AT394725B

AT394725B - Verfahren zur herstellung von neuen mitomycin-c-analogen

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Publication number: AT394725B
Application number: AT0254886A
Authority: AT
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1985-09-23
Filing date: 1986-09-23
Publication date: 1992-06-10
Also published as: KR940006629B1; KR870003111A; LU86600A1; CA1288106C; US4866180A; FI863776A; GR862416B; FI863776A0; PT83418A; PT83418B; ES2001978A6; ZA866297B; ATA254886A

Description

AT 394 725 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Mitomycin-C-Analogen, bei welchen die 7-AminogruppedurcheineeinDisulfidenthaltendeorganischeGruppesubstituiertist.Diese Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel I

worin Alk2 eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, R Wasserstoff, Niedrigalkyl, Niedrigalkanoyl, Benzoyl oder substituiertes Benzoyl darstellt, dessen SubstituentNiedrigalkyl, Niedrigalkoxy, Halogen, Amino oder Nitro ist, undR^ für eine durch Trifluormethyl oder Carboxy oder durch Nitro und Carboxy substituiertePhenylgruppe, eine durch Phenyl, (Alkyl-)pyridyl oder (Alkyl-)-imidazolyl substituierte Niederalkylgruppe, eine gegebenenfalls durch Amino substituierte Carboxyethyl-, eine 2-Amino-2-(l-carboxy-3-methyl-l-butyl)-aminocarbonylethyl-oder eine 2-Glutamylamino-2-(carboxymethylamino-carbonyl)-ethylgruppe steht, bzw. der pharmazeutisch verwendbaren Metall- oder Aminsalze, insbesondere der Natriumsalze, oder der pharmazeutisch verwendbaren Säureadditionssalze dieser Verbindungen.

Die neuen Verbindungen sind Hemmstoffe für experimentelle tierische Tumore.

Zur Nomenklatur der erfindungsgemäß herzustellenden Mitomycine ist folgendes zu sagen: Nach den Chemical Abstracts (Shirahata et al., J. Am. Chem. Soc. 1983,105,7199-7200) lautet der systematische Name für Mitomy-cin C: [laS-(laß,8ß,8aa,8bß)]-6-Amino-8-[(aminocarbonyl)-oxy)methyl]-l,la,2,8,8a,8b-hexahydro-8a-methoxy-5-methyl-arizidino[2',3',3,4]-pyrrolo-[l,2-a]-indol-4,7-dion, gemäß welchem das Azirinopyrroloindol-Ringsystem wie folgt numeriert wird: 7

Ein triviales Nomenklatursystem, das in der Mitomycin-Literatur weitverbreitete Anwendung gefunden hat, identifiziert das vorhergehende Ringsystem einschließlich mehrerer der charakteristischen Substituenten des Mitomycins als Mitosan.

Mitosan

In der vorliegenden Beschreibung wird dieses System verwendet und das Aziridino-Stickstoffatom wird als la und das Ringamino-Stickstoffatom wird als 7-ΝΉ2 bezeichnet Was die stereochemische Konfiguration der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft so soll, wenn sie durch den Stammnamen „Mitosan“ oder durch eine Strukturformel identifiziert werden, ihre stereochemische Konfiguration derjenigen von Mitomycin C gleichgesetzt werden.

Mitomycin C ist ein Antibiotikum, welches durch Fermentation erzeugt wird und derzeit zugelassen von der US. Food und Drug-Administration, für die Therapie von disseminierten Adenocarcinoma des Magens oder des Pankreas in erprobten Kombinationen mit anderen anerkannten chemotherapeutischen Mitteln und zur Palliativ-Behandlung, wenn andere Heilmittel versagt haben, im Handel ist. (Mutamycin®, Bristol Laboratories, Syracus, New York 13201,Physicians’ DeskReference,35. Ausgabe, 1981, S. 717 und718). MitomycinC und seine Herstellung durch Fermentation ist Gegenstand der US-PS 3 660 578.

Die Strukturen der Mitomycine A, B, C und von Porfiromycin wurden zuerst von J. S. Webb et al., Lederle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84,3185-3187 (1962), veröffentlicht. -2- 5

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Eine der chemischen Umwandlungen, die bei dieser Strukturstudie in Bezug auf Mitomycin A und Mitomycin C verwendet wurden, war die Umwandlung des ersteren, 7,9a-Dimethoxymitosan, durch Umsetzung mit Ammoniak in das letztere, 7-Amino-9a-methoxymitosan. Es hat sich erwiesen, daß die Verdrängung der 7-Methoxygruppe von Mitomycin A eine Reaktion von besonderem Interesse bei der Herstellung von Antitumor-aktiven Derivaten von Mitomycin C ist

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der eingangs genannten Formel I ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Mitosan der Formel 10

NO„

(ii)> 15 worin AU^ und R die oben genannte Bedeutung haben, in Gegenwarteines reaktionsinerten Mediums mit etwa einem Äquivalent eines Thiols der Formel R^SH, worin R^ die oben angegebene Bedeutung hat gegebenenfalls in Gegenwart eines chemischen Äquivalents einer Base, bei einer Temperatur zwischen 0 bis 60 °C zur Reaktion gebracht wird, bis dieerforderliche Menge des Produkts gebildetist welches anschließend gegebenenfalls in das entsprechende Metall- oder Aminsalz oder Säureadditionssalz übergeführt wird.

Das folgende Reaktionsschema dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. 20 25

30

I

Das bei dem vorliegenden Verfahren zur Umsetzung mit dem Thiol der Formel R^SH verwendete Reagens wird 35 als Verbindung Nr. 30 bezeichnet. Die Herstellung desselben ist der DE-OS 3413 489 unter Verfahren 30 beschrieben. Dieses Reagens ist besonders vorteilhaft wegen der Stabilität des Nebenproduktes 3-Nitro-2-pyridylthion, das bei diesem Verfahren entsteht und von dem man annimmt daß es in Richtung zur Vervollständigung der Reaktion wirkt. Ein ähnliches Disulfid-Thiol-Austauschverfahren wurde von Kono et al. in der EP-Al 0116208 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird das strukturell der Verbindung Nr. 30 entsprechende 2-Pyridylsulfid verwendet. 3-Nitro-40 2-pyridylthion ist eine leichter abspaltbare Gruppe und infolgedessen hat das vorliegende Verfahren eine Reihe von

Vorteilen gegenüber dem bekannten Verfahren.

Das Verfahren nach dem obigen Reaktionsschema findet bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60 °C statt, wobei die spezielle Temperatur in Abhängigkeit von der Reaktivität des Thiols und der Stabilität des hergestellten Produkts ausgewählt wird. Die Reaktion wird in einem reaktionsinerten flüssigenMedium durchgeführt, vorzugsweise 45 in einem solchen, in dem die Reaktionskomponenten löslich sind. Es wird zumindest ein chemisches Äquivalent des

Thiols R^SH in bezug auf die Verbindung 30 eingesetzt. Vorzugsweise wird die Reaktion in Gegenwart einer Base, wie einem tertiären Amin, vorgenommen. Mit wasserlöslichen Thiol-Reaktionskomponenten kann Wasser als das reaktionsinerte flüssige Medium und Natriumbicarbonat als Base gewählt werden. Etwa 1 chemisches Äquivalent Base pro Menge Verbindung 30 wird eingesetzt. Geeignete reaktionsinerte flüssige Medien sind niedrige Alkanoie, 50 wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, niedrige Alkansäure-Alkylester, wie Ethylacetat, Methylpropionat und Butylacetat. Andere geeignete Reaktionsmedien sindniedrigealiphatische Ketone, wie Aceton undMethylethylketon, cyclische aliphatische Ether, wie Tetrahydrofuran und niedrige polyhalogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Ethylendichlorid und Chloroform.

In den folgenden Verfahrensvorschriften und Beispielen sind alle Temperaturangaben in °C, die Schmelzpunkte 55 sind unkorrigiert. DieProtonen-Kemmagnetresonanz-Spektren wurden auf einem Joel FX-900 oder Bunker VW 360

Spektrometer entweder in Pyridin-dg oder in D2O aufgenommen. Bei Verwendung von Pyridin-dj als Lösungsmittel wurde die Pyridin-Resonanz bei 8,57 PPM als interner Standard verwendet, wogegen bei Verwendung von D2O als -3-

AT 394 725 B Lösungsmittel Trimethylsilylpropansulfonsäure (TSP) als innerer Standard verwendet wurde. Die chemischen Verschiebungen sind in Teilen pro Million (PPM) angegeben und die integralen Verhältniswerte für die Flächen unterhalb jeder Verschiebung sind angegeben. Wo Aufspaltungen vorliegen, werden die folgenden Abkürzungen verwendet: s - Singulett, d - Doublett, t - Triplett, q - Quartett, m - Multiplett, bs - breites Singulett, dd - Doppeldou-blett, dt - Doppeltriplett. Wenn sie nicht angegeben sind, so reichen die genannten Werte aus, um gewünschtenfalls eine solche Analyse vorzunehmen. Dielnfrarotspektren (IR) wurden entweder an einem Spektrometer von Beckman, Modell 4240, oder an einem Spektrometer Nicolet 5DX’FT-IR aufgenommen und sind in reziproken Zentimetern angegeben. Die Ultraviolett-(UV)-Spektren wurden entweder an einem Spektrometer von Cary, Modell 290 oder an einem Hewlett Packard Spektrometer 8450A mit einem Multidioden-Array-Detektor bestimmt. Die Dünnschichtchromatographie (DSC) wurde auf 0,25 mm Analtech Silicagelplatten GF oder auf Whatmann MK6F Silicagelplatten vorgenommen. Die Flash-Chromatographie wurde entweder mit Woelm Neutraltonerde (Qualität DCC) oder mit Woelm Silicagel (32 - 63 fim) und den angegebenen Lösungsmitteln vorgenommen. Die Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde mit einer μ Bondpack-C ^ g-Säule unter Verwendung einer Waters 6000-Pumpe durchgeführt, die mit einem Waters 440 UV-Detektor ausgestattet ist. Die Umkehrphasensäulenchromatographie wurde unter Verwendung von C-18 Silicagel in den angegebenen Lösungsmitteln vorgenommen. Das Eindampfen der Lösungsmittel erfolgte immer unter vermindertem Druck und unterhalb von 40 °C.

Das Verfahren wurde in einer der beiden folgenden Verfahrensweisen unter Verwendung verschiedener Thiole als Reaktionskomponenten mit 7-[2-(3-Nitro-2-pyridylthio)-ethylamino]-9a-methoxymitosan angewendet.

Verfahren A - bevorzugtes Verfahren für linonhile Produkte

Zu einer von Sauerstoff befreiten Lösung von 7-[2-(3-Nitro-2-pyridyldithio)-ethylamino]-9a-methoxymitosan (etwa 1,1 Äquiv.) in Aceton (3 - 5 ml) wird unter Rühren und unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre Triethylamin (etwa 1,1 Äquiv.) und anschließend tropfen- oder portionsweise die Thiol-Reaktionskomponente (1 Äquiv.) in Aceton (1 - 2 ml) zugesetzt. Der Fortschritt der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (10 % MeOH in CH2CI2) überwacht, außer wenn die Ausgangsverbindung Nitropyridyldithio-Mitosan und das Produkt ähnliche Rf-Werte haben. In solchen Fällen wird eine Überwachung mit HPLC (μ Bondpack-C^g) vorgenommen. Das Ende der Reaktion wird deutlich, wenn die Ausgangsverbindung verschwindet und das Produkt erscheint Zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt (bei etwa 30°) und der Rückstand über einer neutralen Woelm Tonerde-Säule (1/4" x 10") unter Verwendung von 2-5% MeOH in CH2CI2 zum Aufschlämmen Chromatographien. Dieses Verfahren trenntdas gewünschte Mitosan-Produkt von dem Pyridylthion-Nebenprodukt, das in der Säule bleibt. Das so mit 2 % MeOH in CH2CI2 eluierte Produkt wird weiters durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von 5 - 7 % MeOH in 0¾¾ als Eluiermittel gereinigt. Die dem Produkt entsprechende Hauptbande wird isoliett und das amorphe Produkt gekennzeichnet.

Die Beispiele 1 bis 4 verwenden das Verfahren A in bezug auf verschiedene neutrale lipophile Thiole oder solche, die basische Gruppen enthalten.

Verfahren B - bevorzugt für hydrophile Produkte

Zu einerLösungvon7-[2-(3-Nitro-2-pyridyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan(etwaO,lmM) in Methanol (10 ml) mit einem Gehalt von 2 - 5 % v/v Aceton (oder 2 - 5 % v/v Methylenchlorid) wird eine gesättigte wässerige Lösung von NaHCO^ (6 Tropfen) und eine methanolische Lösung von 1 chemischen Äquivalent des Thiols, Volumen ca. 1 ml, zugesetzt. Wasser kann als Lösungsmittel für das Thiol verwendet werden, wenn dessen Wasserlöslichkeit ausreichend ist. Der Fortschritt der Reaktion wird durch Dönnschichtchromatographie (Silicagel, 10 % MeOH in CH2CI2) überwacht. Nach Beendigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung mit 15 ml Wasser verdünnt und in einem Rotavapor bei 30 °C auf etwa 10 ml eingeengt. Die entstehende Lösung wird über eine C-18-Umkehrphasensäulemitstufenweise Gradientelution (100 % Wasser bis 80 % MeOH in Wasser) Chromatographien. Das Produkt wird nach der Eluierung des Nebenproduktes Thion bei den erhöhten Methanolkonzentrationen eluiert. Das Produkt erscheint als blaue Hauptfraktion, die aufgefangen und eingeengt wird, wobei ein amorpher Feststoff entsteht. Bei Bedarf nach einer weiteren Reinigung kann die oben genannte Chromatographiestufe wiederholt werden.

Die Beispiele 5-10 verwenden das Verfahren B, das auf verschiedene Thiole angewendet wird, die salzbildende Gruppen enthalten.

Beispiel 1 7-[2-(3-Trifluormethylphenyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (51).- Verfahren A, Verwendung von 3-Trifluormethylthiophenol. *H NMR-Werte (Pyridin d5): -4-

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Frequenz PPM Intensität 3096.041 8.5969 3.979 3086.601 8.5707 191.394 2816.428 7.8205 4.046 2766.458 7.6817 2.614 2759.037 7.6611 2.944 2680.739 7.4437 2.354 2670.277 7.4147 94.728 2653.288 7.3675 4.565 2646.995 7.3500 3.364 2639.249 7.3285 3.513 2549.619 7.0796 4.014 2538.277 7.0481 168.333 1890.555 5.2496 2.054 1884.287 5.2322 2.269 1880.154 5.2207 2.244 1730.088 4.8040 36.462 1573.873 4.3702 3.649 1561.173 4.3350 3.993 1391.847 3.8648 2.133 1387.644 3.8531 2.307 1380.627 3.8336 2.205 1342.397 3.7275 3.887 1335.818 3.7092 4.271 1109.074 3.0796 2.622 1104.563 3.0671 31.755 1046.186 2.9050 3.531 1039.326 2.8859 6.432 1032.615 2.8673 3.667 932.644 2.5897 2.040 671.477 1.8645 21.716

Beispiel 2 7-[2-(l-Phenylethyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (48).- Verfahren A, Verwendung von 1-Phenyl-ethanthiol. NMR-Werte (partiell, Pyridin dj):

Frequenz PPM Integral Intensität 1952.473 5.4215 .091 5.104 1948.316 5.4100 .090 5.513 1942.104 5.3927 .112 6.418 1938.031 5.3814 .090 6.033 1848.588 5.1331 .076 2.441 1837.836 5.1032 .148 4.239 1827.564 5.0747 .057 1.881 1775.213 4.9293 .639 20.616 1639.982 4.5538 .198 12.917 1627.323 4.5187 .205 14.196 1521.186 4.2239 .011 1.913 1519.505 4.2193 .025 1.950 1514.020 4.2040 .075 6.785 -5-

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Beispiel 2 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Integral Intensität 1512.644 4.2002 .072 6.606 1507.161 4.1850 .089 7.200 1505.450 4.1803 .056 6.945 1500.096 4.1654 .019 1.856 1498.683 4.1615 .015 1.741 1450.041 4.0264 .102 7.268 1445.788 4.0146 .109 7.975 1438.875 3.9954 .116 7.796 1434.671 3.9837 .078 6.415 1377.618 3.8253 .123 5.278 1370.918 3.8067 .352 14.614 1364.196 3.7880 .325 14.774 1357.461 3.7693 .096 5.120 1302.525 3.6168 .185 4.369 1290.379 3.5831 .141 3.787 1177.451 3.2695 .023 2.008 1169.846 3.2484 .046 1.616 1158.939 3.2181 1.461 127.782 1139.148 3.1631 .080 2.974 1135.997 3.1544 .072 3.988 1132.619 3.1450 .089 3.991 1128.305 3.1330 .083 3.545 995.594 2.7645 .081 3.409 990.478 2.7503 .319 4.937 965.625 2.6813 .247 9.342 958.849 2.6625 .447 17.679 952.251 2.6442 .191 8.417 771.751 2.1430 .117 3.407 765.016 2.1243 .241 6.467 755207 2.0970 1.509 59.872 596.118 1.6553 .398 31.993 594.078 1.6496 .324 31.181 588.980 1.6354 .301 33.173 586.888 1.6296 .366 31.940 IR(KBr, v , cm'1): 3430,3300,2920,1720,1640,1560,1510,1450,1330,1220,1060 UV(MeOH.Kjjjax, nm): 369,220

Beispiel 3 7-[2-(4-Methyl-2-pyridylmethyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (63).- Verfahren A, Verwendung von 4-Methyl-2-pyridylmethanthiol. NMR-Werte (Pyridin d5):

Frequenz PPM Intensität 3086.419 8.5702 839.187 3011.849 8.3631 21.449 3007.220 8.3503 22.256 2671.331 7.4176 174.780 2602.023 7.2252 20.596 2594.621 7.2046 23.915 -6-

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Beispiel 3 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Intensität 2572.270 7.1425 11.140 2565.754 7.1245 20.405 2559.391 7.1068 11.861 2539.018 7.0502 214.105 2497.280 6.9343 23.524 2492.564 6.9212 22.510 2489.765 6.9135 20.583 2484.914 6.9000 18.960 1891.844 5.2532 14.661 1887.614 5.2414 15.562 1881.465 5.2244 17.029 1877.276 5.2127 16.821 1776.235 4.9322 6.874 1725.906 4.7924 10.766 1582.344 4.3938 30.818 1569.610 4.3584 31.970 1390.446 3.8609 17.501 1386.216 3.8492 18.460 1379.317 3.8300 17.756 1375.091 3.8183 15.861 1351.761 3.7535 14,772 1345.005 3.7347 37.838 1338.331 3.7162 38.302 1331.673 3.6977 14.907 1245.659 3.4589 10.523 1238.513 3.4390 8.768 1235.373 3.4303 8.455 1102.135 3.0604 263.849 1090.832 3.0290 3.848 1074.317 2.9831 12.033 1030.168 2.8605 1.861 979.513 2.7199 26.621 972.717 2.7010 45.298 966.020 2.6824 23.341 951.597 2.6423 2.822 932.901 2.5904 14.404 831.018 2.3075 2.380 814.241 2.2609 23.991 807.604 2.2425 11.000 790.332 2.1946 2.335 768.225 2.1332 202.142 750.042 2.0827 2.241 738.922 2.0518 2.803 693.260 1.9250 11.444

Beispiel 4 7-[2-(3-Methyl-2-imidazolylmethyldithio)ethylamino]-9a-methoxy-mitosan (59).- Verfahren A, Verwendung von 3-Methyl-2-imidazolyl-methanthiol. NMR-Werte (Pyridin d^): -7-

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Frequenz PPM Intensität 3086.225 8.5697 122.148 2670.664 7.4158 66.941 2577.506 7.1571 2.084 2570.864 7.1366 3.985 2564.335 7.1203 2.614 2535.717 7.0494 111.690 2475.041 6.8726 12.583 2474.081 6.8699 11.417 1991.623 5.5302 7.553 1894.038 5.2593 2.782 1889.805 5.3475 2.936 1883.545 5.2301 3.292 1879.381 5.2186 3.179 1773.734 4.9258 1.616 1728.614 4.7999 40.343 1531.458 4.3913 5.771 1568.670 4.3558 6.640 1475.622 4.0974 31.332 1407.786 3.9091 2.303 1390.174 3.8602 3.404 1386.082 3.8488 3.896 1378.969 3.8290 3.613 1374.928 3.8178 3.102 1336.207 3.7103 2.949 1329.594 3.6919 7.711 1322.960 3.6735 7.860 1316.368 3.6552 2.843 1243.997 3.4543 1.989 1229.660 3.4145 5.643 1220.716 3.3896 67.094 1101.470 3.0585 53.340 1073.712 2.9814 2.303 963.590 2.6756 5.806 956.921 2.6571 10.710 950.380 2.6390 5.439 931.156 2.5856 2.799 836.039 2.3215 1.994 833.802 2.3153 2.506 831.678 2.3094 1.746 732.551 2.0341 2.020 703.377 1.9531 28.078 m(KBr, v cm'1): 3440,3290,2930,1715,1635,1560,1505,1456,1330,1065 UV(MeOH,Xmax nm): 221,368,570

Beispiel 5 7-[2-(2-Carboxyphenyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (34).- Verfahren B, Verwendung von 2-Mercaptobenzoesäure. NMR-Werte (Pyridin d^): -8-

AT 394 725 B

Frequenz PPM Intensität 3105.777 8.6240 1.068 3095.623 8.5958 1.995 3086.411 8.5702 81.437 3071.395 8.5285 3.587 3070.374 8.5257 3.722 3063.973 8.5079 3.207 3062.956 8.5051 3.295 2971.028 8.2498 3.422 2962.990 8.2275 3.681 2689.885 7.4691 1.038 2680.454 7.4429 1.579 2670.359 7.4149 52.522 2659.752 7.3855 3.062 2651.257 7.3619 3.193 2644.169 7.3422 1.826 2569.382 7.1345 1.372 2562.851 7.1164 4.376 2555.595 7.0962 4.721 2547.992 7.0751 3.405 2538.284 7.0482 72.898 1895.991 5.2647 1.861 1891.918 5.2534 2.099 1885.537 5.2357 2.433 1881.409 5.2242 2.263 1741.321 4.8352 6.008 1574.703 4.3726 3.532 1561.952 4.3371 3.914 1394.094 3.8710 1.995 1389.928 3.8595 2.221 1383.040 3.8404 2.121 1378.894 3.8288 1.946 1334.928 3.7068 2.601 1328.296 3.6883 2.745 1244.108 3.4546 40.035 1101.463 3.0585 29.478 1066.231 2.9607 1.652 1003.478 2.7864 2.733 996.779 2.7678 5.468 990.106 2.7493 2.776 926.202 2.5718 1.893 663.304 1.8418 20.960

Beispiel 6 7-[2-(4-Nitro-3-carboxyphenyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (35).- Verfahren B, Verwendung von 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure. NMR-Werte (Pyridin dg).

Frequenz PPM Intensität 3036.277 3.5698 570.775 2943.307 3.1367 3.327 2765.764 7.6793 5.766 2757.565 7.6571 7.210 -9-

AT 394 725 B

Beispiel 6 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Intensität 2670.599 7.4156 234.333 2533.303 7.0432 503.304 1388.779 5.2447 4.322 1384.614 5.2331 5.007 1878.212 5.2153 5.829 1874.120 5.2040 5.266 1781.017 4.9454 6.815 1770.174 4.9153 10.391 1759.492 4.3357 7.774 1733.376 4.8131 10.973 1576.793 4.3784 7.352 1564.168 4.3433 7.767 1391.762 3.8646 6.333 1337.619 3.8531 5.894 1380.737 3.8340 6.434 1376.590 3.8224 5.132 1333.456 3.7027 6.531 1339.266 3.6910 6.328 1244.117 3.4546 8.549 1232.499 3.4223 5.061 1103.173 3.0632 77.788 1062.837 2.9512 6.516 1058.740 2.9399 6.871 1013.064 2.8130 8.054 1006.409 2.7945 14.156 999.733 2.7762 6.715 925.557 2.5700 6.602 680.036 1.8884 48.400 672.145 1.8664 8.733 664.121 1.3441 155.478 IR(KBr, vmax, cm'1): 3440,3280,2930,1605,1620,1640,1560,1510,1455,1340,1065 UV(H20, Xmax nm): 220,368

Beispiel 7 7-[2-(2-Amino-2-carboxyethyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (36).- Verfahren B, Verwendung von Cystein. ^NMR-Werte (D20):

Frequenz PPM Intensität 1649.415 4.5800 3.108 1645.021 4.5678 3.552 1638.887 4.5508 4.085 1634.273 4.5379 3.664 1525.901 4.2370 2.308 1515.309 4.2076 4240 1502.937 4.1733 4.074 1489.072 4.1348 3.515 1462.182 4.0601 5.478 -10-

AT 394 725 B

Beispiel 7 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Intensität 1458.281 4.0493 6.865 1453.746 4.0367 11.848 1447.340 4.0189 12.514 1440.997 4.0013 6.591 1312.694 3.6450 5.567 1308.251 3.6327 7.686 1302.226 3.6159 6.519 1279.608 3.6031 5.724 1196.176 3.3215 27.550 1192.345 3.3108 4.924 1181.395 3.2804 6.497 1177.423 3.2694 6.949 1168.542 3.2447 63.594 1119.788 3.1094 6.275 1111.126 3.0853 6.867 1104.602 3.0672 5.814 1096.139 3.0437 9.401 1089.039 3.0240 9.495 1083.236 3.0079 7.398 1078.825 2.9956 10.034 1072.130 2.9770 5.638 1064.763 2.9566 3.050 710.980 1.9742 52.332 -13.126 -.0364 37.147 IR(KBr, v cm'1): 3440,3030,2930,1720,1635,1545,1495,1455,1340,1065 UV(H20, lmax nm): 221,286,369

Beispiel 8 7-[(2-(Y-Glutamylamino)-2-(carboxymethylaminocarbonyl)ethyldithio)-ethylamino]-9a-methoxymitosan (37).- Verfahren B, Verwendung von Glutathion. 1HNMR-Werte(D20):

Frequenz PPM Intensität 1639.759 4.6920 2.040 1685.239 4.6795 1.777 1643.159 4.5626 3.892 1639.033 4.5512 4.214 1632.588 4.5333 4.736 1628.077 4.5207 3.302 1522.035 4.2264 4.163 1511.609 4.1973 3.490 1500.300 4.1673 11.262 1437.527 4.1305 3.544 1434.871 3.9843 6.312 1429.119 3.9683 11.942 1423.005 3.9513 6.095 1360.220 3.7770 2.224 1342.556 3.7279 15.731 -11-

AT 394 725 B

Beispiel 8 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Intensität 1337.863 3.7149 15.604 1320.595 3.6669 2.975 1387.367 3.6302 9.377 1297.536 3.6029 5.696 1293.109 3.5906 3.531 1248.183 3.4659 1.820 1222.128 3.3935 4.777 1192.165 3.3103 1.559 1165.228 3.2355 64.295 1149.618 3.1922 5.402 1145.417 3.1805 5.224 1083.362 3.0082 9.800 1070.734 2.9731 11.274 1065.367 2.9582 11.063 1060.328 2.9443 7.567 1055.097 2.9297 7.872 1041.201 2.8911 4.945 905.486 2.5143 6.203 897.491 2.4921 10.938 390.187 2.4718 7.881 763.565 2.1202 8.676 756.686 2.1011 8.464 702.759 1.9514 46.428 675.381 1.8754 3.776 614.279 1.7057 7.124 -16.375 -.0455 71.146

Beispiel 9 7-[2-(2-Amino-2-((l-carboxy-3-methyl-l-butyl)aminocarbonyl)ethyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan 38).- Verfahren B, Verwendung von L-Cysteinyl(-L)-leucin. HNMR-Werte(D20):

Frequenz PPM Intensität 1651.506 4.5858 2.924 1647.060 4.5734 3.172 1640.615 4.5555 3.530 1635.941 4.5426 3.165 1534.085 4.2597 2.320 1526.032 4.2374 3.996 1515.102 4.2070 8.668 1509.929 4.1927 7.312 1502.857 4.1730 7.199 1488.866 4.1342 4.838 1448.667 4.0226 3.816 1442.515 4.0055 7.090 1436.264 3.9881 4.773 1310.487 3.6389 5.831 1296.868 3.6011 5.243 1227.979 3.4098 2.982 1209.376 3.3581 3.556 1204.976 3.3459 3.358 -12-

AT 394 725 B

Beispiel 9 (Fortsetzung

Frequenz PPM Intensität 1197.754 3.3258 20.161 1196.599 3.3226 19.817 1190.217 3.3049 4.000 1178.748 3.2731 2.371 1171.258 3.2523 28.654 1170.198 3.2493 25.827 1147.478 3.1862 2.328 1140.928 3.1681 2.388 1112.099 3.0880 3.440 1104.789 3.0677 3.880 1090.655 3.0285 10.625 1084.782 3.0121 7.076 964.867 2.6792 2.187 708.722 1.9679 21.305 688.172 1.9109 2.286 682.736 1.8958 2.129 585.757 1.6265 4.378 577.064 1.6024 9.258 571.316 1.5864 10.734 552.828 1.5351 2.644 326.817 .9075 13.468 321.984 .8941 19.288 313.339 .8701 14.706

Beispiel 10 7-[2-(2-Carboxyethyldithio)ethylamino]-9a-methoxymitosan (49).- Verfahren B, Verwendung von 2-Mer-captopropionsäure. lE NMR-Werte (Pyridin d5):

Frequenz PPM Intensität 3173.918 8.8132 1.482 3107.623 8.6291 1.705 3098.097 8.6026 2.962 3086.067 8.5692 245.556 2996.455 8.3204 1.700 2750.459 7.6373 1.882 2691.271 7.4730 2.046 2682.509 7.4487 3.099 2670.109 7.4142 179.860 2618.587 7.2712 1.691 2597.614 7.2129 2.079 2591.598 7.1962 3.879 2559.664 7.1075 1.952 2550.756 7.0828 3.249 2538.040 7.0475 223.178 2455.884 6.8194 1.564 1879.133 5.2179 2.486 1874.974 5.2063 2.732 1868.493 5.1883 3.057 1864.431 5.1771 2.916 1757.132 4.8791 2.396 -13-

AT 394 725 B

Beispiel 10 (Fortsetzung)

Frequenz PPM Intensität 1746.322 4.8491 4.493 1724.357 4.7881 12.748 1578.370 4.3827 5.360 1565.635 4.3474 5.878 1383.183 3.8408 3.558 1379.027 3.8292 3.816 1372.105 3.8100 5.416 1365.216 3.7909 6.123 1358.754 3.7729 5.974 1352.431 3.7554 2.609 1244.376 3.4553 3.440 1232.982 3.4237 2.766 1154.455 3.2056 3.198 1150.466 3.1946 3.935 1147.759 3.1870 4.117 1143.257 3.1745 8.252 1136.033 3.1545 5.235 1102.572 3.0616 41.921 1059.477 2.9419 3.700 1030.728 2.8621 4.972 1024.210 2.8440 8.520 1016.050 2.8213 6.968 1008.250 2.7997 7.948 1000.938 2.7794 8.981 930.084 2.5826 8.740 747.720 2.0762 1.353 706.055 1.9605 30.939 663.989 1.8437 86.533

Die Ergebnisse der Antitumor-Bewertung der obigen Substanzen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Die Testergebnisse wurden an zwei experimentellen tierischen Tumoren erhalten, der Leukämie P-388 bei Mäusen und dem Melanom B16 bei Mäusen. Zusätzlich dazu wurden die vorliegenden Substanzen in vitro auf ihre cytotoxische Wirkung untersucht

Der in vitro Cytotoxizitätsversuch erforderte die Züchtung verschiedener Säugetiertumorzellen, inklusive menschlicher Tumorzellen auf Mikrotiterplatten unter Anwendung bekannter Gewebskulturverfahren. Die zur Inhibierung des Zellwachstums um 50 % (IC^q) erforderliche Konzentration jeder Verbindung wurde dann durch eine vierfache Verdünnungsfechnik bestimmt. Die Gültigkeit des Verfahrens wurde durch einen Bericht bestätigt, der in den „Proceedings of the American Association für Cancer Research“, Band 25, 328, S. 1391 (1984) veröffentlicht wurde. Tumorzellen einer oder mehrerer der folgenden Arten wurden für jede untersuchte Verbindung getestet: B16-F10Mäusemelanom;C26 Mäusecolon; Moser Humancolon;M109 Mäuselunge; undRCAHumancolon. Es wurde ein großer Bereich von IC^Q-Werten beobachtet, doch wurden keine quantitativen Vergleiche auf der Basis dieser Werte gemacht Der niedrigste ICgß-Wert, 0,66 mcg/ml, wurde an der Verbindung 26341 gegen das Mäusemelanom B 16-F10beobachteL Bei diesem System zeigt Mitomycin C ICgQ-Werte im Bereich von 3 - 30 mcg/ ml. Jede dieser beanspruchten Verbindungen zeigte sich aktiv (IC^q < 500 mcg/ml). Mäuseleukämie P388

Im Testprotokoll sind weibliche CDFj-Mäuse vorgesehen, die intraperitoneal mit einem Tumorinoculum von 10^ Asciteszellen von Mäuseleukämie P-388 implantiert waren und mit verschiedenen Dosen einer Testverbindung oder mit Mitomycin C behandelt wurde. Die Verbindungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Gruppen von 6 Mäusen wurden für jede Dosismenge verwendet und sie wurden mit einer einzigen Dosis der Verbindung am Tag der Inoculation behandelt. Eine Gruppe von 10 mit Salzlösung behandelten Vergleichsmäusen wurde in jede Versuchsserie aufgenommen.

DiemitMitomycin C behandelten Gruppen wurden als positiver Vergleich aufgenommen. Ein Versuchsprotokoll -14-

AT 394 725 B von 30 Tagen wurde aufgestellt und für jede Mäusegruppe wurde die mittlere Überlebensdauer in Tagen bestimmt und die Anzahl der Überlebenden zu Abschluß des 30-tägigen Zeitraums festgehalten. Vor der Behandlung und neuerlich am 6. Tag wurden die Mäuse gewogen. Die Massenänderung wurde als Maß für die Toxizität des Medikaments genommen. Es wurden Mäuse mitjeweils20gMasse verwendet und ein Massenverlustvon bis zu etwa 2 g wurde nicht als übermäßig bezeichnet. Die Ergebnisse wurden als % T/C ausgedrückt, was das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zur mittleren Überlebenszeit der mit Salzlösung behandelten Gruppe mal 100 darstellt. Die mit Salzlösung behandelten Vergleichstiere starben meist innerhalb von 9 Tagen. Der „maximale Effekt“ in der Tabelle ist als % T/C ausgedrückt und die diesen Effekt hervorrufende Dosis wird angegeben. Die in Klammem stehenden Werte sind die mit Mitomycin C als positivem Vergleich erhaltenen Wate bei dem gleichen Versuch. So kann die relative Wirksamkeit der vorliegenden Substanzen im Vergleich zu Mitomycin C abgeschätzt werden. Als minimaler Effekt, ausgedrückt als % T/C, wurde 125 angesehen. Die in der folgenden Tabelle angegebene minimale Dosis ist die Dosis, die ein % T/C etwa 125 ergibt Die in jedem Fall in dar Spalte „mittlere Massenänderung“ angegebenen Werte sind jeweils die mittleren Massenänderungen pro Maus bei der maximalen wirksamen Dosis und bei der minimalen wirksamen Dosis.

Melanom B16

Es wurden für den Melanom B16-Test BDFj Mäuse verwendet. Sie wurde subcutan mit dem Tumorimplantat inoculiert. Es wurde ein Versuchsprotokoll von 60 Tagen erstellt. Gruppen von jeweils 10 Mäusen wurden für jede untersuchte Dosierungsmenge verwendet und die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe wurde bestimmt. Für jedes Dosierungsniveau wurden die Testtiere mit der Testverbindung an d Tagen 1, 5 und 9 intravenös behandelt. Vergleichstiere, die auf gleiche Weise wie die Testtiere inoculiert und nur mit dem Injektionsträger ohne Wirkstoff behandelt worden waren, zeigten eine mittlere Überlebenszeit von 18,5 bis 26 Tagen. Die Überlebenszeit im Vergleich zu der der Vergleichstiere (% T/C) wurde als Maß für die Wirksamkeit verwendet. Ein % T/C-Wert von 140 oder mehr wurde als signifikante Tumorinhibierung angesehen. Der in Klammer notierte Wert ist der % T/C-Wert für Mitomycin C beim gleichen Versuch. Verschiedene Verbindungen zeigen eine deutlich höhere Antitumor-Wirkung als das Mitomycin C.

Im Hinblick auf die bei experimentellen tierischen Tumoren gezeigte Antitumorwirkung und das Fehlen einer schädlichen Toxizität im Vergleich zu Mytomycin C können erfindungsgemäß hergestellte Substanzen zur Inhibierung von Säugetiertumoren verwendet werden. Zu diesem Zweck werden die Substanzen systematisch an Säugetiere verabreicht, die mit dem Tumor behaftet sind. Die Wirkstoffe werden in Dosen verabreicht, bei denen sie wirksam, jedoch nicht toxisch sind.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen werden in erster Linie, ähnlich dem Mitomycin C, in Form von Injektionen verabreicht. Es können je nach der speziellen Tumorsensibilität größere oder kleinere Dosen verwendet werden. Die Substanzen werden einfach als trockene pharmazeutische Zusammensetzungen in den Handel gebacht, wobei sie Streckmittel, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisatoren und andere Bestandteile enthalten, die zur pharmazeutischen Eleganz beitragen. Diese Zusammensetzungen werden dann mit einem injizierbaren flüssigen Medium knapp vor da1 Verwendung zu Injektionen verarbeitet. Geeignete injizierbaie Flüssigkeiten sind Wasser, isotonische Salzlösungen und dergl.

Antitumorwirkung von Verbindungen der Formel I (Alkrt ist -CTUGHU-. und R ist Hl P-388 Mäuseleukämie

Nr. (BMY) Nr. R9

Ver- Bei- bindung spiel B16 Melanom optimale Wirkung (Maus i. v.)

Dosis % T/C* maximale Wirkung minimale mittlere Wirkung Gewichts· Dosis % T/C* Dosis änderung 34(26678) '5 3.2.(4.8) 150(159) 0.2 +0.5,+0.3 co2k« 35(26712) 6

co2n· 6.4 147(124) 12.8(3.2) 322(233) 0.8 -0.6,+0.8 -15-

Claims

AT 394 725 B Fortsetzung: P-388 Mäuseleukämie Verbindung Nr. (BMY) Bei spiel Nr. R9 B16 Melanom optimale Wirkung (Maus i. v.) Dosis %T/C* maximale Wirkung Dosis %T/C* minimale Wirkung Dosis mittlere Gewichts änderung 36(26711) 7 Mtj 6.4 163(124) 12.8(3.2) 306(233) 0.4 -1.0,+0.7 37(26733) 8 ΜΟ,ε^και,αι,βΜΐ 'cnoi,- »•OjcaijNnco' 9.6 179(142) 12.8(4.8) 144(239) 6.4 -0.1,+0.5 38(26880) 9 M°jCNciiMiiCOcia«*-laijijCMCHj * 6.4(4.8) 167(172) 0.8 +0.7, +1.1 48(26112) 2 (CH j) - 3.2(4.8) 167(>333) <0.2 -2.0,+1.2 49(26679) 10 HeOjCCHjCH 12.8(4.8) 191(195) 0.4 -0.8,+0.5 51(26682) 1 pr 6.4(4.8) 182(195) 0.8 +0.3,-0.1 59(26723) 4 4.8 4.8 266(179) 12.8(4.8) 322(239) 187(142) 6.4 -2.0,-0.8 63(26858) 3 Uh>-ch2. 6.4(4.8) 144(239) 1.6 -1.7,+0.5 PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen der Formel R-S'S-AlXj-NK

(I), worin A11c2 eine geradkettige oder verzweigte Alkylengnippe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, R Wasserstoff, Niedrigalkyl, Niedrigalkanoyl, Benzoyl oder substituiertes Benzoyl darstellt, dessen Substituent Niedrigalkyl, -16- Ί ΑΤ 394 725 Β Niedrigalkoxy, Halogen, Amino oder Nitro ist, und R9 für eine durch Trifluormethyl oder Carboxy oder durch Nitro und Carboxy substituierte Phenylgruppe, eine durch Phenyl, (A]kyl-)-pyridyl oder (Alkyl-)-imidazolyl substituierte Niederalkylgruppe, eine gegebenenfalls durch Amino substituierte Carboxyethyl-, eine 2-Amino-2-(l-carboxy-3-methyl-l-butyl)-aminocarbonylethyl- oder eine 2-Ghitamylamino-2-(carboxymethylamino-carbonyl)-ethylgruppe steht, bzw. der pharmazeutisch verwend-baren Metall- oder Aminsalze, insbesondere der Natriumsalze, oder der pharmazeutisch verwendbaren Säureadditions- salze dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mitosan der Formel

0D, worin Alk2 und R die oben genannte Bedeutung haben, in Gegenwart eines reaktionsinerten Mediums mit etwa einem Äquivalent eines Thiols der Formel R9SH, worin R9 die oben angegebene Bedeutung hat, gegebenenfalls in Gegenwart eines chemischen Äquivalents einer Base, bei einerTemperatur zwischen 0 und 60 °C zur Reaktion gebracht wird,bisdieerforderliche MengedesProdukts gebildetist, welches anschließendgegebenenfalls in das entsprechende Metall- oder Aminsalz oder Säuieadditionssalz übergeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mitosan der Formel II ein solches verwendet wird, bei dem die Gruppe Alk2 für die Ethylengruppe steht
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol der Formel R9SH 2-Carboxyphenylthiol verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol der Formel R9SH 4-Nitro-3-carboxyphenylthiol verwendet wird.
5. Verfahrennach Anspruch 1 oder 2,dadurch gekennzeichnet,daß als Thiol der FormelR9SH2-(Y-Glutamyl)amino-2-[N-(carboxymethyl)-aminocarbonyl]-ethylthiol verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspuch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol der Formel R9SH 2-Amino-2-[(l-carboxy-3-methyl-l-butyl)-aminocarbonyl]-ethylthiol verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol der Formel R9SH 1-Phenylethylthiol verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch loder2,dadurch gekennzeichnet,daß als Thiol der FormelR9SH2-Carboxyethylthiol verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol da* Formel R9SH 3-Trifluormethyl-phenylthiol verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol da1 Formel R9SH 3-Methyl-2-imidazolylmethylthiol verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Thiol der Formel R9SH 3-Methyl-2-pyridylmethylthiol verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Reaktionsmedium ein niedriges Alkanol, ein niedriger Alkansäurealkylester, ein niedriges aliphatisches Keton, ein cyclischer aliphatischer Ether, ein niedrigerpolyhalogenierter aliphatischer Kohlenwasserstoff mitbis zu 8 Kohlenstoffatomen oderWasser verwendet wird. -17-