DE3025226A1

DE3025226A1 - Radioimmunoassay zur bestimmung von pterinen und neue dafuer verwendbare pterinderivate

Info

Publication number: DE3025226A1
Application number: DE19803025226
Authority: DE
Inventors: Miki Akino; Takeshi Kato; Sadao Matsuura; Toshiharu Nagatsu; Takashi Sugimoto; Tokio Yamaguchi; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1980-07-03
Publication date: 1981-01-22
Also published as: NL8003854A; SE441529B; SE8004933L; US4371514A; FR2460952B1; AU526214B2; CA1150243A; AU6010680A; GB2056459B; GB2056459A; DE3025226C2; FR2460952A1

Description

PATENTANWÄLTE J. REITSTÖTTER W. KINZEBACH

PROF. DR. DR. DIPL. ING. DR. PHIL. DIPL. CHUM.

W. BUNTE (ΐ958-ΐθ7β) K. P. HÖLLER

DR. ING. DR. RKR. NAT. DIPL. CHBM.

TBLEFONi (089) 37 6B83 TELEXl 0215208 16AR D

BAUERBTRASSB 22, BOOO MONCHBN

München, den 4. Juli 1980 M/21 157

DAIICHI RADIOISOTOPE LABORATORIES, LTD. No. 10-5, Nihonbashi 3-chome, Chuo-ku, Tokyo, (Japan)

Radioiininunoassay zur Bestimmung von Pterinen und neue dafür

verwendbare Pterinderivate

POSTANSCHRIFT ι POSTFACH 780, D-8000 MÖNCHEN 43

Die Erfindung betrifft neue Pterinderivate und ein Radioimmunoassay-Verfahren (nachstehend "RIA" genannt) zur Bestimmung von Pterinen unter Verwendung eines Pterinderivats, welches eine radiojodierte Tyramingruppe als Tracer enthält.

Es ist bekannt, daß Pterine, wie Folsäure, beim Aminosäurestoffwechsel als Coenzym eine Rolle ■ spielen. Diese Erkenntnis führte zu dem Gedanken, daß die Feststellung quantitativer Veränderungen an Pterinen in einem Lebewesen zur Diagnose von verschiedenen Enzymmangelerscheinungen hilfreich sein könnte. Vor kurzem wurde über den Zusammenhang von Phenylketonurie und Biopterin in Annals of Neurology, j Band 3, Seiten 224-230 (1978), The N.ew England Journal of Medicine, Band 299, Seiten 673-679 (1978) und Clinica Chimica Acta, Band 93, Seiten 251-262 (1979) berichtet. So besteht großes Interesse an der quantitativen Veränderung von Pterinen (2-Amino-4-hydroxyperidin-Derivaten) im menschlichen Körper.

Es ist ein Bioassay-Verfahren zur Bestimmung von Biopterin (d.h. 2-Amino-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropy1)-pteridin) bekannt, und in Methods in Enzymology, Band 18 B, Seite 618 (1971) beschrieben. Dieses Verfahren ist jedoch nicht zur praktischen Anwendung geeignet, da es realtiv ! lange dauert bis' man das Ergebnis erhält. Ein Verfahren zur j Bestimmung von Neopterin (d.h. 2-Amino-4-hydroxy-6-(L- oderD-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin) wurde noch nicht vorgeschlagen, kann jedoch in Zukunft notwendig werden.

Q30064/087S

Die Erfindung betrifft somit die Schaffung von Pterin-Derivaten der allgemeinen Formel I:

OH ι	N R₇
I I
/^ ir NH Vr

R eine Hydroxyphenylgruppe, eine radiojodierte Hydroxyphenylgruppe, eine Tyraminocarbonylgruppe, eine radiojodierte Tyraminocarbonylgruppe, eine Proteinocarbonylgruppe oder eine Carboxylgruppe;

Q eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;

und
R_ß und R_ jeweils ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit

1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung bestimmter radiojodierter Pterinderivate als Tracer in Radioimmunoassay-(RAI)-Verfahren.

Figuren 1 und 2 zeigen Standardkurven für Biopterin, worin "B" für die Radioaktivität steht (Counts pro Minute, nachstehend "cpm" genannt), "Bo" für die Radioaktivität (cpm) in Abwesenheit der Vergleichssubstnz (Biopterin), und "N" für die Radioaktivität nicht-spezifischer Bindungen (cpm) in Abwesenheit des Antiserums und der Vergleichssubstanz (Biopterin)stehen.

03006A/0878

Für den Radioimmunoassay von Pterinen wurden zwei Arten von
Tracern synthetisiert. Einmal radiojodierte 4-Hydroxy-2-tyraminocarbonylalkylaminopteridin-Derivate und zum anderen
radiojodierte 4-Hydroxy-2-tyraminopteridin-Derivate, wobei
die ersteren eine radiojodierte Tyraminocarbonylgruppe und
die letzteren eine radiojaodierte Hydroxyphenylgruppe für
R in der allgemeinen Formel I aufweisen. Repräsentative
Beispiele für solche Tracer sind radiojodiertes 2-[5-(Tyraminocarbonyl)-pentylamino]-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin und radiojodiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-Hydroxy- . phenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)- \ pteridin.

Darüberhinaus können neue Proteinocarbonylalkylpterine,

wie Biopterinylcaproylprotein, ebenfalls zur Antikörpererzeugung

hergestellt werden. '

Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ist in dem j nachfolgenden Schema dargestellt. In diesem Schema werden ! Biopterin, Rinderserumalbumin (BSA) und Pentylen als .

Beispiele für Pterin, das Protein bzw. die Alkylengruppe | der Formel I verwendet. !

030064/0876

M/21 157

. OH

C^ (VII)

CH₃S ^N^ NH₂ CU)

CVa)

OH

^N

OHOH

I I

CHCHCH.

CH₂CH₂

OH

(VIa)

03006A/0876

M/21 157

OH

(Xa)

■I

OH

OHOH I

CU)

OHOH A I

CHCHCH,

(CH₂)₅C0NHCH₂CH₂-//

OH

HN

NH_

(VII) A OH

■I

NH₀

(VIII) B OH

•1

OHOH \ I

N^CHCHCH₃

COOH (IXa) E OH

•I

OHOH \ I

CHCHCH,

CCH₀) N-COBSA

2'5 CXIIa)

wobei *I ^für radioaktives Jod steht.

030064/0876

M/21 157 - 9 -

In dem obigen Schema werden Reaktionen, welche mit dem gleichen Großbuchstaben neben dem Pfeil gekennzeichnet sind, unter im wesentlichen den gleichen Reaktionsbedingungen durchgeführt.

In dem Reaktionsschema wird 4-Ämino-6-hydroxy-2-methylthio-5-nitrosopyrimidin (II) mit Epsilon-Capronsäure (einer Aminosäure) in Wasser erhitzt, wobei man 4-Amino-2-(2-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidin (VII) erhält. Wenn es sich bei der Aminosäure um eine α-Aminosäure handelt, wird die Reaktion bevorzugt unter alkalischen Bedingungen, z.B. in einer 0,25M wäßrigen Natriumhydroxidlösung durchgeführt. Wird die Verbindung der Formel (II) oder (VII) katalytisch reduziert, wird die 5-Nitrosogruppe in eine Aminogruppe umgewandelt, wobei man dann die Verbindungen der Formel (III) bzw. (VIII) erhält. Für die katalytische Reduktion kann Palladium-Kohlenstoff und dergleichen als Katalysator verwendet werden. Dann werden die Verbindungen der Formel (III) oder (VIII), nachdem sie gegebenenfalls gereinigt wurden, mit 5-Deoxyarabinose-phenylhydrazon in einem Lösungsmittel erhitzt, wobei sich durch Ringschlußkondensation ein Pteridinring bildet und man eine Verbindung der Formel (IVa) oder (IXa) erhält. Beispiele für Lösungsmittel sind wäßrige Alkohole und dergleichen und die Reaktion wird bevorzugt unter einem Inertgasstrom, wie Stickstoff, durchgeführt. Behandelt man die Verbindung der Formel (IVa) mit Tyramin auf ähnliche Weise wie oben für die Umsetzung der Verbindung (II) und der Aminosäure beschrieben, so erhält man 4-Hydroxy-6-(1,2-dihydroxypropyl)-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthylamino]-pteridin der Formel (Va), welches dann, wie nachstehend beschrieben, mit radioaktivem Jod markiert werden kann, und die sich daraus ergebende radiojodierte Verbindung der Formel (VIa) wird dann als Tracer verwendet.

Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Verbindung der Formel (IXa) kann dann mit Tyramin oder einem Protein, wie Rinderserumalbumin (BSA), Kaninchenserumalbumin oder menschlichem Serumalbumin konjugiert werden, wobei mittels eines

Q30Q64/0876

aus dem Stand der Technik bekanten Verfahrens eine Säure-Amid-Bindung gebildet wird. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist das Verfahren unter Verwendung eines gemischten Säureanhydrids, bei dem eine Säure [wie die Verbindung (IXa)] in Gegenwart eines tertiären Amins mit Chlorameisensäure-ester behandelt wird, wobei man ein gemischtes Anhydrid erhält, welches dann mit Tyramin oder einem Protein umgesetzt wird.

Verbindungen, welche Tyramin in ihrer Struktur aufweisen, wie die Verbindungen (Va) oder (Xa), werden mit radioaktivem Jod markiert, um nach irgendeinem der bekannten Verfahren, vorzugsweise unter Anwendung einer Abwandlung des Chloramin T (Natrium-p-toluolsulfonchloramid) Verfahrens, welches nach dem Stand der Technik gut bekannt ist, einen Tracer herzustellen.

Beim Chloramin T Verfahren läßt man im allgemeinen die Umsetzung des Tyraminkonjugats mit dem radioaktiven Natriumjodid in Gegenwart von Chloramin T während einer Zeitdauer von etwa 30 Sekunden bis etwa 5 Minuten ablaufen und stoppt durch Zusetzen von Natrium-meta-bisulfit. Unter dem Gesichtspunkt der Verfügbarkeit, der Halbwertszeit und der spezifischen Aktivität werden I, und I bevorzugt, wobei jedoch I am meisten bovorzugt wird.

Zur Herstellung des Tracers kann auch eine andere Verfahrensweise angewandt werden. Bei diesem Alternativverfahren wird Tyramin zuerst, wie oben beschrieben, mit Jod markiert und anschließend mit einem Pteridinderivat konjugiert, wobei man die gleichen Reaktionen wie oben beschrieben anwendet.

Selbstverständlich kann das in den vorstehenden Reaktionsschemata gezeigte und vorstehend beschriebene Verfahren von einem Fachmann abgewandelt werden, so daß man je nach dem speziellen Zweck eine geeignete Verbindung herstellt.

030064/0876

Beispielsweise kann bei der Herstellung einer Neopterinverbindung D- oder L-Arabinose-phenylhydrazon für den Ringschluß in Stufe B verwendet werden. Weitere Beispiele für Reaktionsteilnehmer, welche in dieser Stufe verwendet werden können, sind Diacetyl und Glyoxal. Es können auch Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden, welche verschiedene Alkylengruppen aufweisen und Beispiele für solche Alkylengruppen sind Methylen, Äthylen, Propylen, Butylen und Pentylen, welche einen Substituenten, wie Methyl, Äthyl oder eine Hydroxybenzylgruppe aufweisen können.

Zur Herstellung eines Antiserums gegen das Pteridin können bekannte Immunisationsverfahren angewandt werden. Beispielsweise werden Säugetiere durch Injektion eines mit Protein konjugierten Pteridins in Form einer Emulsion mit vollständigem Freud' schein Medium immunisiert. Von den Säugetieren können vorteilhaft Kaninchen, Ziegen, Schafe, Meerschweinchen und dergleichen verwendet werden. Nach mehreren Auffrischungsimpfungen wird Blut gesammelt und anschließend werden die Blutkörperchen entfernt. Das Antiserum kann so wie es ist für Versuchszwecke verwendet werden, es können aber auch Reinigungsverfahren, wie Aussalzen oder Affinitätschromatographie vorher durchgeführt werden.

Falls nötig können vor dem RIA eine Urinprobe oder dergleichen für das RIA-Verfahren vorbehandelt werden. Beispielsweise kann bei der Bestimmung von Biopterin im Urin, das reduzierte Biopterin, d.h. Dihydrofoiopterin und Tetrahydrobiopterin unter Verwendung eines geeigneten Oxydationsmittels, wie Jod, oxydiert werden.

Der RIA zur Bestimmung von Pterinen kann nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt" "verden. Nach einer Ausführungsform wird beispielsweise das Antiserum mit einem Puffer auf eine geeignete Konzentration verdünnt und mit einer Probe- oder einer Vergleichslösung inkubiert.

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Die erhaltene Mischung wird dann mit einem Tracer, der nach dem oben beschreibenen Verfahren erhalten wurde, bei einer beeigenten Temperatur, z.B. bei Raumtemperatur, inkubiert, anschließend erfolgt eine geeignete Abtrennung der gebundenen und der freien Antikörper. Beispiele für solche Verfahren sind die Doppel-Antikörper-Methode, die Dextran-Aktivkohle-Methode, die Festphasenmethode, etc. welche alle an sich bekannt sind. Die Radioaktivität jeder der abgetrennten Substanzen wird mit einem Well Scintillations-Zähler gezählt und man stellt eine Vergleichskurve auf, die auf dem für die Vergleichslösungen erhaltenen Wert basiert und bestimmt dann den Urinspiegel anhand der Vergleichskurve.

Es wurde gefunden, daß die Cross-Reaktivität des Biopterinantiserums mit Tetrahydrobiopterin, Dihydrobiopterin, Neopterin, 6,7-Dimethylpterin, Pterin oder Folsäure vernachlässigbar gering ist. Der Antikörper auf Neopterin oder Dimethylpterin hat auch eine hohe Selektivität und zeigt geringe Cross-Reaktivität mit anderen Pterinen.

Das RIA-Verfahren, das den Tracer und das .Pterinylprotein gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, ist äußerst genau und dauert weniger lang als beispielsweise das . Bioassay Verfahren, welches in Methods in Enzymology, Band. 18 B, S. 618 (1971) beschrieben ist. Die Verwendung von radiojodiertem 2-[2-(4-Hydroxyphenyl)äthyl]-aminopteridin-Derivat als Tracer ergibt besonders bezüglich der Sensitivität bessere Ergebnisse als die Verwendung eines der radiojodierten 2-(Tyraminocarbonylalkylamino)-pteridine, weil das erstere eine andere Brücke als das Antigen (Proteinkonjugat) hat.

Bei dem RIA einer Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, welche nicht selbst Antikörper produzieren kann (z. B. ein Hapten), wird die Immunisierung durch Verabreichung eines Haptenproteinkonjugats an Säugetiere erreicht.

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Das so erhaltene Antisemit» enthält sowohl einen Antikörper auf das Brückenglied als auch den Antikörper auf das Hapten. Unter diesen Umständen wird angenommen, daß wenn ein markiertes Hapten (Tracer), das die gleiche Brücke hat wie diejenige, die im Haptenkonjugat verwendet wird, das Assaysystem eine Tendenz zu relativ hohen nicht-spezifischen Bindungen und relativ geringer Sensitivität hat.

Wenn der Tracer und das Antigen die gleiche Brücke, z.B. Caproyl, Propionyl, Butyryl, aufweisen, wird eine Verfahrensstufe zur Abtrennung des Antiserums zur Brücke notwendig.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen noch detaillierter erläutert. Diese Beispiele sollen jedoch nicht einschränkend wirken.

Wenn nicht anders angegeben sind alle Teile, Prozentangaben und Verhältniszahlen auf das Gewicht bezogen.

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M/21 157 - 14 -

; Beispiel 1-1

' In 500 ml einer 0,5M wäßrigen Kaliumhydroxidlösung löst man 18g 4-Amino-6-hydroxy-2-methylthio-5-nitrosopyrimidin (II). Man gibt 10 g 5 %iges Palladium auf Aktivkohle zu der Lösung und reduziert bei Raumtemperatur unter normalem Atmsphärendruck bis die theoretische Menge Wasserstoff verbraucht ist. Nach Entfernen des Katalysators durch Abfiltrieren, wird das Filtrat unter Verwendung von Ameisensäure auf einen pH-Wert von

. 3 bis 4 eingestellt, wobei 4,5-Diamino-6-hydroxy-2-methyl-

! thiopyrimidin (III) in Form von farblosen Nadeln ausgefällt wird., Ohne zu isolieren gibt man die Kristalle zu einer Mischung J von 32 g 5-Deoxy-L-arabinose-Phenylhydrazon und 400 ml Methanol, undrührt die erhaltene Mischung bei 25 ⁰C 90 Minuten lang !

. unter Stickstoffgas und weitere 30 Minuten am Rückfluß. Man kühlt die erhaltene Mischung in einem Eisbad und gibt 100 g ! Kalium-hexacyanoferrat (III) sowie wäßrige Kaliumjodidlösung

^: (5g/500 ml) zu. Man rührt die Mischung bei einem pH-Wert von ; 3 bis 4 20 Stunden lang bei 25 ⁰C, wobei man Sauerstoff zu- I führt, engt die Reaktionsmischung im Vakuum auf ein ; Volumen von 500 ml ein und stellt mit Ammoniak auf einen

: pH von 9 bis 10 ein. Nicht-fluoreszierender Feststoff wird :

' durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wird über eine ! Florisil-Säule (5 χ 60 cm) gegeben und mit Wasser eluiert. ;

■ Man erhält zwei Fraktionen mit blauer Fluoreszenz. Die Haupt- ^; fraktion wird auf 150 ml eingeengt und erneut mit einer Florisil-Säule behandelt und eluiert. Das Eluat engt man im Vakuum zur Trockne ein und extrahiert den Rückstand mit 500 ml heißem Methanol. Man engt den Extrakt auf ein Volumen von 50 ml ein, woraus man nach Abkühlen 5,5 g farbloser Nadeln von 4-Hydroxy-6- (L-erythro-1, 2-dihydroxypropyl) -2-methylthiopteridin (IVa) erhält. Dieses Produkt zersetzt sich bei einer Temperatur oberhalb 210 ⁰C (umkristallisiert aus Wasser).

030084/0876

M/21 157

Analyse C₁

berechnet: gefunden:

C	46	H	31	N	41
39,	27	5,	45	18,	65
40,	4,	18,

Auf die gleiche Weise wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung von D- oder L-Arabinose-phenylhydrazon anstelle von 5-Deoxy-L-arabinose-phenylhydrazon erhält man 4-Hydroxy-

6-(D-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-2-methylthiopteridin (IV) bzw. die entsprechende L-Form (IVc). Der Zersetzungspunkt beider Isomerennach Kristallisation aus Wasser beträgt 158 C.

Analyse C₁₀H₁₂N₄O₄S-H₂O

	:	D-Form:	C	72	H	68	N	54
berechnet	für	L-Form:	39,	63	4,	68	18,	03
gefunden	für	39,	75	4,	63	18,	17
gefunden		39,	4,	18,

Beispiel

1-2

Man erhitzt eine Mischung von 1,0 g 4-Hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-2-methylthiopteridin·. (IVa), 3,0 g Tyramin, 0,8 g Essigsäure und 50 %-iger wässriger Lösung von 2-Methoxyäthanol 6 Stunden lang auf eine Temperatur im Bereich von 100 bis 105 ⁰C. Man stellt den pH der Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure auf 1 bis 2 ein und gibt die Mischung über eine Florisil Säule (3,5 χ 40 cm). Nicht umgesetztes Ausgangsmaterial wird entfernt, indem man die Säule mit 500 ml einer 2M wäßrigen Ameisens,äurelösung und anschließend mit 500 ml Wasser wäscht und das Produkt dann allmählich mit 1 000 ml wäßrigen ammoniakalisehen Lösungen, welche einen Ammoniakgehalt von 0 bis 2 % haben, eluiert. Man engt die Eluate auf ein Volumen von 150 ml ein und behandelt dann erneut,

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wie vorstehend beschrieben, mit einer Florisil Säule. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, mit 200 ml einer wäßrigen ammoniakalischen Lösung extrahiert und der Extrakt wird auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Man stellt den pH der Mischung mit Ameisensäure auf 3 bis 4 ein und kühlt die Mischung, wobei man 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin (Va) in Form von gelben Nadeln erhält, welche sich nach Kristallisation aus Wasser bei 165 ⁰C zersetzen.

Analyse C₁₇H₁₉N₅O₄-H₃O

berechnet: gefunden:

C	39	5	H	N	66
54,	56	5	,64	18,	38
54,		,62	18,

Beispiel 1-3

Markieren mit radioaktivem Jod

Zu 20 μΐ einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4)gibt man 10 μΐ Dimethylformamid welches 10 μg der wie in Beispiel 1 -2 beschrieben erhaltenen Verbindung (Va)/ setzt 10 μΐ (1,2mCi)

ι 25
Na I zu und gibt dann 20 μg Chloramin T, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers zu. Die erhaltene Mischung läßt man 3 0 Sekunden bei 25 C reagieren. Man stoppt die Reaktion durch Zugabe von 40 μg Natrium-meta-bisulfit, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mittels Elektrophorese an Celluloseacetat gereinigt, mit einem 0,05M Phosphatpuffer (pH 7,6) abgetrennt und mit einem Phosphatpuffer, der 5 % BSA enthält extrahiert, wobei man

125

I-markiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-

6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin (VIa) erhält, rf 0,48 [Silicagel-Dünnschicht; Äthylacetat-Methanol-5%ige wäßrige Ammoniaklösung (1:1:0,2 ) Volumenteile].

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Beispiel 1-4

Herstellung von Vergleichssubstanzen

Man erhitzt eine Mischung von 0,2 g 4-Hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-2-methylthiopteridin (IVa), 0,6 g Ammoniumacetat und 5 ml konz. wäßriger Ammoniaklösung 4 Stunden zum Rückfluß. Man säuert die Reaktionsmischung mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 an, gibt über eine Florisil Säule (3,5 χ 20 cm) und eluiert dann mit Wasser. Das Eluat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 50 ml wäßriger Ammoniaklösung extrahiert und der Extrakt wird auf 10 ml eingeengt und gekühlt, wobei man 90 mg Biopterin in Form von elfenbeinfarbenen Nadeln erhält, deren physikalisch-chemischen Eigenschaften mit denen der authentischen Proben in Einklang stehen.

Ähnlich wie oben beschrieben erhält man D-Erythro-neopterin (60 %-ige Ausbeute) und L-Erythro-neopterin (72 %-ige Ausbeute) aus den entsprechenden 2-Methylthio-Verbindungen (IVb) bzw. (IVc).

Beispiel 2

10g 4-Alnino-6-hydroxy-2-methylthio-5-nitrosopyrimidin (II) und 20 g Epsilon-aminocapronsäure gibt man zu 400 ml Wasser und erhitzt die Mischung 1 Stunde am Rückfluß. Die unter Verwendung von Ameisensäure auf pH 2 bis 3 eingestellte Reaktionsmischung kühlt man und sammelt den Niederschlag durch Filtrieren, wobei man 8,5 g 4-Amino-2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-nitrosopyrimidin (VII) erhält. Löst man dieses Produkt in heißer verdünnter wäßriger Ammoniaklösung und säuert mit Ameisensäure an, so erhält man rot-orangefarbene Nadeln.

Die Verbindungen der Formel (VII), welche ähnlich wie oben beschrieben erhalten wurden, sowie deren Schmelzpunkte und die Ausgangsmaterialien sind in Tabelle I aufgeführt.

Q30064/0876

M/21 157

- 18 Tabelle I

OH

NO

JL N

Q-R

Q-R

Fp. (⁰C)

CH₂COOH

COOH

(CH₂J₅COOH

CH(CH₃)COOH(IS)

CH(CH₃)COOH(IR)

COOH

300, wird bei 280 schwarz

300

240-241 (Zers.)

232,5-233,5 (Zers.)

300, Schwarzfärbung bei 245

300

Ausgangsmaterial Glycin

ß-Alanin γ-Aminobuttersäure £-Aminocapronsäure L-Alanin

D-Alanin L-Tyrosin

Beispiel

Man gibt 4,3 g 4-Amino-2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxy-5-

nitrosopyrimidin (VII) zu 60 ml einer 2M Natriumhydroxidlösung und reduziert katalytisch mit Wasserstoff in Gegenwart von 2g Palladium-Aktivkohle. Wenn die Wasserstoffabsorption beendet ist gibt man 20 ml konz. Chlorwasserstoffsäure zur Reaktionsmischung und entfernt den Katalysator durch Abfiltrieren. Man engt das Filtrat ein und trocknet die erhaltenen Kristalle unter Verwendung vonjPhosphorpentoxid als Trockenmittel,

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M/21 157 - 19 -

wobei man 9,5 g 4,5-Diamino-2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxy-pyrimidin-dihydrochlorid-monohydrat (VIII) erhält. 5,0 g des so erhaltenen Produktsund 3,7 g 5-Deoxy-L-arabinosephenylhydrazon gibt man zu 4 00 ml 5 0 %-igem (Volumenteile) Methanol und erhitzt die Mischung unter einem Stickstoffstrom 20 Minuten am Rückfluß. Man stellt den pH der Reaktionsmischung auf 5 ein und führt 6 Stunden lang Luft in die Mischung ein. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein, setzt 100 ml Wasser zu und stellt den pH mit Ameisensäure auf 2,0 ein. Man gibt die Mischung über eine Florisil-Säule (400 ml), wäscht mit 0,25M Ameisensäure und eluiert mit Wasser. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, mit 250 ml Methanol extrahiert und der Rückstand wird zur Trockne eingeengt. Man kristallisiert den Rückstand aus 10 ml Äthanol, wobei man 465 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin (IXa) erhält.

Analyse C₁₅H₂₁N₅O₅-H₃O

berechnet:
gefunden:

Beispiel 3-2

4,3 g 4,5-Diamino-2-(5-carboxypentylamino)-6-hydroxypyrimidindihydrochlorid-monohydrat und 2,5 g Diacetyl löst man in 100 ml Wasser und nachdem man den pH auf 2 bis 3 eingestellt hat erhitzt man die Lösung 1 Stunde am Rückfluß. Nach dem Abkühlen kristallisiert man den Niederschlag aus 50 %igem (Volumenteil) Methanol und erhält 3,1 g 2-(5-Carboxypentylamino) 4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin in Form von gelben Nadeln mit. einem Fp. 215-219 ⁰C. (Zers.).

C	77	H	28	N	96
48,	55	6,	25	18,	55
48,	6,	18,

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Beispiel 4-1

74 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin und 126 μΐ Triäthylamin gibt man ; zu 2 ml Dimethylformamid (DMF). Man setzt der Mischung 65 μΐ Äthylchlorformiat zu, wobei man auf -5 ⁰C kühlt und rührt die Mischung 15 Minuten lang. Nach Zusetzen von 2 ml einer DMF-Lösung, welche 52 mg Tyramin enthält, rührt man die Mischung 30 Minuten lang bei einer Temperatur von -5 ⁰C und ^: dann 1 Stunde bei 0 C. Man engt die Reaktionsmischung im j Vakuum ein, gibt 3 ml 1M Natriumhydroxid zum Rückstand ' und läßt die Mischung 30 Minuten bei 30 ⁰C stehen. Man säuert die Reaktionsmischung mit Ameisensäure an, reinigt durch Florisil-Säulenchromatographie (Kolonne 100 ml, eluiert mit Äthanol-Wasser) und kristallisiert das Produkt dann aus Wasser, wobei man 66 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin-tyramin-Konjugat (Biopterinylcaproyltyramin) (Xa) in Form von farblosen Nadeln mit einem Fp. 169-171 ⁰C (Zers.) erhält.

Analyse C_ H₃₀NgO 'H-O:

C	,54	H	60	N	20
56	,65	6,	48	17,	34
56	6,	17,

berechnet:
gefunden:

Beispiel 4-2

184 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin und 400 μΐ Triäthylamin löst man in 2 ml DMF und gibt dann bei einer Temperatur von -5 C 200 μΐ Äthylchlorformiat zu. Man rührt die" Mischung 15 Minuten bei -5 ⁰C und gibt dann 2 ml einer DMF-Lösung von 137 mg Tyramin zu. Die erhaltene Mischung rührt man 30 Minuten bei -5 C, 1 Stunde bei 0 C und 30 Minuten bei Raumtemperatur.

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Man engt die Reaktionsmischung im Vakuum ein und setzt 2ml 1M Natriumhydroxid zu. Nachdem man bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen hat, säuert man die Mischung mit Ameisensäure an und reinigt durch Florisil-Säulenchromatographie (Kolonne 100 ml)wobei man mit Äthanol-Wasser eluiert, wobei man 101 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin-tyramin-Konjugat (ein Neopterinylcaproyltyramin) erhält, FP. 192-196 °C (Zers.) (kristallisiert aus wäßrigem Äthanol).

Analyse C_?o	^Η30*	-H₂O	C	75	H	39	N	,66
			54,	94	6,	40	16	,33
berechnet:			54,		6,		16
gefunden:
^J6^C



^}6

Beispiel 4-3

249 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin und 200 μΐ Triäthylamin gibt man zu 4 ml DMF und fügt dann 100 μΐ Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von -5 C zu. Man läßt die Mischung 15 Minuten bei -5 C reagieren. Nach Zusetzen von 2 ml einer DMF-Lösung, die 205 mg Tyramin enthält, wird die Reaktion unter Rühren während 30 Minuten bei -5 C und 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Man engt die Reaktionsmischung im Vakuum ein und löst den Rückstand in Wasser. Nach Ansäuern mit Ameisensäure reinigt man die Mischung durch Florisil-Säulenchromatographie, eluiert allmählich unter Verwendung von 1 1 Wasser und 1 1 einer wäßrigen Lösung, welche 200 ml Aceton und 4 g Ammoniak enthält, wobei man 209 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6,7-dimethylpteridin-tyramin-Konjugat erhält Fp. 200 °C (Zers.)(umkristallisiert aus 50 % (Volumenteile) Äthanol) .

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Analyse C„„H„_ßN_cO_'H„O:

berechnet: gefunden:

C	71	H	83	N	,99
59,	77	6,	35	18	,76
59,	7,	18

Beispiel

Markieren mit radioaktivem Jod

10 μΐ DMF, welches 10 μ9 Biopterinyl-caproyl-tyramin-Konjugat enthält, gibt man zu 20 μΐ eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH

1 25 7,4) und gibt dann zu der Mischung 10 μΐ (1,2 mCi) Na I und anschließend 20 μg Chloramin T, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers. Man läßt die Mischung 30 Sekunden bei 25 ⁰C reagieren und stoppt dann die Reaktion durch Zugabe von 40 μg Natriummeta-bisulfit, gelöst in 10 μΐ des gleichen Puffers. Das Produkt wird durch Elektrophoresean Celluloseacetat gereinigt, mit einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,6) abgetrennt und mit einem Phosphatpuffer, der 0,5 % BSA enthält

1 25
extrahiert, wobei man I-markiertes 2-(5-Carboxy-pentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin-tyramin-Konjugat erhält. Rf 0,50 [Silicagel Dünnschichtchromatographie; Äthylacetat-Methanol-5%ige wäßrige Ammoniaklöusng (1:1:0,2) Volumenteile].

Beispiel 6-1

Konjugation mit BSA

74 mg Biopterinylcaproyltyramin und 168 μΐ Triäthylamin gibt man zu 1 ml DMF und setzt dann 87 von -5 ⁰C zu. Man rührt die Mischung 15 Minuten und gibt sie dann zu einer Mischung von 114 mg Rinderserumalbumin (BSA), 2 ml Wasser und 200 μΐ einer 1M Natriumhydroxidlösung. Die erhaltene Lösung rührt man dann 30 Minuten bei -5 C wobei man den pH auf 9 einstellt, 1 Stunde bei 0 ⁰C und 1 Stunde

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bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 5 ml 1M Natriumhydroxidlösung läßt man die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen und dialysiert dann unter Verwendung eines Cellophanschlauches gegen fließendes Wasser.Den Cellophanschlauch gibt man in ein Becherglas, welches eine Mischung von 1 g Natriumacetat und 300 ml Wasser enthält, stellt auf pH 4,5 ein und dialysiert 6 Stunden. Die innere Lösung wird dann zentrifugiert und der Niederschlag wird lyophilisiert, wobei man 95 mg 2-(5-Carboxy-pentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat (Biopterinylcaproyl· BSA) erhält.

Beispiel 6-2

73,4 mg 2- (5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin und 168 μΐ Triäthylamin gibt man zu 1 ml DMF und setzt dann 87 μΐ Äthylchlorformiat bei einer Temperatur von -5 ⁰C zu, wonach man die Mischung 15 Minuten rührt. Man gibt die Reaktionslösung zu einer Mischung von 114 mg BSA, 2 ml Wasser und 200 ml 1M Natriumhydroxid und rührt die erhaltene Mischung dann bei -5 ⁰C während man den pH auf 9 einstellt, 30 Minuten lang, dann 1 Stunde bei 0 C und 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Zusetzen von 1M Natriumhydroxid läßt man die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die Reaktionsmischung dialysiert man wie in Beispiel 6-1 beschrieben, zentrifugiert und lyophilisiert den Niederschlag, wobei man 100 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat (ein Neopterinylcaproyl-BSA) erhält.

Nach einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben, werden die folgenden BSA-Konjugate erhalten.

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Beispiel 6-3

2- (5-Carboxypentyl) -amino^-hydroxy-G^-dimethyl-pteridin-BSA-Konjugat (83 mg) aus 61 mg 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy 6,7-dimethylpteridin.

Substitutionsverhältnis von Pterin: 82%[berechnet von J-E 350 (P^H 7,0)].

Beispiel 6-4

2-CarboxyInethylamino-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2,3-trihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat (44 mg) aus 31 mg der entsprechenden 2-Carboxymethylamino-Verbindung.

Beispiel 6-5

2-Carboxymethylamino-4-hydroxy-6,7-dimethyl-pteridin-BSA-Konjugat (32 mg) aus. 25 mg der entsprechenden 2-Carboxymethylaminoverbindung.

Die nach den Beispielen 1-2 bis 6-5 nach einem ähnlichen Verfahren erhaltenen Verbindungen sind in der folgenden Tabelle II in Zusammenhang mit der obenstehenden Formel (I) aufgeführt.

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M/21 157

Q-R

CH CH

125.

- 25	—	R7	Fp.	C°	C) oder Rf
TABELLE	II	H	165	Cd)
	Il	180-	182	Cd)
DHP	Il	182-	184	Cd)
THP CD)
THP

DHP

Rf 0.48

CH COOH	CH₂CO-BSA	Me	Me	H	206-210 (Zers.)
CCH₂ )₂ COOH	It	It	It	It	275 (Schwarzfärbung)
CCH₂ )₃ COOH	CCH₀) _cQO-tyraniin -^12f	Il	Il	Il	238-240 (Zers.)
CCH₂) ₅ COOH	ti	Il	Il	CH₃	215-219 (Zers.)
CHCCH₃)COOH ClS)	Il	It	Il	H	193-194 (Zers.)
CCH₂) ₅ COOH	DHP	It	216-218 (Zers.)
CH₂COOH	THP	Me	177-180 (Zers.)
CCH₂) ₅COOH	Il	H	186-190 (Zers.)
CCH₂) rCO-tyramin	CH₃	Il	200 (Zers.)
Il	THP	Me	192-196 (Zers.)
Il	DHP	H.	169-171 (Zers.)
CCH₀) ,.CO-BSA	Me	Me
Il	THP	H
Il	DHP	11
Me
THP
Ί Me	Rf 0.58
THP	Rf 0.36
DHP	Rf 0.50

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DHP: L-Erythro-1,2-dihydroxypropy1 THP: L-Erythro-1,2,3-trihydroxypropyl THP (D): D-Erythro-1,2,3-trihydroxypropyl

RF-Wert auf Silicagel-Dünnschicht, entwickelt mit Äthylacetat-Methanol-5% wäßrige Ammoniaklösung (1:1:0,2) Volumen.teile) .

Beispiel

Herstellung des Antikörpers

2- (5-Carboxypentylamino) -4-hydroxy-6- (L-erythro-1 , 2-dihydroxypropyl)-pteridin-BSA-Konjugat mit komplettem Freud'sehern Adjuvans injiziert man intradermal New Zealand weißeh Kaninchen (1 mg pro Kaninchen). Nach einem Monat erfolgt eine zusätzliche Immunisierung (0,4 mg pro Kaninchen) auf die gleiche Weise, und insgesamt vier solcher zusätzlichen Immunisationen werden in wöchentlichen Abständen vorgenommen. 1 0 Tage nach der endgültigen Immunisierung wird von den Kaninchen Blut gesammelt, woraus dann Antiserum erhalten wird.

Beispiel 8-1

(a) Vorbehandlung von Urinproben

Zu 5,0 ml frischem menschlichem Urin gibt man 500 μΐ 5M Chlorwasserstoffsäure und 1 ml einer Q,2 %-igen I₀-O,4 %-igen _ν -Lösung und läßt die erhaltene Mischung

Δ KX

1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann wiederholt man die gleiche Behandlung, nur verwendet man 0,5 M Natriumhydroxid anstelle der Chlorwasserstoffsäure. Man stoppt die Oxidationsreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 2 %-iger Ascorbinsäure und zentrifugiert die Reäktionsmischung

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M/21 157 - 27 -

15 Minuten lang bei 7 000 rpm. Die überstehende Flüssigkeit wird einer Säulenchromatographie mit Dowex-50(H ) (0,9 χ 2 cm) unterworfen. Nach Waschen der Säule mit 20 ml Wasser wird Biopterin mit 5 ml einer 1M wäßrigen Ammoniaklösung eluiert. Man stellt das Eluat auf pH 7 ein und auf ein Volumen von 6,0 ml mit 250 μΐ einer 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und 5M Chlorwasserstoff säure, und verwendet es dann für den Assay.

(b) RIA von Biopterin

Bei dem Test verwendet man einen 0,0175M Phosphatpuffer welcher 0,1 % BSA enthält.

Um den Antikörper auf den Capronsäurerest zu entfernen, werden zwei Reihen der Mischung von 10 ug 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin und 100 μΐ eines 800-fach verdünnten Antiserums 30 Minuten bei 37 C inkubiert. Zu einer Reihe der sich ergebenden Lösung gibt man 100 μΐ des Puffers zu, der Standard-Biopterin (0 bis 710 pMol) enthält und zu der anderen Reihe der Lösung gibt man 100 μΐ der verdünnten Urinprobe (4, 8, 16 und 32-fache Verdünnung), und inkubiert

die Mischung 30 Minuten bei 37 ⁰C. Zu jeder setzt man

1 25
dann 1 0 μΐ radiojodiertes ( I) 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxy-propyl)pteridintyramin-Konjugat (20 000 cpm) zu und läßt die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man 100 μΐ Anti-Kaninchen IgG als zweiten Antikörper zu und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach Zugabe von 500 μΐ 4 %-igem Dextran T-70 (Pharmacia) rührt man die Mischung heftig und zentrifugiert 15 Minutenlang mit 2 000 rpm bei 4 ⁰C. Dann wird die Radioaktivität eines jeden Niederschlages gezählt. Es wird eine Standard-Kurve (Figur 1) gezeichnet, indem man die Werte

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(B-N/B -N) die bei Standardlösungen erhalten wurden, aufträgt, dann werden die Biopterinspiegel in den Ürinproben, basierend auf der Kurve, bestimmt, welche in Tabelle III im Vergleich zu dem vorher beschriebenen Bioassay erhalten wurden.

Tabelle III

	Biopterin	(n Mol/ml Urin)
Nr. der Probe	RIA	Bioassay
1	5,75	5,4
2	.15,1	16,0
3	8,0	7,2
4	10,7	8,9
5	9,7	8,9

Beispiel 8-2 (a) Vorbehandlung von Urinproben

Zu 500 μΐ frischem menschlichem Urin gibt man 50 μΐ einer 2M Chlorwasserstoffsäure und 50 μΐ einer 2 % I2~ 4% KI-Lösung und läßt die Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde in der Dunkelheit stehen. Dann stoppt man die Oxidation durch Zugabe von 50 μΐ einer 2 %-igen Ascorbinsäurelösung zu der Mischung. Man lyophilisiert, um die cnlorwaslerstoffsäure zu entfernen und löst den Rückstand in 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,5) welcher 0,3 % BSA enthält und verwendet sie so für den Assay.

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(b) RIA von Biopterin

Bei dem Assay verwendet man 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,4)
der 0,1 % BSA enthält.

Zu einer Mischung von 100 μΐ des Puffers und 100 μΐ Antiserum (etwa 4 000 bis 5 000-fache Verdünnung), gibt man
100 μΐ Standard-Biopterin (0-300 pmol) in Pufferlösung
oder 100 μΐ Urinprobe (50-100 fache Verdünnung). Man

inkubiert die Mischung 30 Minuten bei 37 ⁰C. Zu jeder

1 25
gibt man dann 100 μΐ radiojodiertes ( I) 4-Hydroxy-

2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-1,2-

dihydroxypropy1)-pteridin ( 10 ooo - 20 000 cpm) und

läßt di

stehen.

läßt die erhaltene Mischung 1 bis 2 Stunden bei 4 ⁰C

Zu der Röaktionsmischung gibt man als den zweiten Anti- ! körper 100 μΐ Anti-Kaninchen IgG. Man läßt die Mischung

10 Minuten bei Raumtemperatur stehen und setzt dann ;

100 μΐ 4 %-iges Dextran T-70 (Pharmacia) zu. Man rührt j

die Mischung heftig und zentrifugiert 15 Minuten bei ■

2 500 rpm bei 4 ⁰C. Dann wird die Radioaktivität des ' Niederschlags gezählt.

Durch Auftragen der so erhaltenen Werte (B-N/B_Q-N) wird die Kurve (A) wie in Figur 2 gezeigt, im Vergleich zur Kurve (B), welche unter Verwendung des gleichen . Tracers wie in Beispiel 8-1 erhalten wurde, gezeichnet. j

Wie «us der Figur hervorgeht, zeigen die Kurven ein ' scharfes Dosia-Ansprechen, wie es für den HIA geeignet ist,, und insbesondere die Sensitivität unter Verwendung des Tracers der eine Brücke hat, die von der des Antigens verschieden ist, ist höher als im Falle der Verwendung der gleichen Brücke.

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Claims

Patentansprüche

1. Verbindungen der allgemeinen Formel:

worin

R Hydroxyphenyl, radiojodiertes Hydroxyphenyl, Tyraminocarbonyl, radiojodiertes Tyraminocarbonyl, eine Proteinocarbonylgruppe oder Carboxyl;

und
R_fi und R_ jeweils Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit

1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten.

2. Radiojodiertes 4-Hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl)-äthyl]-amino-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin nach Anspruch 1.

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3. Radiojodiertes 2-[5-(Tyraminocarbonyl)-pentylamino]-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin nach Anspruch 1.

4. 2-(5-Carboxypenty!amino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropy1)-pteridin-BSA Konjugat nach Anspruch

5. 2-(5-Carboxypentylamino)-4-hydroxy-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-pteridin nach Anspruch 1.

! 6. ■Radioimmunoassay-Verfahren zur Bestimmung von Pterinen,

! dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der ι allgemeinen Formel:

worin

R eine radiojodierte Hydroxyphenylgruppe oder eine radiojodierte Tyraminocarbonylgruppe;

und
R, und R_ jeweils Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, verwendet.

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