Anzahl von Substitutionen am Protein - was zweckmäßig sein könnte, z. B. um eine hohe Intensität im Fall einer radioaktiven Markierung über chelatisierende Gruppen zu haben - seine physikochemischen Eigenschaften (z. B. die Löslichkeit) verändern.
3. Ein statistisches, mehrfach substituiertes Produkt bildet ein heterogenes Gemisch von Molekülen mit verschiedenen Eigenschaften und Problemen, konstante Eigenschaften von Charge zu Charge sicherzustellen, welche Probleme damit begleitet sind.
Die vorliegende Erfindung wendet in einem Hauptaspekt die Tatsache an, daß Enzyme bifunktionelle Reagenzien mit geeigneten reaktiven Gruppen an spezifische Stellen in Polypeptiden oder Proteinen (z. B. Antikörper) lenken können. Diese Stellen sind vorzugsweise der Carboxylterminus der Polypeptidkette, welcher zumindest hinsichtlich der Primärstruktur in den meisten Fällen von der aktiven Stelle der Proteine weit entfernt ist. Dies trifft insbesondere bei Antikörpermolekülen zu, wo der Carboxylterminus von der Antigenbindungsstelle am weitesten entfernt ist. Das Problem Nr. 1, das oben erwähnt ist, kann mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beseitigt werden. Die Beschränkung der Substitution auf eine spezifische Stelle, wie z. B. der Carboxylterminus, eliminiert auch die obigen Probleme Nr. 2 und Nr. 3.
Beispiele von bifunktionellen Reagenzien mit geeigneten reaktiven Gruppen sind Verbindungen mit einer Aminogruppe an einem Ende und mit einer Formyl- oder Aminogruppe (vorzugsweise in geschützter Form) am anderen Ende, wie z. B. o-, m- oder p-Formylphenylalanin.
Die Polypeptid- und Proteinderivate der vorliegenden Erfindung können daher durch eine Kondensationsreaktion zwischen einem Aldehyd oder Keton und einer Aminoverbindung hergestellt werden, um das erwünschte Derivat des Azomethin- oder des Schiffschen Basentypus zu ergeben, und, falls zweckmäßig, eine anschließende Reduktion des Restes -C=N- (welcher relativ labil ist, wenn einer der Reaktionspartner ein Amin und das Produkt eine Schiffsche Base ist), um ein korrespondierendes Derivat zu bilden, welches einen Rest -CH&sub2;- NH- enthält. Die Aminoverbindung kann ein Amin, ein O-alkyliertes Hydroxylamin oder ein Hydrazid sein. Im Fall eines O-alkylierten Hydroxylamins, welches mit einer Carbonylverbindung (Aldehyd oder Keton) reagiert, werden Oxime erhalten, welche einen Rest -C(R)=N-O- enthalten. Da solche Verbindungen relativ stabil sind, ist keine anschließende Reduktion, obwohl möglich, notwendig, um ein korrespondierendes Derivat zu bilden, welches einen Rest - CH(R)-NH-O- enthält. Im Fall eines Hydrazids, welches mit einer Carbonylverbindung reagiert, wird das Reaktionsprodukt einen Rest -C(R)=N-NH- enthalten, welcher wieder relativ stabil ist und keine Reduktion zur Bildung eines korrespondierenden Derivates, welches einen Rest -CH(R)-NH-NH- enthält, benötigt.
Das Grundreaktionsschema, welches die folgende Erfindung anwendet, ist
> C=O + H&sub2;N- → > C=N- → > CH-NH-.
In diesem Schema wird eine komplementäre Gruppe (Carbonyl oder Amino) am N- oder C- Terminus eines Proteins oder Polypeptids unter milden Bedingungen angeordnet. Um eine Spezifität zu erzielen (Unterscheidung zwischen einer angebrachten Aminogruppe und Lysinseitenketten des Proteins oder Polypeptids) muß eine reaktive Aminogruppe, die an einem Protein angebracht ist, eine aromatische sein, d. h., sie muß direkt an einer aromatische Gruppe, wie z. B. Phenyl, angebracht sein, oder sie muß direkt an -O- oder an -NH-CO- angebracht sein, d. h., sie muß ein O-Alkylhydroxylamin bzw. ein Hydrazid sein.
Falls zumindest eine der reaktiven Gruppen (Carbonyl- oder Aminogruppe) der Reaktionspartner aromatisch ist, vorzugsweise, falls beide aromatisch sind, wurde gefunden, daß die Kondensationsreaktion schnell und in hohem Ausmaß effizient ist, und zwar sogar bei überraschend geringen Konzentrationen an Reaktanten. Die beteiligten Reaktivitäten sind ausreichend hoch, um eine Anbringung von z. B. einer polymeren chelatisierenden Gruppe an die spezifische Stelle zu erlauben, was bedeutet, daß es zu Lasten einer einzigen Modifikation an einer spezifischen Stelle auf dem Protein, von der bekannt ist, daß sie für diesen Zweck sicher ist, möglich ist, praktisch so viele der erwünschten Substituentengruppen einzubringen, wie für eine hohe Radioaktivität erforderlich ist. Dieses Merkmal gestattet wiederum, das oben angesprochene Problem Nr. 2 zu überwinden, da eine hohe Zahl von Substitutionen, die über das gesamte Protein verbreitet sind, um eine Markierungsintensität zu erzielen, die hoch genug ist, nicht länger erforderlich ist.
Aus den oben diskutierten Gründen ist es gewöhnlich bevorzugt, daß die Gruppe, welche an der Kondensationsreaktion teilnehmen soll, eine Verbindung vom Schiffschen Basentypus bildet, welche über enzymatische Verfahren spezifisch an dem Carboxyterminus des Proteins oder Polypeptids angebracht ist.
Unter gewissen Umständen kann es jedoch zufriedenstellend und zweckmäßig sein, Schiffsche Basen-Bindungen über Gruppen zu bilden, die am Aminoterminus eingebracht sind, und Gruppen, die mit anderen Verfahren eingebracht sind. Gewöhnlich, aber nicht immer, sind solche Verfahren weniger spezifisch als das Carboxy-terminale enzymatische Verfahren. Bedingungen, unter welchen diese anderen Verfahren angewendet werden könnten, sind:
(i) in Fällen, wo der Carboxy-terminale Bereich für eine Funktion wichtig ist oder aus anderen Gründen nicht verändert werden sollte, und
(ii) wo besondere Eigenschaften des Proteins oder Polypeptids, z. B. sein Besitz einer einzigen oder ziemlich wenigen Seitenkettenreste einer Aminosäure, für welche spezifische chemische Modifikationsreagenzien vorhanden sind oder gestaltet werden können, auf brauchbare Weise ausgenutzt werden können.
Im Kontext der vorliegenden Beschreibung und der vorliegenden Ansprüche soll sich der Ausdruck "Schiffsche Base" auf alle Protein- und Polypeptidderivate erstrecken, welche einen Rest > C=N- aufweisen, und umfaßt somit Verbindungen, wie z. B. Oxime oder Hydrazone. Eine breite Vielzahl gruppenspezifischer Reagenzien für eine Proteinmodifikation sind bekannt, welche die Modifikation, und zwar mit verschiedensten Spezifitätsgraden, der funktionellen Gruppen gestatten, welche in den Proteinen vorhanden sind, gestatten. Ferner sind viele Beispiele vorhanden, wo zwei der chemisch reaktiven Gruppen, welche in solchen Reagenzien vorhanden sind, in ein einziges Molekül eingebracht worden sind, um ein zweiwertiges Reagens vorzusehen (siehe z. B. den Katalog von Pierce Chemical Co., dem führenden Hersteller von Proteinvernetzungsreagenzien der Welt). Bis heute wurde jedoch keines dieser Reagenzien für die Chemie der Schiffschen Basen verwendet. Es sollte erwähnt werden, daß ein großer Vorteil beim Kombinieren, und zwar im gleichen Molekül, einer Gruppe, welche mit funktionellen Gruppen von Proteinen oder Polypeptiden reagieren kann, mit einer Gruppe zu erzielen sein sollte, welche (nach Entschützung, falls sie in geschützter Form vorliegt) eine Schiffsche Basen-Bindung mit einer komplementären Gruppe auf einem anderen Molekül, nämlich einer Carbonyl- oder Aminogruppe, bilden kann. Solche Reagenzien werden durch die allgemeine Formel R³-X-R¹ dargestellt, worin R³ eine chemische Gruppe ist, welche mit funktionellen Gruppen von Proteinen oder Polypeptiden reagiert, X eine zweiwertige organische Gruppe ist, oder fehlen kann, jedoch vorzugsweise ein aromatischer Rest ist, der direkt an R¹ gebunden ist und eine aromatische Gruppe sein muß, oder Sauerstoff, der direkt an R¹ angebracht ist, wo R¹ Amino oder geschütztes Amino und R¹ Carbonyl, acetalisiertes Formyl (z. B. Dimethoxy- oder Diethoxymethyl), Amino oder geschütztes Amino ist. Geeignete Aminoschutzgruppen sind solche, welche stabil genug sind, der Anbringung von R³ an das Polypeptid oder Protein zu widerstehen, obgleich sie labil genug sind, unter Bedingungen entfernt werden zu können, welche das Polypeptid oder Protein nicht irreversibel denaturieren. Viele solche Gruppe sind im Stand der Technik gut bekannt, z. B. Citraconyl, Trifluoracetyl, Boc, BPOC, MSC. Geeignete Gruppen für R³ sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Means, G.E. und Feeney, R.E. [1971] "Chemical Modification of Proteins", Holden-Day, San Francisco): Gruppen, welche mit Aminogruppen selektiv reagieren, sind z. B. Aktivester, wie Hydroxysuccinimidester, ortho-Nitrophenylester, Imidate und Halogenaromaten mit einem Kern, der für eine nukleophile Substitution aktiviert ist; Gruppen, welche mit Sulfliydrylgruppen gezielt reagieren können, z. B. Halogenalkyle, aktivierte Disulfide, Aziridine, aktivierte Vinylverbindungen; Gruppen, welche gezielt mit Guanidogruppen reagieren können, sind z. B. alpha- oder beta-Dicarbonyle; für aromatische Gruppen selektive Reagenzien sind z. B. Diazoniumverbindungen; für Indolgruppen selektive Verbindungen sind z. B. aromatische Sulphenylhalogenide, und für Carboxylgruppen selektive Reagenzien sind z. B. Diazoalkane und Aminoverbindungen, in der Gegenwart von kondensierenden Reagenzien, wie z. B. DCCI.
Die Polypeptid- und Proteinderivate der vorliegenden Erfindung können durch die Formel
A-X-Z-X'-B (I)
dargestellt werden, worin
A der Rest eines Proteins oder Polypeptids ist,
B der Rest eines Proteins oder Polypeptids, einer Reportergruppe oder eines cytotoxischen Mittels ist;
X und X' voneinander unabhängig andere zweiwertige organische Reste sind oder fehlen können;
Z ein zweiwertiger Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe von -C(R)=N-, -N=C(R)-, -CH(R)- NH, -NH-CH(R)-, -C(R)=N-Y-N=C(R)-, -N=C(R)-Y-C(R)=N-, -CH(R)-NH-Y-NH-CH(R)- oder -NH-CH(R)-Y-CH(R)-NH-, worin R Wasserstoff, eine aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche Gruppe mit mindestens einem aromatischen Rest, Sauerstoff oder Stickstoff, direkt an Stickstoff angebracht, substituiert sein kann, und
Y eine zweiwertige organische Gruppe ist,
und Salze davon.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf Salze der oben erwähnten Protein- und Polypeptidderivate, insbesondere auf ihre Metallsalze. Die interessantesten unter den Salzen sind die Metallchelatkomplexe, die für ein Abbilden in vivo brauchbar sind.
Die Verbindungen der Formel I sind also Derivate von Polypeptiden oder Proteinen. Typische Polypeptide und Proteine, deren Reste in der Formel I mit A und B bezeichnet sind, sind einerseits solche, die in der Natur vorkommen und von der Natur isoliert werden können, und zwar unabhängig davon, ob ihre Struktur und/oder ihre Aminosäuresequenzen und ihr Glycosylierungsmuster bereits identifiziert worden ist oder nicht, und andererseits jene, welche synthetisch oder semisynthetisch synthetisiert worden sind oder werden können, und zwar gemäß Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind Derivate von Polypeptiden und Proteinen von medizinischem Interesse, und zwar z. B. Derivate von Immunglobulinen, insbesondere Antikörper des IgG-Typus. Es wird anerkannt werden, daß nicht nur vollständige Antikörper unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung markiert oder derivatisiert werden können, sondern auch ihre Untereinheiten, welche noch funktionell sind, wie z. B. F(ab')&sub2;- oder Fab-Fragmente.
Die Formel I umfaßt Verbindungen der folgenden Typen:
A - X - C(R) = N - X' - B (I-A')
A - X - N = C(R) - X' - B (I-A'')
A - X - CH(R) - NH - X' - B (I-B')
A - X - NH - CH(R) - X' - B (I-B'')
A - X - C(R) = N - Y - N = C(R) - X' - B (I-C')
A - X - N = C(R) - Y - C(R) = N - X' - B (I-C'')
A - X - CH(R) - NH - Y - NH - CH(R)- X' - B (I-D')
A - X - NH - CH(R) - Y - CH(R) - NH - X' - B (I-D'')
worin A, B, X', X', R und Y wie oben definiert sind.
Mit R = Wasserstoff (d. h., wo einer der Reaktionspartner ein Aldehyd oder ein geschützter Aldehyd ist) werden Verbindungen der folgenden allgemeinen Formeln erhalten:
A - X - CH = N - X' - B (I-a')
A - X - N = CH - X' - B (I-a'')
A - X - CH&sub2; - NH - X' - B (I-b')
A - X - NH - CH&sub2; - X' - B (I-b'')
A - X - CH = N - Y - N = CH - X' -B (I-c'))
A - X - N = CH - Y - CH = N - X' - B (I-c'')
A - X - CH&sub2; - NH - Y - NH - CH&sub2;- X' - B (I-d')
A - X - NH - CH&sub2; - Y - CH - NH - X' - B (I-d'')
worin A, B, X, X' und Y wie oben definiert sind.
In dem Fall, wo B für einen Protein- oder Polypeptidrest steht, können diese Reste von A verschieden sein oder identisch zu A sein. Im ersten Fall können Heterodimere von Proteinen und Polypeptiden und im zweiten Fall Homodimere von Proteinen und Polypeptiden erhalten werden.
B kann alternativ den Rest eines zytotoxischen Mittels oder einer Reportergruppe darstellen. Zytotoxische Mittel im vorliegenden Kontext werden so definiert, daß sie alle Verbindungen umfassen, die in der Regel von diesem Ausdruck subsumiert werden, wie z. B. Zytostatika und Toxine. Zytostatika von besonderem Interesse sind jene chemotherapeutisch aktiven Verbindungen gegen Krebs, d. h. Cancerostatika (Carcinostatika). Der Ausdruck "Reportergruppe" soll Verbindungen definieren, welche durch analytische Mittel in vitro und/oder in vivo auf einfache Weise nachweisbar sind und welche diese Eigenschaft auf Verbindungen übertragen, an welche sie gebunden werden. Dieser Ausdruck umfaßt z. B. jede organische Verbindung/Gruppe, welche stark an Metalle (einschließlich und vorzugsweise radioaktive Metalle) binden können. Besonders bevorzugt unter solchen Reportergruppen sind metallchelatisierende Mittel/Gruppen (Chelone), z. B. Desferrioxamin oder DTPA (systematische Bezeichnungen siehe unten). Neben der Tatsache, daß sie eine Verbindung/Gruppe sind, welche radioaktiv markiert werden kann, können Reportergruppen fluoreszierende Gruppen sein oder Gruppen, die mittels NMR- oder ESR-Spektroskopie überwacht werden können.
Die Gruppen X und X' können fehlen oder zweiwertige Reste aliphatischer, aromatischer oder araliphatischer Verbindungen darstellen und substituiert sein. X und X' können identisch sein oder können sich voneinander unterscheiden, z. B., es kann nur eine vorhanden sein. Bevorzugte Gruppen X und X' sind aromatische Reste, z. B. -NH-C&sub6;H&sub4;- oder araliphatische Reste, z. B. -NH-CH&sub2;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-, -NH-CH(COOCH&sub3;)-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;- oder -NH- CH(CONH&sub2;)-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-, da das Bilden der Verbindungen vom Typus der Schiffschen Basen in diesem Fall begünstigt ist. Beispiele aliphatischer Gruppen X oder X' sind -O-CH&sub2;-CO-, - NH-CH&sub2;-CO, -NH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-CH&sub2;-. Es ist absolut notwendig, daß in dem Fall, daß aliphatische Aminogruppen im Protein- oder Polypeptidmolekül vorhanden sind (wobei der letztere Fall in der Regel dann zutrifft, wenn z. B. Lysin vorhanden ist), die aromatische Gruppe an das N-Atom der Gruppe Z der Formel -N=CH- oder -NH-CH&sub2;- angebracht ist, was bedeutet, daß die Bildung der Schiffschen Base über eine aromatische Aminogruppe an der Seitenkette des Proteins oder Polypeptids auftritt. Im Fall, daß das Protein, das Polypeptid oder das zytotoxische Mittel oder die Reportergruppe bereits eine solche aromatische Aminogruppe enthält, über welche die Kopplung bewerkstelligt werden kann, werden X und/oder X' fehlen. In diesem Fall stammt das N-Atom von Z vom Ausgangsprotein, -polypeptid, vom zytotoxischen Ausgangsmittel oder von der Ausgangsreportergruppe. Das gleiche trifft hinsichtlich einer aromatischen Formylfunktion zu.
Um die höchste Spezifität in der Kopplungsreaktion zu erreichen, ist es bevorzugt, entweder aromatische Aldehyde und aromatische Aminoverbindungen zu verwenden, so daß in den Schiffschen Basen-Verbindungen, die erhalten werden, die Reste sowohl dem N- als auch dem C-Atom der Gruppe -CH=N- oder -N=CH- benachbart sind, aromatische Gruppen sind, vorzugsweise Phenylengruppen, oder Ketone und O-Alkylhydroxylamine zu verwenden.
Im Fall, daß einer der Reaktionspartner ein Keton ist, ist es bevorzugt, Aminoverbindungen zu verwenden, welche stärkere Nukleophile als Arylaminoverbindungen sind, und von welchen bekannt ist, daß sie schnell, spezifisch und unter milden Bedingungen mit Carbonylgruppen reagieren. Solche Aminoverbindungen sind z. B. substituierte Hydrazine (Hydrazide) und O-substituierte, vorzugsweise O-alkylierte, Hydroxylamine, wie NH&sub2;-O-CH&sub2;-COOH. Die Stabilität bei nicht extremen pH-Werten von Hydrazonen und Oximen bedeutet, daß der Reduktionsschritt > C=N-X → > CH-NH-X, welcher erforderlich ist, wenn X Aryl ist, nicht notwendig ist, obgleich er möglich ist. In dem Fall, wo eine Hydroxylainoverbindung verwendet wird, wird eine nukleophile Verbindung der Formel I erhalten, worin Z ein zweiwertiger Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe von
-CH=N-O-, O-N=C(R)-, -CH(R)-NH-O-, -O-NH-CH(R)-, -C(R)=N-O-Y-O-N=C(R)-, -O-N=C(R)-Y-C(R)=N-O-, -CH(R)-NH-O-Y-O-NM-CH(R)- und -O-NH-CH(R)-Y-CH(R)-NH-o-,
wobei R und Y oben definiert sind.
Verbindungen der Formeln I-C', I-C'', I-D' und I-D'' werden erhalten, wenn eine Diaminoverbindung der Formel H&sub2;N-Y-NH&sub2; oder eine Dicarbonylverbindung der Formel OC(R)-Y- C(R)O mit einer Carbonyl- bzw. einer Aminoverbindung umgesetzt wird. Y kann jede zweiwertige organische Gruppe, d. h., eine aliphatische, aromatische oder ayraliphatische Gruppe, sein. Aus offensichtlichen Gründen sind einfache Moleküle bevorzugt. Eine am meisten bevorzugte aromatische Gruppe Y ist Phenylen, während im Fall einer aliphatischen Gruppe Y diese Gruppe zwei O- oder NH-Reste aufweist. Es ist auch klar, daß, obwohl Verbindungen der Formeln I-C', I-C'', I-D' und I-D'' unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden können, die im Stand der Technik gut bekannt sind, worin A und B und/oder X und X' verschieden sind, die bevorzugten Verbindungen dieses Typus jene sind, worin B identisch ist mit A, und X' identisch ist mit X (einschließlich der Möglichkeit, daß beide letzteren Gruppen fehlen). Auf diese Weise sind symmetrische Proteine oder Polypeptiddimere erhältlich, welche beinahe spezifisch über eine Kette -C-N-Y-N-C- oder -N-C-Y-C-N- gekoppelt sind.
Die Verbindungen der Formel I und ihre Salze werden gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten durch ein Kondensieren einer Verbindung der Formel
A-X-R¹ (II)
worin R¹ -CO-R, acetalisiertes Formyl oder Amino ist, und A, X und R wie oben definiert sind,
mit einer Verbindung der Formel
R²-X'-B (III)
worin R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist, und X', B und R wie oben definiert sind, oder ein Kondensieren einer Verbindung der obigen Formel II mit einer Verbindung der Formel
R²-Y-R² (IV)
worin Y wie oben definiert ist, und R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist,
um eine Schiffsche Base zu bilden, und, falls erwünscht, Reduzieren des(der) Reste(s) - C(R)=N- oder -N=C(R)-, gebildet durch die Kondensation, zu Resten -CH(R)-NH- bzw. -NH- CH(R)-, und, falls erwünscht, Bilden eines Salzes.
Es wird also entweder eine Carbonylverbindung A-X-C(R)O, im Fall von R = H ein Aldehyd oder ein Acetal davon, vorzugsweise das Methyl- oder Ethylacetal, mit einer Aminoverbindung, vorzugsweise einem aromatischen Amin H&sub2;N-X'-B oder einem O-Derivat von Hydroxylamin, oder eine Aminoverbindung, vorzugsweise ein aromatisches Amin A-X-NH&sub2; oder ein O-Derivat eines Hydroxylamins, mit einer Carbonylverbindung O(R)C-X'-B umgesetzt, im Fall von R = H einem Aldehyd oder einem korrespondierenden Acetal, vorzugsweise dem Methyl- oder Ethylacetal, um die Schiffsche Base zu bilden.
Falls symmetrische Bisproteine oder Bispolypeptide erwünscht sind, wird eine Carbonylverbindung A-X-C(R)O oder ihr Acetal, im Fall R = H, mit einer Diaminoverbindung H&sub2;N-Y-NH&sub2; umgesetzt, oder eine Aminoverbindung A-X-NH&sub2;, vorzugsweise eine aromatische Aminoverbindung oder ein O-Derivat von Hydroxylamin, wird mit einer Carbonylverbindung O(R)C-Y-C(R)O oder einem Acetal davon, im Fall R = H, umgesetzt.
Wie von den Definitionen für A, B und Z oben folgt, sind die Amino- oder Carbonyl- (oder acetalisierten Formyl)-Gruppen R¹ und R² in den Verbindungen der Formeln II und in, welche an der Bildung der Bindung vom Typus der Schiffschen Basen teilnehmen, an die Reste A und/oder B entweder über die zweiwertige organische Gruppe X bzw. X' gebunden, oder können ein Teil der Reste A bzw. B sein, in welchem letzteren Fall X und/oder X' in der erhaltenen Verbindung der Formel I fehlt bzw. fehlen.
Es sollte erwähnt werden, daß mindestens eine der reagierenden Carbonyl- und Aminogruppen eine aromatische Gruppe ist, das heißt, daß sie direkt an eine aromatische Gruppe gebunden ist, so daß in einer Verbindung der Formel I mindestens eine aromatische Gruppe direkt an Z angebracht ist, oder daß, alternativ, im Fall einer aliphatischen Carbonylverbindung die Aminoverbindung ein Hydrazid oder ein Hydroxylamin-O-Derivat ist.
Folglich muß, falls in einer Verbindung A-X-R¹ (II) X eine aliphatische Gruppe aufweist, die an R¹ angebracht ist, die reaktive Carbonyl- oder Aminofunktion R² in der Verbindung der Formel III eine aromatische oder eine araliphatische sein, d. h., daß X' muß eine aromatische Gruppe, die an R² angebracht ist, haben, oder die Aminofunktion sollte von Hydrazin oder Hydroxylamin abgeleitet sein, während, falls X eine aromatische Gruppe besitzt, die an R¹ angebracht ist, oder die Aminofunktion von Hydrazin oder Hydroxylamin abgeleitet ist, die reaktive Carbonyl- oder Aminofunktion R² in der Verbindung der Formel in an entweder eine aromatische oder aliphatische Gruppe angebracht sein kann, wobei jedoch eine aromatische Gruppe bevorzugt ist.
Die Struktur der aliphatischen oder aromatischen Gruppen X' und/oder X ist nicht kritisch. Die aromatische Gruppe kann von einem Kohlenwasserstoff oder von einem Heterozyklus abgeleitet sein: Sie sind vorzugsweise von Benzol abgeleitet, d. h., daß eine von ihnen oder beide ein Phenylenrest ist, welcher substituiert sein kann. Die einzige Beschränkung im Hinblick auf die Substituenten X' und/oder X besteht darin, daß sie die Reaktion der Amino- oder Carbonylgruppe nicht stören sollten, d. h., daß sie nicht statt der Amino- oder Carbonylgruppen reagieren sollten, daß sie kein sterisches Hindernis sein sollten oder daß sie nicht die reaktiven Gruppen inaktivieren sollten.
Verbindungen der folgenden allgemeinen Formeln sind Beispiele von Untergruppen von Verbindungen der allgemeinen Formel I.
A - C(R) = N - X' - B (I-E')
A - X - C(R) = N - B (I-F')
A - C(R) = N - B (I-G')
A - N = C(R) - X' - B (I-E'')
A - X - N = C(R) - B (I-F'')
A - N = C(R) - B (I-G'')
A - C(R) - NH - X' - B (I-H')
A - X - C(R) - NH - B (I-I')
A - C(R) NH - B (I-K')
A - NH - C(R) - X' - B (I-H'')
A - X - NH - CH(R) - B x(I-II'')
und A - NH - CH(R) - B (I-K'')
Mit R = Wasserstoff (d. h., daß einer der Reaktionspartner ein Aldehyd oder ein geschützter Aldehyd ist) werden Verbindungen der folgenden Untergruppen der allgemeinen Formel I erhalten:
A - CH = N - X' - B (I-e')
A - X - CH = N - B (I-f')
A - CH = N - B (I-g')
A - N = CH - X' - B (I-e'')
A - X - N = CH - B (I-f'')
A - N = CH - B (I-g'')
A - CH&sub2; - NH - X' - B (I-h')
A - X - CH&sub2; - NH - B (I-i')
A - CH&sub2; - NH - B (I-k')
A - NH - CH&sub2; - X' - B (I-h'')
A - X - NH - CH&sub2; - B (I-i'')
und A - NH - CH&sub2; - B (I-k'').
Die Kondensation zwischen den Verbindungen II und III kann gemäß Verfahren ausgeführt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, und zwar unter milden Bedingungen und in verdünnten Lösungen. Die Reaktion, die am meisten studiert wurde, war jene von Des- AlaB30-insulin-B29-formanilid mit m-Aminobenzoylferrioxamin B. Die brauchbarsten Bereiche von Bedingungen werden unmittelbar im folgenden beschrieben. Wie jedoch von den beigefügten Beispielen gesehen werden kann, sind die Reaktionsbedingungen auf einfache Weise und erfolgreich auf andere Reaktanten anwendbar, und zwar trotz beträchtlicher Unterschiede in ihrer Natur.
Die Reaktion kann mit guten Ergebnissen in einem pH-Bereich von 3,5-5,5 ausgeführt werden. Es kann jeglicher geeigneter wäßriger Puffer verwendet werden. Normalerweise war der Puffer wäßrige Essigsäure (1%, Vol./Vol.), eingestellt auf den erwünschten Wert mit NaOH-Lösung. Insulinderivate sind am oberen Ende dieses pH-Bereiches schlecht löslich, aber die Zugabe von festem Harnstoff überwand dieses Problem ohne irgendeine nachweisbare Wirkung auf die Kopplungseffizienz. Dimethylformamid konnte ebenfalls als ein Solubilisierungsmittel verwendet werden, jedoch bei einer geringfügigen Verlangsamung der Kopplung. Almliche Probleme mit anderen Proteinderivaten können auf eine ähnliche Weise überwunden werden.
Die Konzentration des Insulin-Aldehyd-Derivats war gewöhnlich zwischen 500 uMol und 1 mMol, jene des anderen Reaktanten, m-Aminobenzoylferrioxamin B, war gewöhnlich zwischen 500 uMol und 2,5 mMol. Die Reaktanten können in äquimolaren Mengen oder bis zu einem mehrfachen Überschuß an einer der Komponenten verwendet werden.
Die Kopplungen können bei Umgebungstemperatur ausgeführt werden. Die Halbwertszeit dieser Reaktionen, beurteilt mittels HPLC nach einem Löschen durch Verdünnung in Säure, ist in der Größenordnung von einer bis zwei Minuten. Nach 20-40 Minuten sind die Ausbeuten in der Regel bereits am Maximum und ist das Ausgangsprodukt beinahe nicht mehr nachweisbar.
Das Protein-Carbonyl-Derivat kann entweder als freie Carbonylverbindung oder, besonders im Fall eines aromatischen Aldehyds, als ein Acetal, vorzugsweise als das Methyl- oder Ethylacetal, verwendet werden. Die freie Verbindung koppelte noch immer in effizienter Weise nach Lagerung als ein gefriergetrocknetes Pulver bei Raumtemperatur während einiger Monate. In der Theorie sollten die Acetal-geschützten Formen vor dem Koppeln entschützt werden, es erwies sich jedoch als möglich, ihre Labilität gegenüber Säure unterhalb pH 6 (welche viel höher ist im Fall von aromatischen Acetalen als die Labilität von aliphatischen Acetalen) vorteilhaft auszunutzen und zuzulassen, daß sie im Kopplungsgemisch entschützt werden. Falls sich herausstellt, daß bei einem pH von 5,5 keine Kopplung auftritt, kann der pH herabgesetzt werden. Bei pH 3,5 wird höchstwahrscheinlich kein Unterschied in der Reaktionsgeschwindigkeit zwischen der Acetal-geschützten Form und dem freien Aldehyd sein.
Wenn sie die geeignete Struktur besitzen, können die Verbindungen vom Typus der Schiffschen Base, die erhalten werden, isoliert und gereinigt werden. Es ist gut bekannt, daß Schiffsche Basen leicht hydrolysieren und relativ instabil sind, und zwar aufgrund einer leichten Spaltung der Bindung -CH=N-. In einigen Fällen kann eine solche Labilität jedoch von Vorteil sein und daher ausdrücklich erwünscht sein. Verbindungen vom Typus der Schiffschen Basen, die von zwei aromatischen Reaktanten (aromatische Aldehydgruppe und aromatische Aminogruppe) erhalten werden, sind stabiler als jene, die erhalten werden, wenn einer der Reaktanten aliphatisch ist. Oxime und Hydrazone sind stabiler als einfache Schiffsche Basen.
Es ist daher in der Regel wünschenswert, die Verbindungen vom Typus der Schiffschen Basen zu stabilisieren. Dies wird am zweckmäßigsten vorgenommen, indem die Bindung - CH=N- zu einer Bindung -CH&sub2;-NH- reduziert wird, und kann auf eine im Stand der Technik gut bekannte Weise erzielt werden, wobei komplexe Metallhydride, vorzugsweise Natriumcyanoborhydrid oder Pyridinboran, verwendet werden. Es ist lediglich ein kleiner Überschuß von Cyanoborhydrid nötig, und es kann ein technisches Produkt ohne Nachteil verwendet werden. Wo eine höhere Reinheit zweckmäßig ist, kann es durch Fällung aus Acetonitril nach dem Verfahren von Jentoft und Dearborn (J. Biol. Chem. 254 4359-4365 [1979]) gereinigt werden. Im übrigen kann Pyridinboran verwendet werden (Wong et al., Anal. Biochem. 139, 58-67 [1984]).
Die erhaltenen Verbindungen der Formel I (Konjugate) können auf einfache Weise in Salze übergeführt werden, wobei Verfahren angewendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Im Fall von Konjugaten, wo B der Rest eines chelatisierenden Mittels (Chelons) ist, sind Metallsalze, insbesondere Salze mit radioaktiven Metallen, die erwünschten Endprodukte, die als wertvolle Hilfsmittel in der Diagnose und in der Therapie brauchbar sind. Es kann jede Art radioaktives Salz erhalten werden, indem einfach ein Protein/Chelon-Konjugat mit einer geeigneten Lösung eines radioaktiven Metalls gemischt wird, und es wird angenommen, daß die verbesserten Techniken zur Konjugation von Proteinen, die mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, zu Verbesserungen in der Radioimmunassay-Technik, der Histo- und Zytochemie und bei der Abbildung in vivo führen werden. Wenn die Protein/Chelon-Konjugate einmal hergestellt worden sind, können sie für lange Zeiträume gelagert werden. Es sollte anschließend möglich sein, wo immer es gewünscht ist, sie mit Alpha-, Beta-, Gamma-, Positronen- und sogar Neutronenemittern unter milden und strikt vergleichbaren Bedingungen zu markieren. Das Verfahren ist gleichermaßen anwendbar auf eine Abbildung mittels NMR mit paramagnetischen Ionen, die als Kontrastmittel wirken. Falls ein Gamma- Emitter erwünscht ist, kann das Protein mit ¹¹¹In (spezifische Aktivität > 5000 Ci/mMol) markiert werden, während ein geeigneter Positronen-Emitter &sup6;&sup8;Ga (max. theoretische spezifische Aktivität 2,7·10&sup7; Ci/mMol) ist.
Die Protein- oder Polypeptidderivate der Formel II, welche als Ausgangsmaterialien in der Kopplungsreaktion der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch Umsetzung eines Proteins oder Polypeptids mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens unter Anwendung von Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, hergestellt werden. Es ist leicht möglich, z. B. Seitenkettenaminogruppen von Proteinen und Polypeptiden mit bifunktionellen Reagenzien z. B. zu acylieren. In dem Fall, wo eine aliphatische oder aromatische Verbindung der Formel R³-X-R¹ verwendet wird, wobei eine Funktion (R3) enthalten ist, die mit einer reaktiven Gruppe einer Proteinseitenkette und einer zweiten reaktiven Gruppe R¹, wobei R¹ sowie X wie obendefiniert sind, reagieren kann, werden Verbindungen der Formel A-X-R¹ (II) erhalten, in welchen der Protein- oder Polypeptidrest über eine Seitenkette verbunden ist. Während in einer solchen Reaktion, z. B. eine Acylierung, an mehreren Stellen auftreten wird und ein Gemisch verschiedener Verbindungen II erhalten wird, ist es bevorzugt, Reaktionsbedingungen anzuwenden, mit welchen die Anbringungsstelle auf einen einzigen gewählten Bereich des Proteins oder Polypeptids begrenzt ist. Ein bevorzugter gewählter Bereich in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung ist der Carboxyterminus des Proteins oder Polypeptids.
In den letzten Jahren wurden bereits proteolytische Enzyme bei der Synthese von Peptidbindungen verwendet. Dies ist möglich, weil die enzymkatalysierte Proteolyse eine reversible Reaktion ist. Das Verfahren wurde von mehreren Autoren beschrieben (siehe z. B. Jakubke et al., Angew. Chemie, Im. Ed. Engl., 24, 85-93 [1985]) und wurde erfolgreich z. B. bei der Herstellung von menschlichem Insulin angewendet (siehe z. B. Rose et al., Biochem. J. 211, 671- 676 [1983]; veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 87 238). Besonders geeignete Enzyme, die bei einer solchen Umkehrproteolyse brauchbar sind, welche verwendet werden können, um Verbindungen herzustellen, welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung die bevorzugten Kopplungsreagenzien sind, sind Trypsin und Carboxypeptidase Y. Es können jedoch auch andere Enzyme verwendet werden, wobei die besten Reaktionsbedingungen in einigen Vorversuchen auf einfache Weise festgelegt werden können.
Die allgemeine Reaktion kann mit der folgenden Gleichung
A-COOH + H&sub2;N-X-R¹ Enzym → A-X-R¹
beschrieben werden, wobei A, X und R¹ wie oben definiert sind und die Carboxylgruppe der C-Terminus des Moleküls ist.
In spezifischen Beispielen wird unten die Kopplung von p-Aminophenylalaninamid (mit Carboxypeptidase Y) und von m-Aminobenzaldehydmethyl- und -ethylacetal (mit Trypsin) an den C-terminalen Bereich der B-Kette von Insulin beschrieben. Diese Verbindungen sind Vertreter bifunktioneller Moleküle der allgemeinen Formel R³-X-R¹, welche in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung besonders brauchbar sind. Bei diesen und allen folgenden Reaktionen wurde kein wie immer gearteter Schutz für die funktionellen Gruppen des Proteins benötigt. Unter den halbwäßrigen Bedingungen, die für die Trypsin-katalysierte Reaktion angewendet wurden, ist die Synthese gegenüber der Hydrolyse in hohem Ausmaß begünstigt. Nur Lys- B29 ist beeinträchtigt, und das Endprodukt war Des-AlaB30-insulin-B29-m-formanilid.
Normalerweise greift die Carboxypeptidase Y in fortschreitendem Maß den C-Terminus von Proteinen an. Ein solcher Abbau kann unter Bedingungen ausgeführt werden, welche die Synthese zur gleichen Zeit wie die Hydrolyse begünstigen (Widmer et al. in Peptides 1980, 46-55 (Herausgeber K. Brunfeldt), Scriptor Kopenhagen [1981]; Widmer et al., in Peptides 1982, 375-379 (Hrsg. Blaha und Malon), W. de Gruyter Berlin und New York [1983]). Unter solchen Umständen ist es eines, in welchem brauchbare Produkte vorherrschen, obgleich ein Gemisch erhalten wird. Falls große Polypeptide und Proteine verwendet werden, ist die Heterogenität des Endproduktes, welche aufgrund eines kontinuierlichen Abbaus des Proteins vom C-Terminus oder vielleicht dem Einbau von mehr als einem Molekül der Verbindung R³- X-R¹ existiert, jedoch von geringerer Wichtigkeit, da sie auf einen kleinen Bereich beschränkt bleibt, nämlich den C-Terminus des Moleküls, und wird für seine Aktivität nicht kritisch sein.
Das obige Kopplungsprinzip, welches auf alle interessierenden Proteine ausgedehnt werden kann, ist von besonderem Interesse, und zwar im Hinblick auf seine Anwendbarkeit auf Immunglobuline, insbesondere Antikörper des Typus IgG und auf Fragmente davon, wie z. B. F(ab')&sub2; oder Fab. Trypsin produziert Fab-ähnliche Fragmente analog jenen, die mit Papain hergestellt wurden, und die obige Gleichung trifft auch für die Fixierung einer einzigartigen Stelle zur Konjugation am C-Terminus davon zu, ein Bereich, der bekanntermaßen von der Antigenbindungsstelle weit entfernt ist. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß Papain auch an einer solchen Kopplungsreaktion teilnimmt und direkt die gewollten Derivate von Fab-Fragmenten ergibt. Ferner wird auch die Carboxypeptidase Y Anbringungspunkte (für die Bildung von Derivaten des Typus von Schiffschen Basen) an den C-Termini aller Ketten von IgG-, F(ab')&sub2;- und Fab-Molekülen einbringen, und zwar wieder weit entfernt von den Antigenbindungsstellen.
Die Durchfuhrbarkeit der Methode mit der Carboxypeptidase Y wurde genau studiert. Der mögliche Bereich von Bedingungen beim Koppeln von p-Aminophenylalaninamid an Insulin mit Carboxypeptidase Y wurde auf die folgende Weise erforscht:
Eine wäßrige Lösung von p-Aminophenylalaninamid (10 mg/ml) wurde auf den erwünschten pH im Bereich von 5,5 bis 9,5 mit entweder verdünnter NaOH oder verdünnter HCl, sofern notwendig, eingestellt und dann gefriergetrocknet. Dieses Produkt konnte dann in Wasser gelöst werden, wobei eine selbstpuffernde Lösung bei jeder erwünschten Konzentration im Bereich von 0,1 Mol bis zur Sättigung hergestellt werden kann. Für jeden Satz von Bedingungen wurden 4,5 ul einer Lösung von zinkfreiem Insulin (20 mg/ml in 0,01 N HCl) genommen. 5,5 ul dieses Puffers (0,1 Mol Natriumphosphat) wurden beim erwünschten pH zugegeben. Dann wurde das p-Aminophenylalaninamid in der Form 6,5 ul einer selbstpuffernden Lösung beim richtigen pH und der gewählten Konzentration zugegeben. Carboxypeptidase Y (1 ul einer wäßrigen Lösung von 2,14 mg Protein/ml) wurde dann zugegeben. Falls die Lösung nicht klar war (d. h. nahe des isoelektrischen Punktes von Insulin), wurde in ausreichendem Maß fester Harnstoff zugegeben, um sie zu klären. Dieses System wurde für eine schnelle Feststellung eines Bereichs von Amidkonzentrationen und Reaktionszeiten verwendet. Bei jedem Zeitpunkt wurde das Ausmaß an Kopplung und Abbau im ersten Fall durch Löschen von 2 ul des Reaktionsgemisches in 100 k¹ Eisessigsäure, Verdünnen auf 1,7 ml in 0,01 N HCl, und Aufbringen von 1 ml der erhaltenen Lösung auf HPLC festgestellt. Anzeichen eines Erfolgs wurden mit Tests mit dem Produkt bestätigt, welches von Verdauungen in größerem Umfang nach einer Säurelöschung mittels Gelfiltration in 1% Essigsäure isoliert wurde. Die gewählte Reaktion war ein Schiffsches Basenkoppeln mit Benzaldehyd und eine nachfolgende Reduktion mit Cyanoborhydrid.
Die besten Bedingungen, die gefunden wurden, sind: pH 8,5; eine Endkonzentration an p-Aminophenylalaninamid von 1,3 Mol; Inkubation von 7 bis 22 Stunden bei 20ºC. Eine Verdauung bei pH-Werten höher als pH 8,5 führte zu einer viel langsameren Reaktion, während eine Verdauung bei pH-Werten unterhalb pH 8,5 zu immer mehr Abbau und zu einer immer weniger brauchbaren Synthese führte. Bei pH 5,5 oder bei praktisch jedem pH bei Abwesenheit von p-Aminophenylalaninamid führte die Konzentration von Carboxypeptidase Y, die in den obigen Tests verwendet wurde, zu einem raschen und außerordentlich hohen Abbau.
Zusätzliche Versuche ergaben, daß im Gegensatz dazu, was bei einer Verwendung von Trypsin als Enzym vorteilhaft ist, die Zugabe von Butan-1,4-diol bis zu 50 Vol.-% nur einen geringen Vorteil bei mit Carboxypeptidase vermittelten Kopplungen mit der alpha-Aminogruppe von p-Aminophenylalaninamid ergibt, aber die Kopplungsausbeute erhöht, wenn das angreifende Nukleophil ein Benzylaminderivat ist.
Die Durchführbarkeit der Methode mit Carboxypeptidase Y wurde mit Insulin gezeigt, wobei die Bedingungen für jedes neue Protein optimiert werden müssen. Mit relativ wenigen Versuchen wird es sich als möglich erweisen, Bedingungen zu finden, welche brauchbare Ausbeuten an Derivaten, die koppeln können, ergeben.
Die Lösungen von Butan-1,4-diol können, sobald sie hergestellt worden sind, für sehr lange Zeitspannen gelagert werden. Aminobenzaldehyde, die für eine spontane Polyinerisation zwischen ihrer Amino- und ihrer Aldehydgruppe bekannt sind, mußten an der Aldehydfunktion geschützt werden, solange die Aminofunktion durch Kombination mit dem Protein geschützt war. Der Acetalschutz war ausreichend stabil, um alle Schritte der Synthese zu überleben, die erhaltenen Proteinaldehydacetale waren aber gegenüber Säure so labil, daß sie unter Bedingungen entschützt werden können, die mild genug sind, um für die Unversehrtheit der meisten Proteine kein Risiko darzustellen.
Ein weiterer gewählter Bereich für die Einbringung einer komplementären Gruppe (Amino- oder Carbonylfunktion) ist der Aminoterminus des Proteins oder Polypeptids.
Ein N-terminaler Glycylrest eines Proteins kann so durch Transaminierung, vorzugsweise durch Umsetzung mit Glyoxylat, in eine Aldehydfunktion umgewandelt werden. Diese Reaktion schreitet unter relativ milden Bedingungen voran (siehe z. B. Dixon, H.B.F. und Fields, R., Methods in Enzymology, 25, 409-419 [1979]). Die allgemeine Anwendbarkeit dieser Reaktion kann ausgedehnt werden, indem Gly als N-terminaler Rest von Proteinen, die mittels rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurden, eingebracht wird. In den Fällen, wo Gly nicht N-terminal ist, kann eine brauchbare Ketogruppe nichtsdestotrotz durch Transaminierung einer anderen N-terminalen Aminosäure als Glycin gebildet werden, um die korrespondierende Ketosäure zu ergeben.
Ferner können die N-terminalen Reste Ser und Thr in einer äußerst milden Reaktion mit Perjodad oxidiert werden (z. B. 20ºC, 26 uMol Protein, 1 mMol Imidazolpuffer, pH 6,95, zweifacher Überschuß an Perjodat, 5 Min.). Das N-terminale Ser reagiert etwa 1000 Mal schneller als andere Proteingruppen (Fields, R. und Dixon, H.B.F., Biochem. J. 108, 883 [1968]), so daß eine hohe Spezifität erreicht werden kann. Für eine größere Verallgemeinerung kann das N-terminale Ser oder Thr durch rekombinante DNA-Techniken oder, in geeigneten Fällen, durch Auswählen einer Quelle des interessierenden Proteins, welches einen natürlichen N-Terminus Ser oder Thr aufweist, eingebracht werden.
Die N-terminalen, aliphatischen Polypeptidylaldehyde, die mit diesen Techniken hergestellt werden, können vorzugsweise mit aromatischen Aminen oder mit O-Alkylhydroxylaminen, umgesetzt werden.
Die meisten der Verbindungen der Formel A-X-R¹ (II), worin A, X und R¹ wie oben definiert sind, und worin, zusätzlich zur oben angegebenen Definition, R¹ geschütztes Amino sein kann, besonders jene, bei welchen X über den Carboxyterminus davon mit A verbunden ist, sind neue Verbindungen und ebenso Teil der vorliegenden Erfindung. Wie oben diskutiert (siehe Seite 10), sind bevorzugte Verbindungen der Formel II solche, bei welchen X ein aromatischer oder ein araliphatischer Rest ist oder O an die Aminogruppe angebracht ist, wobei R¹ Amino oder geschütztes Amino ist. Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel II sind Derivate von Immunglobulinen, d. h. solche, in welchen A den Rest eines Immunglobulinmoleküls, vorzugsweise eines IgG- oder Antikörpermoleküls oder eines Fragments davon, wie z. B. ein Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragment, darstellt. Die Herstellung der neuen Verbindungen kann gemäß Verfahren bewirkt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, besonders in der Art und Weise, die oben beschrieben ist, und zwar durch Umkehrproteloyse.
Die Reaktionspartner der Verbindungen II sind Verbindungen der Formel R²-X'-B (III), wobei R², X' und B wie oben definiert sind. Falls zwei Proteine oder ein Protein und ein Polypeptid miteinander verbunden werden sollen (Bildung von Homo- und Heterodimeren) ist B der Rest eines Proteins oder eines Polypeptids. Die Proteine oder Polypeptide werden über eine Amino- oder eine Carbonylfunktion gekoppelt, welche Funktion bereits im Molekül vorhanden ist, oder welche mit Verfahren eingebracht wird, die im Stand der Technik bekannt sind. Eine Formylfunktion kann in geschützter Form als ein Acetal, vorzugsweise in der Form eines Methyl- oder Ethylacetals, vorhanden sein.
Die Keto-, Aldehyd- oder acetalisierte Aldehydfunktion in den Verbindungen II und III kann entweder direkt eingebracht werden, wobei Reaktionen angewendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, oder indirekt in der Form einer Nicht-Carbonyl-Vorläufergruppe eingebracht werden, welche mit bekannten Verfahren in eine Carbonylfunktion umgewandelt werden kann, wie z. B. die Perjodatoxidation eines Diolrestes (siehe Beispiele 7 und 17) oder eines Restes mit vicinalen Hydroxy- und Aminogruppen.
Hinsichtlich der Reaktionspartner der Verbindung II, d. h. die oben definierten Verbindungen der Formel III, sind jene Verbindungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von höchster Bedeutung, in welchen B der Rest eines chelatisierenden Mittels (Chelons) ist. Jede Verbindung, welche in der Lage ist, Metallionen zu chelatisieren, kann verwendet werden. Falls das chelatisierende Mittel bereits eine Gruppe R², d. h. eine Amino- oder Carbonylfunktion (in welchem Fall X' fehlt) enthält, besteht keine Notwendigkeit, eine zusätzliche funktionelle Gruppe dieses Typus einzubringen und kann das Chelon direkt an eine Verbindung der Formel II oben gekoppelt werden (sondern nicht gewünscht ist, eine aliphatische Gruppe R² in eine bevorzugte aromatische Gruppe R² umzuwandeln). 1-p-Aminophenylethylendinitrilotetraessigsäure (U.S.P. 3,994,966) ist ein Beispiel einer solchen Verbindung, welche bereits eine aromatische Aminogruppe enthält. Andere geeignete chelatisierende Mittel, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar und erwähnenswert sind, sind 1-Amino-6,17-dihydroxy- 7, 10, 18,21 -tetraoxo-27-(N-acetylhydroxylamino)-6, 11, 17,22-tetraazaheptaeicosan, im übrigen als Desferrioxamin oder Deferoxamin bekannt (in seiner Eisen-gebundenen Form als Ferrioxamin B bekannt), und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA; Krejcarek et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 77, 581-585 [1977]). Diese letzteren zwei chelatisierenden Mittel können mit Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, in bevorzugte Derivate R²- B umgewandelt werden.
Bis heute wurde Desferrioxamin an Proteine mittels statistischer Kopplung an Aminogruppen von Seitenketten angebracht, und zwar entweder mit Glutaraldehyd (Janoki et al., Int. J. Appl. Radiat. Isot. 34, 871-877 [1983] oder durch wasserlösliches Carbodiimid (Janoki et al., J. Nucl. Med. 24, 909 [1982]). bewerkstelligt. Diese Veröffentlichungen geben auch, während sie die ausgezeichnete Wahl dieses Chelons in vollem Ausmaß demostrieren, die Notwendigkeit an, nach spezifischeren, milderen Kopplungsverfahren zu suchen.
Ferrioxamin B ist viel besser löslich als seine eisenfreie Form, Desferrioxamin. Da es schwieriger ist, den Synthesen mit den eisenfreien Verbindungen zu folgen, da die Chromatographie oft schwierig durchzuführen ist, und da auch die Gefahr besteht, daß die Hydroxylaminogruppen, falls sie nicht durch Chelatisierung geschützt sind, an Nebenreaktionen teilnehmen könnten, wurde Ferrioxamin B statt der eisenfreien Verbindung verwendet, um Proteinkonjugate herzustellen. Dann wurde das Eisen mit Säure/EDTA entfernt, und die metallfreie Form des Konjugates wurde bis zur Verwendung gelagert. Es hat sich erwiesen, daß diese Methode zufriedenstellend ist, und zwar beurteilt auf Grund der Tatsache, daß das auf diese Weise behandelte Proteinkonjugat mit ¹¹¹In und &sup6;&sup8;Ga beladen werden konnte, während ein Proteinkonjugat, welches noch sein Eisen aufwies, nicht beladen werden konnte. Ferrioxamin B wurde daher durch Anwendung der folgenden Reaktionssequenz (Schema 1) zu m-Aminobenzoylferrioxamin B umgewandelt, welches ein Beispiel einer Verbindung der allgemeinen Formel III und ein sehr brauchbarer Kopplungspartner beim Verfahren zur Herstellung von Protein- oder Polypeptidderivaten gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Schema 1
Statt m-Aminobenzoylferrioxamin B kann auch die analoge Verbindung verwendet werden, in welcher das Eisenion durch Cu²&spplus; ersetzt ist. Dieses letztere Ion wird ausreichend schwach gebunden, um durch andere Metalle, wie z. B. Fe³&spplus;, ersetzt zu werden, jedoch sonst stark genug, um während sämtlicher der anderen Operationen, die oben beschrieben sind, im Komplex zu verbleiben.
Die Herstellung von m-Aminobenzoylferrioxamin B und seine Kopplung an ein Insulinderivat sind im Detail in den Beispielen 1(b) bzw. (c) beschrieben (unten). Die Kupferanaloga dieser Verbindungen können auf eine analoge Weise zu jener, die hier beschrieben ist, hergestellt werden.
Kuprioxamin B wird exakt analog zu dem veröffentlichten Verfahren für den Eisenkomplex hergestellt (Prelog, V. und Walser, A., Helv. Chim. Acta 45, 631-637 [1962]), und zwar mit einer äquivalenten Menge an Kupfer(II)-Chlorid statt Ferrichlorid, welches in dieser Publikation verwendet wird. Die Zwischenprodukte, sowie das Endprodukt m-Aminobenzoylferrioxamin B, haben alle eine grüne Farbe. Ihre Rf-Werte auf der Dünnschichtchromatographie (t.l.c.) sind alle identisch mit jenen der Eisenverbindungen.
Im Gegensatz zu dem Fall von m-Aminobenzoylferrioxamin B ist eine Entfernung des Metalls vor dem Beladen mit einem anderen Metall im Fall von m-Aminobenzoylferrioxamin B nicht notwendig. Die Bindungskonstante von Kupfer im Komplex ist viele Größenordnungen kleiner als jene für Metalle, wie Eisen und Gallium, welche das Kupfer beinahe sofort in einer verdünnten, neutralen oder mildsauren Lösung ersetzen.
DTPA wurde gewöhnlich an Proteine angebracht, und zwar entweder mittels seines Bisanhydrids (z. B. Layne et al., J. Nucl. Med 23, 627 [1982]), oder mittels eines Verfahrens mit gemischten Anhydriden (Krejcarek und Tucker, Biochem. Biophys. Res. Comm 77, 581 [1977]). In beiden Fällen ist das Koppeln der Seitenketten an das Targetprotein statistisch. Dazu kommt noch, daß das Bisanhydrid mit mehr als einer Aminogruppe zugleich reagieren kann, und es auch bis zu einem beträchtlichen Ausmaß tut. Dieses Reagens wird in einem wäßrigen Medium auch sehr rasch hydrolysiert, und obwohl dies seine Verwendung bis heute nicht in großem Ausmaß behindert hat, könnte es nichtsdestotrotz ein komplizierender Faktor unter gewissen Umständen sein. Paik et al., J. Nucl. Med. 24, 932 (1983) bildeten ein gemischtes Anhydrid zwischen sorgfaltig kontrollierten Mengen von DTPA und Isobutylchlorformiat. Wie jedoch bei der ursprünglichen Arbeit von Krejcarek und Tucker (supra), waren sie nicht in der Lage, die Bildung von statistischen Gemischen von Produkten zu vermeiden, und zwar unabhängig davon, welches Reaktantenverhältnis gewählt wurde. Auch das gemischte Anhydrid war Wasser gegenüber zu labil.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde daher ein aktiviertes Derivat von DTPA gewählt, welches wegen seiner Stabilität von seiner bireaktiven Form gereinigt werden konnte. Dieses Derivat ist DTPA-mono-(m-formanilid) (oder sein Dimethyl- oder Diethylacetal), wobei seine Herstellung im folgenden Schema gezeigt ist. Schema 2
Während oben die Zweckmäßigkeit erwähnt wurde, Ferrioxamin B in seiner metallgebundenen Form bis zum Ende der Synthese des Protein/Chelon-Konjugates zu halten, gibt es mit dem DTPA-Derivat keine solche Schwierigkeit. Die Synthese kann mit metallfreien Verbindungen ausgeführt werden, und das Endproteinkonjugat konnte mit dem erwünschten Ion ohne Schwierigkeit beladen werden.
Ein Beispiel von sehr starken Verbindungen der Formel in hinsichtlich der chelatisierenden Aktivität, welche Verbindungen ein polymeres Chelon enthalten, welches mit dem Schiff'chen Basenverfahren der vorliegenden Erfindung leicht koppeln kann, sind Verbindungen der Formel m-NH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CO-[N&epsi;-(DTPA-alanyl)-Lys]n, worin n eine ganze Zahl > 1 ist. Die Herstellung einer solchen Verbindung mit n = 5 und seine Kopplung wird im Detail unten in Beispiel 6 beschrieben. Eine andere Verbindung dieses Typus ist z. B. Polyglutaminsäure, an welche Ferrioxamin B an bis zu ein Ferrioxamin B pro Seitenkettencarboxygruppe gekoppelt ist (siehe unten Beispiel 15). In Analogie zu Polyglutaminsäure und ihren Derivaten können jedoch andere polymere Verbindungen, insbesondere Polypeptide, verwendet werden, um Verbindungen der Formel III der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Schließlich ist ein anderes einwertiges Derivat der chelatisierenden Gruppe DTPA, welches zum Markieren von Polypeptiden und Proteinen verwendet werden kann, DTPA-Alanin- p-nitrophenylester, d. h. eine Verbindung der folgenden Formel:
Diese Verbindung kann folgendermaßen hergestellt werden:
Zu 2 ml eines wäßrigen 1 Mol Natriumacetatpuffers, pH 5,5, wurden 50 mg Ala-p-nitrophenylester HCl unter starkem Vortex-Mischen bei Raumtemperatur zugegeben. Als sich das Material gelöst hatte, wurden 84 mg DTPA-Bisanhydrid unter weiterem starken Vortex- Mischen zugegeben. Das Anhydrid löste sich in einer Zeitspanne von etwa zwei Minuten. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Reaktionsgemisch auf eine präparative HPLC-Säule (250·16 mm, gepackt mit 7 um Lichrosorb RP-8-Teilchen), die vorher mit 0,1% (Gew./Vol.) Trifluoressigsäure in Wasser äquilibriert worden war, injiziert. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittel 5 Min. lang bei 2 ml/Min. eluiert, wonach ein zweiphasiger, linearer Gradient von reinem Acetonitril aufgetragen wurde, wobei die erste Phase 35% Acetonitril nach 35 Minuten erreichte und die zweite 55% Acetonitril nach 85 Minuten Gesamtzeit erreichte. Das Eluierungsmittel wurde auf 55% Acetonitril während 5 Minuten gehalten, bevor es während 10 Min. linear auf 0% hinterprogrammiert wurde. Der Abfluß wurde bei 214 nm überwacht. Das erwünschte Produkt wurde bei einer Retentionszeit von 57-62 Min. gesammelt, und das dimere Produkt, welches der Acylierung von zwei Molekülen Ala-p-nitrophynelester durch das Bisanhydrid zuzuschreiben ist, eluierte bei einer Retentionszeit von 74-95 Min. Nach Entfernung des Acetonitrils bei Raumtemperatur auf einem Rotationsverdampfer wurde das Produkt mittels Lyophilisierung gewonnen (Ausbeute ca. 40 mg). Das Produkt wurde mittels FAB-MS und durch analytische HPLC auf einer Radialpak uBondapak C-18-Patrone mit einem liearen Gradienten aus reinem Acetonitril (0-60%, Vol./Vol., 2% pro Min.) nach 5 Minuten in 0,1% (Vol./Vol.) wäßriger CF&sub3;COOH untersucht. Das erwünschte Produkt eluierte unter diesen Bedingungen bei einer Retentionszeit von 25 Min. Einige Chargen, welche eine Verunreinigung enthielten, identifiziert mittels FAB-MS, daß sie einen zusätzlichen Alanylrest jedoch nur eine Nitrophenylestergruppe enthielten und aus der analytischen Säule bei einer Retentionszeit von 26 Min. eluierten, wurden auf der präparativen Säule (siehe Beispiel 1(c)) erneut gereinigt. Die Ausbeute von 50 mg Ala-p-nitrophenylester·HCl: ca. 24 mg. Das Endprodukt war rein, überprüft mittels analytischer HPLC, und ergab das erwartete FAB-MS-Spektrum (protoniertes Molekülion bei m/z 586, Natrium-kationisiertes Ion bei m/z 608 und Kalium-kationisiertes Ion bei m/z 624).
Die oben erwähnten Verbindungen, bei denen ein chelatisierendes Mittel modifiziert wurde, um es für eine Kondensationsreaktion zum Herstellen von Schiffschen Basen geeignet zu machen, sind neu und daher ebenso Teil der vorliegenden Erfindung.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die folgende Erfindung, jedoch nicht auf eine beschränkende Weise.

Beispiel 1

(a) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-m-formanilid

Tris-HCl (16 mg) wurde in 3 ml Butan-1,4-diol, welches in einem Zentrifugenröhrchen enthalten war, zerkleinert. Die Suspension wurde gründlich gemischt, und die Kristalle, welche sich nicht gelöst hatten, wurden auf den Boden des Röhrchens zentrifugiert. Zu 1,162 ml des Überstandes wurden 260 mg m-Aminobenzaldehyddimethylacetal zugegeben, und das Gemisch wurde auf einem Vortexmischer gemischt. (In einem zweiten Versuch wurde das korrespondierende Diethylacetal verwendet.) Nach Zugabe von 30 ml n-Ethylmorpholin (frisch destilliert) und weiterem Schütteln wurde der pH der Lösung mit einer Glaselektrode gemessen und durch sukzessive Zugaben von 10% (Vol./Vol.) Essigsäure in Butan-1,4-diol auf 6,2 eingestellt. Wegen der Säureladilität des Acetals, wurde die Säure sehr vorsichtig und unter starkem Mischen zugegeben. Besondere Sorgfalt war erforderlich, sobald der pH auf unterhalb 6,5 gefallen war. Die erhaltene Lösung konnte in gefrorenem Zustand bei -20ºC für viele Monate gelagert werden.
Die gepufferte Acetallösung (300 ul) wurde 20 mg Zn-freiem Insulin zugegeben (Rose et al., Biochem J 211, 671 [1983]), gefolgt von 10 ul Wasser. Normalerweise ging das Insulin während einer Inkubation bei 38ºC von 1 h in Lösung, wobei nur gelegentlich leicht geschüttelt wurde. Sobald das Insulin in Lösung war, wurden 10 ul einer frisch hergestellten Lösung von TPCK-behandeltem Trypsin (5 mg in 40 ul) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 37ºC fortgeführt. Der Kopplungsfortschritt wurde durch Celluloseacetat-Elektrophorese (pH 8) verfolgt, wie beschrieben von Rose et al., Biochem. J. 195, 765 [1981], oder mit HPLC (250· 4,6 mm RP-18 Spheri 5-Säule mit einem linearen Gradienten von 3,5 bis 35% (Vol./Vol.) Acetonitril in 0,3 Mol Ammoniumsulfat in 7 Minuten). Das Reaktionsprodukt wanderte bei der Elektrophorese langsamer als das Insulin und kam zwei Minuten nach dem Insulin auf HPLC an. Beurteilt nach jedem Kriterium war das Verhältnis von Insulin zu Produkt 1 : 2,5 zu Gunsten des letzteren, nach typischerweise 3 h Inkubation. Wie mit HPLC zu sehen ist, erschienen einige andere Proteinpeaks fortschreitend während der Inkubation, aber der größte von ihnen stellte letzten Endes 14% des Gesamtproteins dar.
Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und 3,1 ml Eisessigsäure wurden zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Das erhaltene Gemisch wurde dann mit einem gleichen Volumen von 10% (Vol./Vol.) Essigsäure verdünnt und auf einer 90·2,6 cm Säule aus Sephadex G-50 (fein) einer Gelfiltration unterzogen und mit 1% Essigsäure eluiert.
Die Fraktionen, welche das Insulinderivat enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Das Produkt wurde mittels Ionenaustauschchromatographie (Säule 2·20 cm A-25, Pharmacia), äquilibriert mit 7 Mol Harnstoff - 100 mMol Tris, eingestellt auf pH 8,4 (Glaselektrode), Harnstoff bereits vorhanden) mit 12 Mol HCl weiter gereinigt. Die Eluierung wurde mittels eines linearen Gradienten (insgesamt 1 Liter) zwischen diesem Ausgangspuffer und einem identischen, außer der Gegenwart von NaCl (200 mMol), ausgeführt. Die Fraktionen des ersten Peaks, welche ankamen, wurden vereinigt und gegen 1% (Vol./Vol.) Essigsäure dialysiert.
Falls gewünscht wurde, das Acetal zu konservieren (normalerweise nur in dem Fall der geringfügig stabileren Methylform), wurde das Trypsin gestoppt, indem das Inkubationsgemisch in 5 ml des Ausgangspuffers für die Säule A-25 verdünnt und die Lösung direkt der Säule A-25 aufgetragen wurde. In diesem Fall waren die meisten Bedingungen so, wie oben angegeben, außer daß der Gradient von 0-155 mMol NaCl war. Das Trypsin ging auf einmal durch die Säule, zusammen mit dem m-Aminobenzaldehyddimethylacetal und seinen Nebenprodukten. Das gewünschte Produkt trat früh im Gradienten auf, etwa 4 Säulenvolumina nach dem anfänglichen Durchbrechen. Der Test zeigte, daß das erwünschte Produkt nichtsdestotrotz durch keine Trypsinaktivität kontaminiert war. Mit der Ausnahme eines unveränderten Insulins, welches im Gradienten viel später auftrat, war das gewünschte Produkt der einzige signifikate Proteinpeak. Die vereinigten Produktfraktionen wurden gegen 0,5% (Gew./Vol.) wäßriges NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und gefriergetrocknet.
Die Produkte konnten mittels HPLC (250·4,6 mm RP-18 Spheri 5-Säule mit einem linearen Gradienten von 3,5 bis 35% (Vol./Vol.) Acetonitril in 0,3 Mol Aminoniumsulfat in 7 Minuten) weiter gereinigt werden (von ziemlich unbedeutenden Verunreinigungen), wobei bis zu 5 mg auf einmal beladen wurde. Das Eluierungsmittel war ausreichend sauer, um jegliches acetalisiertes Protein während der Abtrennung zu entschützen. Das chromatographische Verhalten acetalisierter und nicht-acetalisierter Insulinderivate war identisch.
Charakterisierung des Produktes:
Die erhaltene Verbindung (nach Säurebehandlung zur Entfernung des mutmaßlichen Acetalschutzes) wurde an m-Aminobenzoesäure gekoppelt, um auf übliche Weise eine Schiffsche Base zu erhalten (siehe Beispiel 1(c)). Falls Tritiumborhydrid verwendet wurde, die Schiffsche Base zu reduzieren, wurde Tritium in die Proteinfraktion aufgenommen. Das reduzierte Produkt wanderte auf Celluloseacetat (pH 8) als ob es die Gruppe -COOH wiedergewonnen hätte, die es durch Ersatz des C-terminalen Alanins durch den m-Formylbenzaldehyd verloren hatte, und die Bande des reduzierten Produktes zeigte die charakteristische blaue Fluoreszenz von m-Aminobenzoaten. Eine Verdauung mit Armillaria-Protease ergab ein Produkt mit den erwarteten papierelektrophoretischen Eigenschaften.

(b) Herstellung von m-Aminobenzoylerrioxamin B

Ethylacetat (10 ml) wurde 125 mg m-Aminobenzoesäure (purum) zugegeben. N- Ethylmorpholin (frisch destilliert, 200 ul) wurde dem Gemisch zugegeben, gefolgt von 1 ml di.-tert.Butyldicarbonat (purum). Die schwach trübe Lösung klärte sich beim Stehen über Nacht bei 20ºC. Dann wurde das Gemisch dreimal mit 10 ml 0,3 Mol NaHCO&sub3; extrahiert, und die vereinigten wäßrigen Schichten wurden gekühlt und angesäuert, und zwar durch Zugabe eines gleichen Volumens von gekühlter 0,6 Mol Zitronensäure. Zu diesem Zeitpunkt bildete sich ein Präzipitat, welches verschwand, als die Suspension mit 15 ml Ethylacetat extrahiert wurde. Nach Trennung der Phasen wurde die wäßrige Schicht erneut mit 5 ml Ethylacetat extrahiert, und die zwei organischen Schichten wurden vereinigt. Die vereinigte organische Fraktion wurde über MgSO&sub4; über Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung getrocknet, zuerst durch Rotationsabdampfung und dann in einem Desikator (NaOH-Pellets) unter einem Ölpumpenvakuum. Etwa 80 mg dieses Produktes wurden in 252 ul Dimethylformamid gelöst, und zwar zusammen mit 42,6 mg N-Hydroxysuccinimid. Dieser Lösung wurden 76,4 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 63 ul Dimethylformamid zugegeben, und das Gemisch wurde unter Rühren über Nacht stehen gelassen. Ein Präzipitat begann sich sofort zu bilden, und war am folgenden Morgen äußerst dicht. TLC des Überstandes zeigte praktisch eine vollständige Umwandlung in ein Produkt mit der erwarteten Wanderung eines Boc-m-aminobenzoesäurehydroxysuccinimidoesters. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation entfernt und der Überstand in einem Vakuumdesikator über NaOH-Pellets in einem Ölpumpenvakuum getrocknet. Der leicht wachsige Feststoff, der auf diese Weise erhalten wurde, wurde ohne weitere Reinigung in der folgenden Reaktion verwendet.
Zu 4 ml einer wäßrigen 0,4 Mol Lösung von Ferrioxamin (343,8 mg) wurde ein gleiches Volumen Dimethylformamid zugegeben. Dann wurde N-Ethylmorpholin zugegeben, bis der pH (extern auf feuchtem pH Papier geschätzt) auf über 8 anstieg. Etwa 300 ul der Base waren erforderlich. Zu diesem Gemisch wurden dann 196 mg Boc-m-aminobenzoesäurehydroxysuccinimidoester, der in 4 ml Dimethylformamid gelöst war, zugegeben. Nach Sicherstellung, daß sich der pH nicht nennenswert geändert hatte, wurde das Gemisch bei 20ºC über Nacht stehen gelassen. Am folgenden Morgen wurden 12 ml destilliertes Wasser dem Reaktionsgemisch zugegeben, und die Lösung wurde dreimal mit 24 ml (jedes Mal) Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 3,2 ml (jedes Mal) Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde ,auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Das Produkt wurde mittels FAB-MS charakterisiert. Die Boc-Gruppe wurde entfernt, indem der Rückstand in 7 ml 98-100% Ameisensäure aufgelöst wurde. Nach 30 Min. wurde das entschützte Produkt mittels HPLC (250·16 mm Säule, gefüllt mit 7 u Lichrosorb RP-8, linearer Gradient zwischen 15% und 45% Acetonitril während 30 Min. in 0,1% (Vol./Vol.) wäßrige CF&sub3;COOH, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 mi/Min.) isoliert. Das erwünschte Produkt (222 mg, 54% Ausbeute) war im ersten Hauptpeak (Retentionszeit 35,5 Minuten), welcher nach der Injektionstransienten auftrat und wurde mittels FAB-MS charakterisiert. Ein zweiter Peak trat nach 42,5 Minuten auf; und es wurde mittels Massenspektrokopie gefunden, daß er das N- Formylderivat des erwünschten Produktes war. Ein dritter Peak (Retentionszeit 56,5 Min.) enthielt nicht-entschütztes Ausgangsprodukt.
Der Grad an N-Formylierung kann beträchtlich verringert werden, indem bei einer niedrigeren Konzentration des Boc-Derivates (12 mg/ml) gearbeitet wird. Es ist auch möglich, die Formylgruppe durch Behandlung mit 0,1 Mol HCl bei Raumtemperatur zu entfernen, wobei der Fortschritt der Entfernung mittels HPLC überwacht wird.
Die obige Herstellung kann mittels TLC verfolgt werden. In n- Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser (15 : 3 : 12 : 20, Vol./Vol.) auf Kieselgel 60 (Merck) sind die jeweiligen Rf-Werte:
Ferrioxamin 0,27
m-Aminobenzoyl-ferrioxamin B 0,44
N-Formyl-m-aminobenzoyl-ferrioxamin 0,48
Boc-m-aminobenzoyl-ferrioxamin 0,56

(c) Herstellung von Des-AlaB30-insulin/Ferrioxamin B-Konjugat

1 mg Des-AlaB30-insulin-B29-m-formylanilid wurde in 45 ul einer 5,5 mMol Lösung von m-Aminobenzoylferrioxamin B in einem wäßrigen 1% (Vol./Vol.) Essigsäurepuffer mit einer starken NaOH-Lösung auf pH 3,5 gebracht. Zu dieser Lösung wurden 20 ul wäßriges 2,4 mMol Natriumcyanoborhydrid und 50 ml Wasser zugegeben.
Nach 20 Min. wurde mittels HPLC geprüft, daß die Reaktion beendet war, und das Reaktionsprodukt, Des-AlaB30-insulin-B29-NH-C&sub6;H&sub4;-m-CH&sub2;-NH-m-C&sub6;H&sub4;-CO-ferrioxamin B, wurde mittels HPLC isoliert, wobei eine 250·4,6 mm RP-18 Spheri 5-Säule (Brownlee Laboratories, 2045 Martin Ave., Santa Clara, CA 95050, USA) und ein linearer Acetonitrilgradient in wäßrigem 0,3 Mol Aminoniumsulfat während 30 Min. verwendet wurden. Der Gradient wurde mittels eines 2-Pumpen-Systems mit 0,3 Mol Aminoniumsulfat als Lösungsmittel A (Äquilibrierung) und 0,3 Mol Aminoniumsulfat/35% (Gew./Vol.) wäßriges Acetonitril hergestellt. Die zwei Lösungsmittel wurden mit Stammlösungen von 3 Mol Aminoniumsulfat aufgefüllt, welche durch sorgfältige Zugabe von konz. H&sub2;SO&sub4; auf einen angegebenen pH von 2,7 (Glaselektrode) eingestellt wurden. Die Eluierung war bei 1 ml pro Min.
Nach Entfernung von Acetonitril in einem Luftstrom wurden die vereinigten Fraktionen, welche das Insulinkonjugat (eine blaßrote Lösung) enthielten, auf einer Sep-Pak-Patrone (Waters Associates, Milford, Mass. 01757, USA) gemäß den Vorschriften des Herstellers aufgearbeitet. Nach einer ersten Wäsche mit 10% (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril wurde die Eluierung mit wäßrigem 40% (Vol./Vol.) Acetonitril bewirkt. Das konzentrierte Produkt wurde nach Ausblasen des Acetonitrils lyophilisiert. Der pfirsichfarbene Feststoff wurde auf Celluloseacetat (pH 8) und HPLC (Radialpak u Bondapak C-18-Patrone in einem Z-Modul, linearer Gradient aus reinem Acetomtril (0-60%) in 0,1% (Vol./Vol.) wäßriger CF&sub3;COOH) homogen gefunden. Das Produkt wurde weiter mittels FAB-MS einer Verdauung mit Armillaria-Protease charakterisiert. Die Verdauung wurde bei pH 7,8 in 1% (Gew./Vol.) Ammoniumhydrogencarbonat ausgeführt. Es ist bekannt, daß diese Protease spezifisch an der aminoterminalen Seite von LysB29 von Insulin spaltet.

Beispiel 2

Entfernung von Eisen aus dem Des-AlaB30-insulin/Ferrioxamin B-Konjugat

Zu 225 ul einer 138 uMol Lösung in Wasser des Des-AlaB30-insulin/Ferrioxamin B- Konjugates, welches gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, wurden 25 ul 1 Mol Propionsäure und 2 ul 0,01 Mol ETDA zugegeben, und das Gemisch wurde mit verdünnter HCl auf pH 3 eingestellt. Die rosa Farbe der Lösung ging schnell verloren. Falls erwünscht, kann die Reaktion spektroskopisch verfolgt werden, da nach einer Entfernung des Eisens der Peak zwischen 400 nm und 450 nm, der für das Ferrioxamin B-Konjugat charakteristisch ist, vollständig verschwindet. Eine solche Spektroskopie mit einer Testlösung von 1 mMol Ferrioxamin B zeigte, daß die Halbwertszeit für die Entfernung von Eisen bei pH 3 annähernd 90 Sekunden war, während jene bei pH 3,5 annähernd 340 Sekunden war. Die Reaktion bei pH 2,5 war zu schnell, um sie verfolgen zu können.
War das Eisen einmal entfernt worden, wurde die Lösung mit 1,7 Mol Natriumacetatpuffer auf pH 5,5 eingestellt. Das erhaltene Präzipitat wurde sorgfältig durch Zentrifugierung in 0,7 Mol Natriumacetatpuffer gewaschen, bis erwartet werden konnte, daß die Konzentration an restlichem ETDA vernachläßigbar war, verglichen mit de&ijlig;enigen des Konjugates. Es wurde gefunden, daß solche Spuren, welche persistierten, nicht signifikant um &sup6;&sup8;Ga und ¹¹¹In unter den unten beschriebenen Markierungsbedingungen konkurrieren konnten. Das eisenfreie Proteinderivat wurde in einem gefrorenen Pellet für Monate ohne scheinbare Beeinträchtigung seiner Kapazität, markiert zu werden, gelagert.

Beispiel 3

Markierung des Des-AlaB30-insulin/Desferrioxamin B-Konjugates mit radioaktiven Metallen

Das Des-AlaB30-insulin/Desferrioxamin B-Konjugat, welches gemäß Beispiel 2 erhalten wurde, wurde in einer Konzentration von 7 ug/ul in einem Puffer aufgelöst oder suspendiert, der durch Mischen von gleichen Voluminia von 0, 1 Mol Ammoniumacetat und 0,1 Mol Natriumcitrat und durch Einstellen der erhaltenen Lösung auf pH 8,5-9 mit wäßrigem 33% (Gew./Vol.) Ammoniak hergestellt wurde. Die Lösung des radioaktiven Metalls (¹¹¹¹InCl&sub3; oder &sup6;&sup8;GaCl&sub3;) wurde zur Pufferlösung in einer Konzentration zwischen 1 uCi und 1 mCi/ul unmittelbar vor dem Protein zugegeben. Das Reaktionsgemisch kann in allen weiteren Tests direkt verwendet werden.
Der Markierungsgrad kann sofort bestimmt werden, und zwar durch radioaktive Techniken, wie Szintillationsradioaktivzählung, Radioaktivitätsscannen und Radioautographie auf Standard-Röntgenfilm nach HPLC oder Celluloseacetat-Elektrophorese (pH 8).

Beispiel 4

(a) Herstellung des Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenylalaninmethylesters

p-Amino-L-phenylalaninhydrochlorid 1/2 H&sub2;O (Bachem, Bubendorf, Schweiz) wurde unter Rühren in 8,5 Mol HCl/MeOH zu etwa 140 mg/ml aufgelöst und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Reagentien wurden unter einem Stickstoffstrom und schließlich unter Hochvakuum entfernt, wobei als ein bröckeliges, weißes Pulver p-Amino-L-phenylalaninmethylester-Hydrochlorid erhalten wurde. Die Umsetzung war quantitativ, bestimmt mittels TLC (ButanoVAceton/Essigsäure/Wasser, 7 : 2 : 7 : 4, Vol./Vol.) und mit Cadmium/Ninhydrin als Färbemittel.
Der Rf des Ausgangsmaterials war 0,28; jener des Produktes war 0,52.
208 mg p-Amino-L-phenylalaniiinethylester·HCl wurden in 2 ml Butanol-1,4-diol gelöst. Zu dieser Lösung wurden etwa 2 ml 0,5 Mol Tris-Base in Butan-1,4-diol/H&sub2;O (4 : 1, Vol./Vol.) zugegeben, bis der pH (Glaselektrode) 6,5 war. 100 mg festes Zn-freies Insulin wurde 3,1 ml gepufferter Methylesterlösung zugegeben. Das meiste des Insulins ging nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC in Lösung. Trypsin (12 mg, Worthington TPCK-Güte) wurde in 120 ul Wasser aufgelöst, und 100 ul der Lösung wurden zugegeben. Nach 90 Minuten bei 37ºC, während welcher Zeit das Insulin vollständig aufgelöst wurde, ergab die Cellulose-Acetat-Elektrophorese bei pH 8, daß mehr als die Hälfte des Insulins in ein Produkt umgewandet worden war, welches langsamer wanderte als Insulin. Da der pK einer aromatischen Aminogruppe erheblich unterhalb 8 ist, ist dies das erwartete Verhalten des erwünschten Produktes. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und 3,1 ml Eisessigsäure wurden zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Dann wurde das erhaltene Gemisch mit einem gleichen Volumen 10% (Vol./Vol.) Essigsäure verdünnt und einer Gelfiltration auf einer Sephadex G- 50(fein)-Säule von 90·2,6 cm unterworfen, wobei mit 1% (Vol./Vol.) Essigsäure eluiert wurde.
Die Fraktionen, die zum Peak des Derivates gehörten, wurden gesammelt und lyophilisiert. Das Produkt wurde mittels Ionenaustauschchromatographie (Säule 2·20 cm A-25, Pharmacia), äquilibriert mit 7 Mol Harnstoff - 100 mMol Tris, eingestellt auf pH 8,4 (Glaselektrode), Harnstoff bereits vorhanden) mit 12 Mol HCl weiter gereinigt. Die Eluierung wurde mittels eines linearen Gradienten (insgesamt 1 Liter) zwischen diesem Ausgangspuffer und einem identischen, außer der Gegenwart von NaCl (200 mMol), ausgeführt. Der Peak, der als erstes erschien, wurde vereinigt und gegen 1% (Vol./Vol.) Essigsäure dialysiert. Nach Lyophilisierung wurden 54,5 mg Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenyllalaninmethylester erhalten.
Das Produkt ergab auf HPLC (Radialpak u Bondapak C-18-Patrone in einem Z-Modul, linearer Gradient von 25-45% (Vol./Vol.) Acetonitril in 0,1% (Vol./Vol.) wäßriger CF&sub3;COOH während 20 Minuten) einen einzigen Peak. Das Produkt wanderte bei Cellulose-Acetat-Elektrophorese bei pH 8 als einziger Fleck, und zwar in der erwarteten Position, d. h. daß es langsamer als Insulin wanderte. Bei einer Elektrophorese bei pH 1,9, somit erheblich unterhalb des pK einer aromatischen Aminogruppe, wanderte das Produkt schneller als unmodifiziertes Insulin, was damit konsistent ist, daß es bei diesem pH eine zusätzliche positive Ladung besitzt. Die Verdauung des Produktes mit Trypsin setzte Des-Octapeptid-(B23-B30)-insulin frei (welches mittels HPLC und mittels Elektrophorese auf Cellulose-Acetat bei pH 8 identifiziert wurde), wobei das Heptapeptid Reste B23-B29 (welches mittels HPLC, mittels Papierelektrophorese bei pH 6,5 und mittels FAB-MS identifiziert wurde) und freien m-Aminophenylalanihmethylester (welcher mittels HPLC und mittels Papierelektrophorese bei pH 6,5 identifiziert wurde) umfaßte.

(b) Herstellung von DTPA-Mono-(m-formylanilid)

Sowohl Dowex-50 (WX-4, H-Form) als auch Bimsstein-Siedesteinchen wurden durch Filtration in 20 Volumina Ethanol gewaschen. Beide wurden dann in 5 Volumina Ethanol während 3 Min. gekocht, filtriert und in einem Vakuumdesikkator getrocknet. 1 g getrockneter Dowex-50 wurden 13,5 g m-Nitrobenzaldehyd (purum) und eine reichliche Menge von Siedesteinen zugegeben. Methanol (125 g) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 60 Min. unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde das Gemisch abgekühlt und filtriert. Annähernd 70 ml 0,2 Mol Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, wurden zugegeben. Die wäßrige Phase der erhaltenen Emulsion wurde mit 40 ml und 35 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde einige Stunden über frisch erhitztem K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und zu einem Sirup abgedampft. TLC auf Kieselgel 60 (Merck) mit CHCl&sub3;/MeOH (9 : 1, Vol./Vol.) zeigte eine Änderung im Rf, konsistent mit der vollständigen Umwandlung zum Dimethylacetal (Rf = vorher 0,68, nachher 0,73).
Auf analoge Weise wurde durch Erhitzen unter Rückfluß von 13,5 g m-Nitrobenzaldehyd mit 125 g Ethanol während 30 Min. das korrespondierende Diethylacetal hergestellt, welches leichter zu isolieren war. Da Ethanol mit Wasser azeotrope Gemische bildet, konnten 60 ml durch Destillation entfernt werden, während der Dowex-Katalysator noch immer vorhanden war (es bestand keine Notwendigkeit, Alkali zuzugeben). Der Rückstand wurde nach Filtration auf einem Rotationsverdampfer in einen Sirup übergeführt.
Zur Reduktion der Nitro- zur Aminoverbindung wurde dem Verfahren gefolgt, welches von Howarth und Lapworth, J. Chem. Soc. 121, 76-85 (1922) für das Diethylacetal vorgeschlagen wurde.
50 g Na&sub2;S (puriss.) wurden in 50 ml Wasser aufgelöst, und 25 g 12 Mol HCl wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde unter Rühren einer Lösung von 15 g des Dimethylacetals in 90 ml Methanol zugegeben (Ethanol für das Diethylacetal). Die Reaktion wurde durch 6stündiges Erhitzen unter Rückfluß beendet, wonach der Alkohol aus der tiefroten Lösung abdestilliert wurde. Der wäßrige Rückstand wurde abgekühlt und zweifach mit 30 ml Diethylether extrahiert. Die Etherschicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert, und durch Rotationsverdampfung getrocknet. Die Dimethyl- und Diethylacetale konnten während Zeitspannen von einigen Monaten ohne sichtbare Zersetzung oder Polymerisation bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert werden.
Zu 20 mg m-Aminobenzaldehyddiethylacetal wurde 1 ml Pyridin, gefolgt von 1 ml Wasser, zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde langsam 200 mg Diethylentriaminpentaessigsäure-(DTPA)-dianhydrid (Calbiochem, La Jolla, USA) zugegeben, während kontinuierlich gemischt wurde, um das Anhydrid aufzulösen.
Nach 15minütigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung außen mit Eis gekühlt, während 2 ml Essigsäure zugegeben wurden. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde die Probe auf ein HPLC-System, welches bereits von Rose et al., Biochem. J 220, 189 (1984) beschrieben wurde, aufgetragen (zwei getrennte Durchgänge). Es wurde eine Radial u Bondapak C-18-Patrone verwendet, die mit wäßriger 0,1% (Vol./Vol.) Trifiuoressigsäure äquilibriert war. Die Fließgeschwindigkeit betrug 2 ml/Min. Sobald das Pyridinacetat nach 30 Min. eluiert worden war (Überwachungsabsorption bei 214 nm) wurde ein linearer Gradient aus reinem Acetonitril (Steigerung 2% pro Min. bis 60%, Vol./Vol.) aufgetragen, um die zwei Hauptfraktionen zu eluieren. Diese Fraktionen machten zusammen mehr als 90% der Absorption bei 214 nm, welche nach der Reagensfront erschien, auf, und sie sind die einzigen, welche mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin ein Präzipitat ergaben. Eine Rotationsverdampfung des Acetonitrils, gefolgt von einer Lyophilisierung, ergab 9 mg einer ersten Fraktion und 8,5 mg einer zweiten Fraktion. Eine analytische Hochspannungspapierelektrophorese wurde bei pH 6,5 durchgeführt. Die Flecken, Ninhydrin-negativ, wurden durch Sprühen mit einer gesättigten Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 2 Mol HCl sichtbar gemacht.
Die Papierelektrophorese bei pH 6,5 zeigte, daß die erste HPLC-Fraktion eine relative Mobilität (m) von -0,72 (m von Asparaginsäure = -1,0) hatte und daß die zweite Fraktion einen in-Wert von -0,34 hatte. Die erste HPLC-Fraktion wurde als das Ergebnis einer Acylierung eines Moleküls m-Aminobenzaldehyd gefolgt von einer Hydrolyse des zweiten Anhydridteils angesehen, und die zweite HPLC-Fraktion wurde als das Ergebnis einer Acylierung von zwei Molekülen m-Aminobenzaldehyd durch das DTPA-Dianhydrid angesehen. Diese Interpretation wurde durch die FAB-MS-Spektren der zwei Fraktionen bestätigt, welche Signale enthielten, die den protonierten Molekülionen bei m/z 497 bzw. 600 zuzuschreiben sind, und zeigte, daß, wie erwartet, der Acetalschutz durch die sauren Bedingungen bei der Aufarbeitung entfernt worden war.

(c) Koppeln von Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenylalanin-methylester und DTPA-mono- (m-formylanilid)

Der DTPA-m-Aminobenzaldehyd wurde im Puffer pH 3,5 von Beispiel 1(c) bei einer Konzentration von 5 mMol (2,64 mg/ml) gelöst. 10 mg Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenylalaninmethylester wurden in 450 ul dieser Lösung gelöst, und 500 ul von 10 mMol NaBH&sub3;CN wurden zugegeben. Es begann sich sofort ein Prazipitat (welches später als das gewünschte Produkt identifiziert würde) zu bilden. Nach 15 Minuten wurde das Präzipitat durch vorsichtige Zugabe von Eisessigsäure wieder in Lösung gebracht, und mit wäßriger 0,1% (Vol./Vol.) CF&sub3;COOH auf etwa 1,5 ml verdünnt. Das Gemisch wurde einer HPLC unterzogen (Radialpak uBondapak C-18-Patrone im Z-Modul, 5 Min. isokratisch, dann linearer Gradient von 25-45%, (Vol./Vol.), Acetonitril in 0,1%, Gew./Vol., wäßrige CF&sub3;COOH während 20 Min.). Das erwünschte Produkt trat nach etwa 17 Minuten auf und war der erste Peak nach dem Injektionstransienten. Das Acetonitril wurde in einem Stickstoffstrom abgedampft, und nach Lyophilisierung wurden 9 mg Produkt erhalten. Das Produkt war auf HPLC und auch auf Celluiose-Acetat-Elektrophorese bei pH 8 homogen. Es ergab im letzteren System einen Fleck, welcher schneller gegen die Anode wanderte als Insulin. Nach einem Markieren mit überschüssigem nicht-radioaktivem InZ111 und Aufarbeitung über Sep-pak wurde das Produkt durch Verdauung mit Trypin, gefolgt von HPLC, charakterisiert.

Beispiel 5

Markierung des Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenylalanin-methylester/DTPA-mono-(mformylanilid)-Koniugates mit radioaktiven Metallen

Das Des-AlaB30-insulin-B29-p-aminophenylalanin-methylester/DTPA-mono-(m--formylanilid)-Konjugat, welches gemäß Beispiel 4 erhalten worden war, wurde auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 3 für das Des-AlaB30-insulin/Deferoxamin-Konjugat beschrieben, mit ¹¹¹In und &sup6;&sup8;Ga markiert.

Beispiel 6

(a) Herstellung von m-Aminobenzoylpenta-[(N&epsi;-DTPA-alanyl)lysin]

Nα-Carbobenzoxy-penta-[(N&epsi;-boc)-lysin] (Bachem, Schweiz) wurde in wasserfreier Trifiuoressigsäure bis zu einer Konzentration von 25 mg in 750 ul gelöst. Nach 30 Min. bei Raumtemperatur wurde die Trifiuoressigsäure durch Abdampfung entfernt. Weitere Säurespuren wurden durch erneutes Auflösen des Feststoffes in wasserfreiem Methanol (10 ul MeOH für jedes mg Ausgangsprodukt) entfernt. Das Produkt ergab nun einen Ninhydrin-positiven Fleck auf der Papierelektrophore, mit den erwarteten Mobilitäten bei pH 1,9 und 6,5. Eine Menge des getrockneten, säurebehandelten Materials, welche 8,5 mg Ausgangsprodukt äquivalent war, wurde in DMSO (21 ul) gelöst, 34 mg DTPA-Alanin-p-nitrophenylester wurde zugegeben, gefolgt von 42 ul DMSO. Der sich einstellende pH wurde dann mit N-Ethylmorpholin (annähernd 35 ul) auf 8 eingestellt (feuchtes pH-Papier).
Die Reaktion wurde mittels Papierelektrophorese bei pH 6,5 verfolgt und wurde nach 25 h als beendet beurteilt (progressiver Ersatz des Ausgangsproduktes mit sogar mehr sauren Flecken mit immer schwächerer Ninhydrinfarbe und schließlich praktisch ein Verschwinden der gesamten Ninhydrinfarbe). Das Reaktionsgemisch wurde lyophilisiert und erneut in wäßriger konz. HBr gelöst (45 ul für jedes mg des geschützten Pentalysin-Ausgangsmaterials). Nach 30 Min. bei 20ºC wurde die Probe getrocknet. Dann wurde sie in 1% Essigsäure (bei einer Konzentration von 10 mg/ml) erneut gelöst und durch eine Säule aus Sephadex G-25 (Innendurchmesser 8 mm, Länge 60 cm) fließen gelassen. Das erwünschte Produkt, Penta-[(N&epsi; -DTPA-alanyl)-lysin], tritt im Durchbruchsvolumen auf. Es hatte auf Papierelektrophorese bei pH 6,5 die erwartete Mobilität. Die Sephadex-Sammlungen wurden lyophilisiert. Eine Menge dieses Produktes, äquivalent zu 10 mg geschütztem Pentalysin, wurde in 166 ul DMSO aufgenommen, und 26 mg Boc-m-aminobenzoyl-hydroxysuccinimidoester wurden zugegeben, gefolgt von 4 ul N-Ethylmorpholin. Nach 15 h bei 20ºC verschwand die ursprüngliche Ninhydrinfarbe auf Elektrophorese. Nach Behandlung des getrockneten Reaktionsgemisches mit 750 ul Trifiuoressigsäure und anschließendem Trocknen kehrte die Ninhydrinfarbe zur annähernd der gleichen elektrophoretischen Position (wie erwartet) zurück, jedoch als eine viel schwächere, aber sich viel schneller entwickelnde gelbe Farbe (charakteristisch für eine aromatische, in Gegensatz zu einer aliphatischen Aminogruppe).

b) Herstellung eines Konjugates aus m-Aminobenzovl-penta-[(N&epsi;-DTPA-allanyl)-lysin] und Des-AlaB30-insulin

Das rohe Produkt, welches unter (a) erhalten wurde, wurde direkt als eine 7 mMol Lösung zum Koppeln an das Produkt von Beispiel 1(a) in exakter Analogie zum Verfahren von Beispiel 1(c) verwendet, um das erwünschte Konjugat zu erhalten. Das neue Proteinderivat hat die erwartete intensive blaue Fluoreszenz und eine Mobilität bei Cellulose-Acetat-Elektrophorese bei pH 8,3 von annähernd dem 1,5fachen jener des Ausgangsinsulinderivates. Das Produkt wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 mit ¹¹¹In markiert. Eine Titration des Produktes mit ¹¹¹In von geringer spezifischer Aktivität unter Anwendung einer Cellulose-Acetat-Elektrophorese, um zwischen dem proteingebundenen und dem proteinfreien Indium zu unterscheiden, schlug vor, daß beinahe alle DTPA-Gruppen markiert sind, wenn die richtige Menge an ¹¹¹In einem Protein bei einer Konzentration von etwa 10 pMol angeboten wird.

Beispiel 7

(a) Herstellung von S-(2,3-Dihvdroxypropyl)cysteamin

Cysteaminhydrochlorid (1,08 g) und Dithiothreitol (1,46 g) wurden in 100 ml Alnmoniumbicarbnat (2%, Gew./Vol.) gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
3,1 g 3-Brom-1,2-dihydroxypropan wurden zugegeben. Die Alkylierung der Thiolgruppe wurde mittels Papierelektrophorese bei pH 1,9 verfolgt (Verfahren beschrieben von Gonzales und Offord, Biochem. J. 125, 309-317 [1971]). Nach 29 Stunden bei Raumtemperatur hatte sich der Cysteaminfleck (mit Ninhydrin gelb gefärbt) beinahe ausschließlich in einem Fleck (mit Ninhydrin grau gefärbt) mit der vorhergesagten Mobilität (Offord, Methods Enzym 47, 51-69 [1977]) des gewünschten Produktes umgewandelt. Ein schwacher zweiter Fleck war sichtbar, welcher der vorhergesagten Mobilität des bis-alkylierten Cysteamins entsprach.
Das Reaktionsgemisch wurde direkt einer Säule von Dowex 50X8 (3·15 cm) aufgetragen, welche vorher mit Pyridin/Essigsäure/Wasser von 25 : 1 : 225, (Vol./Vol.), pH 6,5, äquilibriert worden war. Dann wurde die Säule mit 200 ml H&sub2;O gewaschen, gefolgt von 50 ml des Puffers mit pH 6,5. Das erwünschte Produkt wurde aus der Säule mit 100 ml Ammoniaklösung (4 Mol) frei gesetzt. Das Aminoniakeluat wurde 20 Min. am Rotavapor abgedampft und dann gefriergetrocknet; Ausbeute: 493 mg eines elektrophoretisch homogenen Materials.

(b) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-S-(2,3-dihydroxylpropyl)-cysteamid

Eine Probe des Produktes, welches unter (a) erhalten worden war (200 mg) wurde in 1,118 ml Butan-1,4-diol gelöst. Eisessigsäure (37,5 ul) wurde zugegeben. Der pH (Glaselektrode, sehr langsames Ansprechen) wurde mit etwa 100 ul einer gesättigten Lösung von Tris(Base) in Butan-1,4-diol auf 7,0 angehoben.
Diese Lösung wurde verwendet, um das erwünschte Produkt auf eine Weise herzustellen, die jener exakt analog war, die in Beispiel 4 beschrieben ist (einschließlich der Aufarbeitung). Das Proteinprodukt hatte die elektrophoretischen und Ionenaustauscheigenschaften, die von einem Monoamid-substituierten Insulin erwartet werden, aber seine Hauptcharakterisierung liegt in seiner Verwendung für die über eine Schiffsche Base vermittelte Kopplung an m- Aminobenzoesäure und für die detaillierte Studie dieses letzteren Produktes (siehe unten).

(c) Koppeln von Des-AlaB30-insulin-B29-S-(2,3-dihydroxylpropyl)-cysteamid an m-Aminobenzoesäure

2 mg des substituierten Insulinamids, welches oben gemäß (b) erhalten worden war, wurden in 150 ul Natriumacetatpuffer (0,48 Mol, pH 5,6, 7 Mol in Harnstoft) aufgelöst. Dazu wurden 16 ul frisch hergestellte Perjodsäure (4 g/l H&sub2;O) und 83 ul einer Lösung von m-Aminobenzoesäure (1,23 Mol) gegeben. Diese letztere Lösung wurde hergestellt, indem eine 0,1 Mol Lösung der Säure mit einer starken Natriumhydroxidlösung auf pH 6,5 eingestellt, lyophilisiert und erneut auf 1,23 Mol gelöst wurde. Schließlich wurden 16,6 ul Natriumcyanoborhydrid (30 mMol) zugegeben. Nach 60 Min. wurde das Gemisch dialysiert und erneut in 1 ml HCl (0,01 Mol) gelöst. Diese Lösung wurde für die HPLC auf eine C 18-Säule, wie in den früheren Beispielen beschrieben, aufgetragen, und mit einem linearen Gradienten von 29-35% (Vol./Vol.) Acetonitril in 0,3 Mol Ammoniumsulfat entwickelt, was 15 Minuten dauerte. Die Ammoniumsulfat-Stammlösung (3 Mol), die verwendet wurde, diese Eluierungsmittel herzustellen, war mit starker H&sub2;SO&sub4; auf pH 2,7 (Glaselektrode) eingestellt worden. Der Produktpeak, welcher etwa 90% des Proteins entsprach, trat nach etwa 2 Min. nach der Position des Ausgangsmaterials auf. Das Protein wurde aus den geeigneten gesammelten Fraktionen auf einer Sep-pak-Patrone absorbiert, nachdem das Acetonitril ausgeblasen worden war. Nach einem Waschen der Patrone mit 0,1% (Vol./Vol.) wäßriger Trifiuoressigsäure/10% (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril wurde das Produkt mit 2 ml 0,1% wäßriger Trifiuoressigsäure/40% wäßrigem Acetonitril eluiert. Das Protein, welches durch Ausblasen des Acetonitrils mit anschließendem Lyophilisieren gewonnen wurde, war stark fluoreszierend. Es wurde mit seiner Mobilität auf Cellulose-Acetat-Elektrophorese und durch Verdauung mit Armillaria-Protease charakterisiert. Das kleine Fragment aus der Armillaria-Verdauung wurde mittels FAB-MS charakterisiert.

Beispiel 8

Allgemeines Verfahren zur Herstellung von IgGs die an den C-Termini ihrer Ketten mit DTPA markiert sind

(a) Auswählen optimaler Bedingungen

Ein monoklonales oder polyklonales IgG (9 mg/ml, isotone Salzlösung) wird mit Puffer (Na-Phosphat, 0,1 Mol, pH 8,5), p-Aminophenylalaninamid (460 mg/ml) und Carboxypeptidase Y (2 mg/ml) im Volumverhältnis von 4,5 : 5,5 : 6,5 : 1 gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu gewählten Zeitpunkten nach dem Beginn der Reaktion (normalerweise nach 20 Min., 60 Min., 2,5 h, 5 h, 18 h) werden Proben von 6,5 ul genommen und mit 2 ul wäßriger Trichloressigsäure, 10% (Gew./Vol.) gefallt. Das Präzipitat wird mittels Zentrifugieren gewonnen und durch Zentrifugieren in weiteren 200 ul Trichloressigsäure gewaschen. Das Pellet wird in wäßrigem, gesättigtem Harnstoff gelöst, gefallt und noch einmal unter Verwendung von 10% Trichloressigsäure gewaschen. (Dieses extensive Waschen ist nötig, um Spuren des p-Aminophenylalaninamids zu beseitigen, da diese Verbindung zu Beginn in einer sehr hohen Konzentration vorhanden ist.) Das Pellet wird in Acetatpuffer (Essigsäure, 10%, mit konzentrierter NaOH auf pH 3,5 gebracht), aufgelöst, wobei Harnstoff verwendet wird, falls es nötig ist. Es wird dann mit 0,5 mg festem DTPA-bis-Anhydrid unter starkem Schütteln behandelt. Nach 2 Min. wird das Protein gefällt und neuerlich wie oben gewaschen. Ein weiterer Zyklus aus Auflösung, Umfallung und Waschen wird ausgeführt. Dann wird das Produkt in 10 ul Citratpuffer von Beispiel 3 erneut suspendiert, und 1 ul einer Lösung von ¹¹¹In-Oxim (Amersham International p.l.c., GB) wird zugegeben. Nach 5 Minuten wird das
Pellet mittels Zentrifugation gewonnen, in 200 ul destilliertem Wasser gewaschen und gezählt.
Zu jedem Zeitpunkt werden parallel Kontrollproben hergestellt. Diese können von einer Inkubation erhalten werden, in welcher die Lösung der Carboxypeptidase Y durch ein äquivalentes Volumen von destilliertem Wasser ersetzt wird. Als optimale Zeit wird jene angesehen, wenn (nach Berichtigung auf die spezifische Radioaktivität des ¹¹¹In und Subtraktion der Hintergrundradioaktivität, die mit der entsprechenden Kontrolle angegeben wird) die Radioaktivität der Probe jedem IgG-Molekül entspricht, welches durchschnittlich einen p-Aminophenylalaninamidrest an seinem Carboxyl-Terminus aufweist. Ein repräsentatives Ergebnis bei einer angewendeten spezifischen Radioaktivität des verwendeten ¹¹¹In (85 Ci/uMol) ist ca. 6.000 cpm nach Subtraktion der Kontrolle.

(b) Herstellung in größerem Umfang

Die x-stündige Inkubation, welche das optimale Ergebnis in Teil (a) ergab, wird dann mit 0,4 mg IgG wiederholt. Die Reaktion wird durch 25-fache Verdünnung auf pH 3,5 (10% Essigsäure, die vorher mit wäßriger 5 Mol NaOH eingestellt worden war) gestoppt. Das Protein wird aus diesem Gemisch mittels Gelfiltration (Sephadex G-150) gewonnen.
Das erhaltene Produkt wird mit DTPA-mono-(m-Formanilid) (Beispiel 4) durch Reduktion mit Cyanoborhydrid auf die übliche Weise umgesetzt: Proteinkonzentration 4 mg/ml, Aldehydkonzentration 1 mMol, Cyanoborhydridkonzentration 0,75 mMol, pH 3,5 (Acetat, 1%). Nach 90 Minuten wird eine Probe genommen und durch Inkubation mit ¹¹¹In, wie z. B. in Beispiel 3 beschrieben, markiert. Das markierte Protein wird vom markierten, nicht-gekoppelten Aldehyd auf einer Sep-pak-Patrone abgetrennt. Der Aldehyd wird mit wäßrigem 20% Acetonitril/wäßriger 0,1% Trifluoressigsäure entfernt, während das Protein nicht entfernt wird. Die mit dem Protein verbundene Radioaktivität (nach Subtraktion von geeigneten Kontrollzählungen) entspricht einer vollständigen Umsetzung. Das erwünschte Protein wird vom Rest des Schiffsche Basen-Reaktionsgemisches mittels Gelfiltration, wie vorher beschrieben, isoliert.

Beispiel 9

(a) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-N-(formylmethyl)amid

1,33 g Aminoacetaldehyddiethylacetal (Fluka, Schweiz) wurden 8 ml Butan-1,4-diol zugegeben, gefolgt von 450 ul Essigsäure. Zu 100 mg Des-AlaB30-insulin (hergestellt im wesentlichen gemäß Morihara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 92, 396 [1980] wurden 3 ml der Acetallösung zugegeben, gefolgt von 0,1 ml Wasser, und das Gemisch wurde 10 Min. bei 370 inkubiert, wobei sich das Des-AlaB30-insulin auflöste. Nach Zugabe von 100 ul Wasser, welches 10 mg mit TPCK behandeltes Trypsin (Worthington) enthielt, wurde die Lösung bei 37ºC 90 Minuten inkubiert und mit einem gleichen Volumen reiner Essigsäure bei 0ºC gelöscht. Die erhaltene Lösung wurde mit einem gleichen Volumen von 1% Essigsäure verdünnt und dann auf einer Säule (90·2,6 cm) aus Sephadex GSO (Güte: fein) gelfiltriert und mit 1% (Vol./Vol) Essigsäure eluiert. Die Fraktionen, welche das Insulinderivat enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Das Produkt wurde mittels Ionenaustauschchromatographie auf einer Säule A-25 gereinigt, wie in Beispiel 4(a) beschrieben. Nach Dialyse gegen 1% Essigsäure und Lyophilisierung wurden 33 mg Produkt gewonnen.
Bei HPLC eluierte das Produkt 1,5 Min. später aus der C-18-Patrone als das Des-AlaB30-insulin (Bedingungen wie in Beispiel 4(a)), was damit konsistent ist, daß es hydrophober ist. Eine Entschützung des Acetals wurde auf sehr einfache Weise dadurch erzielt, daß das Des-AlaB30-insulin-B29-N-(formylmethyl)-amid-diethylacetal (2 mg/ml) in 5% Ameisensäure bei 37ºC über Nacht inkubiert wurde, unter welchen Bedingungen eine Entschützung von annähernd 90% erzielt wurde. Bei analytischer HPLC eluierte das Produkt, Des-AlaB30-insulin B29-N-(formylethyl)-amid, aus der C-18-Patrone früher als das Diethylacetal (und sehr nahe zur Position des Des-AlaB30-insulins). Das Des-AlaB30-insulin-B29-N-(formylmethyl)-amid wurde aus der verdünnten Ameisensäure mittels Lyophilisierung gewonnen.

(b) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-N-(formylmethyl)-amid/m-Aminobenzoyl-ferrioxamin B-Koniugat

Zu 20 mg Des-AlaB30-insulin-B29-N-(formylmethyl)-amid, welches in 0,2 ml 0,48 Mol wäßrigem Natriumacetatpuffer (pH 5,6) gelöst war, wurden 117 mg m-Aminobenzoylferrioxamin B, gelöst in 800 ul Dimethylformamid, zugegeben. Der pH wurde mit NaOH auf 5,0 eingestellt, und dann wurden 500 ul einer 10 mMol Lösung von Natriumcyanoborhydrid (Aldrich) in Wasser zugegeben. Der pH, welcher auf 6,2 angestiegen war, wurde auf 5,5 eingestellt, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die analytische HPLC auf einer C-18-Patrone (Bedingungen wie in Beispiel 4(a)) zeigte, daß etwa 80% des Ausgangsmaterials in eine Spezies umgewandelt worden war, welche 3 Minuten später als das restliche Ausgangsmaterial eluierte. Diese später eluierende Spezies, welche später als das erwünschte Produkt, Des-AlaB30-insulin-B29-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-C&sub6;U-m-CO-ferrioxamin B, identifiziert wurde, wurde auf der gleichen Säule präparativ isoliert. Das Produkt (11,9 mg) war aufgrund des vorhandenen Eisens pfirsichfarben und wurde durch Verdauung mit Trypsin charakterisiert, was Des-octapeptid-(B23-B30)-insulin (identifiziert mittels HPLC und Elektrophorese auf Celluloseacetat bei pH 8) ergab, das Heptapeptid, welches B23-B29- Reste (identifiziert mittels HPLC, mittels Elektrophorese auf Papier bei pH 6,5 und mittels FAB-MS) und NH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-C&sub6;H&sub4;-m-CO-ferrioxamin B (identifiziert mittels FAB-MS) umfaßte.

Beispiel 10

(a) Herstellung von DTPA-mono-(N-formylmethyl)-amiddiethylacetal

Diese Verbindung wurde aus DTPA-bis-Anhydrid und Aminoacetaldehyddiethylacetal analog der Herstellung von DTPA-mono-(m-formylanilid) (Beispiel 4(b)) hergestellt, wobei 20 mg der Aminokomponente und 200 mg des Anhydrids verwendet wurden. Erneut wurden zwei Hauptprodukte mittels HPLC isoliert (wie in Beispiel 4(b)), und zwar 5 mg einer ersten Fraktion und 6,1 mg einer zweiten Fraktion. Die erste Fraktion hatte bei Elektrophorese auf Papier bei pH 6,5 eine relative Mobilität von etwa -0,76 (Asp = -1,0); sie war auf Ninhydrin negativ und wurde durch Sprühen mit DNP-Hydrazin in 2 Mol HCl sichtbar gemacht. Ein Erwärmen auf 100ºC war notwendig, um einen gelben Fleck sichtbar zu machen, was nahelegt, daß der Acetalschutz, bei aliphatischen Aldehyden viel weniger labil als bei aromatischen, noch immer vorhanden war. Die Fraktion wurde als DPTA-mono-(N-Formylmethyl)amid-diethylacetal mittels FAB-MS charakterisiert. Die zweite HPLC-Fraktion wurde mittels FAB-MS identifiziert, durch starke Signale bei m/z 624, 646 und 662 (protoniertes Molekülion, mit Natrium kationisiertes Ion bzw. mit Kalium kationisiertes Ion), als das Dimere, welches aus der Acylierung von zwei Molekülen Aminoacetaldehyd durch das Bisanhydrid (DPTA-bis-(N-Formylmethyl)amid-diethylacetal) resultierte.

(b) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L-phenyl-alanin-methylester/DTPA- mono-(N-formylmethyl)-amid-Koniugat

Die Acetalschutzgruppe DPTA-mono-(N-Formylmethyl)amid-diethylacetal wurde mit 1 Mol HCl quantitativ entfernt. 0,63 mg entschütztes Material wurden in 250 ul Puffer gelöst, welcher durch Einstellen des pH einer wäßrigen 1% (Vol./Vol.) Essigsäure auf pH 3,5 mit 1 Mol NaOH hergestellt wurde. 0,2 mg Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L-phenylalanin-methylester (siehe Beispiel 4(a)) wurden in 9 ul der DPTA-mono-(N-formylmethyl)amid-Lösung aufgelöst, und 10 ul wäßriges Natriumcyanoborhydrid (10 mMol) wurden zugegeben. Nach 90 Min. bei Raumtemperatur wurde das Produkt, welches ausfiel, durch Ansäuerung (um es löslich zu machen) isoliert, gefolgt von HPLC auf der C-18-Patrone. Obgleich das Produkt zu nahe zur Position des Insulinausgangsderivates für jede brauchbare Abtrennung, die versucht werden könnte, eluierte, zeigte eine Elektrophorese auf Cellulose bei pH 8, daß eine Kopplungsausbeute von etwa 40% erzielt worden war.

Beispiel 11

Herstellung eines Dimers von Insulin unter Verwendung von Des-AlaB30-insulin-B29-p- amino-L-phenylalanin-methylester und m-Benzoldialdehyd

Zu 100 ul 1 Mol Propionsäure, welche 2 mg Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L- phenylalanin-methylester und 26,8 ug m-Benzoldialdehyd enthielt, wurden 100 ul 1 Mol Propionsäure, welche 62,8 ug Natriumcyanoborhydrid enthielt, zugegeben. Nach 5 Min. bei Raumtemperatur wurde das Produkt mittels HPLC auf einer C-18-Patrone isoliert. Die Gelfiltration auf Sephadex G-50 zeigte, daß das Insulinausgangsderivat umgewandelt worden war, und zwar in einer Ausbeute von etwa 70% in eine dimere Verbindung (bezogen auf die Eluierung aus Sephadex G-50), weiches aus der Patrone C-18 eluierte (analytische Fahrweise, linearer Gradient von 25-40%, Vol./Vol., Acetonitril in 0,1% Trifiuoressigsäure bei 1% pro Min.) und erschein drei Minuten nach dem Ausgangsmaterial. Unter ähnlichen Reaktionsbedingungen ergibt unmodifiziertes Schweineinsulin weniger als 1% dimeres Material. Die Struktur des dimeren Produktes ist:

Beispiel 12

Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L-phenylalanin/Des-AlaB30-insulin-B29--mformylanilid-Koniugates

10,2 mg Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L-phenylalanin-methylester (hergestellt wie in Beispiel 4(a) beschrieben) wurden in 5 ml wäßriger 1% (Gew./Vol.) Aminoniumbicarbonatlösung, welche mit NaOH auf pH 9,5 gebracht worden war, verseift. Nach Inkubation während 24 h bei 37ºC wurde das verseifte Produkt auf einer Sep-pak gemäß den Gebrauchsanweisungen des Herstellers isoliert und mit 50% (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril, welches 0,05% in Trifiuoressigsäure war, eluiert. Die Verseifung des Methylesters wurde mittels Elektrophorese auf Celluloseacetat bei pH 8 bestätigt. Das Produkt wurde durch Lyophilisierung nach Entfernung des Acetonitrils auf dem Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur gewonnen. Einem Volumen einer Lösung von Des-AlaB30-insulin-B29-p-amino-L-phenylalanin (50 mg/ml in 1 Mol Propionsäure) wurde ein Volumen einer Lösung von Des-AlaB30-insulin-B29-m-formylanilid (hergestellt gemäß Beispiel 1(a) mit Reinigung durch HPLC; auch 50 mg/ml in 1 Mol Propionsäure) und ein halbes Volumen einer Lösung von Natriumcyanoborhydrid (3,14 mg/ml) in 1 Mol Propionsäure) zugegeben. Nach 4 Min. wurde mittels HPLC (Patrone C-18) gezeigt, daß etwa 70% des Ausgangsproteins in ein hydrophoberes Material umgewandelt worden war, welches zwei Minuten später als das Ausgangsamin eluierte und die Eigenschaften eines Dimers mit der vermutlichen Struktur:
hatte.

Beispiel 13

(a) Herstellung von N-Hydroxysuccinimidester von 4-Methoxy-3 -nitrobenzoesäure

1,97 g (10 mMol) 4-Methoxy-3-nitrobenzoesäure wurde in 50 ml Acetonitril aufgelöst. 1,15 g (10 mMol) N-Hydroxysuccinimid wurden unter Schütteln zugegeben. Schließlich wurden 2,063 g (10 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Gemisch geschüttelt. Nach 2 Stunden bei etwa 20ºC hatte sich ein Präzipitat von Dicyclohexylharnstoff gebildet. Die Lösung wurde durch einen Trichter Gooch 3G filtriert. Die Esterbildung wurde mittels t.l.c. des Filtrates (CHCl&sub3;/MeOH = 9 : 1, Vol./Vol.) bestimmt. Eine Bobachtung unter U.V. zeigte den Ester als einen dunklen Fleck mit Rf bei etwa 0,9. Nach Abdampfung des Acetonitrils blieb ein weißlich-gelbes Pulver im Kolben zurück. Das Pulver wurde erneut in 50 ml heißem Isopropanol gelöst. Etwa 2 Spatelspitzen Aktivkohle wurden zugegeben, und die Lösung wurde in einem kochen Wasserbad für etwa 5 Minuten gekocht. Die siedende Lösung wurde schnell durch ein Sinterglasfilter (G4, vorher mit Durchfließenlassen von heißem Isopropanol erwärmt) in einen heißen Kolben gegossen. Die Lösung wurde über Nacht abkühlen gelassen. Weiße, nadelähnliche Kristalle wurden gebildet (Fp etwa 145-152ºC) mit den erwarteten t.l.c.- Eigenschaften.

(b) Insulinaktivierung mit N-Hydroxysuccinimidester von 4-Methoxy-3 -nitrobenzoesäure

61 mg (10 uMol) Insulin (vom Schwein) wurden in 2,1 ml DMSO aufgelöst. Dazu wurden 900 ul einer Lösung von N-Ethylmorpholincarbonat, pH 8,3 (diese Lösung wurde aus 10 ml N-Ethylmorpholin und gepulvertem Trockeneis unter Rühren hergestellt, bis der pH der Lösung, mit einer Elektrode gemessen, 8,3 war) gegeben.
Eine Lösung von 3,6 mg des N-Hydroxysuccinimidesters der 4-Methoxy-3-nitrobenzoesäure wurde in 100 ul DSMO hergestellt. Dies wurde der obigen Insulinlösung unter Schütteln zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Das Verhältnis von N-Hydroxysuccinimidester zu Insulin war auf einer Molbasis 1 : 1. Die Umsetzung wurde durch Ansäuerung, das heißt Zugabe von 60 ul HCl, 37% (pH der Reaktionslösung etwa 2,5 auf Papier) gestoppt. Die angesäuerte Reaktionslösung wurde gegen NH&sub4;HCO&sub3; (1%) dialysiert und dann lyophilisiert.
Das Nitrobenzoyl-Insulinderivat wurde durch Ionenaustausch auf einer 11·2,5 cm DEAE-A 25-Säule (Fließgeschwindigkeit annähernd 1 ml/min, äquilibriert mit 0,1 Mol Tris- HCl/7 Mol Harnstoff, pH 8,4, Eluierung mit einem 0 bis 0, 15 Mol NaCl-Graduenten) gereinigt. Die Peak-Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser und dann gegen NH&sub4;HCO&sub3; (1%, Gew./Vol.) dialysiert und dann lyophilisiert. Jeder Pool wurde mittels HPLC analysiert (gleiche Bedingungen wie oben), um die Reinheit des monosubstituierten Nitrobenzoylinsulins zu bestätigen.

(c) Reduktion von monosubstituiertem Nitrobenzoylinsulin zu monosubstituiertem Aminobenzoylinsulin

5 mg gereinigtes, monosubstituiertes Nitrobenzoylinsulin wurden in 1 ml Tris-HCl (50 mMol)-Puffer, pH 8,3, aufgelöst. 60 ul einer Natriumdithionitlösung (50 mMol in H&sub2;O) wurden zugegeben (3,6facher Überschuß Dithionit gegenüber Insulin). Nach Schütteln auf einem Vortex-Mischer wurde die Lösung 3 Minuten bei Raumtemperatur (annähernd 20ºC) stehen gelassen.
Die Reaktion wurde durch Verdünnen der Lösung auf 4 ml mit einem Puffer von 50 mMol Tris-HCl, pH 8,3, gestoppt. Die Reaktionslösung wurde über eine SEP-PAK-Patrone (WATERS) entsalzt. Die Probe wurde auf der Patrone mit einer Lösung von 10% CH&sub3;CN/0,1% TFA absorbiert und mit einer Lösung von 40% CH&sub3;CN/0,1% TFA herauseluiert. Das überschüssige Acetonitril wurde mit einem Druckluftstrom weggetrocknet, und dann wurde die Lösung lyophilisiert.
Das erhaltene Aminobenzoylinsulinpulver wurde mittels präparativer HPLC (RP-18- Säule; Puffer: 0,3 Mol (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, pH 2,7; Beladung mit 24% CH&sub3;CN, linearer Gradient bis zu 35% CH&sub3;CN während 45 Minuten) gereinigt. Die Peak-Fraktionen wurden getrennt gesammelt, das überschüssige Acetonitril wurde unter einem Druckluftstrom abgedampft, und dann wurden die übrigbleibenden Lösungen lyophilisiert.
Die Peaks, welche bei oder nahe der erwarteten Position für mit Aminobenzoyl substituiertes Insulin auftraten, wurden wie folgt getestet. Der gefriergetrocknete Pool wurde auf 7,9 mg/ml in 10 nMol HCl gelöst, und versuchsweise wurden Schiffsche-Basen-Kopplungen an Benzaldehyd auf die übliche Weise ausgeführt (10 mMol, wäßrig, solubilisiert mit einer geringen Menge festem Harnstoff). Die Pools, welche mittels HPLC beurteilt wurden, daß sie am wirksamsten mit der Benzaldehydlösung gekoppelt haben, wurden für die nachfolgenden Tests gewählt. Es wurden zwei Peaks, vermutlich Isomere, gesehen, die mit Benzaldehyd sehr gut koppeln können.

(d) Herstellung eines Aminobenzoylinsulin/Des-AlaB30-insulin-B29-m-formylanilid-Konjugates

Methode

Der gereinigte Insulin-aryl-NH&sub2;-(aminobenzoylinsulin)-Pool wurde an Insulin-aryl- CHO (Des-AlaB30-insulin-B29-m-formylanilid, hergestellt, wie in Beispiel 1(a) beschrieben) gekoppelt, wobei das folgende Verfahren angewendet wurde:
Insulin-aryl-NH2 (6,8 mg/ml) 5 ul (34 ug oder 5,7 nMol)
+ Insulin-aryl-CHO (7,8 mg/ml) 4,3 ul (34 ug oder 5,7 nMol)
+ NaBH&sub3;CN (3 mMol) 2 ul (6 nMol)
+ Essigsäure 4,17%, eingestellt auf 1,2 ul pH
3,5 mit starker NaOH
Nach Vortex-Mischen und 30-minütigem Stehenlassen bei Umgebungstemperatur wurde die Lösung mittels HPLC wie vorhin und mit einem SDS-Gradientengel von 15-25% (bei pH 8,3) analysiert. Sowohl HPLC als auch das SDS-Gel zeigte eine Bildung von gekoppeltem Material. Auf dem Gel wurde eine Bande von MG etwa 11.900 beobachtet, was die Anwesenheit eines Insulindimers bestätigte.

Beispiel 14

(a) Herstellung eines Fab-p-aminophenylalaninamids mit Carboxypeptidase Y

Eine Lösung eines Fab-Antikörperfragmentes wurde durch Papainverdauung eines Antikörpers, Gelfiltrationschromatographie und Konzentration mittels Membranfiltration unter Anwendung von Standardmethoden hergestellt. Die Lösung wies einen Proteingehalt von 4,3 mg/ml auf; und das Lösungsmittel war Dulbecco-Phosphat-gepufferte Salzlösung. Zu 70 ul dieser Lösung wurden 7 mg festes p-Aminophenylalaninamid zugegeben und aus einer Lösung gefriergetrocknet, welche mit 0,01 Mol NaOH oder 0,01 Mol HCl, entsprechend den Erfordernissen, auf einen pH von 8,5 eingestellt worden war. Sobald das p-Aminophenylalaninamid in Lösung war, wurden 7 ul Carboxypeptidase Y von Carlsberg (1 mg Feststoff, entsprechend 0,106 mg Protein, pro 50 Mikroliter) zugegeben. Nach zwei und einer halben Stunde bei Raumtemperatur wurde das Enzym mit PMSF (7 Mikroliter einer Lösung von 10 mg/ml in Acetonitril) inhibiert und 10 Minuten bei 0ºC gelassen. Dann wurde das Verdaute mit 500 Mikroliter Dulbecco-Phosphat-gepufferte Salzlösung verdünnt und einer Gelfiltration unterworfen (Sephadex GSO; Säule 60 cm·0,9 cm Durchmesser). Der Protein-Peak wurde gesammelt und auf 1,1 mg/ml konzentriert (überwacht mittels O.D.&sub2;&sub8;&sub0;; O.D. 1,3 = 1 mg/ml).

(b) Herstellung von Fab-p-Aminophenylalaninamid mit Papain

Zu einem Volumen einer Lösung eines Fab-Fragmentes (die gleichen Lösungsbedingungen, wie jene, die oben bei (a) angewendet wurden) wurden zwei Volumina einer Lösung von 1 Mol p-Aminophenylalaninamid (pH mit Essigsäure auf pH 6,7 eingestellt) gegeben. Drei Volumina Butan-1,4-diol wurden zugegeben, gefolgt von 0,06 Volumina Cystein (1 Mol). Ein 50 : 50-Gemisch einer Papainsuspension und Butan-1,4-diol wurde hergestellt (Endpapaingehalt 18 mg/ml), und 0,28 Volumina des Gemisches wurden auf einmal der Fab-Lösung zugegeben. Der scheinbare pH wurde mit pH-Papier überprüft: Falls der scheinbare Wert unterhalb pH 6,2 war, wurde er mit 0,01 Mol NaOH auf 6,2-6,7 angehoben (unter sorgfaltigem, schnellem Mischen). Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Papain durch Zugabe des geeigneten Volumens an Jodessigsäure, 0,5 Mol, welche mit einer 1% NaHCO&sub3;-Lösung auf pH 7,0 gebracht war, inaktiviert. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Proteinkonjugat auf Sephadex GSO isoliert, wie oben beschrieben.

(c) Herstellung von Fab-p-Aminophenylalaninamid mit Trypsin

Zu einem Volumen einer Lösung eines Fab-Fragmentes (die gleichen Lösungsbedingungen wie in (a)) wurden zwei Volumina der Lösung von 1 Mol p-Aminophenylalaninamid, pH 6,7, die in (b) verwendet wurde, zugegeben. Dann wurde Butan-1,4-diol (3,2 Volumina) zugegeben, gefolgt von 0,2 Volumina Schweinetrypsin (10 mg/ml in HCl 10&supmin;² Mol). Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde der pH mit Essigsäure auf 3,5 gebracht und das modifizierte Fab mit Gelfiltration isoliert, wie oben angegeben.

(d) Herstellung von N&epsi;-Dansyl-Nα-(m-formylbenzoyl)lysin

4-Carbobenzaldehyd (Fluka) wurde mit trockenem Methanol bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. T.l.c. auf Silika mit Chloroform/Methanol (9 : 1, Vol./Vol.) zeigte im wesentlichen eine quantitative Umwandlung zum Acetal, beurteilt durch Überprüfung nach Aufsprühen einer gesättigten Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 2 Mol HCl (Rf des Produktes etwa 0,3, Rf des Ausgangsaldehyds etwa 0,15). Das Produkt wurde durch Rotationsabdampfung ohne Erwärmen gewonnen, und Wasserspuren wurden aus dem weißen Kuchen durch die Zugabe von 50 ml Dichlormethan, gefolgt von einer nochmaligen Rotationsabdampfung, entfernt. Dem Kuchen wurden unter Mischen 2,3 g N-Hydroxysuccinimid in 120 ml Ethylacetat, gefolgt von 4,12 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Ethylacetat zugegeben. Die quantitative Übertragung des Carbodiimids aus dem Wägeröhrchen in das Reaktionsgefäß wurde durch Abwaschen mit 10 ml Ethylacetat sichergestellt. Nach etwa 1 Minute bildete sich eine schweres Präzipitat. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Präzipitat durch Filtration entfernt. Das Präzipitat wurde mit 20 ml Ethylacetat gewaschen, und die vereinigten Filtrate wurden zu einem Öl abrotovapiert, welches Öl spontan kristallisierte. Die Umkristallisation aus 120 ml Propan-2-ol ergab 2,75 g eines weißen kristallinen Produktes. Die Massenspektrometrie (Bombardement mit schnellen Atomen) zeigte ein starkes Signal bei m/z-262, interpretiert als M+H&spplus;-MeOH. Die Verbindung ergibt auf t.l.c. einen einzelnen Fleck (das gleiche chromatographische System und Besprühung wie oben) mit einem Rf von etwa 0,6.
N&epsi;-Dansyl-Nα-L-lysin (Sigma, 9,5 mg) wurde unter leichtem Erwärmen in 100 ul Dimethylformamid gelöst. N-Ethylmorpholin (3 ul) wurde zugegeben, so daß der scheinbare pH, beurteilt durch punktförmiges Auftragen auf feuchtes pH-Papier, zwischen 8 und 8,5 war. Diese Lösung wurde mit ,einer Lösung von 7,3 mg Hydroxysuccinimidoester von 4-Carboxybenzaldehyddimethylacetal in 50 ul Dimethylformamid gemischt. Der scheinbare pH wurde auf die gleiche Weise wie oben geprüft und, falls nötig, mit N-Ethylmorpholin (1 ul auf einmal) eingestellt. Nach 4 Stunden und 30 Minuten (wobei der scheinbare pH von Zeit zu Zeit geprüft und, falls notwendig, eingestellt wurde) wurde eine ähnliche Lösung von 7,3 mg des aktiven Esters zugegeben und die Reaktion für weitere 4 Stunden fortschreiten gelassen. Dann war die Reaktion, beurteilt mittels t.l.c., praktisch beendet. Das t.l.c.-System war jenes, welches in Beispiel 1(c) beschrieben ist, und die Rf-Werte waren etwa 0,3 und 0,6 für Dansyllysin bzw. das Produkt. Das Gemisch wurde dann mit 1 ml Essigsäure (1%, Vol./Vol.) zentrifugiert, und der Überstand wurde einer HPLC (System von Beispiel 4(c)) unterworfen. Der fluoreszierende Haupt-Peak, der mit dem Gradienten (etwa 40% Acetonitril) eluierte, wurde gesammelt, und das Acetonitril wurde mit einem Luftstrom ausgetrieben. Das Produkt wurde durch Messung seiner elektrophoretischen Mobilität bei pH 6,5 (vorhergesagt und beobachtet, 0,5 [mAsp = 1,0]) charakterisiert. Dieser Stammlösung (600 ul) wurden 6 ul Mol HCl zugegeben, und die Lösung wurde mit 10&supmin;³ Mol HCl zehnfach verdünnt. Dies brachte die Konzentration auf 0,7 mMol, beurteilt durch direkten Vergleich des U.V.-Absorptionsspektrums mit jenem einer Lösung von Dansyllisin bekannter Konzentration. Es wurde angenommen, daß die optische Dichte des Dansylchromophors in den zwei Substanzen etwa gleich ist.
Es wurde erwartet, daß der Acetalschutz während der HPLC entfernt wird (pH des Systems etwa 2). Diese Hypothese wurde durch die Tatsache bestätigt, daß das Produkt eine schnellen Kopplung an aromatische Amine über die Schiffsche Base/Cyanohydrid-Reaktion durchmachte, und zwar ohne die Notwendigkeit für eine vorherige Säurebehandlung.

(e) Koppeln von Fab-p-aminohenlalaninamid und N&epsi;-Dansyl-Nα-(m-formylbenzol)lysin

Das Fab-Derivat, welches gemäß dem Verfahren (a) erhalten wurde (1,1 mg/ml), wurde entweder bei pH 3,5 (Acetatpuffer, hergestellt durch Einstellen einer 12% (Vol./Vol.) Essigsäure mit konzentrierter NaOH auf pH 3,5 und anschließendem Verdünnen auf ein Endäquivalent von 10% Essigsäure) oder pH 2 (1 Mol Propionsäure, mit 1 Mol HCl auf pH 2 heruntergebracht) gepuffert. In jedem Fall wurden zwei Volumina Puffer für jeweils fünf Volumina Fab- Lösung verwendet. Dieser Lösung wurden 1 Volumen einer Lösung des Lysinderivates, welches gemäß Verfahren (d) erhalten wurde (etwa 0,7 mMol in 10&supmin;³ Mol HCl) und 1 Volumen Natriumcyanoborhydrid (3 mMol) zugegeben. In den Kontrollen wurde das Cyanoborhydrid durch Wasser ersetzt. Es wurden von Zeit zu Zeit Proben gezogen, und das Ausmaß der Kopplungsreaktion wurde durch Elektrophorese auf Celluloseacetat beurteilt. Salz und jeglicher nicht-gekoppelte Aldehyd wurden größtenteils eliminiert, bevor gearbeitet wurde, und zwar mittels Acetonfällung des Proteins, welches für eine Elektrophorese im Elektrophoresepuffer (2% Ameisensäure/8% Essigsäure/8 Mol Harnstoff) aufgenommen wurde. Es schien, daß die Kopplung zwischen 20 und 80 Minuten ihr Maximum erreichte. Das fluoreszierende Proteinkonjugat wurde durch Fällung (kaltes Aceton) und Waschen isoliert. Die Kontrollen zeigten keine Fluoreszenz.

Beispiel 15

Herstellung von m-Aminobenzoylpolyglutaminsäure an den Seitenketten mit Ferrioxamin B substituiert

Polyglutaminsäure (Sigma Inc., Glutaminsäure, durch Ausbildung von Peptidbindungen über ihre alpha-Amino- und Carboxylgruppen polymerisiert, mittlere Anzahl von Resten pro Kette etwa 50) wurde in Dimethylsulfoxid (100 mg in 1 ml DMSO) suspendiert. Der scheinbare pH, extern mit feuchtem pH-Papier beurteilt, wurde durch vorsichtige Zugabe von N-Methylmorpholin auf 8 gebracht. Hydroxysuccinimidester der m-Aminobenzoesäure (Beispiel 1) wurde dann zugegeben (75 mg). Der scheinbare pH wurde mit N-Methylmorpholin auf 8 erneut eingestellt. Die Polyglutaminsäuresuspension klärte sich allmählich im Verlauf von 18 Stunden bei 20ºC. Die Papierelektrophorese zeigte, daß die Aminogruppe nach 24 Stunden beinahe vollständig reagiert hatte. Dann wurde Wasser (5 ml) zugegeben und die Lösung 1 h bei 20ºC stehlen gelassen, um jeglichen restlichen aktiven Ester zu hydrolysieren (der pH blieb während der Zeitspanne oberhalb 7). Ein Präzipitat, welches sich bildete, sobald das Wasser zugegeben war, wurde am Ende der Zeitspanne von 1 Stunde durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde mit Essigsäure (10%, Vol./Vol., vorher auf pH 3 eingestellt) aufs eingestellt. Die Lösung wurde gelagert und aufgearbeitet, wie erforderlich, und zwar in Chargen, welche 5-10 mg Polyglutaminsäure äquivalent waren. Die Aufarbeitung bestand in einer Adsorption auf einer Sep-Pak C18-Patrone (Typus 51910), welche mit HCl, 10&supmin;&sup4; Mol, äquilibriert worden war. Es wurde mit 2·10 ml der gleichen HCl-Lösung gewaschen und mit 2 ml 10-4 Mol HCl/Acetonitril (6 : 4, Vol./Vol.) desorbiert. Dann wurde das Acetonitril mit einem Luftstrom entfernt, und die trübe Suspension des Polyglutaminsäurederivates wurde unter verringertem Druck getrocknet. Dieses Material wurde wie folgt an Ferrioxamin B gekoppelt.
1 Volumen einer Lösung des Polyglutaminsäurederivates (20 mg/ml in Dimethylformamid) wurden 1,8 Volumina einer Lösung von 1,1-Carbonyldiimidazol (80 mg/ml DMF) zugegeben. Nach 30 Minuten bei 20ºC wurde festes Ferrioxamin B zugegeben (1 mg/14 ul Reaktionsgemisch). Der größte Teil des Ferrioxamins löste sich sofort. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 5 Volumina Essigsäure (wäßrig, 0,1%) verdünnt und auf Sephadex GSO aufgetragen. Der Polymer-Peak wurde auf Sep-Pak konzentriert, wie oben beschrieben, außer daß die Äquilibirierungslösung wäßrige 0,1% CF&sub3;COOH war, und daß mit wäßriger 0,1% CF&sub3;COOH/Acetonitril, 19 : 1 (Vol./Vol.) gewaschen wurde, und die Desorption fand in wäßriger 0,1% CF&sub3;COOH/Acetonitril, 1 : 4 (Vol./Vol.) statt. Nach Entfernung des Acetonitrils aus der desorbierten Fraktion in einem Luftstrom wurde die wäßrige Lösung in 0,1% CF&sub3;COOH mit einem Gradienten von 0-100% Acetonitril in 30 Minuten auf HPLC (C&sub1;&sub8;, Umkehrphase) aufgetragen. Das gesuchte Produkt eluierte als ein relativ breiter Peak bei etwa 50% Acetonitril. Die Peak-Fraktionen wurden auf übliche Weise getrocknet. Der BOC-Schutz wurde mit wasserfreier CF&sub3;COOH (50 ul pro mg Produkt während 30 Minuten bei 20&sup0;C) entfernt. Die Spektroskopie und die Aminosäureanalyse zeigten einen Einbau von zwischen 0,71 und 0,76 Resten Ferrioxamin B pro Glutaminsäurerest.

Beispiel 16

(a) Herstellung des Chelons H&sub2;N-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B

1,093 g O-Carboxymethylhydroxylaminhemihydrochlorid (Fluka) wurde durch Einbau der tert.Butyloxycarbonylgruppe unter Standardbedingungen (Wasser/Methanol) unter Verwendung von 4,365 g Boc&sub2;O (Fluka) am N geschützt. Der pH wurde mit NaOH auf 9 gehalten. Nach 16 Stunden bei 22ºC wurde die Lösung abgedampft und der feste Rückstand in 10 ml Wasser aufgenommen. Nach Kühlen auf 0ºC wurde die Lösung sorgfältig auf pH 3 angesäuert, und das Präzipitat, welches sich bildete, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Ausbeute nach Trocknung im Hochvakuum: 1 g. Das Produkt wurde mittels negativer Ionen- FAB/MS (intensives M-H bei m/z 190) als Boc-NH-O-CH&sub2;-COOH identifiziert.
191 mg Boc-NH-O-CH&sub2;-COOH wurden in 25 ml DMSO gelöst, und 115 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugegeben. Der erhaltenen Lösung wurden 210 mg Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 5 ml DMSO, zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Eine Lösung von Ferrioxamin B in DMSO (6,6 ml, 15 mg/ml) wurde zugegeben, und genügend N-Methylmorpholin, um den pH (extern mit einem feuchten Merck-pH-Streifen, welcher chemisch gebundene Farbstoffe aufwies, um eine Wasserspülung zu ermöglichen und die dem Ferrioxamin zuzuschreibende Farbe zu entfernen) auf 8 zu bringen. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf etwa 150 ml mit Wasser verdünnt und das N,N'-Dicyclohexylharnstoff-Prazipitat durch Zentrifugierung entfernt. Die Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 3 angesäuert und das Produkt in Portionen auf einer C18 Sep-Pak-Säule folgendermaßen gewonnen. Nach einer ersten Methanolwäsche wurde die Sep-Pak-Säule mit 0,1% Essigsäure äquilibriert, eine Probenportion aufgetragen und die Säule mit 0,1% Essigsäure gewaschen, um DMSO zu entfernen. Das Waschen mit 0,1% Essigsäure/Acetonitril (9 : 1, Vol./Vol.) entfernte Spuren von nicht umgesetztem Ferrioxamin B, und das gesuchte Produkt wurde mit 0,1% Essigsäure/Acetonitril (7 : 3, Vol./Vol.) euliert. Nach Vereinigen der Produktportionen wurde das Lösungsmittel durch Rotationsabdampfung entfernt, und die Boc-Gruppe wurde entfernt, indem das Produkt in 1 ml Trifiuoressigsäure aufgelöst und 45 Minuten bei 22ºC inkubiert wurde. Die Säure wurde durch Rotationsabdampfung entfernt, wonach der Rückstand in Wasser aufgenommen und in einer Sep-Pak-Säule gereinigt wurde, wie oben beschrieben, außer daß dieses Mal, da die hydrophobe Boc-Gruppe entfernt worden war, die Farbe mit 0,1% Essigsäure/Acetonitril (9 : 1, Vol./Vol.) eluiert wurde. Acetonitril wurde durch Rotationsabdampfung entfernt, und die wäßrige Lösung wurde dann gefriergetrocknet: Ausbeute etwa 35 mg. Das Produkt lief als ein orangebrauner, Ninhydrin-negativer, einzelner Fleck auf Silika-t.l.c. in Butanol/Essigsäure/Wasser/Aceton (7 : 2 : 4 : 7, Vol./Vol.) mit einem Rf von etwa 0,35 (Rf von Ferrioxamin etwa 0,1). Es lief als ein einzelner Fleck ein wenig langsamer als Ferrioxamin auf Papierelektrophorese bei pH 1,9, und wurde dann als NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B mittels positiver Ionen-FAB/MS (intensiver M+H bei m/z 687) identifiziert.

(b) Koppeln des Chelons NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B an Aldehyde und Ketone

Um zu zeigen, daß das neue Chelon NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B unter milden Bedingungen mit Aldehyden und Ketonen reagiert, wurde das Chelon (etwa 5 mMol) jeweils mit 4-Carboxybenzaldehyd (etwa 1,3 mMol), mit o-Aminobenzaldehyd (etwa 3 mMol), mit 3- Aminoacetophenon (etwa 3 mMol) mit N-Acetyl-3-aminoacetophenon (etwa 3 mMol), mit 4- Aminoacetophenon (etwa 3 mMol), mit N-Acetyl-4-aminoacetophenol (etwa 3 mMol), mit Heptanaldehyd (etwa 3 mMol), mit Nonan-5-on (etwa 3 mMol) und mit Pyruvat (etwa 3 mMol) in Acetatpuffer bei pH 3, 4, 5 und in Pyridinacetatpuffer bei pH 6,5, bei 22ºC inkubiert. Kontrollinkubationen wurden mit Ferrioxamin B unter ähnlichen Bedingungen vorgenommen. Mit dem Hydroxylaminochelon schritt eine rasche Reaktion mit allen Reagenzien bei pH 3 und 4 voran und ergab ein gefärbtes Produkt, welches im oben beschriebenen t.l.c.-System hydrophober als das Chelon war, und im erwarteten Verhältnis hinsichtlich des Chelonüberschusses. Die Flecken zogen keinen Schwanz und es trat während mindestens 24 Stunden keine weitere Umsetzung auf. Die reaktiveren Reagenzien (Pyruvat und Aldehyde, außer o-Aminobenzaldehyd) reagierten innerhalb 5 Stunden bis zu einem pH von 6,5. Unter ähnlichen Bedingungen zeigte unsubstituiertes Ferrioxamin, welches eine aliphatische Aminogruppe hat, kein Anzeichen einer Reaktion mit irgendeiner der Reagenzien: Jegliches Produkt, welches sich durch temporäre Verbindung der Carbonylverbindung mit Ferrioxamin gebildet haben könnte, muß bei den Analysebedingungen (t. i. c. in Butanol/Essigsäure/Wasser/Aceton) instabil gewesen sein. Die Oxime, die durch die Kopplung erhalten werden, sind stabile Verbindungen.

(c) Koppeln von Des-AlaB30-insulin-B29-m-formanilid an NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B

1 mg Des-AlaB30-insulin-B29-m-formanilid (erhalten nach Beispiel 1a) wurde in 100 ul einer Lösung von NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B (10 mMol in 0,1% Essigsäure) gelöst und 2 Stunden bei 22&sup0;C inkubiert. Dies führte zur erwarteten Bildung des O-Alkyloxims des Proteinderivates, welches mittels t.l.c. auf Silikafolien nachgewiesen wurde, wobei Butanol/Essigsäure/Wasser/Aceton (7 : 2 : 4 : 7, Vol./Vol.) verwendet wurde, welches das Vorhandensein eines gefärbten Flecken mit ,beinahe Nullmobilität, welcher mit Cadmium-Ninhydrin positiv gefärbt wurde, zeigte. Es ,wurde gezeigt, .daß dieses Material das erwartete Konjugat Des-AlaB30-insulinyl-3-aminobenzaldehyd-O-alkyloxim war, und zwar durch Umkehrphasen- HPLC (unter Verwendung von 0,1% TFA und Acetonitril, eine Macherey-Nagel-Säule 5 um C8 300 A 4 mm·25 cm bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.; das Proteinderivat, nicht gefärbt, eluiert nahe der Position von Des-AlaB30-insulinyl-3-aminobenzaldehyds, jedoch vom Ausgangsmaterial gut getrennt, auf einem Gradienten von 1% Acetonitril pro Minute) und durch Elektrophorese auf Celluloseacetat bei pH 8,0 (das gefärbte Proteinderivat lief in einer Position, die für Insulinderivate charakteristisch ist, welche eine negative Ladung verloren haben, und wurden mit Ponceau S rot gefärbt).

Beispiel 17

3-Aminopropan-1,2-diol (0,5 Mol) wurde an Des-AlaB30-insulin (4 mMol) mit 90% Butan-1,4-diol bei pH 6,5 gekoppelt (unkorrigierte Glaselektrode, pH mit Essigsäure eingestellt), und zwar innerhalb von 2 Stunden bei 22ºC unter Verwendung von TPCK-behandeltem Schweinetrypsin (Enzym/Substrat-Verhältnis 1 : 10 Gew./Gew.) als Katalysator. Die Umsetzung war sehr sauber und die Kopplungsausbeute, beurteilt mittels Elektrophorese auf Celluloseacetat, war etwa 70%. Eine Arbeitsweise, welche 1,3-Diaminopropan-2-ol (0,5 Mol) anstelle von 3-Aminopropan-1,2-diol anwendete, ergab ein ähnliches Ergebnis.
Die Des-AlaB30-insulin-B29-Derivate sind auf eine Perjodadoxidation unter milden Bedingungen empfindlich, wobei sie ein Derivat mit einer Carboxy-terminalen Aldehydgruppe ergeben.

Beispiel 18

(a) Herstellung von Des-AlaB30-insulin-B29-m-acetanilid

10 mMol Des-AlaB30-insulin in 90% Butan-1,4-diol wurden an 3-Aminoacetophenon (0,5 Mol) bei einem pH (unkorrigierte Glaselektrode) von 5,5 (pH mit Essigsäure eingestellt) während einer Zeitspanne von 5 Stunden bei 22ºC unter Verwendung von TPCK-behandeltem Schweintrypsin (Enzym/Substrat-Verhältnis 1 : 10, Gew./Gew.) als Katalysator gekoppelt. Die Reaktion war sehr sauber, beurteilt mittels Elektrophorese auf Celluloseacetat, und die Kopplungsausbeute war etwa 70%. Die Reaktion wurde mit Essigsäure gelöscht, und das Gemisch wurde auf eine Säule von Sephadex GSO, fein, (2,6 cm·90 cm) aufgetragen, äquilibriert und mit 1% Essigsäule eluiert. Dieser Schritt entfernte Trypsin und kleine Moleküle, einschließlich überschüssigen Reagenses. Der Insulin-Peak wurde lyophilisiert (Ausbeute 8,8 mg), und es zeigte sich, daß er ein Gemisch aus gekoppeltem und ungekoppeltem Produkt (gekoppeltes Produkt etwa 70%) war, und zwar mittels Elektrophorese auf Celluloseacetat bei pH 8,0. Gekoppeltes Produkt wurde von ungekoppeltem Produkt durch Umkehrphasen HPLC (unter Verwendung von 0,1% TFA und Acetonitril, einer Macherey-Nagel-Säule 5 um C8 300 A 4 mm·25 cm bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.) abgetrennt, wobei das gekoppelte Produkt später eluierte, von Des-Ala-insulin auf einem Gradienten von 1% Acetonitril/min. gut getrennt.

(b) Koppeln von Des-AlaB30-insulin-B29-m-acetanilid an NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B

Eine Portion des erhaltenen Produktes (0,8 mg) wurde bei Raumtemperatur in einer Lösung in 100 ul 0,1% Essigsäure mit 10 mMol NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B inkubiert. Nach einigen wenigen Stunden zeigte t.l.c. (auf Silikafolien unter Verwendung von Butanol/Essigsäure/Wasser/Aceton, 7 : 2 : 4 : 7, Vol./Vol.) das Vorhandensein eines gefärbten Flecken mit beinahe Nullmobilität, welcher mit Cadmium-Ninhydrin positiv färbte. Es wurde gezeigt, daß dieses Material das erwartete Konjugat Des-AlaB30-insulin-B29-m-acetylanilid/NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B-Oxim war, und zwar durch Umkehrphasen-HPLC auf der gleichen Macherey-Nagel-Säule (das gekoppelte Proteinderivat, nun gefärbt, eluiert nahe zur Position von Des-AlaB30-insulin-B29-m-acetanilid) und durch Elektrophorese auf Celluloseacetat bei pH 8,0 (das gefärbte Proteinderivat läuft in einer Position, die für Insulinderivate charakteristisch ist, welche eine negative Ladung verloren haben, und färbt sich mit Ponceau S rot).

Beispiel 19

(a) Herstellung von [GlyoxyloylA1]insulin vom Schwein und [GlyoxloylA1, BenzyloxalylB1]insulin vom Schwein

12 mg Schweineinsulin wurden in 12 ml einer Lösung, welche 2 Mol Pyridin, 0,8 Mol Essigsäure, 10 mMol Natriumglyoxylat und 2 mMol CuSO&sub4; (pH 5,5) enthielt, gelöst. Die Reaktion war im wesentlichen nach 20 Minuten beendet, wurde jedoch für 3 Stunden weiter fortschreiten gelassen. Proben, die nach 20 Minuten gezogen wurden, zeigten auf Umkehrphasen- HPLC (gleiches System wie in Beispiel 18a) wenig Ausgangsinsulin, wobei etwas Material bei der Position einer mono-transaminierten Spezies ([GlyoxyloylA1]insulin) und die große Mehrheit bei der Position einer di-transaminierten Spezies ([GlyoxyloylAl, BenzyloxalylB1]insulin) eluierte. Das Hauptreaktionsgemisch wurde mit Wasser auf 50 ml verdünnt und durch eine Waters Sep-Pak-Säule geschickt, welche dann mit 2 ml 0,1% Trifluoressigsäure (wäßrig)/Acetonitril (2 : 3, Vol./Vol.) eluiert wurde. Das modifizierte Insulin wurde dann mit 2 ml 0,1% Trifiuoressigsäure (wäßrig/Acetonitril (2 : 3, Vol./Vol.) eluiert. Das Acetonitril wurde mit einem Luftstrom entfernt, und die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert.

(b) Koppeln von [GlyoxyloylA1]insulin vom Schwein und [GlyoxyloylA1, BenzyloxalylB1]insulin vom Schwein an NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B

Das Material, welches gemäß (a) erhalten wurde, wurde an NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamm B gekoppelt, und zwar mit dem identischen Verfahren, das in Beispiel 18b beschrieben ist. Die HPLC gestattete die Isolierung von zwei gefärbten Proteindenvaten, wobei eines nahe der Position des mono-transaminierten Insulins und das andere (die Mehrheit) nahe der Position des di-transaminierten Derivates eluierte.

Beispiel 20

Ribonuklease S-Protein wurde von Ribonuklease S (Sigma Chemical Co.) durch Umkehrphasen-HPLC auf der Beckman-Maschine isoliert, wobei die vorhin erwähnte (Beispiel 18a) Macherey-Nagel-Säüle und ein Gradient von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure verwendet wurden: Das S-Protein eluiert später und gut getrennt vom S-Peptid, und die Eluierungspositionen von sowohl dem S-Peptid als auch dem S-Protein wurden durch Laufenlassen authentischer Standards (erhalten von Sigma) verifiziert. Das gereinigte S-Protein, welches von 5 mg Ribonuklease S erhalten wurde, gelöst in 1,2 mMol HCl, wurde bei pH 7 mit Imidazol gepuffert und die Probe in zwei Aliquote von 5 ml geteilt. Eine Portion wurde mit 5 ml einer Lösung von Perjodsäure (19,2 mg/ml in Wasser) während 6 Minuten bei 22&sup0;C oxidiert. Danach wurde die Reaktion mit 1 ml Ethan-1,2-diol gelöscht. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sep-Pak C18-Patrone, die mit 1,2 mMol HCl äquilibriert war, aufgetragen. Nach Waschen mit 1,2 mMol HCl wurde die Proteinfraktion mit 3 ml 1,2 mMol HCl/Acetonitril (4 : 6, Vol./Vol.) eluiert. Einer Hälfte des Eluates wurden 1,5 ml NH&sub2;-O-CH&sub2;-CO-Ferrioxamin B (10 mMol in 50 mMol Natriumacetat, pH 5; nach Mischen 5,1) zugegeben. Die Probe wurde bei 22ºC über Nacht inkubiert. Bei präparativer HPLC wurde ein gefärbtes, Protein enthaltendes Material aus der Macherey-Nagel-Säule (unter Bedingungen ähnlich jenen, die zur Isolierung des S-Proteins angewendet wurden) nahe zur Position des S-Proteins eluiert: Das Material enthielt noch immer etwas ungekoppeltes Protein. Die Anwesenheit des Ferrioxamin- Chromophors im Material, welches mittels HPLC isoliert worden war, wurde durch Spektrophotometrie auf einem Varian Cary-Gerät bestätigt.

Claims

1. Protein- und Polypeptidderivate und ihre Salze, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein oder Polypeptid an seinem Carboxy- oder Aminoterminus über eine Zwischengruppe, die mindestens einen Rest der Formel -C(R)=N- (oder -N=C(R)-) oder -CH(R)-NH- (oder -NH- CH(R)-), worin R Wasserstoff, eine aliphatische, aycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche Gruppe substituiert sein kann, enthält, mit dem gleichen oder einem anderen Protein oder Polypeptid, mit einer Reportergruppe oder einem cytotoxischen Mittel konjugiert ist.

2. Protein- und Polypeptidderivate und ihre Salze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein oder Polypeptid an seinem Carboxy- oder Aminoterminus über eine Zwischengruppe, die mindestens einen Rest der Formel -CH=N- (oder -N=CH-) oder -CH&sub2;-NH- (oder -NH-CH&sub2;-), enthält, mit dem gleichen oder einem anderen Protein oder Polypeptid, mit einer Reportergruppe oder einem cytotoxischen Mittel konjugiert ist.

3. Protein- und Polypeptidderivate, wie in Anspruch 1 beansprucht, der Formel

A-X-Z-X'-B (I)

worin

A der Rest eines Proteins oder Polypeptids ist, der an seinem Carboxy- oder Aminoterminus mit X-Z-X'-B gebunden ist;

B der Rest eines Proteins oder Polypeptids, einer Reportergruppe oder eines cytotoxischen Mittels ist;

X und X' voneinander unabhängig zweiwertige organische Reste sind oder fehlen können;

Z ein zweiwertiger Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe von -C(R)=N-, N=C(R)-, -CH(R)- NH, -NH-CH(R)-, -C(R)=N-Y-N=C(R)-, -N=C(R)-Y-C(R)=N-, -CH(R)-NH-Y-NH-CH(R)- oder -NH-CH(R)-Y-CH(R)-NH-, worin R wie in Anspruch 1 definiert ist, mit mindestens einem aromatischen Rest, Sauerstoff oder Stickstoff, direkt an Stickstoff angebracht, und

Y eine zweiwertige organische Gruppe ist,

und Salze davon.

4. Protein- und Polypeptidderivate, wie in Anspruch 3 beansprucht, der Formel 1, worin Z ein zweiwertiger Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe von -CR=N-O, -O-N=C(R)-, -CH(R)- NH-O-, -O-NH-CH(R)-, -C(R)=N-O-Y-O-N=C(R)-, -O-N=C(R)-Y-C(R)=N-O-, -CH(R)- NH-O-Y-O-NH-CH(R)- und -O-NH-CH(R)-Y-CH(R)-NH-O-, wobei R und Y wie in Anspruch 3 definiert sind.

5. Protein- und Polypeptidderivate, wie in Anspruch 2 beansprucht, der Formel

A-X-Z-X'-B (I)

worin

Z ein zweiwertiger Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe von -CH=N-, -N=CH-, -CH&sub2;-NH, - NH-CH&sub2;-, -CH=N-Y-N=CH-, -N=CH-Y-CH=N-, -CH&sub2;-NH-Y-NH-CH&sub2;- oder -NH-CH&sub2;-Y- CH&sub2;-NH-, mit mindestens einem aromatischen Rest, Sauerstoff oder Stickstoff, direkt an Stickstoff angebracht, und

Y eine zweiwertige organische Gruppe ist,

und Salze davon.

6. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 5 beansprucht, worin A an seinem Carboxyterminus an X-Z-X-B gebunden ist.

7. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 5 beansprucht, worin A an seinem Aminoterminus an X-Z-X'-B gebunden ist.

8. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht, worin Z -C(R)=N- oder - N=C(R)- ist, wobei R Wasserstoff, eine aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche Gruppe substituiert sein kann.

9. Verbindung, wie in Anspruch 3 oder 5 beansprucht, wobei Z -C(H)=N- oder -N= C(H)ist.

10. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht, worin Z -C(R)=N-O- oder -O-N=C(R)- ist, wobei R Wasserstoff, eine aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche Gruppe substituiert sein kann.

11. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht, worin Z -CH&sub2;-NH- oder -NH-CH&sub2;- ist.

12. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3, 5 bis 9 und 11 beansprucht, worin eine aromatische Gruppe direkt an das N-Atom der Gruppe Z, welche -N=CH- oder -NH-CH&sub2;- ist, angebracht ist.

13. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht, worin Z -CH=N-Y- N=CH oder -N=CH-Y-CH=N- ist'.

14. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 beansprucht, worin Z -CH&sub2;-NH-Y- NH-CH&sub2;- oder -NH-CH&sub2;-Y-CH&sub2;-NH- ist.

15. Verbindung, wie in Anspruch 13 oder 14 beansprucht, worin Y ein Phenylenrest ist.

16. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 beansprucht, worin eine aromatische Gruppe direkt an die N-Atome der Gruppe Z, welche -N=CH-Y-CH=N- oder -NH-CH&sub2;- Y-CH&sub2;-NH- ist, angebracht ist.

17. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 5 bis 16 beansprucht, worin X oder X' ein Phenylenrest ist.

18. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 5 bis 17 beansprucht, worin sowohl X als auch X' Phenylenreste sind.

19. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht, worin der Protein- oder Polypeptidrest A ein Immunglobulin oder ein Fragment davon ist.

20. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht, worin der Protein- oder Polypeptidrest A ein IgG-Molekül oder ein Fragment davon ist.

21. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht, worin der Protein- oder Polypeptidrest A ein Fab- oder ein F(ab')&sub2;-Fragment eines Immunglobulins ist.

22. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, worin die Reportergruppe oder der Rest B ein Rest von Desferrioxamin B oder eines Metallderivates davon ist.

23. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, worin die Reportergruppe oder der Rest B ein Rest von DTPA oder eines Metallderivates davon ist.

24. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, worin die Reportergruppe oder der Rest B [N&epsi;-(DTPA-alanyl)-Lys]&sub5; oder eines Metallderivates davon ist.

25. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, worin die Reportergruppe oder der Rest B ein Polyglutaminsäurerest ist, an welchen einige Ferrioxaminβ-Reste gekoppelt wurden.

26. Verfahren zur Herstellung von Protein- oder Polypeptidderivaten der Formel (I) von Anspruch 3 oder ihrer Salze, welches Verfahren umfaßt:

ein Kondensieren einer Verbindung der Formel

A-X-R¹ (II)

worin R¹ -CO-R, acetalisiertes Formyl oder Amino ist, und A, X und R wie in Anspruch 3 definiert sind,

mit einer Verbindung der Formel

R²-X'-B (III)

worin R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung H -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist, und X', B und R wie in Anspruch 3 definiert sind, oder ein Kondensieren einer Verbindung der obigen Formel II mit einer Verbindung der Formel

R²-Y-R² (IV)

worin Y wie oben definiert ist, und

R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung H -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist,

um eine Schiffsche Base zu bilden, und, falls erwünscht, Reduzieren des(der) Reste(s) - C(R)=N- oder -N=C(R)-, gebildet durch die Kondensation, zu Resten -CH(R)-NH- bzw. -NH- CH(R)-, und, falls erwünscht, Bilden eines Salzes.

27. Verfahren zur Herstellung von Protein- oder Polypeptidderivaten der Formel (I), wie in Anspruch 4 definiert, und ihrer Salze, welches Verfahren umfaßt: ein Kondensieren einer Verbindung der Formel

A-X-R¹ (II)

worin R¹ -CO-R, acetalisiertes Formyl oder -O-NH&sub2; ist, und A, X und R wie in Anspruch 4 definiert sind,

mit einer Verbindung der Formel

R²-X'-B (III)

worin R² -O-NH&sub2; ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -O-NH&sub2; ist, und X', B und R wie in Anspruch 4 definiert sind, oder ein Kondensieren einer Verbindung der obigen Formel II mit einer Verbindung der Formel

R²-Y-R² (IV)

worin Y wie oben definiert ist, und

R² -O-NH&sub2; ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist, und -CO-R oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II -O-NH&sub2; ist, um eine Schiffsche Base zu bilden, und, falls erwünscht, Reduzieren des(der) Reste(s) -CH=N- O- oder -O-N=CH-, gebildet durch die Kondensation, zu Resten -CH&sub2;-NH-O- bzw. -O-NH- CH&sub2;-, und, falls erwünscht, Bilden eines Salzes.

28. Verfahren zur Herstellung von Protein- und Polypeptidderivaten der Formel (I), wie in Anspruch 5 definiert, oder ihrer Salze, welches Verfahren umfaßt:

ein Kondensieren einer Verbindung der Formel

A-X-R¹ (II)

worin A und X wie in Anspruch 5 definiert sind, und R¹ Formyl, acetalisiertes Formyl oder Amino ist,

mit einer Verbindung der Formel

R²-X'-B (III)

worin X' und B wie in Anspruch 5 definiert sind, R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Formyl oder acetalisiertes Formyl ist, und Formyl oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist,

oder ein Kondensieren der obigen Formel II mit einer Verbindung der Formel

R²-Y-R² (IV)

worin Y wie in Anspruch 5 definiert ist, R² Amino ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Formyl oder acetalisiertes Formyl ist, und Formyl oder acetalisiertes Formyl ist in dem Fall, wo R¹ in der obigen Verbindung II Amino ist, um eine Schiffsche Base zu bilden, und, falls erwünscht, Reduzieren des(der) Reste(s) -CH=N- oder -N=CH-, gebildet durch die Kondensation, zu Resten -CH&sub2;-NH- bzw. -NH-CH&sub2;-, und, falls erwünscht, Bilden eines Salzes.

29. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 28 beansprucht, worin die Reduktion der(des) Reste(s) -C(R)=N- oder -N=C(R)- mit einem komplexen Metallhydrid bewirkt wird.

30. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 28 beansprucht, worin die Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid oder Pyridinboran bewirkt wird.

31. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 30 beansprucht, worin B der Rest eines Chelatbildners ist und ein Metallderivat mit einem radioaktiven Metall gebildet wird.

32. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 31 beansprucht, worin das Ausgangsmaterial der Formel II durch Umkehrproteolyse hergestellt wird.

33. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 31 beansprucht, worin das Ausgangsmaterial der Formel II durch Transaminierung hergestellt wird.

34. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 31 beansprucht, worin das Ausgangsmaterial der Formel II durch Perjodatoxidation hergestellt wird.

35. Verbindung der Formel

A-X-R¹ (II)

worin A der Rest eines Proteins oder Polypeptids ist, der an seinem Carboxy- oder Aminoterminus an X-R¹ gebunden ist,

X ein zweiwertiger organischer Rest ist, oder, falls A an seinem Aminoterminus modifiziert ist, fehlen kann, und

R¹ -CO-R, acetalisiertes Formyl, Amino oder geschütztes Amino ist, worin R Wasserstoff, eine aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder araliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, welche Gruppe substituiert sein kann, und worin, wenn R¹ Amino oder geschütztes Amino ist, ein aromatischer Rest, Sauerstoff oder Stickstoff direkt an den Stickstoff der Amino- oder geschützten Aminogruppe angebracht ist.

36. Verbindung, wie in Anspruch 35 beansprucht, worin R¹ Formyl, acetalisiertes Formyl, Amino oder geschütztes Amino ist.

37. Verbindung, wie in Anspruch 35 oder 36 beansprucht, worin X eine aromatische Gruppe enthält, die direkt an R¹ angebracht ist.

38. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 37 beansprucht, worin X -NH-C&sub6;H&sub4;ist.

39. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 37 beansprucht, worin X -NH- CH(COOCH&sub3;)-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4; ist.

40. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 37 beansprucht, worin X -NH- CH(CONH&sub2;)-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4; ist.

41. Verbindung, wie in Anspruch 35 beansprucht, worin -X-R¹ -NHCH&sub2;CHO ist.

42. Verbindung, wie in Anspruch 35 beansprucht, worin -X-R¹ NHCH&sub2;CH(OH)CH&sub2;NH&sub2; ist.

43. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 42 beansprucht, worin A ein Immunglobulin oder ein Fragment davon ist.

44. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 43 beansprucht, worin A ein IgG-Molekül oder ein Fragment davon ist.

45. Verbindung, wie in einem der Ansprüche 35 bis 44 beansprucht, worin A ein Fab- oder ein F(ab')&sub2;-Pragment eines Immunglobulins ist.