DE4308739C1 - Pterinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Pterinderivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B17/00—Azine dyes

Description

Neopterin und Dihydroneopterin werden ganz überwiegend von Monocyten/Makrophagen von Primaten (zum Teil auch in geringerem Maße von niedrigeren Säugern) nach Aktivierung durch Interferone und LPS in stark erhöhten Mengen pro­ duziert und ausgeschieden. Bei vielen Erkrankungen, die mit einer Aktivierung, des zellulären Immunsystems einher­ gehen, können in praktisch allen Körperflüssigkeiten er­ höhte Neopterinwerte festgestellt werden.
Die Neopterinbestimmung erweist sich als diagnostisch wertvoll, z. B. prognostisch bei Transplantatabstoßung und HIV-Infektion oder beim Screening auf verborgene Krankheiten bei Blutspendern zur Erhöhung der Sicherheit von Bluttransfusionen. Der Nachweis kann durch ver­ schiedene Methoden erfolgen, z. B. durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion, Radioimmunoassay, Dünnschicht­ chromatographie usw. Auch Dihydroneopterin läßt sich, nach einer bei niedrigem pH durchgeführten Oxidation nach bekannten Verfahren (Iod oder MnO2) als Neopterin oder auch direkt mit HPLC/elektrochemischer Detektion be­ stimmen.
Tetrahydrobiopterin (BH4) ist essentieller Cofaktor zahl­ reicher lebenswichtiger Enzyme, wie z. B. der aromatischen Aminosäurehydroxylasen (Synthese z. B. der Neurotrans­ mitter Dopamin und Hydroxytryptamin) und der NO-Syntha­ sen. Biopterin selbst ist in Körperflüssigkeiten praktisch nicht vorhanden; es wird aber quantitativ aus BH4 durch saure Oxidation erhalten und kann wie Neopterin nach verschiedenen Verfahren bestimmt werden.
Es wurden auch nichtradioaktive Immunoassays beschrie­ ben, doch konnte bislang kein einfach durchzuführender und richtig (im Vergleich zu HPLC) messender Enzym­ immunoassay für die Bestimmung von Neopterin auf den Markt gebracht werden.
Ein Radioimmunoassay zur Bestimmung von Pterinen wird beschrieben in der DE-A 30 25 226, in welcher die Spacergruppe zwischen der N2-Gruppe und der Markergruppe eine gradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt. Auch diese Immunoassays sind nicht empfindlich genug, um routinemäßig und zu­ verlässig das Neopterin oder Biopterin zu bestimmen.
Auch die Immunoassays gemäß EP-A 0 370 960 weisen als Spacergruppe eine Hexansäuregruppe auf, die zu unbe­ friedigenden Ergebnissen führt.
Die Erfindung hat sich somit die Aufgabe gestellt, Substanzen zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe es möglich ist, wesentlich empfindlichere Immunoassays her­ zustellen. Eingehende Untersuchungen haben zu dem Er­ gebnis geführt, daß überraschenderweise wesentlich empfindlichere Immunoassays entwickelt werden können, wenn die Spacergruppe zwischen der Aminogruppe und der Markergruppe eine 4-Aminobutyl-l-carboxyamidopropyl- Gruppe ist, welche über die 3-Propyl-Gruppe entweder mit der N2- oder der N3-Gruppe des Neopterins oder Biopterins verknüpft ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit zunächst die Pterinderivate der allgemeinen Formel I
worin R1 die Gruppe -(CHOH)2-CH3 oder -(CHOH)2-CH2OH darstellt, R2 und R3 nicht gleich sind und entweder Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)3CONH(CH2)4-NH-R4 dar­ stellen, wobei R4 darstellt Wasserstoff oder eine übliche Markergruppe für Immunoassays oder übliche Träger­ materialien für Festphasenimmunoassays oder höhermole­ kulare immunogene Gruppen zur Herstellung von Anti­ körpern.
Als Markergruppe kommen insbesondere in Frage radioaktive Marker, Enzymmarker, Fluoreszenzmarker oder Chemi­ lumineszenzmarker.
Als Trägermaterialien für Festphasenimmunoassays kommen beispielsweise Polystyrolröhrchen oder Kugeln in Frage, die mit reaktiven, schwer löslichen Materialien be­ schichtet sind wie synthetische Polypeptide etc. Als höhermolekulare immunogene Gruppen kommen vor allen Dingen Peptide mit mehr als 6 Aminogruppen und Poly­ acrylamide in Frage.
Diese Pterinderivate können hergestellt werden, indem Pterinderivate der allgemeinen Formel II
in der R1 die obengenannte Bedeutung hat und R5 und R6 nicht gleich sind und entweder Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)3-COOH darstellen mit 1,4-Diaminobutan um­ gesetzt werden, woraufhin gewünschtenfalls die end­ ständige freie Aminogruppe mit einem Marker, einer Festphase oder der immunogenen Gruppe verknüpft wird.
Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung dieser Pterinderivate zur Herstellung von Immunoassays zur Bestimmung von Neopterin oder Biopterin.
Die als Ausgangsprodukte für die Herstellung der Pterin­ derivate I verwendeten Pterinderivate der allgemeinen Formel II können auf folgende Art und Weise hergestellt werden:
Neopterin oder Biopterin werden mit 4-Brombuttersäure­ ethylester umgesetzt zum N3-(3-Carboxypropyl)-neopterin- oder -biopterin-ethylester. Dieser Ethylester kann ent­ weder mit Säure zur freien N-Carbonsäure hydrolisiert werden, die dann mit 1,4-Diaminobutan umgesetzt wird oder aber der Ester wird alkalisch verseift, wobei gleich­ zeitig eine Umlagerung zur N2-Carbonsäure stattfindet. Auch diese Carbonsäure läßt sich mit 1,4-Diaminobutan weiter umsetzen. Die Umsetzung mit dem Diaminobutan er­ folgt vorzugsweise mit Hilfe von N-Hydroxysuccinimid unter Zusatz von Morpholinoethylisonitril in wasserfreiem Dimethylformamid sowie von Lutidin. Schließlich ist es auch möglich, das fertige N3-Amid durch Alkali umzulagern in das entsprechende N2-Derivat.
Aus den Substanzen der allgemeinen Formel I, in denen R4 Wasserstoff bedeutet, werden mit den entsprechenden Markergruppen, einer Festphase oder immunogenen Gruppe die Substanzen hergestellt, in denen R4 eine Marker­ gruppe, eine Festphase oder immunogene Gruppe ist.
Die Substanzen der allgemeinen Formel I, in denen R4 Wasserstoff ist können nämlich auch hervorragend dazu benutzt werden, Antikörper gegen Neopterin und Biopterin zu gewinnen. Hierzu werden sie an die hierfür üblicher­ weise verwendeten immunogenen Gruppen wie Proteine, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA), Thyroglobulin oder Polyacrylamide etc. gebunden und Kaninchen, Schafen, Hühnern oder Mäusen appliziert. Es können auch die üb­ lichen Adjuvantien verwendet werden, die für die je­ weilige Tierspezies vorteilhaft ist. Auch die Anzahl und der Abstand der Boosters kann sich danach richten. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß auch mit Hilfe anderer Substanzen erzeugte Antikörper gegen Biopterin und Neopterin geeignet sein können, entsprechende Immunoassays herzustellen. Schließlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper zu verwenden, wie sie beispielsweise aus den Milzzellen immunisierter Mäuse nach üblichen Verfahren herstellbar sind.
Die an entsprechende Trägermaterialien gebundenen Derivate, zum Beispiel an BSA, Immunoglobuline, Trans­ ferrin oder Plastikoberflächen lassen sich auch in Immunoassays nach EP 135 071 einsetzen.
Als radioaktive Marker sind beispielsweise geeignet 3′-125Iodtyrosyl- oder 4′-Hydroxy-3′-125iodphenyl­ propionsäurederivate der Formel
die durch Umsetzung der ω-Aminoneopterinderivate (bzw. der (ω-biopterinderivate) mit dem N-Hydroxysuccinimid­ aktivester der entsprechenden rakioaktiven Markerver­ bindung umgesetzt und mittels HPLC getrennt werden, - oder auch durch radioaktive Markierung der entsprechend hergestellten iodfreien Derivate erhalten wird.
Als Enzymmarker geeignet sind beispielsweise alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder β-Galactosidase, die nach üblichen Methoden aktiviert (z. B. über Glutar­ aldehyd, Epoxiderivate oder durch Periodatoxidation) und an die endständige Aminogruppe der ω-Aminopterinderivate gekoppelt werden. Die Abtrennung erfolgt im allgemeinen durch Gelchromatographie, evtl. unter Hochdruckbe­ dingungen.
Als Fluoreszenzmarker geeignet ist beispielsweise die Fluoresceingruppe, die durch Umsetzung der ω-Amino­ pterinderivate mit Fluoresceinisothiocyanat einfach ein­ geführt wird. Die Verbindungen werden mittels HPLC ge­ reinigt.
Als Chemilumineszensmarker geeignet sind zum Beispiel Akridiniumester, Luminolderivate oder ABEI, die im all­ gemeinen über ihre Aktivester eingeführt und mit HPLC gereinigt werden.
In den nachfolgenden Beispielen ist die Herstellung der Ausgangsmaterialien sowie der erfindungsgemäßen Substan­ zen als auch ihre Anwendung näher erläutert.
Herstellung der Zwischenprodukte der Formel II
12 mg Neopterin werden in 1,5 ml DMF suspendiert und mit 14 µl 4-Brombuttersäureethylester und mit 26 mg K2CO3 (wasserfrei) 2 Tage bei: Raumtemperatur geschüttelt. Mit einem Aliguot des Reaktionsansatzes wird eine präparative DC (Cellulosefolien; n-Propanol/3% wäßriges NH3 (2/l)) durchgeführt. Die Hauptzone (Rf ca. 0,65) wird mit Methanol Wasser eluiert. Es handelt sich um N3-(3- Carboxypropyl)-neopterinethylester.
5 mg dieses Ethylesters werden in 2 ml H2O mit 500 µl 1 N HCl 2 Tage bei Raumtemperatur lichtgeschützt leicht geschüttelt. Danach wird im Hochvakuum unter Rotation eingedampft. Der Ester wird vollständig hydrolisiert. Die Ausbeute beträgt 3,7 mg (80%). Der Rf-Wert beträgt ca. 0,23 (Cellulosefolien; n-Propanol/3%iges wäßriges Ammoniak (2/l)). Es handelt sich um N3-(3-Carboxypropyl)­ neopterin.
5 mg N3-(3-Carboxypropyl)-neopterin-ethylester werden mit 2 ml 0,2 N Natronlauge 3 Stunden bei Raumtemperatur bei Lichtausschluß behandelt und danach mit Salzsäure neutra­ lisiert. Die Dünnschichtchromatographie (Cellulosefolien; n-Propanol/3% wäßrigen Ammoniak (2/l)) ergibt einen Rf-Wert von 0,15. Die Ausbeute beträgt 3,2 mg (69%). Es handelt sich um N2-(3-Carboxypropyl)-neopterin.
Herstellung der Substanzen der allgemeinen Formel I Beispiel 1
3 mg N3-(3-Carboxypropyl)-neopterin werden in 1,5 ml DMF (wasserfrei) mit 5 mg N-Hydroxysuccinimid und 6 µl Morpholinoethylisonitril in 50 µl DMF (wasserfrei) sowie mit 4 µl Lutidin versetzt. Nach drei Tagen leichtem Schütteln bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß werden 50 µl 1,4-Diaminobutan zugegeben; es wird zwei Tage lang weiter geschüttelt. Ein Aliquot wird durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt (Cellulosefolien; n-Propanol/3% wäßrigen Ammoniak (2,5/l)). Die Hauptzone (Rf ca. 0,3) wird mit Methanol/Wasser eluiert und unter Rotation eingedampft. Es handelt sich um das N3-ω-Amino­ neopterinderivat.
Beispiel 2
7 mg N2-(3-Carboxypropyl)-neopterin werden in 2 ml DMF (wasserfrei) mit 5 µl Lutidin versetzt. 6 mg N-Hydroxy­ succinimid und 7 µl Morpholinoethylisonitril werden in 120 µl DMF (wasserfrei) gelöst und zu obiger Lösung ge­ geben. Es wird 5 Tage bei Raumtemperatur zugegeben und unter Lichtausschluß gerührt. Danach werden 100 µl 1,4-Diaminobutan bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß 16 Stunden leicht geschüttelt. Die präparative Dünn­ schichtchromatographie auf Cellulosefolien im Laufmittel n-Propanol/3% wäßrigen NH3 (2,5/l) ergibt eine Hauptzone mit dem Rf ca. 0,27. Diese wird mit Methanol/Wasser/ Ammoniak eluiert und unter Rotation eingedampft. Die Ausbeute beträgt 4,3 mg (53%). Es handelt sich um eine im Dünnschichtchromatogramm saubere Substanz ohne positive Nebenflecken mit Ninhydrin.
Beispiel 3
1 mg N3-ω-Aminoneopterinderivat (erhalten gemäß Beispiel 1) wird in 500 µl 0,2 N Natronlauge 4 Stunden bei Raum­ temperatur unter Lichtausschluß leicht geschüttelt. Nach Neutralisation mit Salzsäure wird lyophilisiert. Das Dünnschichtchromatogramm auf Cellulosefolien mit n-Pro­ panol/3% wäßrigem Ammoniak (2,5/l) ergibt einen Rf-Wert von ca. 0,27. Es handelt sich um die gleiche Substanz wie die im Beispiel 2 erhaltene.
Beispiel 4
0,24 mg N3-ω-Aminoneopterinderivat gemäß Beispiel 1 werden in 25 µl Carbonatpuffer (1 M, pH 9) mit 55 µl (0,5 mg) aktivierte alkalischer Phosphatase (Pierce) versetzt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Nach Zugabe von 15 µl Lysin (2 M) werden nach zwei Stunden 175 µl Rinder­ serumalbumin (BSA) (1%) zugesetzt und durch Gelchromato­ graphie (NAP-10-Säule; Pharmacia) getrennt.
Beispiel 5
In analoger Weise wie im Beispiel 4 beschrieben, werden 0,24 mg N2-ω-Aminoneopterinderivat (vergleiche Beispiel 3) mit alkalischer Phosphatase versetzt und nach Zusatz von BSA durch Gelchromatographie getrennt.
Beispiel 6
20 mg BSA werden in 2 ml Wasser unter Eiskühlung mit 100 µl Glutaraldehyd versetzt. Nach einer Stunde bei Raum­ temperatur werden 0,5 mg N3-ω-Aminoneopterinderivat gemäß Beispiel 1 in 1 ml Methanol/Wasser zugegeben und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Überschüssige Aldehyd­ gruppen werden mit Lysin abgesättigt. Danach wird gegen Wasser dialysiert (insgesamt 5 l) und portioniert lyo­ philisiert. Die Ausbeute beträgt 14 mg. Es handelt sich um ein Neopterin-BSA-Konjugat.
Beispiel 7
In analoger Weise wie in Beispiel 6 beschrieben werden 25 mg Keyhole Limpet hemocyanin (KLH) in 2 ml Wasser mit N3-ω-Aminoneopterinderivat umgesetzt. Danach wird gegen insgesamt 6 l Wasser (mehrfacher Wechsel) dialysiert und portioniert lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt 18 mg. Es handelt sich um ein Neopterin-KLH-Konjugat.
Beispiel 8
In analoger Weise wie in Beispiel 6 beschrieben, werden 20 mg BSA mit N2-ω-Aminoneopterinderivat umgesetzt und dialysiert. Die Ausbeute beträgt 13 mg. Es handelt sich um das entsprechende Neopterin-BSA-Konjugat.
Beispiel 9
10 µl einer Lösung des ω-Aminoneopterinderivates gemäß Beispiel 1 oder 3 (0,6 mg/ml) werden in 50 µl 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 8,5 vorgelegt, mit 40 µl einer Akridiniumesterlösung (MA70, Höchst Behring; 1 mg/ml) versetzt und 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtaus­ schluß inkubiert. Die Reinigung des markierten Neopterins erfolgt über C18-RP-HPLC mittels eines Gradienten aus Eluens A: H2O/AcCN/TFA; 95/5/0,1%; und Eluens B: AcCN/H2O/TFA; 90/10/0,1%.
Beispiel 10 Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Neopterin in Körper­ flüssigkeiten Herstellung des Tracers
Das Neopterin/alkalische Phosphatasekonjugat gemäß Bei­ spiel 5 wird in einem Puffer aus 100 mM Hepes pH 6,4, 1 mM MgCl21 80 mg/l Lebensmittelfarbstoff Blau, 10,7 g/l alkalische Phosphatase (1 U/mg), je 1,07 g/l Schaf- bzw. Rinder-IgG und 16 g/l BSA auf ca. 1800 U/µl verdünnt und zu je 2,5 ml aliguotiert und lyophilisiert.
Herstellung der beschichteten Mikrotiterplatten
Die Mikrotiterplatten (Maxisorp F96, Nunc) werden mit einer Lösung aus 10 mg/l Esel-anti-Schaf-Antikörper in 10 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM NaCl, befüllt (300 µl/Kavität) und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird abgesaugt und die Platten mit 0,5% BSA/2% Zucker-Lösung 2 Stunden abgesättigt. Ein Anti-Neopterin- Antiserum wird in 10 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM NaCl auf 2 mg/l verdünnt und die Platten damit befüllt (300 µl/Kavi­ tät). Nach 18-24 Stunden wird die Lösung abgesaugt, die Platten erneut wie oben abgesättigt und anschließend lyo­ philisiert.
Herstellung der Standards
Neopterin-freies humanes Serum wird sterilfiltriert, mit 0,05% NaN3 und der gewünschten Menge an reinem Neopterin versetzt.
Assaydurchführung
  • 1. Rekonstituiere 2,5 ml des lyophilisierten Tracers mit 40 ml 100 mM Hepes pH 6,5, 150 mM MgCl2.
  • 2. Pipettiere 50 µl Standard- bzw. Patientenserum (oder Plasma) und 150 µl Tracer ein eine unbeschichtete Mikrotiterplatte und mische gründlich.
  • 3. überführe 150 µl dieser Mischung in die beschichtete Mikrotiterplatte und inkubiere 2 Stunden bei Raum­ temperatur unter Lichtausschluß.
  • 4. Wasche 3×.
  • 5. Pipettiere 10 µl 4-Nitrophenylphosphat (4-NPP- Lösung) und inkubiere 30 min.
  • 6. Stoppe die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 2 N NaOH.
  • 7. Messe in einem Photometer bei einer Wellenlänge von 405 nm.
Ergebnis
Typische Standardkurve
Konzentration nmol/l
OD
2
1.978
5 1.477
10 1.098
25 0.706
50 0.530
Verdünnungsechtheit
(Verdünnung mit Nullserum, Mittelwert aus 6 Patientenseren)
Wiederfindung
Original|111%
1 : 2 102%
1 : 4 100%
1 : 8 98%
1 : 16 104%
Wiederfindung von Standard 5 (50 nmol/l)
(Mittelwert aus 10 Seren)
1 + 1|94%
1 + 2 94%
Beispiel 11 Herstellung des Tracers
Das markierte Neopterin gemäß Beispiel 9 wird in einem Puffer aus 50 mM K-Phosphat pH 6,5, 20 g/l BSA, je 0,8 g/l Schaf- und Maus-IgG, 0,2 g/l Lebensmittelfarbstoff Blau, und 0,1 g/l KathonCG auf ca. 8.000 RLU/µl verdünnt, á 1,4 ml aliguotiert und lyophilisiert.
Herstellung der Standards
Neopterin-freies humanes Serum wird sterilfiltriert, mit 0,05% NaN3 und der gewünschten Menge an reinem Neopterin versetzt.
Herstellung der beschichteten Röhrchen
Anti-Neopterin-Antiserum wird in 10 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM NaCl auf 6,6 mg/l verdünnt, je 300 µl dieser Lösung in Startubes (Maxisorp, Nunc) befüllt und 18-24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wird abgesaugt und die Röhrchen mit einer Lösung aus Zucker/BSA (2%/0,3%) abgesättigt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird erneut abgesaugt und die Röhrchen werden lyophili­ siert.
Assaydurchführung
  • 1. Rekonstituiere 1,4 ml Tracerlyophilisat mit 28 ml 50 mM K-Phosphatpuffer pH 6,5.
  • 2. Pipettiere 50 µl Standard- bzw. Patientenprobe und 250 pl Tracer in mit Anti-Neopterin-Antikörper be­ schichtete Röhrchen.
  • 3. Inkubiere 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Licht­ ausschluß bei 30 UpM.
  • 4. Wasche die Röhrchen 4×.
  • 5. Messe in einem Luminometer.
Ergebnis
Die typischen Werte für eine Standardkurve betragen:
Konzentration nmol/l
RLU
2
49 587
5 34 589
15 14 389
50 5137
150 1964
500 935
Verdünnungsechtheit
(Verdünnung mit Nullserum, Mittelwert aus 10 Seren)
Verdünnung
Wiederfindung
Original 108%
1 : 2 102%
1 : 4 94%
1 : 8 100%
1 : 16 98%
1 : 32 111%
Wiederfindung
(Aufstockung von Seren mit Standard 6)
(500 nmol/l)
2 + 1|103%
1 + 1 98%
1 + 2 108%
Präzision

Claims (4)

1. Pterinderivate der allgemeinen Formel I worin R1 die Gruppe -(CHOH) 2-CH3 oder -(CHOH)2-CH2OH darstellt, R2 und R3 nicht gleich sind und entweder Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)3CONH(CH2)4-NH-R4 darstellen, wobei R4 dar­ stellt Wasserstoff oder eine übliche Markergruppe für Immunoassays oder übliche Trägermaterialien für Festphasenimmunoassays oder höhermolekulare immuno­ gene Gruppen zur Herstellung von Antikörpern.
2. Pterinderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Markergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe der radioaktiven Marker, der Enzymmarker, der Fluoreszenzmarker oder Chemilumineszenzmarker.
3. Verfahren zur Herstellung von Pterinderivaten der allgemeinen Formel I worin R1 die Gruppe -(CHOH) 2-CH3 oder -(CHOH)2-CH2OH darstellt, R2 und R3 nicht gleich sind und entweder Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)3CONH(CH2)4-NH-R4 darstellen, wobei R4 darstellt Wasserstoff oder eine übliche Markergruppe für Immunoassays oder übliche Trägermaterialien für Festphasenimmunoassays oder höhermolekulare immuno­ gene Gruppen zur Herstellung von Antikörpern, da­ durch gekennzeichnet, daß Pterinderivate der all­ gemeinen Formel II in der R1 die obengenannte Bedeutung hat und R5 und R6 nicht gleich sind und entweder Wasserstoff oder die Gruppe -(CH2)3-COOH darstellen mit 1,4-Diamino­ butan umgesetzt werden, woraufhin gewünschtenfalls die endständige freie Aminogruppe mit einem Marker, einer Festphase oder der immunogenen Gruppe ver­ knüpft wird.
4. Verwendung von Pterinderivaten gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Immunoassays zur Bestimmung von Neopterin oder Biopterin.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506567B2 (en) * 2000-01-31 2003-01-14 Fuji Photo Film Co., Ltd. Water-soluble flourescent intercalator compound
US7442372B2 (en) 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
EP1696877A4 (de) * 2003-11-13 2010-06-09 Gen Hospital Corp Verfahren zur schmerzbehandlung
EP1708690B1 (de) 2003-11-17 2016-07-20 BioMarin Pharmaceutical Inc. Behandlung von phenylketonurie mit bh4
CA2581814C (en) 2004-11-17 2015-10-13 Biomarin Pharmaceutical Inc. Stable tablet formulation of tetrahydrobiopterin
WO2006063215A2 (en) * 2004-12-08 2006-06-15 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for the treatment of pulmonary hypertension of the newborn
WO2007067570A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for the treatment of disease
US20100009997A1 (en) * 2007-01-12 2010-01-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Method of treating a metabolic or neuropsychiarty disorder with a bh4 derivative prodrug
JP2010515747A (ja) * 2007-01-12 2010-05-13 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド テトラヒドロビオプテリンプロドラッグ
PT2139485E (pt) 2007-04-11 2013-01-16 Biomarin Pharm Inc Métodos de administração da tetra-hidrobiopterina, composições associadas e métodos de medição
BRPI0821970A2 (pt) * 2008-01-03 2015-06-23 Biomarin Pharm Inc Análogos de pterina para tratamento de condição responsiva a bh4
WO2009088979A1 (en) * 2008-01-07 2009-07-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Method of synthesizing tetrahydrobiopterin
US8507210B2 (en) * 2009-06-05 2013-08-13 B.R.A.H.M.S Gmbh Detection of bacterial infections in subjects suffering from dyspnea
US20120115244A1 (en) 2010-11-09 2012-05-10 Abbott Laboratories Materials and methods for immunoassay of pterins
US9216178B2 (en) 2011-11-02 2015-12-22 Biomarin Pharmaceutical Inc. Dry blend formulation of tetrahydrobiopterin
WO2019175328A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh Bh4pathwayactivationandusethereoffortreatingcancer
WO2019175332A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh Bh4 pathway inhibition and use thereof for treating t-cell mediated autoimmune diseases or hypersensitivity

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3025226A1 (de) * 1979-07-04 1981-01-22 Daiichi Radioisotope Lab Radioimmunoassay zur bestimmung von pterinen und neue dafuer verwendbare pterinderivate
EP0370960A1 (de) * 1988-11-21 1990-05-30 Ivo E. Pera Neopterin als Marker in einem diagnostischen Testkit zum Nachweis von retroviralen Krankheiten

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE301292C (de) *
JPS57158783A (en) * 1981-03-26 1982-09-30 Daiichi Rajio Isotope Kenkyusho:Kk Pterin derivative
JPH0757754B2 (ja) * 1989-09-02 1995-06-21 学校法人藤田学園 ビオプテリン，ネオプテリン及び天然プテリジンの酵素免疫測定法及びそのための支持体
DE9217853U1 (de) * 1992-12-30 1993-03-25 Educational Foundation Fujita Gakuen, Toyoake, Aichi, Jp

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3025226A1 (de) * 1979-07-04 1981-01-22 Daiichi Radioisotope Lab Radioimmunoassay zur bestimmung von pterinen und neue dafuer verwendbare pterinderivate
EP0370960A1 (de) * 1988-11-21 1990-05-30 Ivo E. Pera Neopterin als Marker in einem diagnostischen Testkit zum Nachweis von retroviralen Krankheiten

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