DD262998A5 - Verfahren zur herstellung eines konjugates von einem vinca-alkaloid mit einem protein - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines konjugates von einem vinca-alkaloid mit einem protein Download PDF

Info

Publication number
DD262998A5
DD262998A5 DD86297644A DD29764486A DD262998A5 DD 262998 A5 DD262998 A5 DD 262998A5 DD 86297644 A DD86297644 A DD 86297644A DD 29764486 A DD29764486 A DD 29764486A DD 262998 A5 DD262998 A5 DD 262998A5
Authority
DD
German Democratic Republic
Prior art keywords
protein
solution
maleoyl
carbon atoms
monoclonal
Prior art date
Application number
DD86297644A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean A A Hannart
Andre B L Trouet
Kandukuri S B Rao
Original Assignee
Omnichem S. A.,Be
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Omnichem S. A.,Be filed Critical Omnichem S. A.,Be
Publication of DD262998A5 publication Critical patent/DD262998A5/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6805—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a vinca alkaloid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates von einem Vinca-Alkaloid mit einem Protein. Erfindungsgemaess werden Konjugate von einem Vinca-Alkaloid des Typs Indol-Dehydroindol mit einem Protein oder einem Protein-Fragment, der allgemeinen Formel I hergestellt, in der beispielsweise bedeuten: R1 ein Protein oder ein Protein-Fragment, R2 COOC1-3-Alkyl oder COR7, worin R7 NH2 ist, ein Ester einer Amino-Saeure oder eines Peptids, R3, H, CH3, CHO; wenn R5 und R6 einzeln betrachtet werden, ist R6 H und eines von R4 und R5 ist Ethyl und das andere H oder OH; wenn R5 und R6 zusammen mit den Kohlenstoffatomen betrachtet werden, an die sie gebunden sind, so bilden sie gemeinsam einen Oxiran-Kern und R4 ist Ethyl, und A bedeutet ein bifunktionelles organisches Derivat vom Typ Maleoylaminosaeure, Maleoylpeptid oder Maleoylphenoxy. Formel I

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Konjugate von Vinca-Alkaloiden des Typs Indol-Dihydromdol mit Proteinen oder Protein-Fragmenten, die pharmazeutische Eigenschaften aufweisen, insbesondere eine cytostatische Aktivität. Die Vinca-Alkaloide des Typs IndoJ-Dihydroindöl, insbesondere Vinblastin, Vincristin und Vindesin, werden bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Die chemotherapeutische Verwendung dieser Derivate ist jedoch in der Wirksamkeit durch ihre Sekundäreffekte begrenzt. Daher wurden bereits zahlreiche Derivate synthetisiert, um diese Sekundäreffektive zu verringern.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Das Vinblastin und einige seiner.Derivate, insbesondere das Vincrisjtin oder das Vindesin, wurden schon mit Proteinen, beispielsweise mit Albumin oder mit verschiedenen Immunoglobulinen, gekuppelt. Daraus resultierten Kupplungsprodukte oder Verbindungen, sogenannte „Konjugate"
Wir weisen insbesondere auf die folgenden Belegstellen der Literatur hin:
— J.D.Teale, Jacqueline M.Cleugh et V. Marks, Br. J. CHn. Pharm.4,169-172,1977
. — C. H. J. Ford, C. E. Newmann, J. R. Johnsen, C. S. Woodhouse, T. A. Reeder, G. F. Rowland, R. G. Simmends, Br. J. Cancer, 47, 35-42,1983 "
— M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G.Simmends, E.Jacobs, C.H.Marsden, R.W.Baldwin, Br. J. Cancer,47,43-49,1983
.— J.R.Johnson,C.H.J.Ford,C.E.Newman, C.S.Woodhouse, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, Br. J. Cancer,44,472-475,1981
— EIi Lilly Eur. Pat. Applic, Publ. n° 56.322, 21.7.82
— R. A.Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzan, G.A.Poore,J. Med. Chem. 22,391,1979
— Eii Lilly, U. K. Pat. Applic, Publ. n° 2.137210,3.11.84
— OnmiChem., Eur. Pat. Applic, Publ. n° 124.502. 7.11.84.
Die Kupplung dieser Indol-Dihydroindol-Derivate wurde nicht nur mit dem Ziel durchgeführt, neue immunologische Reagenzien zur Verfügung zu stellen, sondern vor allem in Hinblickauf die Herstellung von wirksameren, selektiveren und wenigertoxischen Anti-Tumor-Substanzen.
Bis.zum gegenwärtigen Zeitpunkt wurden zwei Typen der Kupplung in Erwägung gezogen:
a) die Kupplung an C3 über das Zwischenprodukt eines Azid-Derivats (EP-PS 56322).
b) Die Kupplung an C4 über das Zwischenprodukt einer Estergruppe, abgeleitet von der Hydroxyl-Gruppe des Kohlenstoffs in 4-Stellung desVinca-Alkaloid-Gerüstes (GB-PS 2137210; EP-PS 124502).
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Vinblastin-Derivaten mit starker Antitumorwirkung, die keine unerwünschten Nebenwirkungen verursachen.
Darlegung des Wesens der Erfindung . '
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Konjugate von einem Vinca-Alkaloid mit einem Protein mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.
Erfindungsgemäß werden neue Produkte hergestellt, die Konjugate von Vinca-Alkaloiden des Typs Indol-Dihydroindol mit Proteinen oder Protein-Fragmenten darstellen. Erfindungsgemäß erfolgt die Kupplung ebenfalls über das Zwischenprodukt einer Estergruppe, die von der Hydroxyl-Gruppe des Kohlenstoffs in 4-Stellung des Vinca-Alkaloid-Gerüstes abgeleitet ist. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht insbesondere in Konjugaten von Vinca-Alkaloiden des Typs Indol-Dihydroindol mit einem Protein oder einem Protein-Fragment, entsprechend der allgemeinen Formel I
AR1
in der
R1 ein Protein oder ein Protein-Fragment darstellt; R2 ist COOC^-Alkyl oder Co-R7, worin R7 NH2 ist, ein Estereiner Aminosäure oder eines Peptide; . R3 bedeutet H, CH3, CHO;
wenn R5 und R6 einzeln betrachtet werden, ist R6 H und eines von R4 und R5 ist Ethyl und das andere H oder OH; wenn R5 und R6 zusammen mit den Kohlenstoffatomen betrachtet werden, an die sie gebunden sind, so bilden sie gemeinsam einen Oxivan-Kem und A bedeutet ein bifunktionelles organisches Derivat vom Typ Maleoylaminosäure, Maleoylpeptid oder Maleoylphenoxy.
Diese erfindungsgemäßen Konjugate sind dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder das Protein-Fragment mit der Vinca-Verbindung über das Zwischenprodukt einer Arm-Verbindung gekuppelt wird, durch vorherige Kondensation des 4-Desacetylindol-dihydroindol-Vinca-Alkaloids mit einem bifunktionellen organischen Derivat vom Typ Maleoylaminosäure oder Maleoylpeptid der allgemeinen Formel
HOOC- Σ - Έ
— wobei im Fall der Maleoylaminosäuren X bedeutet: eine lineare Alkylenkette mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen; eine verzweigte Alkylenkette mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen; eineCycloalkylenkettemit3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
eine Phenylkette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Wenn dasbifunktionelle Derivat vom Typ Maleoylaminosäure ist, bedeutet X zusätzlich zu den obengenannten Werten die Gruppe R-CH der natürlichen Aminosäuren R-CH-COOH. In diesem letzten Fall versteht es sich von selbst, daß die Funktionen
NH2 durch die in der Peptid-Synthese übliche Schutzgruppen geschützt werden können, wenn die R-CH-Gruppe reaktionsfähig ist.
— wobei im Fall der Maleoylpeptide X bedeutet:
ein Fragment der PePtId-KeWe-(X1-NH-CO)n-Xi-worin η = 1,2,3 oder 4 ist und X1 die gleiche Bedeutung wie X in der oben beschriebenen Form besitzt.
— wobei X ebenfalls ein Phenyl-Radikal darstellen kann: wenn das oben definierte bifunktionelle Derivat Asymmetrie-Zentren aufweist, so kann es in der racemischen Form oder in einer seiner optisch aktiven Formen verwendet werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Konjugate durch die folgende Formel dargestellt werden:
/ Y
'Kr
Il ,-
COUCH..
O-C-X-N
in der
Ri ein Protein oder ein Protein-Fragment darstellt;
X ist so beschaffen, wie oben definiert;
R2 ist COOCi_3-Alkyl oder CO-R7, worin R7 NH2 ist oder der Ester einer Aminosäure oder eines Peptide; R3 ist H, CH3, CHO;
wenn R5 und R6 einzeln betrachtet werden, ist R6H und eines von R4 und R5 ist Ethyl und das andere H oder OH; wenn R5 und R6 zusammen mit den Kohlenstoffatomen betrachtet werden, an die sie gebunden sind, so bilden sie gemeinsam einen Oxivan-Kem und R4 ist Ethyl.
Die Verbindungen mit der vorstehenden Formel können gattungsmäßig beschrieben werden als
— Vinblastin-Derivate, in denen R2 COOCH3 ist, R3 Methyl ist, R4 Hydroxyl darstellt, R5 Ethyl bedeutet und R6 Wasserstoff ist;
— Vindesin-Derivate, in denen R2CO-NH2JSt und R3, R4, R5 und R6 die obengenannten Bedeutungen für die Vinblasin-Derivate besitzen;
— 23-Vinblastinoyl-aminosäuren-Derivate, in denen R2 CO-R7 ist, worin R7 den Ester einer Aminosäure oder eines Peptide darstellt und R3, R4, R5 und R6 die obengenannten Bedeutungen für die Vinblastin-Derivate besitzen;
— Vincristin-Derivate, in denen R2 COOCH2 ist;
R3 Formyl ist, R4 Hydroxyl darstellt, R5 Ethyl bedeutet und R6 Wasserstoff ist;
— Leurosidin-Derivate, worin R2 COOCH3 ist,
R3 Methyl ist, R4 Ethyl darstellt, R5 Hydroxyl bedeutet und R6 Wasserstoff ist;
— 4-Deoxy-VLB-„A"-Derivate, in denen R2 COOCH3 ist, R3 Methyl darstellt, R4 und R6 Wasserstoff bedeuten und R5 Ethyl ist,
— 4-Deoxy-VLB-„B"-Derivate, in denen R2 COOCH3 ist, R3 Methyl darstellt, R4 Ethyl ist und R5 und R6 Wasserstoff bedeuten;
— Leurosin-Derivate, in denen R2 COOCH3 ist,
R3 Methyl darstellt, R4 Ethyl ist und R5 und R6 zusammen eine Epoxid-Bindung bilden.
Das bifunktionelle Derivat vom Typ Maleoylaminosäure kann aus der Kondensation eines N-Alkoxymaleimids mit einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure stammen. Im Fall der Kondensation mit Glycin ist X = CH3; mit Alanin X = CH-CH3; mitß-AlaninX = (CH2)2; mit Phenylalanin X = CH-CH2-C6H5; mit a-Amino-Buttersäure X=CH-CH2-CH3; mit Valin X = CH-CH-(CH3)2; mit Norvalin X = CH-CH2-CH2-CH3; mit Leucin X = -CH-CH2-CH-(CHs)2; mit Isoleucin X =
-CH - ClTG2H5
mit NorleucinX = CH-(CH2I3-CH3; mit 6 Aminocapronsäure X = (CH2)5; mit 11-Amino-undecansäureX = (CH2)10; mit 12-AmidodecansäureX = (CH2J11.
Das bifunktionelle Derivat vom Typ Maleoylpeptid kann ebenfalls aus der Kondensation eines N-Alkoxymaleimids mit einem Dipeptid oder einem Tripeptid stammen, um ein Derivat-(X^NH-CO-inX-i zu ergeben, worin X1 die gleiche Bedeutung besitzen kann wie oben für X beschrieben.
Die Proteine, die vorteilhafterweise verwendet werden können, sind insbesondere Albumin von Rinderserum oder menschlichem Serum, Fetuin oder Immunoglobuline.
Die verwendeten Proteine kann man ebenfalls behandeln, um sie selektiv zu modifizieren. Diese Modifizierungen ermöglichen es, Protein-Konjugate zu erhalten, die bei ihrer therapeutischen Anwendung vorzugsweise im Bereich gewisser Gewebe konzentriert werden, beispielsweise in der Leber. Es ist daher möglich, vor der Kondensation des Vinca-Alkaloid-Derivates mit dem Protein dieses letztere zu galactosylieren.
Die zu den Antigenen der Oberfläche von malignen Zellen spezifischen Immunoglobuline und die Techniken zu ihrer Herstellung, aus immunisiertem Tierserum oder durch Kultur von Hybriden, die monoklonal Antikörper absondern, sind bekannt.
Der bevorzugte Typ von Antikörper für die erfindungsgemäße Verwendung ist ein Immunoglobulin der Klasse IgG menschlichen Ursprungs.
Jedoch sind die Immunoglobuline anderer Arten auch in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Einige repräsentative Immunoglobuline sind die folgenden:
— Ig von Ziege oder Schaf, immunisiert mit carcinomembryonalem Antigen,
— Ig vom Kaninchen anti-LLA,
— verschiedene Ig vom Affen, anti-LLa, anti-LMA, anti-LLC, anti-LMC,
— Ig von Ziege oder Schaf, immunisiert mit Membranen vom Lungen-carcinom,
— monoklonal IG, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper gegen das menschliche Colo-rectal-Carcium absondern,
— monoklonale IG, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper gegen das menschliche Melanom absondern,
— monoklonale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit leukämischen Human-Zellen reagieren,
— monoklonale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit menschlichen Neuroblastom-Zellen reagieren . * .
— monoklonaJe Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit Antigenen vom Human-Mammacarcinom reagieren,
— monoklonale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit den Zellen des Human-Ovarial-Carcinoms reagieren,
— monoklonaie Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit Human-Osteosarcom-Zellen reagieren,
— monoklonale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Lungencarcinom-Antikörper absondern.
Die-Konjugate können ebenfalls hergestellt werden mit Immunoglobulin-Fragmenten, nämlich den Fragmenten Fab, Fab' oder F(ab')2 oder monomeren IgM, erhalten aus einem Antikörper durch Verdauung mit Hilfe eines proteolytischen Enzyms. Die Konjugate der vorliegenden Erfindung werden in einer ersten Stufe durch Kondensation einer Maleoylaminosäure odereines Maleoylpeptids mit dem Hydroxyl in 4-Stellung eines 4-Desacetyl-indoldihydroindol-Vinca-Alkaloids der Formel Il erhalten, um ein Derivat der Formel III zu ergeben .
in der X, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben erwähnte Bedeutung besitzen.
In einer zweiten Stufe werden die Vinca-4-carboxy-maleoyl-Derivate der Formel III dann mit einem Protein oder einem Protein-Fragment kondensiert, und zwar durch Addition von entweder freien Thiol-Gruppeii oder von freien Amino-Gruppen des Proteins, beispielsweise den vom Lysin-Rest des Proteins stammenden Amino-Gruppen, mit der olefinischen Doppelbindung des Maleimids, gemäß einem Additions-Mechanismus vom Typ Michael (Means, G. E. et Feeney, R. E.; Chemical modification of proteins, 1971, S. 110-138, Holden, Day Inc., San Francisco), um die Konjugate der Formel I zu ergeben. Vom chemischen Gesichtspunkt aus wird die Herstellung der Maleoyläminosäuren oder der Maleoylpeptide gemäß den von O. Keller und J. Rudinger, HeIv. 58,531 (1975), von D. H. Rich, P. D. Gesselchen, A.Tong, A. Cheung und C. K. Buckner; J. med. Chem., 18,1004(1975) und von A.Sato und M.Nakao; J. Biochem., 90,1117 (1981) beschriebenen Methoden realisiert. Die Kondensation der Maleoyl-Deriväte mit dem Vinca-Alkaloid kann in klassischer Art und Weise mit Hilfe eines Chlorameisensäure-Alkylesters durchgeführt werden, vorzugsweise mit Chlorameisensäure-Ethylester oder-Isobutylester, in Anwesenheit einer Amin-Base wie Triethylamin, N-Methylpiperidin, N-Methyl-morpholin, und in einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat, Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid.
Das erhaltene Derivat wird aus dem Reaktionsmedium isoliert und mit Hilfe von in der Chemie angewendeten, klassischen Methoden gereinigt.
Es kann auch jede andere Methode zur Aktivierung der Carbonsäure-Gruppe der Maleoylaminosäure oder des Maleoylpeptids, insbesondere die in der Peptid-Chemie üblichen Methoden, bei diesem Kondensationstyp angewendet werden, um die Kondensation mit dem Vinca-Alkaloid durchzuführen.
Insbesondere in dem Fall, wo X Phenyl bedeutet, wird die Kondensation mit 3-N-Succinimidyl-maleimidobenzoat durchgeführt, erhalten gemäß der von T.AIkawa, J. Biochem., 79, 233 (1976) und von M. J.O'Sullivan et al.. Anal. Biochem., 100,100 (1979) beschriebenen Methode. .
Die Herstellung der Konjugate kann durch Reaktion des Proteins, des monoklonalen oder des polyklonalen Antikörpers mit der Vinca-Verbindung der Formel III unter klassischen Bedingungen erfolgen, beispielsweise im wäßrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 4°C und 4O0C und einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5.
Die Anzahl der verknüpften Reste kann von der Konzentration der Reaktionspartner und der Dauer der Reaktion abhängen, im allgemeinen liegt die Zahl jedoch zwischen 5 und 20.
Beispielsweise wird eine Lösung der Verbindung der Formel III, in einem organischen LösungsmitteLwie Dioxan, tropfenweise zu einer gepufferten Lösung des Proteins gegeben, z. B. unter Verwendung eines 0,1 M-Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,2. Nach einer Nacht bei gewöhnlicher Temperatur wird das Konjugat mittels Gelfiltration isoliert, durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert. Der Gehalt an Proteinen wird nach der Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloiden durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt.
Die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführten Versuche „in vitro" und „in viro", um ihre Anti-Tumor-Aktivität zu demonstrieren, zeigen, daß die Bildung des Konjugates über das Zwischenprodukt einer Maleoyl-Bindung
0 Q-CO-Z-H
' °4
vorteilhafter sein kann als über eine Bindung OCO-X-Co. Die Maleoyl-Bindung ermöglicht nämlich gleichzeitig die Konjugation der freien Thiol-Gruppen und der Amino-Gruppen des Proteins oder des Protein-Fragments. Außerdem zeigt die Umsetzung durch lysosomiale Enzyme eine viel umfangreichere Freisetzung des Vinca-Alkaloids im Fall der Maleoyl-Bindung. Die Konjugate sind ebenfalls im Serum und im sauren pH-Bereich stabiler.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden an Mäusen BDF-, getestet, bei denen eine Leukämie P388 auf intra-peritonealem Weg implantiert wurde. Die ersten Resultate zeigen, daß die Verbindungen an diesem Experimental-Modell eine signifikante
Aktivität aufweisen, da sie eine Erhöhung der Überlebenszeit induzieren.
Die neuen erfindungsgemäßen Konjugate weisen insbesondere interessante Anti-Tumor-Eigenschaften auf und sind daher geeignet, in der Human-Therapeutik verwendet zu werden.
Bei ihrer therapeutischen Anwendung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise auf parenteralem Wege verabreicht,-gelöst in einem pharmazeutisch akzeptablen Lösungsmittel. Physiologisches Wasser oder andere Pufferlösungen, beispielsweise mit einem Phosphat, sind geeignete Lösungsmittel. Der Wirkstoff wird im allgemeinen in einer Dosierung verabfolgt, die von 50 mg bis zu einigen Gramm schwanken kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können außerdem in Kombination mit anderen Anti-Tumor-Mitteln eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiel
Die folgenden Beispiele illustrieren in nicht einschränkender Weise das Verfahren, das zu den erfindungsgemäßen Verbindungen führt.
Beispiel 1: N-Carbomethoxy-maleimid
Eine Lösung von 3,8g (0,04MoI) Maleimid und 4g (0,04M) Triethylamin in 150 ml Ethylacetat wird bei einer Temperatur von 00C mit 3ml (0,04MoI) Chlorameisensäure-methylester, gelöst in 20ml Ethylacetat, behandelt. Nach 1 Stunde Rühren wird der Niederschlag abfiltriert und mit Ethylacetat gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand, kristallisiert in einer Ethylacetat-Isopropylether-Mischung, ergibt 4,19g N-Carbomethoxy-maleimid. NMR-Spektrum: (CDCI3,5): 6,75 (2H,S)f, 3,9 (3H, S).
Beispiel 2: IM-Maleoyl-L-analin
Eine Lösung von 2,3g (0,025M) L-Alanin in 100ml gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung wird bei einer Temperatur von O0C unter kräftigem Rühren mit 3,87g (0,026M) N-Carbomethoxymaleimid behandelt. Nach einer Stunde wird die Lösungsmit 200 ml Wasser verdünnt und bei einer Temperatur von 400C eine Stunde lang gerührt. Der pH-Wert der Lösung (8,2) wird dann durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 6,4 gebracht. Anschließend wird die Lösung auf 100 ml konzentriert, durch Zugabe von 1 M-Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Dieorganischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/Essigsäure 95/5)
gereinigt. Man erhält auf diese Weise 1,2g N-Meleoyl-L-alanin. ·
Ausbeute 48%
IR-Spektrum(kBr)cnTV 3400,3100,2930,1780,1740,
1700,1460,1420,1390,1370,
1345,1220,1175,1118,1080,
1068,1015, 970, 835, 700
NMR-Spektrum (CDCI3)5: 6,7(2H,S);4,8; (1H,g); 1,65 (3H,d).
Beispiel 3: IM-Maleoyl-e-aminocabronsäure
Eine Lösung von 4,2g (32,2mM)6-Amino-capronsäurein 163ml einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung wird bei einer Temperatur von 00C unter kräftigem Rühren mit 5g (32,3 mM) N-Carbomethoxymaleimid behandelt. Nach einer Stunde wird die Lösung mit 256 ml Wasser verdünnt und bei Umgebungstemperatur eine Stunde lang gerührt. Der pH-Wert der Lösung (8,2) wird dann durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 6,4 gebracht. Anschließend wird die Lösung auf 100 ml konzentrierter, durch Zugabe von 1 M-Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Dieorganischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/Essigsäure 95/5) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 4,7 g N-Maleoyl-6-amino-capronsäure.
Ausbeute: 51 %
IR-Spektrum (kBr, cm"1): 3090,2940,2880,1770,1710,1470,1450,1 380,1 370,1 340,1 315,1 260,1 210,1135,1110,1140,1100, 1015,1000,815,840,735,700.
Beispiel 4: ^N-MaleoyO-L-glutaminsäure-methylester
Eine Lösung von 1g (6,2mM)y^L-Glutaminsäure-methylester in 31,2 ml einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung wird bei einer Temperatur von 00C unter kräftigem Rühren mit 961 mg(6,2mM) N-Carbomethoxy-maleimid behandelt. Nach einer Stunde wird die Lösung mit 126 ml Wasser verdünnt und eine Stunde lang bei einer Temperatur von 4O0C gerührt. Der pH-Wert der Lösung (8,2) wird dann durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 6,4 gebracht. Anschließend wird die Lösung auf 50ml konzentriert, durch Zugabe von 1 M-Schwefelsäure auf pH2 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, überwasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/ Essigsäure 95/5) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 956 mg reines Produkt. Ausbeute: 49% NMR-Spektrum: 60: 7,9 (S, H Säure); 6,5 (S, Maleimid);
4,6 (m, CH*); 3,5 (S, OCH3);
2,3 (m, CH2GIu) IR-Spektrum (kBr) cm"1: 3470,3110,2960,1 775,1 750-1 690,1440,1410,1 265-1150,1 090,1 015,830,700.
Beispiel 5: N-Maleoyl-L-isoleucin
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 erhält man N-Maleoyl-L-isoleucin, indem man 424mg (3,22 mM) L-Isoleucin mit 500 ml (3,2mM) N-Carbomethoxy-maleimid behandelt.
Ausbeute: 20%
Massensprektrum (CDI, Isobutan): 432 (2M + 1), 352,270,212 (M+ + 1), 188,166,132,123.
NMR-Spektrum (CDCI3) δ: 8,55 (Ep., OH); 6,85 (2, S, Maleimid-Doppelbindung); 4,65 (1, d, CH); 2,6 (m, 1, CH); 1,28 (d, CH3); 1,1
Beispiel 6: a-(N-Maleoyl)-L-aspartansäure-benzylester
Eine Lösung von 1g (4,48mM)a-L-Aspartansäure-benzylesterin 22,5ml einer gesättigten Natriumbicarbonat-Lösung wird bei einer Temperatur von 0°C unter kräftigem Rühren mit 694mg (4,48mM) N-Carbomethoxymaleimid behandelt.
Nach einer Stunde wird die Lösung mit 91 ml Wasser verdünnt und bei einer Temperatur von 40°C 1 Stunde lang geführt. Der pH-Wert der Lösung (8,2) wird dann durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 6,4 gebracht. Anschließend wird die Lösung auf 50 ml konzentriert, durch Zugabe von 1 M-Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert.
Die organischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/Essigsäure 95/5) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 267 mg reines Produkt.
Ausbeute: 20%
NMR-Spektrum (CD3OD, 6OmH2, ppm):
7,1 (5H, m, H Benzyl); 6,6 (2H, S, D1, Maleimid); 5 (2H, S, CH2 Benzyl); 3,1 (2H, m CH2).
IR-Spektrum (kBr, cm"1);
3 060,1765,1 745,1 720,1410,1 270, 830,740, 700.
Beispiel 7: N-Maleoyl-H-amino-undecansäure
Eine Lösung von Maleinsäureanhydrid (2,4g, 24,8mM) in 10,1 ml Essigsäure wird zu einer Lösung von 11-Aminoundecansäure (5g, 24,8mM) in 30ml Essigsäure gegeben und die Mischung 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur kräftig gerührt.
Der weiße Niederschlag wird abfiltriert, mit kalter Essigsäure gewaschen und getrocknet (6,3 g, 21,1 mM, 85%). 3g des Niederschlages (10,0OmM) werden in trocknem Toluen (300 ml) gelöst und mit Triethylamin (2g, 22,2 mM) behandelt. Die Lösung wird in einem Dean-Stark-Apparat mittels kräftigem Rühren unter Rückfluß gehalten, bis zum Verdampfen des Toluens.
Das Produkt wird über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/Essigsäure 95/5) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 1,06g N-Maleoyl-11-amino-undecansäure.
Ausbeute: 37%
NMR-Spektrum (6OmH2, CDCI3, ppm);
8,8 (bp, COOH); 6,5 (2H, S, d1# Maleimid); 3,4 (2H, m, CH2); 2,3 (2H, m, CH2); 1,2 (16H, bp, 8 CH2).
IR-Spektrum (kBr,cm"1): 3450,3100,2910,2850,1770,1700,1 610,1 590,1470,1450,1 420,1 375,1340,1310,1 280,1 240,1180, 1125,840,700.
Beispiel 8: IM-Maleoyl-12-amino-dodecansäure
Eine Lösung von Maleinsäureanhydrid (2,28g, 23,22 mM) in 9,6ml Essigsäure wird zu einer Lösung von 12-Amino-dodecansäure (5g, 23,22mM) in 28ml Essigsäure gegeben und die Mischung 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur kräftig gerührt! Der weiße Niederschlag wird abfiltriert, mit kalter Essigsäure gewaschen und getrocknet (6,2g, 20,9mM, 86%). 4,9g (15,9mM) des Niederschlages werden in trockenem Toluen (500ml) gelöst und mit Triethylamin (4,9 ml, 35mM) behandelt. Die Lösung wird in einem Dean-Stark-Apparat mittels kräftigem Rühren unter Rückfluß gehalten, bis zum Verdampfen des Toluens. Das Produkt wird über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Chloroform/Essigsäure 95/5) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 1,38g N-Maleoyl-12-amino-dodecansäure.
Ausbeute: 29%
NMR-Spektrum (6OmHz, CDCI3, ppm); 6,52 (2H, s, d1, Maleimid); 3,42 (2H, m, CH2); 2,3 (2H, m, CH2); 1,25 (18H, broad peak,
IR-Spektrum (kBr, cm"1):
3450, 3080, 2920, 2825,1770,1 470,1 450,1 440,1 415,1 380,1 340,1 300,1 260,1 250,1 205,1120, 920, 840,700.
Beispiel 9: 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin
Zu einer Lösung von 1,52g (0,009M) N-Maieoylalanin und 1,25ml (0,009M) Triethylamin in 10 ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 1,17ml (0,009M) Chlorameisensäure-isobutylester in 5ml Ethylacetat.
Man rührt IV2 Stunden lang bei einer Temperatur von O0C und fügt dann 2,3g (0,003M) 0-4-Deacetyl-Vinblastin in Lösung von 20 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei 00C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung 10 Stunden lang. Dann gibt man 50 ml Ethylacetat und 50ml einer wäßrigen 10%igen Natriumcarbonatlösung hinzu. Man rührt, dekantiert und trennt die organische Phase ab. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit einer wäßrigen Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Dichlormethan/Methanol 92/8) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 1,86g des reinen Produktes.
Ausbeute: 67,6%
Massensprektrum (DCI, Isobutan): 935 (M + 14), 922 (M + 1), 921 (M), 751,693,519,445,371,133.
NMR-Spektrum (CDCI3,360MHz, ppm):
8 (NH, 1 H); 7,5-7 (4H, H-p', Η-10Ή-11', H-12'); 6,7 (2H, Anhydrid); 6,55 (1 H, H-14); 605 (1 H, H-17); 5,85 (1 H, H-7); 5,45 (1 H, H-4); 5,15 (1 H, H-6); 4,8 (1 H, CH); 3,95 (1 H, H-17'); 3,85 (3H,-OMe); 3,78 (3H1-OMe); 3,7 (1 H, H-2); 3,6 (3H1-OMe); 2,7 (3H, NMe); 1,72 (3H, CH3 Alanin); 0,9-0,8 (6H, CH3-21, CH3-2T).
Beispiel 10: 4-{l\l-Maleoyl)-6-amino-caproyl-Vinblastiri
Zu einer Lösung von 604mg (2,861 mM) N-Maleoyl-6-amino-capronsäure und 514μΙ (4,65mM) N-Methylmorpholin in 4ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 371 μΙ (2,861 mMJChlorameisensäureisobutylester in 1 ml Ethylacetat. Man rührt 3 Minuten lang bei einer Temperatur von O0C und gibt dann 550 mg (0,715 mM) O-4-Deacetyl-vinblastin in Lösung von 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei 00C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung 10 Stunden lang. Man filtriert die Lösung und die Ethylacetat-Phase wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Dichlormethan/Methanol 94/4) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 263mg des reinen Produkts. Ausbeute: 23%
Massensprektrum (DCI, Isobutan): 993,979; 965 (M+ + 4); 963 (M+ + 2); 961 (M+); 946; 933; 920; 906; 812; 754; 693. IR-Spektrum (kBr, cm"1): 3400; 350; 2940; 1740; 1700; 1615;1 500; 1460; 1440; 1410; 1370; 1220; 1170; 1040. NMR-Spektrum (CDCI3,360MHz, ppm):
7,47-712 (4H, m, H11', H12', H13' 1 H14'); 6,65 (2H,s,d 1 Maleimid); 6,55(14,s, H14); 6,05(1 H,s,H17); 5,82(1 H,m, H7); 5,42 (1 H,s, H4); 5,25 (1 H, m, H6); 3,92 (1 H, m, H17); 3,77 (6H, s, OCH3 C23OOCH3); 3,70 (1 H, s, Hz); 3,6 (3 H, s, C18OOCH3); 2,7 (3H, s, NCH3); 2,32 (m, CH2Aminocapron); 1,62 (m, CH2 Aminocapron); 0,9-0,8 (6H, t,CH321 +CH321').
Beispiel 11: 4-(N-Maleoyl)-L-glutamyl-^:metgylester-Vinblastin
Zu einer Lösung von 282mg (1,17OmM) N-Maleoyl-L-glutaminsäure-^methylesterund 163μΙ (1,17OmM) Triethylamin in 1,4ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 152 μΙ (1,17OmM) Chlorameisensäureisobutylester in 1 ml Ethylacetat. Man rührt 4 Minuten lang bei einer Temperatur von 00C und gibt anschließend 300 mg (0,390mM)0-4-Deacetyl-Vinb|astin in Lösung von 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei O0C hält. Dann läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung 10 Stunden lang. Man filtriert die Lösung und die organische Phase wird unter Vakuum konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Ethanol/Ethylacetat 30/90) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 22 mg des reinen Produkts. Ausbeute: 38%
Massenspektrum (DCI, Isobutan): 1 036,1 022,1 009, 995 (M+ + 4), 992 (M+ + 1), 937, 885, 811, 751, 694, 635, 541. NMR-Spektrum (CDCI3, 360MHz, ppm): 9,4 (1 H, m, OH); 8 (1 H, s, NH, Ind.); 7,5-7,10 (4H, m, H11, H12, H13, H14); 6,7 (2H, s, d1 Maleimid); 6,58 (1 H, s H14); 6,05 (1 H,s, H17); 5,80 (1 H, m, H7); 5,48 (1 H, s, H4); 5,25 (1 H, m, H6); 4,73 (1 H, m, CHxGlu); 3,95 (1 H, m, H17); 3,85 (3H, s, OCH3Ar); 3,75 (3H, s, C23OOCH3); 3,63 (3H, s, C18OOCH3); 3,58 (3H,s, OCH3GIu); 2,80 (3H, s, NCH3); 2,238 (m,CH2, GIu); 0,9-0,8 (6H,t, CH321 + CH32T)
IR-Spektrum: (kBr, cm"1): 3430,1 740,1715,1 615,1 500,1460,1 430,1405,1 385,1 250,1 225,1 030,1 005,825.
Beispiel 12: 4-(N-Maleoyl)-L-isoleucyl-Vinblastin
Zu einer Lösung von 150mg (0,7109mM) N-Maleoyl-L-isoleucin und 99μΙ (0,7109mM) Triethylamin in 1 ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 92 μΙ (0,7109mM)Chlorameisensäure-isobutylesterin 1 ml Ethylacetat. Man rührt 3 Minuten lang bei einer Temperatur von 0°C und gibt dann 182 mg (0,237 mM)0-4-Deacetyl-Vinblastin in Lösung von 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei O0C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung 10 Stunden lang. Man filtriert die Lösung und die Ethylacetat-Phase wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Ethanol/ Ethylacetat 30/90) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 133 mg des reinen Produktes.
Ausbeute: 40%
Massenspektrum (DCI, Aceton): 1039,963(M+ + 2); 904; 812; 769; 728; 637; 593; 549.
IR-Spektrum (kBr, cm"!: 3480-3400; 2960; 2920; 2880; 1 775; 1740; 1710; 1 610; 1 500; 1460; 1 430; 1 380; 1 250; 1 220; 1 040; 1000; 830; 740.
NMR-Spektrum (CDCI3, 360MHz, ppm): 9,4 (m, OH); 7,5-7,1 (4H, m, CH arom. 11'-12'-13'-14'); 6,65 (2H, s, d, Maleimid-Bindung); 6,6 (1 H, S, C14-H); 6,05 (1 H, s, C17-H); 5,8 (1 H, s, C7-H); 5,45 (1 H, S, C4-H); 5,25 (1 H, m, C6-H); 4,5 (1 H, d, C-H); 3,95 (1 H, m, H17); 3,8 (3 H, s, OCH3Ar); 3,75 (3H, s, C23OOCH3); 3,7 (1 H, s; H2); 3,6 (3H, s, C18O-OCH3); 2,65 (3 H, s, NCH3); 1,1 (d, 3 H, CH3 Isoleucin); 0,9-0,8 (9H, m, CH3 Isoleucin + CH32V + CH,21).
Beispiel 13: 4-(N-Maleoyl)-L-aspartyl-a-benzyl-ester-Vinblastin
Zu einer Lösung von 267mg (0,88mM) N-Maleoyl-L-aspartansäure-a-benzylesterund 118μΙ (0,88mM) Triethylamin in 1 ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 114μΙ (0,88 mM) Chlorameisensäureisobutylester in 1 ml Ethylacetat.
Man rührt 4 Minuten lang bei einer Temperatur von O0C und gibt dann 227 mg (0,29 mM) O-4-Deacetyl-Vinblatin in Lösung von 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei 00C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung über Nacht.
Man filtriert die Lösung und die organische Phase wird unter Vakuum konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Ethanol/Ethylacetat 30/90) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 105mg des reinen Produkts.
Ausbeute: 34%
NMR-Spektrum (CDCI3,360 MHz, ppm);
805 (1 H, s, NH Ind16); 7,5-7,17 (4H, m, H11', H12', H13', H14'); 7,37-7,3 (5H, m, H Benzyl); 6,75 (2H, s, d 1 Maleimid); 6,60 (1 H, s, H14); 6,10 (1 H, s, H17); 5,87 (1 H, m, H7); 5,45 (1 H, s, H4); 5,30 (1 H, m, H6); 5,20 (2H, m, CH2 Benzyl); 3,95 (1 H, m, H17); 3,82-3,75 (6H, s, OCH3 + COOCH3 23); 3,70 (1H, s, H2); 3,62 (3H, s, C18OOCH3); 2,60 (3H, s, NCH3); 0,9-0,8 (6H, CH321')· IR-Spektrum (kBr, cm"1)
3 460,3 030,2 960,2 880,1 770,1740,1715,1 610,1 600,1 460,1 430,1 410,1380,1 260,1 220,1175,1110,1 025,910,800,730,700.
Massenspektrum (DCI, Isobutan);
1 085,1 071,1 057,1 054,1 039,1 023,1013,768,708, 542,158.
Beispiel 14: 4-(N-Maleoyi)-11-amino-undecanoyl-Vinblastin
Zu einer Lösung von 476mg (1,69mM) N-Maleoyl-11-aminoundecansäure und 326μΙ (2,8mM) N-Methylmorpholin in 3ml Ethylenacetat, gekühltauf eine Temperatur von 0°C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 218μΙ (1,69mM) Chlorameisensäure-isobutylesterin 1 ml Ethylacetat Man rührt 3 Minuten lang bei einer Temperatur von 0°C und gibt dann 433mg (0,56mM) 0-4-Deacetyl-Vinblastin in 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei 0°C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung über Nacht.
Man filtriert die Lösung und die Ethylacetat-Phase wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Ethanol/Ethylacetat 30/90) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 240mg des reinen Produktes.
Ausbeute: 41%
NMR-Spektrum (CDCI3,360MHz, ppm):
8 (1 H, s, NH Ind16'); 7,5-7,13 (4H, m, H11', H12', H13', H14'); 6,68 (2H, s, d 1 Maleimid); 6,63 (1 H, s, H14); 6,10 (1 H, s, H17); 5,83 (1 H, m, H7); 5,48 (1H, s, H4); 5,25 (1 H, m, H6); 3,95 (1 H, m, H17'); 3,80 (6H, s, OCH3 + C23OOCH3); 3,73 (1 H, S, H2); 3,6 (3H, s, C18OOCH3); 2,7 (3H,s, NCH3); 1,28 (16H, broad peak, CH2-); 0,88-0,8 (6H,tCH321 +tCH321').
IR-Spektrum (kBr, cm"1):
3430,3040,2930,2860,1 770,1735,1710,1 615,1 505,1460,1410,1 370,1230-1 250,1 000-1100.
Massenspektrum (DCI, Isobutan):
1089,1064,1 048,1 034,1 000,990, 976, 960.
Beispiel 15: 4-(N-Maleoyl)-12-amino-dodecanoyl-Vinblastin
Zu einer Lösung von 699mg (2,37 mM) Ν-Μ3ΐβονΙ-12-3Γηίηοαοαβ03η83υΓβυηα433μΙ (3,95 mM) N-Methylenmorpholin in 4,2 ml Ethylacetat, gekühlt auf eine Temperatur von 00C, gibt man tropfenweise eine Lösung von 307 μΙ (2,37 mM) Chlorameisensäureisobutylester in 1 ml Ethylacetat.
Man rührt 3 Minuten lang bei einerTemperaturvonO°Cund gibt dann 607 mg (O,79mM)O-4-Deacetyl-Vinblastin in Lösung von 1 ml Ethylacetat hinzu, wobei man die Temperatur bei 00C hält. Anschließend läßt man auf Umgebungstemperatur ansteigen und rührt die Mischung über Nacht. Man filtriert die Lösung und die Ethylacetat-Phase wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution Ethanol/Ethylacetat 30/90) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 271 mg des reinen Produktes.
Ausbeute: 33%
NMR-Spektrum (CDCI3,36OmHz, ppm):
8 (1 H, s, NH Ind16'); 7,5-7,10 (4H, m, H11', H12', H13', H14'); 6,65 (2H, s, d1 Maleiid); 6,60 (1 H, s, H14); 6,08 (1 H, s, H17); 5,83 (1 H, m, H7); 5,48 (1 H, s, H4); 5,25 (1 H, d, H6); 3,95 (1 H, m, H17'); 3,78 (6H, S1-OCH3 + C23OOCH3); 3,73 (1 H, S, H2); 3,6 (3H, s, C18OOCH3); 2,7 (3H, s, NH3); 1,25 (2OH, Vn1-CH2-); 0,9-0,8 (6H, 6, CH321 + CH321').
IR-Spektrum (kBr, cm"1):
3460,3040, 2930,2860,1 735,1700,1 610,1 500,1 460,1 430, 1410,1 365,1 245,1 220.
Massenspektrum (CDI, Isobutan):
1 063,1 046 (M+ + 1), 1 037,1 028,1 016, 312,117.
Beispiel 16: 4-(N-Maleoyi)-L-alanyl-Lysyl-ethylester-Vinblastin
Zu einer Lösung von 40,26 mg (0,163 mM)Lysin-ethylester-Hydrochlorid und 150 μΙ (0,978 mM) Triethylamin in 7,5 ml absolutem Ethanol, gibt man tropfenweise eine Lösung von 150 mg (0,163 mM) 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin in 1 ml Ethanol. Man rührt über Nacht bei Umgebungstemperatur und dampft die Lösung dann ein. Der erhaltene Rückstand wird mittels Chromatographie über eine Kieselerde-Kolonne (Elution 14% MeOH/NH3in Ether) gereinigt. Man erhält auf diese Weise 101,2 mg des reinen Produkts.
Ausbeute: 67%
Massenspektrum (CDI, Isobutan):
1 095 (M+ + 2);1 094 (M+ + 1); 1 037; 921; 839; 769; 693; 615; 574; 532.
IR-Spektrum (kBr, cm"1):
3460; 2940; 1740; 1 710; 1 615; 1 500; 1460,1430; 1 590; 1 250; 1 225; 1120; 1 010; 735.
NMR-Spektrum (CDCI3,36OmHz, ppm):
8 (1 H, NH, 16'); 7,5-7,1 (4H, H11', H12', H13', H14'); 6,6 (1 H, s, H14); 6,08 (1 H, s, H17); 5,8 (1 H, m, H7); 5,45 (1 H, s, H4); 5,3 (1 H, m, H6); 4,8(1 H, m,CHx); 4,18 (2H,q,-OCH2); 3,83(3H,s, OCH3); 3,78 (3H,s,OCH3); 3,6(3H,s, OMe); 2,68(3H,s, NCH3); 1,65 (3H,d,CH3 AIa); 1,43 (2H, s); 1,28 (CH3, OCH2CH3); 0,9-0,8 (6H, CH3"21 + CH3"21').
Beispiel 17: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHGaI) (V4-AIa-MaI-AHg)
44mg 4-(N-Maleoyl)-L-alanoyl-Vinblastin werden in 1 ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 50 mg AHGaI in 5 ml Phosphat-Puffer (0,2 M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin-Lösung zu der AHGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei gewöhnlicher Temperatur über Nacht gerührt und mittels Filtration überSephadex-Gel G-25 (2,6 χ 96cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5) gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (96ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloiden durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 13,5MoIe Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 18: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-6-amino-caproyl-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHg) · (V4-C6-MaI-AHg)
234mg 4-(N-Maleoyl)-6-aminocaproyl-Vinblastin werden in 1 ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 50 mg AGGaI in 5ml Phosphatpuffer (0,2M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleyol)-6-amino-caproyl-Vinblastin-Lösung zu der AH-Gal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei gewöhnlicher Temperatur über Nacht gerührt und mittels Filtration über Sephadex-Gel G-25 (2,6 χ 96cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (100ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioakivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 12,7MoIe Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 19: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-L-glutamyl-y"methylester-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHg) (V4-Glu-Y-methvlester-Mal-AHg)
24mg 4-(N-Maleoyl)-L-glutamyl-y=methylester-Vinblastin werden in 1 ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 50mg AHGaI in 5ml Phosphatpuffer (0,2M) vom pH-Wert8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-L-glutamyl-yrmethylester-Vinblastin-Lösung zu der AHGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei gewöhnlicher Temperatur über Nacht gerührt und mittels Filtration über Sephadex-Gel G-25 (2,6 χ 96cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (100 ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert. Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 11,8 Mole Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 20: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-L-isoleucyl-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHGaI) (V4-IIe-MaI-AHG)
250mg 4-(N-Maleoyl)-L-lsoleucyl-Vinblastin werden in 20ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 591 mg AHGaI in 16,5ml Phosphatpuffer (0,4M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die4-(N-Maleoyl)-L-isoleucyl-Vinblastin-Lösung zu der AHGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei gewöhnlicher Temperatur über Nacht gerührt und mittels Filtration über Sephadex-Gel G-25 (2,6 x 96cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (180ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 8,8 Mole Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 21: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-L-aspartyl-a-benzylester-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHGaI) (V4-ASp-O-B. E.-Mal-AHg)
105mg 4-(N-Maleoyl)-L-aspartyl-a-benzylester-vinblastin werden in 7,9ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 226mg AHGaI in 6,3ml Phosphatpuffer (0,4M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-L-aspartyl-a-benzylestervinblastin-Lösungzu der AHGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei gewöhnlicher Temperatur über Nacht gerührt und mittels Filtration über Sephadex-Gel G-25 (2,6 χ 96cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (60 ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 5,7 Mole Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 22: Kupplung von 4-(4-Maleoyi)-11-amino-undecanoyl-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHGaI) · (V4-C11-MaI-AHg).
440mg 4-(N-Maleoyl)-11-amino-undecanoyl-Vinblastin werden in 46ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 969mg AHGaI in 27ml Phosphatpuffer (0,4M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-11-amino-undecanoyl-Vinblastin-Lösung zu der AHGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei einerTemperatur von 40°C 5 Stunden lang gerührt und mittels Filtration über Trisacryl-Gel (5,6 χ 50cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gereinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (250 ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 10,2 Mole Alkaloid pro Mol galactosyliertes Human-Albumin.
Beispiel 23: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-12-amino-dodecanoyl-Vinblastin mit galactosyliertem Human-Albumin (AHGaI)-(V4-C12-MaI-AHg).
120mg 4-(N-Maleoyl)-12-amino-dodecanoyl-Vinblastin werden in 16ml Dioxan gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 339mg AHGaI in 9,4ml Phosphatpuffer (0,4M) vom pH-Wert 8,5 her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-12-amino-dodecanoyl-Vinblastin-Lösung zu der AGGal-Lösung gegeben. Die Mischung wird bei einer Temperatur von 40 °C 6 Stunden lang gerührt und mittels Filtration überTriacryl-Gel (5,6 x 50cm), im Gleichgewicht mit einer NaCI-Lösung (9%o, pH 7,5), gi.reinigt. Der ausgesonderte Pie wird gesammelt (240 ml), durch Ultrafiltration konzentriert und sterilisiert.
Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das erhaltene Konjugat enthält 9 Mole Alkaloid pro Mol galactosyliertem Human-Albumin.
Beispiel 24: Kupplung von 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin mit unspezifischem Immunoglobulin (IgG) (V4-AIa-MaI-IgG).
4mg 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin werden in 193μΙ Ethanol gelöst. Andererseits stellt man eine Lösung von 10mg IgG (626μΙ) in 357 μΙ Phosphatpuffer (0,4M) vom pH-Wert 8,5 und 447μΙ Wasser (7mg Prot/ml) her. Dann wird die 4-(N-Maleoyl)-L-alanyl-Vinblastin-Lösung zu der IgG-Lösung gegeben. Die Mischung wird über Nacht bei einerTemperaturvon 35°C gerührt und mittels HPLC über eine Kolonne (Gel-Filtration) Dupont de Nemours GF450 x 250, eingestellt in einem Phosphat-Puffer 0,2M vom pH-Wert 7,5, gereinigt.
Der ausgesonderte Pie wird gesammelt und dosiert. Der Gehalt an Proteinen wird durch die Methode von Lowry gemessen und der Gehalt an Alkaloid durch Messung der Radioaktivität eingeschätzt. Das Konjugat enthält 6,6 Mole Alkaloid pro Mol Immunoglobulin.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden einer pharmakologischen Untersuchung unterzogen.
1. Sensibilität zu lysosomalen Enzymen
Die Sensibilität der Konjugate zu lysosomalen Enzymen wurde durch Inkubation dieser Konjugate in Anwesenheit von 5mM Cyctein, 4OmM Acetatpuffer und lysosomalen Enzymen, über eine Dauer von 48 Stunden und bei einer Temperatur von 37°C untersucht. Nach 48 Stunden Inkubation werden die nicht beschädigten Proteine nach Zugabe von 5mg Albumin-Serum durch 2 Volumen Acetonitril gefällt.
Nach Inkubation der Proben bei einer Temperatur von 4°C während 40' und Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen pro Minute während 40' wird die Radioaktivität des aufschwimmenden Anteiles durch Zählen eines aliquoten Teiles in flüssiger Szintillation ermittelt. Die lösliche Radioaktivität ist ein Maß für die Umsetzung des Konjugates.
Die Prozentsätze für die erhaltenen Umsetzungen sind die folgenden:
V4-AIa-MaIAHg: 92%
V4-C6-MaIAHg: 100%
V4-IIe-MaIAHg: 75%
V4-C11-MaIAHg: 79%
V4-C12-MaIAHg: 92%
2. Stabilität im Serum
Die Stabilität der Konjugate in Anwesenheit von Serum wurde durch deren Inkubation in Anwesenheit von 62% Kalb-Fötus-Serum über eine Dauer von 48 Stunden und bei einer Temperatur von 370C untersucht.
Nach 48 Stunden Inkubation werden die nicht beschädigten Proteine durch Zugabe eine's Volumens Trichloressigsäure (TCA 40%) gefällt.
Nach Inkubation der Proben bei einer Temperatur von 4°C während einer Stunde werden diese zentrifugiert und die Radioaktivität des aufschwimmenden Anteiles wird durch Zählen eines aliquoten Teiles in flüssiger Szintillation ermittelt. Die lösliche Radioaktivität ist ein Maß für die Umsetzung der Konjugate
Die Ergebnisse zeigen, daß die Konjugate im Verlauf von 49 Stunden stabil sind.
3. Stabilität bei saurem pH-Wert
Die Stabilität der Konjugate im sauren pH-Bereich wurde durch Inkubation der Konjugate in Anwesenheit von 4OmM Acetat-Puffer vom pH-Wert 4,5 während 48 Stunden und bei einer Temperatur von 37°C untersucht. Die Umsetzung wird durch die Technik der Fällung mittels TCA ermittelt
Die Ergebnisse zeigen, daß die Konjugate unter diesen Bedingungen stabil sind.
4. Chemotherapeutische Aktivität bei Leukämie P388
Die chemotherapeutische Aktivität der Zwischenprodukt-Derivate und der Konjugate wurde an Leukämie P388 ermittelt, verabfolgtauf intraperitonealem Weg bei der weiblichen Maus BDF1:10e Tumorzellen werden auf intraperitonealem Weg am Tag Null inokuliert. Die Konjugate werden dann auf intraperitonealem Weg am Tag 1 verabreicht. Der ILS-Wert stellt den Prozentsatz der Überlebenszeit der behandelten Mäuse im Vergleich zu den nicht behandelten Mäusen dar.
Das molare Verhältnis kennzeichnet die Anzahl an Alkaloid-Molen pro Mol galactosyliertem Human-Albumin.
Die Zahl der am Tag 60 überlebenden Mäuse ist ebenso angegeben, wie die Dosis in mg/kg des Alkaloids und des Proteins.
3.1. Zwischenprodukt-Derivate
Produkt Dosis ILS Überlebende
mg/kg/Tag % am Tag 60
VBL(Vinblastin) 3 77 0/10
VCR (Vincristin) 2,7 64 0/11
V4-AIa-MaI 5 (Beispiel 9) 25 100 0/7
50 127 0/7
75 -70 0/6
V4-Glu-y^methylester-Mal 50 88 0/10
100 111 0/10
V4-IIe-MaI (Beispiel 12) 50 148 0/7
100 -79 0/7
V4-C6-MaI (Beispiel 10) 25 102 0/8
50 218 1/7
100 -83 0/7
Produkt Dosis ILS Überlebende ILS Überlebende
mg/kg/Tag % am Tag 60 % am Tag 60
V4-C11-MaI(BeISpIeIM) 50 37 1/7
100 -19 1/5 77 0/10
V4-C12-MaI (BeispieH 5) 25 185 1/5 64 0/11
50 >633 6/8 69 0/5
100 7 1/7 133 1/5
3.2. !Conjugate 201 0/5
Dosis molares 175 1/3
Produkt mg/kg/Tag Verhältnis 138 0/7
Vinca Protein >552 3/5
VBL 3 >574 3/5
VCR 2,7 47 0/5
V4-AIa-MaIAHg 60 374-466 13,5-10,7 67 0/5
80 450 15 75 0/5
100 562 15 88 0/5
130 2766 6,6 51 0/5
150 3035 4,1 48 0/5
150 1276 9,8 79 0/5
150 913 13,7 95 0/5
V4-Asp-a-benzyl ester MaI-AHg 60 768 5,7 137 1/5
V4-Glu-yimethyl ester-Mai AHg 60 987 4,7 147 1/5
100 1645 4,7 153 1/5
150 2468 4,7
V4-IIe-MaIAHg 60 545 8,8 227
. 100 908 8,8 >606 3/5
150 1362 8,8 186 3/10
V4-C6-MaIAHg 60 400 12 -45 0/5
150 995 12 >769 5/5
V4-C11-MaIAHg 60 378 11,8
80 504 11,8
753 7,9
90 658 10,2
100 630 11,8
100 646 7,9
150 945 11,8
V4-C15-MaIAHg 90 741 9

Claims (6)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugates von einem Vinca-Alkaloid mit einem Protein oder einem Protein-Fragment, der allgemeinen Formel I
    CCCCH.
    AR,
    sowie gegebenenfalls einer pharmazeutischen Zusammensetzung ( in der
    R1 ein Protein oder ein Protein-Fragment darstellt;
    R2 ist COOC^-Alkyl oder CO-R7 worin R7 NH2 ist, ein Ester einer Amino-Säure oder eines Peptide,
    R3 bedeutet H, CH3, CHO;
    wenn R5 und R6 einzeln betrachtet werden, ist R6 H und eines von R4 und R5 ist Ethyl und das andere H oder OH; wenn R5 und R6 zusammen mit den Kohlenstoffatomen betrachtet werden, an die sie gebunden sind, so bilden sie gemeinsam einen Oxiran-Kern und R4 ist Ethyl, und A bedeutet ein bifunktionelles organisches Derivat vom Typ Maieoylaminosäure, Maleoylpeptid oder Maleoylphenoxy, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Maieoylaminosäure, ein Maleoylpeptid oder Maleoylphenoxy der Formel^
    HOOC - X - M
    in der X eine lineare Alkylenkette mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder eine verzweigte Alkylenkette mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylenkette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylkette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder die Gruppe R-CH der natürlichen Aminosäuren
    R-CH- COOH;
    oder das Fragment einer Peptidkette vom Typ -(Xi-NH-CO)n-Xi- bedeutet, in der η = 1, 2, 3 oder 4
    ist und X1 eine lineare Alkylenkette mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine verzweigte Alkylenkette mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl en kette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Phenylkette mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder die Gruppe R-CH der natürlichen Aminosäuren darstellt, oder auch ein Phenyl-Radikal ist; in seiner racemischen Form oder in einer seiner optisch aktiven Formen, mit dem Hydroxyl in 4-Stellung einer Verbindung der allgemeinen Formel
    kondensiert; in der
    R2f R3/ R4f Rs* R6 ur>d X die vorgenannten Bedeutungen besitzen, und dadurch, daß man das erhaltene Zwischenprodukt mit einem Protein oder einem Protein-Fragment kondensiert, sowie gegebenenfalls die Verbindung der allgemeinen Formel I mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerund Füllstoffen, gemäß einer Einheitsdosis von 50 mg bis zu mehreren Gramm, gegebenenfalls in Verbindung mit anderen aktiven Substanzen, mischt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß'man die erste Stufe der Kondensation mit Hilfe eines Chlorameisensäure-alkylesters durchführt, vorzugsweise mit Chlorameisensäureethylester oder Chlorameisensäure-isobutylester, in Anwesenheit einer Amin-Base, wie Triethylamin, N-Methyl-piperidin oder N-Methyl-morpholin, in einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid, dadurch, daß man das erhaltene Zwischenprodukt aus dem Reaktionsmedium isoliert, daß man es reinigt, und daß man die zweite Stufe der Kondensation in üblicher Art und Weise durchführt, und zwar im wäßrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 40C und 25°C und einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder die mehreren RCH-Funktionsgruppen der natürlichen Aminosäuren, dargestellt durch X oder X1, mittels an sich bekannter Schutzgruppen geschützt sind.
  4. 4. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein R1 Albumin von Rinderserum oder menschlichem Serum, Fetuin oder Immunoglobuline ist.
  5. 5. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Ri selektiv behandelt wird.
  6. 6. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R1 ein Immunoglobuiin ist, ausgewählt aus der folgenden Gruppe, gebildet durch:
    — Ig von Ziege oder Schaf, immunisiert mit carcinoembryonalem Antigen;
    — Ig vom Kaninchen anti-LLA;
    — Ig von Ziege oder Schaf,.immunisiert mit carcinoembryonalem Antigen;
    — verschiedene Ig vom Affen, anti-LLA, anti-LMA, anti-LLC, anti-LMC;
    — Ig von Ziege oder Schaf, immunisiert mit Membranen vom Lungencarcinom; ;— monoklonale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die /
    -r- Antikörper gegen das menschliche Colo-rektai-Carcinom absondern;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper gegen das menschliche Melanom absondern;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit ieukämischen Human-Zellen reagieren;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit menschlichen Neuroblastom-Zellen reagieren;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit Antigenen vom Human-Mammacarcinom reagieren;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit den Zellen des Human-Ovarial-Carcinoms reagieren;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Antikörper absondern, die mit Human-Osteosarcom-Zellen reagieren;
    — monokionale Ig, ausgehend von Mäuse-Hybriden, die Lungencarcinom-Antikörper absondern; oder einem Immunoglobulin-Fragment, nämlich Fab, Fab' oder F(ab'>2 oder monomerem IgM, erhalten aus einem Antikörper durch Verdauung mit Hilfe eines proteolytischen Enzyms.
DD86297644A 1985-12-16 1986-12-15 Verfahren zur herstellung eines konjugates von einem vinca-alkaloid mit einem protein DD262998A5 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
LU86212A LU86212A1 (fr) 1985-12-16 1985-12-16 Nouveaux conjugues de la vinblastine et de ses derives,procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DD262998A5 true DD262998A5 (de) 1988-12-21

Family

ID=19730605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DD86297644A DD262998A5 (de) 1985-12-16 1986-12-15 Verfahren zur herstellung eines konjugates von einem vinca-alkaloid mit einem protein

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPS62195387A (de)
DD (1) DD262998A5 (de)
LU (1) LU86212A1 (de)
ZA (1) ZA869320B (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19636889A1 (de) * 1996-09-11 1998-03-12 Felix Dr Kratz Antineoplastisch wirkende Transferrin- und Albuminkonjugate zytostatischer Verbindungen aus der Gruppe der Anthrazykline, Alkylantien, Antimetabolite und Cisplatin-Analoga und diese enthaltende Arzneimittel
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7585491B2 (en) * 2002-12-13 2009-09-08 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62195387A (ja) 1987-08-28
LU86212A1 (fr) 1987-07-24
ZA869320B (en) 1987-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3836006C2 (de) Monophosphoryllipid-A-Derivate, Verfahren zur Herstellung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten und Verwendung von Monophosphoryllipid-A-Derivaten
EP1447099B1 (de) Antineoplastisch wirkende Polyethylenkonjugate zytostatischer Verbindungen und diese enthaltende Arzneimittel
KR100208957B1 (ko) 신규한 cc-1065 유사체
DE4310142A1 (de) Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung
PT99954B (pt) Processo de preparacao de moleculas de ligacao labeis aos acidos e de composicoes farmaceuticas
EP0124502A2 (de) Konjugierte Vinblastin-Verbindungen und ihre Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
US5030620A (en) Vinblastine derivatives, and pharmaceutical compositions containing them
DE3122479A1 (de) N-(vinblastin-23-oyl)-aminosaeurederivate
DE112018007259T5 (de) Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurebildenden Selbststabilisierungs-Anbindung
HU205135B (en) Process for producing monoclonal antibody nucleoside conjugates
DE69907419T2 (de) Antitumorwirkstoffe
DE4314091A1 (de) Immunologisches Nachweisverfahren für Triazine
PT84932B (pt) Processo para a preparacao de conjugados de imunoglobulinas
WO1994014798A1 (de) Aminosäurederivate von heterocyclen als pkc-inhibitoren
DE4122210C2 (de) Konjugate aus tumoraktiver Verbindung und Serumalbumin sowie Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung
EP0374098A2 (de) Retrovirale Proteasehemmer
CA3198230A1 (en) Conjugate and use thereof
DE69731649T2 (de) Konjugate und spezifische immuntests des methadonmetaboliten 2-ethylidin-1,5-dimethyl-3,3-diphenyl-3,3-diphenylpyrrolidin
DD262998A5 (de) Verfahren zur herstellung eines konjugates von einem vinca-alkaloid mit einem protein
DE10081928B4 (de) 6-O-Acetylmorphin (6MAM)-Analoge Verbindungen, welche zur Verwendung in Immuntests geeignet sind, hiergegen gewonnene Antikörper, deren Herstellung sowie Reagentien und Reagenssysteme, die diese umfassen
DE2621507C2 (de)
DE69819340T2 (de) Optisch reine camptothecinanaloge, optisch reines synthese-zwischenprodukt und verfahren zu ihrer herstellung
US5359087A (en) Bioactive quisqualic acid analogs
DD205906A5 (de) Verfahren zur herstellung von n-(vinblastinoyl-23)-derivaten von aminosaeuren
DE4431317A1 (de) Schutz- bzw. Ankergruppen und deren Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
ENJ Ceased due to non-payment of renewal fee