DD254009A5 - Verbindung zur herstellung neuer konjugierter verbindungen von vinblastin und seinen derivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer konjugierter Verbindungen von Vinblastin und bestimmter bekannter Derivate desselben mit Proteinen, Proteinfragmenten. Erfindungsgemaess werden Verbindungen der allgemeinen Formel hergestellt, worin beispielsweise bedeuten: A eine Bruecke wieNH-R COCH(CH2)nCO u. a., n 1 bis 5, R Wasserstoff, eine Acylgruppe u. a.; R1 einen ggf. modifizierten Proteinrest; R2 eine Methoxygruppe u. a.; R3 Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe. Formel

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer konjugierter Verbindungen von Vinblastin und von bestimmten bekannten Derivaten desselben mit Proteinen, Proteinfragmenten, Aminosäuren oder Aminen, die als Antitumormittel verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Vinblastin und bestimmte seiner Derivate, insbesondere das Vincristin oder das Vindesin, wurden bereits mit Proteinen, beispielsweise mit Albumin oder verschiedenen Immunoglobulinengekuppelt. Daraus resultieren Kupplungsprodukte oder Verbindungen, die „konjugierte Verbindungen" genannt werden. Wir beziehen uns insbesondere auf die folgenden Literaturstellen:

— J.D.Teale, Jacqueline M. Clough et V. Marks, Br. J.CIin. Pharmac. 4,169-172,1977

— C. H. J. Ford, C. E. Newmann, J. R. Johnson, C. S. Woodhouse, T. A. Reeder, G. F. Rowland, R. G.Simmonds, Br.J. Cancer 47, 35-42,1983

— M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, E.Jacobs, CH.Marsden, R.W.Baldwin, Br. J. Cancer 47,43-49,1983

— J.R.Johnson, C.H.J.Ford, C.E.Newman, C.S.Woodhouse, G.F.Rowland, R.G.Simmons, Br.J.Cancer 44, 472-475,1981 .

— EIi Lilly Eur. Pat. Applic, Publ. n°56.322,21.7.82

— R. A.Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzon,G.A.Poore J.Med. Chem.22,391,1979

Es wird ebenfalls auf das Ausschließungspatent DD-PS 219771 verwiesenen dem die Kupplung der bis-lndol-Derivate mit Proteinen, Proteinfragmenten oder Aminen über eine Brücke der Art-COCH₂-,-CO(CH₂I_n-CO-beschrieben wird, wobei η von 1 bis 5 variieren kann und die Brücke der genannten Art durch eine Alkyl- oder Aminogruppe substituiert sein kann.

Die Kupplung dieser bis-lndol-Derivate wurde nicht nur zu dem Zweck vorgenommen, neue immunologisch reaktive Stoffe zu entwickeln, sondern erfolgte vor allem im Hinblick auf die Herstellung von Antitumormitteln, die aktiver, selektiver und weniger toxisch sind.

Zu diesem letztgenannten Zweck wurden zahlreiche konjugierte Proteinverbindungen mit anderen Antitumormitteln bisher.

studiert. Das gilt insbesondere für konjugierte Verbindungen eines Antikörpers und eines Ricin-Fragments oder für konjugierte Verbindungen von Albumin und M?thotrexat (französische Patentanmeldung Nr.2437213, C M Industries; B. C. F. Chu,

S. B. Howell J. of Pharmacology and Exp. Therapeutics, 219 [2], 389-393,1981).

Die monoclonalen Antikörper, insbesondere solche menschlichen Ursprungs, die mit bekannten Antitumormedikamenten gekuppelt sind, sind insbesondere Gegenstand verschiedenster Untersuchungen.

Schließlich wird hervorgehoben, daß die Verwendung und Bewertung von 1:1-Komplexen von bis-lndolalkaloiden mit TubuMn in der BE-PS Nr.854053 beschrieben wurde. In bestimmten Fällen kann sich dadurch eine geringere Toxizität und eine stärkere chemotherapeutische Wirksamkeit als für die entsprechenden freien Alkaloide ergeben.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung der Verbindungen mit stärkerer Antitumorwirkung und geringerer Toxizität.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Erfinungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung neuer Produkte zur Verfügung gestellt, die konjugierte Verbindungen von Vinblastin oder Derivaten des Vinblastin mit Proteinen oder Proteinfragmenten sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kupplung über eine Estergruppe vorgenommen wird, die von der Hydroxylgruppe des 4-Kohlenstoffatoms des Vinblastin-Skeletts abgeleitet ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Proteinfragment mit der Vinblastinverbindung über eine Brücke gekuppelt wird, die durch vorangehende Kondensation des Vinblastinderivats mit einer bifunktionellen organischen Verbindung, die gegebenenfalls aktiviert ist, hergestellt wurde.

Das 4-0-Desacetylvinblastin-Derivat kann beispielsweise das Vindesin, das 4-0-Desacetylvinblastin sein, das am 3-C mit einer Aminosäure gekuppelt ist oder das 4-O-Desacetyldesoxy- - Vinblastin oder das 4-0-Desacetyl-4'-desoxy-vinblastin, das am 3-C mit einer Aminosäure gekuppelt ist.

Das Verfahren gestattet insbesondere die Herstellung von Verbindungen, die der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:

3 '

CH₃OOC

CH₃O

—A -R

OH

CO

in welcher A eine „Brücke" wie

NH-R I

- COCH-(CH₀) CO - oder 2. η

NH-R

- CO- (CH₀) -CHCO-z η

darstellt, wobei η von 1 bis 5 variiert, R ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe wie Acetyl, Trifluoracetyl oder Carbobenzyloxy darstellt, R₁ einen gegebenenfalls modifizierten Proteinrest bedeutet, R₂ für eine Methoxygruppe, eine Aminogruppe oder einen alpha-Aminosäurerest steht, der durch eine Amidbindung gebunden ist und dessen Estergruppe ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält, und R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet, die jeweils in den beiden möglichen Konfigurationen vorliegen können, sowie von Additionssalzen derselben mit einer mineralischen oder organischer Säure.

Die therapeutische Wirkung der Verbindung gemäß der Erfindung liegt höher als difi der bisher beschriebenen Verbindungen,

und deren Toxizität ist merklich geringer.

Gemäß der Erfindung werden die Derivate in einer ersten Stufe durch Kondensation eines Anhydrids, beispielsweise des Asparaginsäure-, Glutaminsäure- Anhydrids oder eines höheren Homologen an dem 4-C-Hydroxyl des 4-0-Desacetylvinblastin oder des 4-0-Desacetyldesoxyvinblastin oder eines der Derivate, wie das 4-O-Desacetyldesoxyvinblastin-3-carboxamid oder das 4-0-Desacetyldesoxyvinblastin-3-carboxamid hergestellt.

Die so erhaltenen Hemiaspartat- oder Hemiglutamatderivate oder höhere Homologue werden nun mit dem Protein, dem Proteinfragment in einem Lösungsmittel, in welchem diese Verbindungen löslich sind, kondensiert. Zu diesem Zweck kann man eine Mischung von Wasser und Dioxan verwenden, die mit Hilfe eines Puffers, beispielsweise eines Borat-Puffers, auf einem entsprechenden pH-Wert gehalten wird. Eine Bestätigung der Kondensation erfolgt durch Chromatographie oder Elektrophorese. In diesem letztgenannten Fall kann man radioaktives Vinblastin (beispielsweise tritiiert) zur Erleichterung der

Kennzeichnung verwenden.

Vom chemischen Standpunkt aus läßt sich die Kondensation mit den Proteinen durch die Gewinnung kovalenter Bindungen erklären, die durch die Reaktion der Aminogruppen des Proteinlysins mit der aktivierten Estergruppe des Hemiaspartat-oder

Hemiglutamatderivats entstehen.

Das Albumin aus Rinderserum weist beispielsweise 56 aminierte Lysinreste auf. Die Anzahl der Vinblastinmoleküle pro Protein variiert in Abhängigkeit von den Arbeitsbedingungen, wird im allgemeinen jedoch zwischen 1 und 34 liegen.

Die Aktivierung kann in klassischer Weise durch Behandlung mit einem Alkylchloroformiat, vorzugsweise mit Äthyl- oder Isobutyl-Chloroformiat, in Gegenwart einer Aminobase, wie dem N-Methyl-Piperidin oder dem N-Methyl- Morpholin

vorgenommen werden.

Die Kondensation kann mit der das aktivierte Anhydrid enthaltenden Reaktionsmischung in situ vorgenommen werden. In den meisten Fällen kann das aktivierte Anhydrid jedoch auch isoliert werden.

Die erhaltene konjugierte Verbindung wird auf klassische Weise, wie es in der Chemie oder im Fall konjugierter Proteinverbindungen in der Biochemie üblich ist, isoliert. Die konjugierte Proteinverbindung wird dabei durch Zusatz von Aceton aus dem Reaktionsmedium ausgefällt, dann zentrifugiert, gewaschen, lyophilisiert und durch Gelfiltration gereinigt.

Gegebenenfalls kann man das so erhaltene Derivat einer klassischen Succinylierungsreaktion unterwerfen, wodurch Aggregationsprobleme, die für bestimmte konjugierte oder nicht konjugierte Proteine charakteristisch sind, vermieden

werden.

Die vorteilhafterweise verwendeten Proteine sind insbesondere das Albumin aus Rinderserum oder Humanserum, das Fötuin oder Immunoglobuline, wobei diese letzteren gegebenenfalls durch das Verfahren der monoclonalen Antikörper gewonnen

werden.

In diesem letztgenannten Fall hat sich die Verwendung monoclonaler Antikörper menschlichen Ursprungs, die eine bestimmte Wirkung gegenüber menschlichen Tumoren zeigen, als besonders interessant erwiesen.

Die verwendeten Proteine können auch im Hinblick auf eine selektive Modifizierung behandelt werden. Diese Modifizierungen gestatten die Gewinnung konjugierter Proteinverbindungen, die bei ihrer therapeutischen Verwendung bevorzugt im Bereich bestimmter Gewebe, beispielsweise im Bereich der Leber, angereichert werden. So ist es möglich, vor der Kondensation des Vinblastinderivats mit dem Protein dieses letztere zugalaktosylieren. Die Galaktosylierung wird beispielsweise durch Anwendung der von G.Wilson in The Journal of Biochemistry, 253 (7) 2070-2072,1978 beschriebenen Methode vorgenommen.

Die mit diesen erfindungsgemäßen Verbindungen vorgenommen in-vitro-Versuche zur Aufzeigung ihrer Antitumorwirkung deuten darauf hin, daß die Bildung der konjugierten Verbindung über die C-4-Bindung über C-3 erfolgt.

Gemäß einer Variante, kann ebenfalls eine Verbindung der Art-A-R₁, wobei A und Ri die vorher angegebenen Bedeutungen haben, in einem geeigneten Lösungsmittel auf das 4-C-Hydroxyl des 4-O-Desacetylvinblastin oder des 4-O-Desacetyldesoxyvinblastin oder eines der Derivate, wie das 4-O-Desacetylvinblastin-3-carboxamid oder das 4-O-Desacetyldesoxyvinblastin-3-carboxamid, kondensiert werden.

Die Aktivierung entsteht vorteilhafterweise durch die Einwirkung eines Alkylchloroformiats wie das Ethylchloroformiat oder das Isobutylchloroformiat, in Gegenwart einer Aminobase, wie das N-methyl-piperidin oder das N-methyl-morpholin oder das Triethylamin.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben einige konjugierte Verbindungen gemäß der Erfindung, wobei die bis-lndol-Derivate in der 4-C-Position mit einem Proteinfragment, über eine Brücke der Art substituiertes Hemiaspartat oder substituiertes Hemiglutamat, gekuppelt sind.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Verbindungen besitzen äußerst interessante Antitumor-Eigenschaften und können in der Humantherapie eingesetzt werden. Diese Vinblastin-Derivate können insbesondere für die Behandlung von Leukämien, Gliomen, Lymphosarkomen und anderen bösartigen Tumoren, darunter auch den sogenannten „festen" Tumoren, verwendet werden.

In der Humantherapie werden sie daher zur Behandlung des Morbus Hodgkin und anderer Tumore, für die eine Behandlung mit Vinblastin, Vincristin oder Vindesin vorgesehen ist, verwendet.

Für ihre therapeutische Anwendung werden die. erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls in lyophilisierter Form vorzugsweise auf parenterale Weise, in einem pharmazeutisch anwendbaren Lösungsmittel gelöst, verabreicht. Unter den Additionssalzen bevorzugt man nicht-toxische, pharmazeutisch anwendbare Salze, wie die Salze von Mineralsäuren, z. B. der Salz-, Phosphor- und Schwefelsäure oder von organischen Säuren, wie der Essig-, Propion-, Bernstein-, Wein-, Oxal-, Methansulfon- oder Benzolsulfonsäure. Physiologische Kochsalzlösung oder andere beispielsweise mit einem Phosphat gepufferte Salzlösungen sind geeignete Lösungsmittel.

Der Wirkstoff wird normalerweise in einer Dosierung verabreicht, die von 50 mg bis zu mehreren Gramm variieren kann. Diese Verbindungen können außerdem in Kombination mit anderen Antitumormitteln verwendet werden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

a) a-und /3-lsomeren des VBL^-O-Desacetyl^-O-L-N-acetyl-hemiasparaginsäureester

Zu einer Lösung von 700 mg (0,91 mmol)4-O-desacetyl-vinblastin in 20 ml wasserfreies Dichlormethan, werden 250 mg N-acetyl-L-asparaginsäureanhydrid zugesetzt.

Die Lösung wird 20 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Vakuumdestillation des Lösungsmittels, wird der erhaltene Rückstand durch Chromatographie auf einer Siliziumdioxid-Kolonne gereinigt (Laufmittel Äther/Methanol/NH₄OH zu 25,% 60/49,75/0,25).

Nach Trockenmahlung in einem Petroläther/Dichlormethan-Gemisch, werden 650mg der obengenannten Verbindung, in der Form eines weißen Pulvers, erhalten, (rdt: 77%).

Die Produktanalyse durch HPLC (Chromatographie in flüssiger Phase mit hoher Leistung) deutet auf die Anwesenheit der beiden Isomeren α und ß, im Verhältnis 85/15.

* IR-Spektrum (KBr): 3420, 2960, 2880,1 737,1 660,1 613,1501,1460,1430crrT¹.

* Massenspektrum : DCI (Isobutan) : 925 (M⁺), 939 (M⁺ + 14), 857, 769, 693, 635.

b) a- und /3-lsomeren des Methylesters der VBL-4-O-L-N-acetyl-hemiasparaginsäure

Eine Lösung von 500mg (0,540 mmoles) der α- und /3-lsomeren des VBL-4-N-acetyl-L-hemiasparaginsäureesters in 10 ml absoluten Methanols, das durch trockenes HCI gesättigt ist, wird während 20 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach Abdestillierung des Lösungsmittels unter Vakuum, wird der Rückstand in einem Gemisch von 15 ml distilliertem Wasser' und 15 ml Dichlormethan aufgenommen. Das Gemisch wird durch NH₄OH-Zusatzalkalinisiert. Die wäßerige Phase wird mit 3 Teilen von 20 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, hintereinander mit 40 ml Wasser und 40 ml einer wäßerigen, mit NaCI gesättigten Lösung gewaschen, auf Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Siliziumdioxyd gereinigt (Eluierung durch CH₂CI₂:CH₃OH

95:5). -

In der Weise werden 410 mg der α- und /3-lsomere der obengenannten Verbindung erhalten.

Durch Chromotographie erhaltene Anteile der verschiedenen getrennten Isomere sind analysiert worden.

— Hauptisomer:

* Massenspektrum (DCI, Isobutan): 939 (M⁺), 940 (M⁺ + 1), 953(M⁺+ 14).

* IR-Spektrum (KBr): 2950, 2880,1740,1675,1615,1503Cm"¹ ' '

* NMR-Spektrum (CDCI₃,360 MHz) δ : 9,65 (OH), 8,02 (NH), 7,52 (H-9'), 7,16-7,05 (H-10', H-11', H-12'), 6,61 (H-9), 6,52 (NH), 6,07

* (H-12), 5,75 (H-14), 5,52 (H-17), 5,17 (H-15), 4,75 (-CH-NH), 3,95 (H-17A'), 3,80 (-0Me), 3,77 (-0Me), 3,70 (-0Me), 3,60 (-0Me), 2,80 (H-21A', H-12B'), 2,67 (NMe), 2,62 (H-21), 2,00 (MeCO), 0,92-0,75 (2Me)

* Rf : 0,51 (CH₂CI₂^H₃OH 90:10 Siliziumdioxyd).

— Nebenisomer:

* Massenspektrum (DCI-lsobutan) : 939 (M⁺), 940 (M⁺ + 1).

* IR-Spektmm (KBr) : 1 740, 1 675,1 615cm-¹.

* NMR-Spektrum (CDCI₃,360 MHz) δ : 9,25 (OH), 8,02 (NH), 7,50 (H-9'), 7,16-7,05 (H-10', H-11/, H-1 T), 6,57 (H-9), 6,52 (NH), 6,08 (H-12), 5,82 (H-14), 5,47 (H-17), 5,28 (H-15), 4,75 (CH-NHAc), 3,93 (H-17A'), 3,77 (2 x OMe), 3,70 (OMe), 3,60 (OMe), 2,70 (N-Me), 2,02 (MeCO-), 0,95-0,77 (2 Me). .

*. Rf:0,39(CH₂CI₂:CH₃OH 90:10 Siliziumdioxyd).

Beispiel 2

a- und /3-lsomeren des VBL^-O-desacetyM-O-L-N-carboxybenzyloxyglutaminsäureesters Eine Lösung von 4-0-deacetylvinblastin (300mg, 0,39mmol) und N-carbobenzyloxy-L-glutaminsäureanhydrid (144mg, 0,519mmol) in Dichlormethan (5ml) wird während 20 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt.

Das Lösungsmittel wird unter Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wird chromatographisch auf einer Siliziumdioxyd-Kolonne (Eluierung:Äther/Methanol/NH₄OH 25% 50/49,5/0,5) gereinigt. Auf diese Weisen werden 230 mg des oben genannten Produktes in Form eines a- und y-lsomeren-Gemischs erhalten

Die HPLC-Analyse des Produktes zeigt die Anwesenheit der a- und y-lsomeren im Verhältnis von 60 zu 40.

* IR-Spektrum (KBr) : 3450, 2960, 2880,1 730,1 612,1 593,1 501,1459,1 432,1 228cm"¹.

* Massenspektrum (DCI-isobutan): 1032 (M⁺ +11,984,928,723Cm;¹

Beispiel 3

Kupplung des VBL^-O-Desacetyl^-O-L-N-acetylhemiasparaginsäureesters mit galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum

a) 80,6mg VBL-4-O-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiäsparaginsäureester werden in 2ml Dioxan gelöst, die Lösung wird dann in ein Eisbad getaucht. Anschließend werden 24,4/xl Triäthylamin in 0,5ml Dioxan und 22,6μΙ Isobutylchloroformiat in 0,5ml Dioxan zugesetzt. Es wird während einer Stunde gerührt. Andererseits wird eine Lösung von 200 mg galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum in 37 ml Wasser zubereitet. Der pH-Wert wird mit Natronlauge IN auf 8,5 eingestellt.

Die Lösung wird auf 4⁰C abgekühlt. Nach 1 Stunde, wird der aktivierte Ester zur Lösung von galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum hinzugefügt. Die Lösung wird während 14 Stunden bei 4⁰C gerührt, während der pH-Wert auf 8,5 durch IN-Natronlauge-Zusatz gehalten wird. Die Lösung wird durch Filtration auf Gel Sephadex G 25 gereinigt, das durch eine Lösung von NaCI 9/1 000, pH-Wert 7,5, auf Gleichgewicht gehalten wird. Die die konjugierte Verbindung enthaltenden Anteile werden vereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert. Der Gehalt an Proteinen wird durch die Lowry-Methode gemessen und der Gehalt an Alkaloiden wird durch Radioaktivitätsmessung bestimmt.

Die so erhaltene konjugierte Verbindung enthält 13 Mole Vinblastin pro galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum. Die Bestimmung der Zusammensetzung der konjugierten Verbindung aus Monomeren, Dimeren und Polymeren, durch HPLC, ergibt 82% Monomeren und 16% Dimeren.

b) 80,6mg VBL^-O-desacetyl^-O-L-N-acetylhemiasparaginsäureester werden in 2ml Dioxan gelöst. Die Lösung wird dann in ein Eisbad getaucht. Anschließend werden 24,4μ.Ι Isobutylchloroformiat in 0,5ml Dioxan hinzugesetzt.

Andererseits wird eine Lösung von 200 mg galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum in 37 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH-Wert = 8,2, zubereitet. Der pH-Wert wird durch IN Natronlauge auf 8,5 eingestellt.

Die Lösung wird auf 4°C abgekühlt. Nach 1 Stunde wird der aktivierte Ester der Lösung von galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum zugesetzt. Die Lösung wird während 14 Stunden bei 4⁰C gerührt, während der pH-Wert durch I N-Natronlauge-Zusatzauf 8,5 gehalten wird. Die Lösung wird durch Filtration auf Gel Sephadex G25 gereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert. Der Gehalt an Proteinen wird durch die Lowry-Methode gemessen und der Gehalt an Alkaloiden wird durch die

Messung der Radioaktivität bestimmt. .

Die erhaltene konjugierte Verbindung enthält 9,3 Mol Vinblastin pro Mol galaktosyliertem Albumin aus Menschenserum. Die Bestimmung der Zusammensetzung der konjugierten Verbindung aus Monomeren, Dimeren und Polymeren, durch HPLC, zeigt 91,5% Monomeren, 7% Dimeren und 1,5% Polymeren.

Die Empfindlichkeit der konjugierten Verbindung aus dem Beispiel gegenüber lysosomialen Enzymen, ist durch Inkubation dieser konjugierten Verbindung, während 48 Stunden bei 37°C, in Gegenwart von 5mM Cystein, 4OmM Acetatpufferund lysosomialen Enzymen. Im Laufe der Zeit, werden Aliquoten entnommen und die nicht zerfallenen Proteine werden durch Trichloressigsäure-Zusatz (40%ig) ausgefällt. Nach einstündiger Inkubation der Proben bei 4⁰C, werden diese zentrifugiert und die Radioaktivität des oben Schwimmenden wird durch die Zählung der Szintillationen eines Aliquoten bestimmt.

Die lösliche Radioaktivität ist ein Maß der Zersetzung der konjugierten Verbindung. Der Versucht zeigt, daß 75% der konjugierten Verbindung nach 24 Stunden zersetzt sind. Bis 48 Stunden wird keine weitere Entwicklung festgestellt.

Die chemotherapeutische Wirkung der konjugierten Verbindung nach dem Beispiel ist durch Versuche auf Leukämie P338, die bei weiblichen BDF₁-Mäusen auf intraperitoneale Weise implantiert worden ist, getestet worden = 10⁶ Tumorzellen werden auf intraperitoneale Weise am Tage 0 verabreicht. Die konjugierte Verbindung wird auf intraperitoneale Weise am Tage 1 verabreicht. Die Resultate zeigen, daß die konjugierten Verbindungen eine sehr hohe Wirkung auf dieses Versuchsmodell aufweisen, da sie zu einer Zunahme der Überlebenszeit von mehr als 650% führen, wenn sie in einer Dosis von 60 mg/kg verabreicht werden; die Anzahl Überlebende am Tage 60 ist 5/5.

Beispiel 4

a- und γ-lsomeren des Äthylesters der N-(4-O-deacatyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vinblastinoyl-23)-L-tryptophansäure.

Nach der Methode von Beispiel 1 ist der Äthylester der N-(deacetyl-0-4-vinblastinoyl-23)-L-tryptophansäure in Äthylester des N-(4-0-deacetyl-4-0-N-acetyl-hemiaspartat-vinblastinoyl-23)-tryptophansäure (Gemisch aus α- und γ-lsomeren) umgesetzt worden.

Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie auf Siliziumdioxyd (Eluierung-Äther/Methanol/NH₄OH zu 25% = 50/ 49,75/0,25) gereinigt. Es werden 200mg des obengenannten Produktes aus 314mg Ausgangsprodukt erhalten.

* Massenspektrum: (DCI, Acetone) : 1126 (M⁺¹), 1 066, 984,970,951,911.

* IR-Spektrum: (KBr) : 3400, 2960, 2940,1 740m 1 665,1 618cm"¹

Beispiel 5

α- und /3-lsomeren des Äthylesters der N-K-O-desacetyM-O-L-N-acetyl-hemiaspartet-vinblastinoyl^SJ-L-isoleucinsäure. Nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, ist Äthylester der N-ideacetyl-CM-vinblastinoyl^SJ-L-isoleucinsäure in Äthylester der N-(4-0-deacetyl-4-0-L-N-acetyl-hemiaspartet-vinblastinoyl-23)-L-isoleucinsäure umgesetzt worden.

* Massespektrum: (DCI-acetone): 1051 (M⁺), 1036,1009, 977, 897, 838, 755,709, 652.

* IR-Spektrum (KBr): 3410, 2963, 2929, 2880,1 734,1 676,1 612,1 500,1460,1430,1 372,1 333,1 293cm"¹.

Beispiel 6

α- und γ-lsomeren des 4-O-Deacetyl-4-O-L-N-acetylhemiglutamat-vinblastin.

Nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren, ist 4-O-Deacetylvinblastin mit N-acetyl-L-glutaminsäure-anhydrid behandelt worden, um 271 mg CM-Deactetyl^-O-L-N-acetyl-hemiglutamat-vinblastin (a-undy-lsomerengemisch) aus 380mg O-4-Deacetylvinblastin herzustellen.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung konjugierter Verbindungen von Vinblastin oder Derivaten des Vinblastins mit Proteinen oder Proteinfragmenten nach der Formel₍

O - A - R.

in welcher A eine „Brücke" wie

NH-R - COCH-(

)_nCO -

oder

NH-R - CO-(CH₂J_n-CH-

darstellt, wobei η von 1 bis 5 variiert und R ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe wie Acetyl, Trifluoracetyl oder Carbobenzyloxy bedeutet, Ri einen gegebenenfalls modifizierten Proteinrest bedeutet, R₂ für eine Methoxygruppe, eine Aminogruppe oder einen alpha-Aminosäurerest steht, der durch eine Aminobindung gebunden ist und dessen Estergruppe 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält, und R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet, welche jeweils in den beiden Konfigurationen vorliegen können, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Säureanhydrid wie

NH-R I - HOOC-CH-(CH₂J_n

auf die Hydroxylgruppe in C-4des Vinblastins oder eines Derivaten des Vinblastins kondensiert, und anschließend das so erhaltene Derivat mit dem Proteinrest kondensiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteinrest vom Albumin aus Menschenserum oder Rinderserum, vom Fötuin oder von Immunoglobulinen, die gegebenenfalls durch monoclonale Antikörper, vorzugsweise monoclonale Anitkörper menschlichen Ursprungs, vorzugsweise galaktosyliert, abgeleitet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß für die Kondensierung eines Säureanhydrids wie

NH-R
t

- HOOC-CH-(CH₂)_n-C00H -

auf die Hydroxylgruppe in C-4 des VinblastPns oder eines Derivaten des Vinblastins, ein Lösungsmittel benutzt wird, das im wesentlichen aus Dichlormethan besteht, und daß für die Kondensierung des so erhaltenen Produkts mit dem Protein rest ein Lösungsmittel benutzt wird, das im wesentlichen aus einem Gemisch von Wasser und Dioxan besteht.