LU86212A1 - Nouveaux conjugues de la vinblastine et de ses derives,procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents
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Description
» « NOUVEAUX CONJUGUES DE LA VINBLASTINE ET DE SES DERIVES, PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT.
La présente invention se rapporte à de nouveaux conjugués d'alcaloïdes vinca de type indole-dihydroindole avec des protéines ou des fragments de protéines doués de propriétés pharmaceutiques et, en particulier, | d'activité cytostatique. Les alcaloïdes vinca de type indole-dihydroindole, . notamment la Vinblastine, la vincristine et la vindésine, sont employés i; . dans le traitement du cancer. L'usage chimiothérapeutique de ces dérivés ; est toutefois limité dans son efficacité par leurs effets secondaires, i . C'est pourquoi de nombreux dérivés ont été synthétisés afin de diminuer ces effets secondaires.
U
La Vinblastine et certains de ses dérivés, eh particulier la vincristine ou | - la vindésine, ont déjà été couplés à des protéines par exemple l'albumine ! ou diverses immunoglobulines. Il en résulte des produits de couplage ou l · ' des composés dits "conjugués".
\ Γ " 2 I « <*·
Nous relevons notamment les références suivantes de la littérature : - J.D.Teale, Jacqueline M.CIough et V.Marks, Br.J.Clin.Pharmac. 4, 169-172 ,1977 - C.H.J.Ford, C.E.Newman, J.R.Johnson, C.S.Woodhouse, T.A.Reeder, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, Br.J.Cancer 47, 35-42, 1983 - M.J.Embleton, G.F.Rowland, R.G.Simmonds, E.Jacobs, C.H.Marsden, R.W.Baldwin, Br.J.Cancer 47,43-49, 1983 - J.R.Johnson, C.H.J.Ford, C.E.Newman, C.S.Woodhouse, G.F.
Rowland, R.G.Simmonds, Br.J.Cancer , 44, 472-475, 1981 - Eli Li,,y> demande de brevet Européen n° 56.322 du 21.07.82 - R.A.' Conrad, G.J.Cullinan, K.Gerzon, G.A.Poore, J.Med.Chem. 22, 391, 1979 - Eli Lilly,, demande de brevet britannique n° 2.137210 du 03.11.84 - OmniChem,· demande de brevet européen n° 124.502 du 07.11.84 ' Le couplage de ces dimères indole-dihvdroindole$ a été entrepris non i seulement dans le but de mettre au point de nouveaux réactifs immunologiques mais surtout en vue de la préparation de substances anti-tumorales plus actives, plus sélectives et moins toxiques.
f
Deux types de éouplage ont été jusqu'à présent en/isagés.
al couplage en C^ par l'intermédiaire d'un dérivé azide ( demande de brevet Européen n° 56.322).
b) couplage en C^ par l'intermédiaire d'un groupe ester dérivé du groupe hydroxyle du carbone 4 du squelette de l'alcaloïde vinca ( demande de brevet britannique n° 2.137.210; demande de brevet européen n° 124.502).
La présente invention concerne des produits nouveaux qui sont des conjugués d'alcaloïdes vinca du type indole-dihydroindole avec des protéines, des fragments de protéines caractérisés en ce que le couplage est effectué également par l'intermédiaire d'un groupe ester dérivé du groupe hydroxyle du carbone 4 du squelette de l'alcaloïde vinca.
? h / ν'· « « * 3 .L'objet de l'invention consiste plus particulièrement en des conjugués d'alcaloïde vinca de type in-dole-dihydroindole avec une protéine ou un fragment de protéine, répondant à la formule générale 05 / [ "f*> Q 1 y ·
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CÜOQI^ s • ' /, \ 15 [ JT··. / · ^
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' 1!2 20 dans laquelle représente une protéine ou un fragment de protéine; 25 R2 est C00Ci_3 alkyle, ou CO-R7 où R7 est NH2/ un ester d'acide aminé ou de peptide; R3 est H, CH3, CHO; lorsque R5 et Rg sont pris séparément, Rg est H et un des R4 et R5 est éthyl et 30 l'autre est H ou OH; lorsque R5 et Rg sont pris ensemble avec les carbones auxquels ils sont attachés, ils forment un noyau oxirane et R4 est éthyle et '35 1 A est un reste de dérivé organique bifonc- \p tionnel du type maléoylaminoacide ou malê- K oylpeptide ou maléoylphénoxy.
β » 0 ' il
Ces conjugués, suivant l'invention, sont caractérisés en ce que la protéine ou le fragment de protéine est couplé au composé vinca par l'intermédiaire d'un bras, par condensation préalable de l'alcaloïde vinca 4-désacétyl indole dihydroindole avec un dérivé organique bifonctionnel de type maléoylaminoacides ou de type maléoylpeptide de formule générale 0 ti
HOOC - X - N
yJ
0 - Dans le cas des maléoylaminoacides X représente'une chaîne linéaire alkylène de 1 à 6 atomes de carbone.
une chaîne ramifiée alkvlène de 2 à 5 atomes de carbone.
. une chaîne cycloalkylène de 3 è 6 atomes de carbone, une chaîne phénylène de 3 à 6 atomes de carbone.
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De plus, lorsque le dérivé bifonctionnel est de type maléoylamîno-acide, X représente, outre les valeurs reprises ci-dessus, le groupement R-CH des acides aminés naturels R-CH-COOH. Dans ce derniers NH2 cas, il va de soi que, lorsque le groupement R-CH est fonctionnalisé, les fonctions peuvent être protégées par les groupements protecteurs habituellement utilisés en synthèse peptidique.
v - Dans le cas des maléoylpeptides X représente un fragment de chaîne peptidique -(X.|-NH-CO) -X -où n = 1,2,3,4 et X a la même signification que le X décrit ci-dessus.
- X peut également représenter un radical phény! :
Lorsque le dérivé bifonctionnel défini ci-dessus représente des centres d'asymétrie, il peut être utilisé sous sa forme racémique ou sous une de ses formes optiquement actives.
λ * " · · "j
Plus particulièrement, les conjugués de l'invention peuvent être représentés par la formule suivante : "K5 H ^ ^ _ UOULt*..
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3 | Y O-C-X-N
R. ' « \ j , s;
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0 Ri t dans laquelle représente une protéine ou un fragment de protéine.
X est tel que défini ci-dessus R2 est COOC^_3 alkyle3ou CO-R7 où R^ est NH^^un ester d'acide aminé ou de peptide.
' R3 est H, CH3, CHO.
lorsque R^ et R^ sont pris séparément, R^ est H et un des ' Ri, et r5 et l’autre esc H eu CH. lorsque Rr et Rr son* pris ensemble avec les carbones j υ auxquels ils sont attaches, iis forment un noyau oxirane et R^ est éthyle .
—y e * 6 •Les composés ayant la formule précédente peuvent être décrits de manière générique soit comme des dérivés de la vinblastihe où R^ est COOCH^, R3 est méthyle,R^ est hydroxyle^ est éthyfe,Rg est hydrogène.
des dérivés de la vindésineoù R^ est CO-NH^, R^, R^, R^ et Rg ont· la signification décrite pour les dérivés de la Vinblastine.
dés dérivés de vinblastinoyl-23 amino acide où R2 est CO-Ry, Ry étant un ester d'acide aminé ou de peptide, R^, R^, R,. et Rg ont la signification décrite pour les dérivés de la Vinblastine.
des dérivés de la vincristine où Ry est COOCH^, est formyiejR^ est hydroxyl e R,. est éthyle ,Rg est hydrogène.
des dérivés de la leurosidine où R^ est COOCH^, R3 est méthylejR^ est éthyle R5 est hydroxyfe,Rg est hydrogène.
des dérivés dè la VLB "A" (il'-déoxyVinblastine) où R2 est COOCH3. R3 est méthyle,R^ et Rfi sont des hydrogènes, 'R,, est éthyle · des dérivés de la VLB "B" (H'-déoxyleurosidine) cù R2 est COOCH3, R3 est méthvlejR^ est éthyle,Rg et Rg sont des hydrogènes. ' des dérivés de la leurosine où R2 est COOCHg, R3 est méthyle ,R4 .est éthyle Rg et Rg forment ensemble un lien a -époxide.
Le dérivé bifonctionnel de type maléoylaminoacide peut résulter de la condensation d'une N-alkoxymaléïmide avec un acide aminé naturel OU non, dans le cas de la condensation avec la glycine X = Cl·^; avec l'alaline X = CH-CH3; avec la ß -alanine X = (CH^; avec la phénylalanine X = CH-CH--C.Hc; avec l'acide a -amino butyrique X = CH-CH--CH * avec la valine X = CH-CH-fCH^^; avec la norvaline X = CH-CHy-CH^-Cf·^; avec la leucine X = -CH-Cl-^-CH-fCH^; avec XC9H5 .
l'isoleucine X = -CH-CHN “ -avec la norleucine X = CH3 ' » CH-fCH^-Cl·^; ayec l'acide 6-amino caprolque X = fCHylg...
r j - . · f 7 m
Le dérivé bifonctionnel de type maléoylpeptide peut résulter egalement de la condensation d'une N-alkoxy maléimide avec un dipeptide, un tripeptide pour donner un dérivé -(X-NH-CO-) X, où X, peut avoir la même signification que le X décrit ci-dessus.
i
Les protéines qui peuvent être avantageusement utilisées sont en particulier l'albumine de sérum bovin ou humain, la fétuine ou des immunoglobulines.
Les protéines utilisées peuvent également être traitées afin d'être sélectivement modifiées. Ces modifications permettent d'obtenir des conjugués protéiques qui seront, lors de leur utilisation thérapeutique, préférentiellement concentrés au niveau de certains tissus, par exemple, au niveau du foie. Il est ainsi possible, préalablement à la condensation du dérivé de l'alcaloïde .vinca à la protéine, de galactosyler cette dernière.
Les immunoglobulines spécifiques aux antigènes de surface de cellules malignes et les techniques pour leur production à partir de sérum d'animaux immunisés ou pari culture d'hybridomes secrétant des anticorps monoclonaux sont bien connjues. Le type préféré d'anticorps pour l'usage dans l'invention est une immunoqlobuline de la classe IgG d'origine humaine.
Toutefois, les immunoglobulines d'autres espèces sont aussi inclues dans cette invention. Certaines immunoglobulines représentatives sont les suivantes’ : - Ig de chèvre ou de mouton immunisés avec l'antigène carcinoembryon-naire.
- Ig de lapin anti-LLA
[ - Différentes Ig de singe anti-LLA, anti-LMA, anti-LLC, anti-LMC.
; r 8 * » - lg de chèvre ou de mouton immunisés avec des membranes de carcinome du poumon.
- Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps contre le carcinome colo-rectal humain.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps contre le mélanome humain.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps réagissant avec des cellules leucémiques humaines.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps réagissant avec des cellules de neuroblastomes humaines.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps réagissant avec des antigènes de cancer du sein humain.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps réagissant avec des cellules de carcinome ovarien humain.
- lg monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps réagissant avec des cellules d'osteosarcome humain.
- la monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps du cancer du poumon.
Les coniugués peuvent également être préparés avec des fragments d'immunoglobulines à savoir les fragments Fab, Fab' ou F(ab')2 ou IgM monomère obtenus a partir d'un anticorps par digestion par un enzyme protéolytique.
Les conjugués de la présente invention sont obtenus, dans une première étape, par condensation d'un maléoylaminoacide ou d'un maléoylpeptide sur l'hydroxyle en d'un alcaloïde vinca 4-désacétyl indole-dihydroindole de ·. formule ll'pour donner un dérivé de formule III,
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Mgl - , R3 : tt R3 : « y* J II 3 . 00
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1 III R2 dans lequel X, R^, R^, R^, Rg, Rg ont la signification mentionnée ci-dessus.
Dans une deuxième étape, .les dérivés vinca-4-carboxy maléoyl III sont alors condensés avec une protéine ou un fragment de protéines par addition soit des groupements thiols libres, soit des groupements aminés libres de la protéine, par exemple, les groupements aminés dérivés des résidus lysine de la protéine sur la double liaison oléfinique de la maléïmide suivant un mécanisme d'addition de type Micha'el (Means, G.E. et Feeney, R.E.; Chemical modification of proteins, 1971, p.110-138, Holden Day Inc., San Francisco). J
Du point de vue chimique, - l'obtention des maléoylaminoacides ou des maléoylpeptides est réalisée selon les méthodes décrites par 0. Keller et J. Rudinger, Helv. 58, 531 f 1975), par D.H. Rieh, P.D. Cesselchen, « A. Tong, A. Cheung et C.K. Buckner; J. Med. Chem., 1_8, 1004 (1975) et par A". Sato et M. Nakao; J. Biochem., 90, 1117 (1981 ).
- la condensation des dérivés maléoyls avec l'alcaloïde vinca peut être effectuée de manière classique par un chioro-formiate d'alkyle, de préférence le chloroformiate d'éthyle ou d'isobutyle, en présence d'une base aminée telle que la triéthylamine, la N-méthyl pipéridine, la N-méthyl morpholine, dans un solvant organique tel que ^ l'acétate d'éthyle. Je tétrahydrofuranne, le chlorure de méthylène.
i * * 10 ! .
Le dérivé obtenu est isolé du milieu réactionnel et purifié au moyen de méthodes classiques utilisées en chimie.
Toute autre méthode d'activation du groupement carboxylique du maléoylamino acide ou du maléoylpeptide pour réaliser la condensation avec l'alcaloïde yinca, en particulier les méthodes utilisées dans la chimie des peptides, peut être appliquée à ce type de condensation.
En particulier, dans le cas où X est phényl, la condensation est réalisée avec le N-succinimidyI-3 maléimidobenzoate, obtenu selon les méthodes i décrites par T. Aikawa; J. Biochem., 79, 233 (1976) et M.J. O'Sullivan et al., Anal. Biochem., 100, 100 (1979).
L'obtention des conjugués peut être réalisée en faisant réagir la protéine, l'anticorps polyclonal ou monoclonal avec le composé vinca de formule III sous des conditions classiques, par exemple en milieu aqueux, à une température comprise entre U°C et 25°C et un pH de 7,5 à 9,5.
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Le nombre de résidus attachés peut dépendre de la concentration des réactifs et cie la durée de la réaction, mais le nombre moyen est ! · généralement compris entre 5 et 20.
Par exemple, une solution du composé III dans un solvant organique tel que le dioxanne est ajoutée goutte à goutte, à une solution tamponnée de ί protéine, par exemple un tampon phosphate 0,1 M à pH 8,2. Après une nuit à la température ordinaire, le conjugué est isolé par filtration sur qel, concentré par ultrafiltration et stérilisé. Le contenu en protéines est * *' mesuré par la méthode de Lowry et le contenu en alcaloïdes estimé par y ' mesure de la radioactivité.
« r I Les essais "in vitro" et "in vivo" effectués avec les composés de | l'invention pour démontrer leur activité anti-tumorale indiquent que la
jv formation du conjugué par l'intermédiaire d'un lien maléoyl O-CO-X-N
|| | peut être plus avantageuse que par un lien O-CO-X-CO- 0H
I 1 11
En effet, le lien maléoyl permet à la fois, la conjugaison des groupements thiols et des groupements aminés libres de la protéine ou du fragment de protéine. De plus, la digestion par les enzymes lysosomiales indiquent Îune libération beaucoup plus importante de l'alcaloïde vinc? dans le cas du lien maléoyl. Les conjugués sont également stables dans le sérum et à pH acide.
Les composés de l'invention ont été testés sur des souris BDF^ auxquelles une leucémie P388 a été implantée par voie intra-péritonéale. Les premiers résultats indiquent que les composés présentent une activité significative sur ce modèle expérimental puisqu'ils induisent une augmentation du temps de survie.
Les nouveaux conjugués de l'invention présentent des propriétés antitumorales particulièrement intéressantes et susceptibles d'être utilisées en thérapeutique humaine.
Pour leur application thérapeutique, les composés de l'invention, sont de préférence administrés par voie parentale, dissous dans un solvant pharmaceutiquement acceptable. L'eau physiologique ou d'autres solutions tamponnées, par exemple avec un phosphate sont des solvants appropriés. La substance active est généralement administrée à une posologie pouvant I varier de 50 mq à plusieurs grammes.
; | Les composés de l'invention peuvent en outre être utilisés en combinaison avec d'autres agents anti-tumoraux.
Ί I » !..
[ - 12
Les exemples suivants illustrent de manière non limitative le procédé conduisant aux composés de l'invention.
Exemple T. N-carbomethoxy maléimide.
Une solution de 3,8 g . (0,04 M) de maléimide et 4 g (0,04 M) de triethylamine dans 150 ml d'acétate d'éthyle est traitée à 0°C par 3 ml (0,04 M) de méthylchoroformiate dissous dans 20 ml d'acétate d'éthyle. Après une heure d'agitation, le précipité est filtré, lavé par l'acétate d’éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par de l'eau, séchées sur sulfate de sodium anhydre et évaporées à sec sous vide.
Le résidu, cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle-éther isopropylique, donne 4,19 g de N-carbomethoxy maléimide.
Spectre RMN : (CDCI3,6) : 6,75 (2H,s), 3,9 (3H,s) i
Exemple 2. N-Maléoyl L-alanine. !
Une solution de 2,3 g (0,025 M) de L-alanine dans 100 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium est traitée à 0°C, sous agitation vigoureuse, par 3,87 g (0,025 M) de N-carbométhoxymaléimide.
Après une heure, la solution est diluée par 200 mî d'eau et agitée à 40°C pendant une heure. Le pH de la solution (8,2) est ensuite amené à 6,4 par addition d'acide sulfurique concentré. La solution est ensuite concentrée à 100 ml et acidifiée à pH 2 par addition d'acide sulfurique 1 M et extraite trois fois par l'acétate d'éthyle. Les phase organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de sodium anhydre et évaporées à sec sous vide.
Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice félution chloroforme/acide acétique 95/5). On obtient de cette façon 1,2 g de N-maléoyl L-alanine.
Rendement 48%.
J
-, 13
Spectre I.R. (KBr) cm : 3400, 3100, 2930, 1780, 1740, 1700, 1460, 1420, 1390, 1370, 1345, 1220, 1175, 1118, 1080, 1068, 1015, 970, 835, 700.
Spectre R.M.N (CDCI )6: 6,7 (2H,s); 4,8 (lH,g); 1,65' (3H,d)
Exemple 3. 4-(N-maléoyl)-L-alanyl-vinblastine.
A une solution de 1,52 g (0,009 M) de N-maléoylalanine et de 1,25 ml (0,009 M) de triéthylamine dans 10 ml d'acétate d'éthyle refroidie à 0°C, s on ajoute goutte à goutte une solution de 1,17 ml (0,009 M) d'isobutyl- chloroformiate dans 5 ml d'acétate d'éthyle. On agite 1 h 30 à 0°C, puis on ajoute 2,3 g (0,003 M) de 0-4 deacetyl Vinblastine en solution dans | 20 ml d'acétate d'éthyle en gardant la température à 0°C. On laisse I ( * | ensuite revenir à température ambiante et agite le mélange 10 heures. On | ajoute 50 ml d'acétate d'éthyle et 50(ml d'une solution aqueuse à 10% de j carbonate de sodium. On agite, décante et sépare la phase organique.
ïi | La phase aqueuse est extraite trois 'fois par de l’acétate d'éthyle. Les I phases organiques réunies sont lavéefe par une solution aqueuse, séchées ! sur sulfate de magnésium et évaporée^ à sec sous vide. Le résidu obtenu ! est purifié par chromatographie sur colonne de silice" (élution dichloro- [ méthane/méthanol 92/8). On obtient ainsi 1,86 g de produit pur.
: Rendement : 67,6%
Spectre de masse (DCI, isobutane); 935 (M+14), 922 (M+1), 921 (M), 751, | ' 693, 519, 445, 371, 133.
|( Spectre RMN (CDC13,360 MHz,ppm):8 ( N H, 1 H ) ; 7,5-7 (4H,H-9',H-10;H-11 ', AH-12') ; 6,7 (2H,anhydride); 6,55 (1H, H-14) ; 6,05 (1H,H-17); 5,85 (1H,H-7); 5,45 (1 H,H-4) ; 5,15 (1H,H-6); m 4,8 ΠΗ, CH*); 3,95 (ΐΗ,Η-17'); 3,85 (3Η, -OMe); 3,78 (3H,-OMe); 3,7 (1H.H-2); 3,6' (3H,-Ome); 2,7 (3H,NMe) ; 1.72 (3H,CH3 alanine); 0,9-0,8 (6H, CH3-21, CH3-2T).
Exemple 4. Couplage de 4-(N-maléoyl)-L-alanyl Vinblastine avec l'albumine humaine galactosylée (AHgal). (V^-Ala-Mal-AHg) 88,4mg de 4-(N-maIéoyl)-L-alanyl Vinblastine sont dissous dans 1 ml de dioxanne. D'autre part, on prépare une solution de 50 mg d'AHgal dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 8,2. Le pH est ajusté ä 8,5 avec de la soude IN. Après une heure, la solution de 4-(N-maléoyl)-L-alanyl Vinblastine est ajoutée à la solution d'AHgal. Le mélange est agité à température ordinaire pendant 5 heures et ensuite clarifié par centrifugation. La solution est purifiée par filtration sur gel Sephadex G-25 (3 x 90 cm) équilibré dans une solution de NH^HCC^ 0,1 M pH 7,8.
Le pic ' exclu est collecté (96 m!) et concentré par ultrafiltration et stérilisé.
Le contenu en protéines est mesuré par la méthode de Lowry et le contenu en alcaloïdes estimé par mesure de la radioactivité.
Le conjugué obtenu contient 13,5 moles de Vinblastine par mole d'albumine humaine galactosylée.
Exemple ~5. Sensibilité aux enzymes lysosomiales.
3 H
La sensibilité du conjugué -Ala-Mai-AHgal aux enzymes lysosomiales a été étudiée par incubation, pendant 48 heures à 37°C, de ce conjugué en présence de cystéine 5 mM, de tampon acétate 40 mM et d'enzymes lysosomiales. Au cours du temps, des parties aliquotes sont prélevées et les protéines non dégradées sont précipitées par addition d'un volume d'acide trichloroacétique (TCA 401).
S- is ]h ; . Après incubation des échantillons <i 4°C pendant une heure, ceux-ci sont centrifugés et la radioactivité du surnageant est estimée par comptage d'une partie aliquote en scintillation liquide.
La radioactivité soluble est une mesure de la digestion du conjugué. L'expérience démontre que 851 du conjugué sont digérés après 24 heures. On n'observe plus d'évolution jusau'à 48 heures.
Exemple 6. Stabilité dans le sérum.
! La stabilité du conjugué V^'-Ala-Mal-AHgal en présence de sérum a été étudiée par incubation du conjugua an présence de 62% de sérum de veau foetal, à 37! C pendant 48 heures. Les parties aliquotes sont prélevées au • ; cours du temps et le pourcentage de digestion est mesuré par la technique de précipitation au T CA décrite précédemment. Les résultats ; montrent que le conjugué est stable au cours des 48 heures.
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Exemple 7. Stabilité à pH acide.
! ( - --
'· 3H
La stabilité du conjugué -Ala-Mnl-AHqal à pH acide a été étudiée par | incubation du conjugué en’présence de tampon acétate/40 mM, pH 4.5, à I 37°C, pendant 48 heures. La digestion est estimée par la technique de f , , I précipitation au TCA. Les résultats montrent que le conjugué est stable ! dans ces conditions.
! Exemple 8. Activité antitumorale.
j I! I L'activit*; chimiothérapique- du conjuquc Y ^ ‘-Aia-Mai-AHaa! a été évaluée sur la leucémie P388 administrée par voie i.p. chez la souris BDF^ femelle : 10, cellules tumorales sont inoculées par voie i.p. au jour 0. Le conjugué est administré par voie i.p. au jour 1,
Les premiers résultats démontrent que le conjugué présente une activité significative sur ce modèle expérimental puisqu'il induit une augmentation !ii . de survie de210% lorsqu'il esfedministré à la dose de i00mg/kg.
I . J c r. vrv k \i ·/
H
Claims (25)
1. Conjugués d'alcaloïde vinca de type indole-dihydroindole avec une protéine ou un fragment de protéine, répondant à la formule générale 05 .x , ; f io II \A:; /k J .. -*> , CUUCI!^ 15 , |!
4. I \ S.s- . r JL. . , -C" "· : I N /.j ' 1 I. 20 ; i » , i dans laquelle R_l représente une protéine ou un fragment 1 · * J de protéine; i
2. R2 est C00Ci_3 alkyle, ou CO-R7 où R7 est NH2/ un ester d'acide aminé ou de peptide; ' R3 est H, CH3, CHO; \ _ lorsque R5 et Rg sont pris séparément, Rg , · est H et un des R4 et R5 est éthyl et j 30 l'autre est H ou OH; lorsque R5 et Rg sont pris ensemble avec les. carbones auxquels ils sont attachés, ) ils forment un noyau oxirane et R4 est f éthyle et 35. est un dérivé organique bifonctionnel du . type maléoylaminoacide ou malêoylpeptide i tfk ou maléoylphênoxy. « 4 17
2. Conjugué selon la revendication 1 caractérisé en ce que A répond à la formule générale υ \ '>--—-1 05 HOCH. - X - - \ * \ A U 10 dans laquelle X représente une chaîne linéaire alkylène de 1 à 6 atomes de carbone, une chaîne ramifiée alkylène de 2 à 5 atomes de carbone, une chaîne cycloalkylène de 3 à 6 atomes de carbone, une chaîne phênylène de 3 à 6 atomes de carbone, ou le groupement R-CH des acides ami-15 nés naturels R-CH-COOH; nh2 un fragment de chaîne peptidique du type -(Χχ-ΝΗ-CO)η-Χχ- dans laquelle n = 1, 2, 3, 4 et Χχ est une chaîne linéaire alkylène !de 1 à 6 atomes de carbone, 20 une chaîne ramifiée alkylène (de 2 à 5 atomes de carbone, une chaîne cycloalkylène de 3 à 6 atomes de carbone, une chaîne phênylène de 3 à 6 atcmes de carbone, ou le groupement R-CH des acides aminés naturels; sous sa forme racémique ou sous une de ses formes opti- 25 quement actives ou bien un radical phényle.
3. Conjugué selon la revendication 1 caractérisé en ce que le ou les groupements fonctionnalisés RCH des | acides, aminés naturels, représentés par X ou Χχ, sont | protégés par des groupements protecteurs connus en soi.
4. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 est méthyle, R4 est hydroxyle, R5 est éthyle, Rg est hydro- i .gène.
5. Conjugué selon l'une quelconque des revendica- : 35 tions 1 à 3 caractérisé en ce que R2 est Ç0-NH2, R3, R4, J R5, R5 ont la signification décrite pour les dérivés de ! 1 la Vinblastine. i „ i ιδ
6. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que R2 est CO-R7 avec R7 étant un ester d'acide aminé ou de peptide, R3, R4, R5 et Rg ont la signification décrite pour les dérivés de 05 la Vinblastine.
7. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1- à 3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 est formyle, R4 est hydroxyle, R5 est éthyle, Rg est hydrogène.
8. Conjugué selon l'une quelconque des revendica tions 1 à 3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 est méthyle, R4 est éthyle, R5 est hydroxyle, Rg est hydrogène .
9. Conjugué selon 1'une quelconque des revendica-15 tions 1 à ‘3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 est méthyle, R4 et Rg sont des hydrogènes, R5 est éthyle. , 10. Conjugué selon l'une quelconque des revendi cations 1 à 3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 ^st méthyle, R4 est éthyle, R5 et Rg sont des hydrogè- 20 nés. {
11. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à'3 caractérisé en ce que R2 est COOCH3, R3 est méthyle, R4 est éthyle, R5 et Rg forment un lien &-époxide.
12. Conjugué selon l'une quelconque des revendi cations précédentes caractérisé en ce que la protéine Rg est l'albumine de sérum bovin ou humain, la fétuine ou £ des immoglobulines.
13. Conjugué selon l'une quelconque des revendi-30 cations précédentes caractérisé en ce que la protéine Rj^ est traitée sélectivement.
14. Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que R^ est une immunoglobuline choisie parmi le groupe constitué par
35. Ig de chèvre ou de mouton immunisés avec l'antigène carcinoembryonnaire; f· Ig de lapin anti-LLA; „ < “ 15 - différentes Ig de singe anti-LLA, anti-LMA, anti-LLC, anti-LMC; - Ig de chèvre ou de mouton immunisés avec des membranes de carcinome du poumon;
05. Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré tant des anticorps contre le carcinome colo-rectal humain; · - Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrétant des anticorps contre le mélanome humain;
10. Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré tant des anticorps réagissant avec des cellules leucémiques humaines; ; - Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré- ! tant des anticorps réagissant avec des cellules de J 15 neuroblastomes humaines; j - Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré- | tant des anticorps réagissant avec des antigènes de I cancer du sein humain; | j - Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré- j 20 tant des anticorps réagissant avec des cellules de j carcinome ovarien humain; | - Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secré- jj tant des anticorps réagissant avec des cellules d'os- [ téosarcome humain;
25. Ig monoclonales à partir d'hybridomes de souris secrê- f! | tant des anticorps du cancer du poumon; | ou un fragment d'immunoglobuline à savoir Fab, Fab* ou f F(ab')2 ou IgM monomère obtenu à partir d'un anticorps j; par digestion par un enzyme protéolytique, j 30 15. Procédé pour la préparation d'un conjugué d'alcaloïde vinca avec une protéine ou un fragment de protéine répondant à la formule (I) 1 -Λ A 20 05 --\ K<. MjJ > - H COOC11 -J s 1 : 10 / A'"A ' ! A,_γΝΟ- c ! I », I ?— ί «;«Ά.Α,. Αρ j I 15 *> ,: “ VA I 0 ». ί ! I dans laquelle Rj, R2, R3, R4, R5, Rg et X ont les signi- 1 fications mentionnées aux revendications 1 et 2, carac- [ 20 térisé en ce qu'on condense un maléoylaminoacide ou ma- léoylpeptide de formule I t 1 25 . — i - p
1 I ί :1-1(- - > l i i 30 î 35 i 1· î : ir .» * * 9' 21 sur l'hydroxyle en C4 d'un composé de formule générale (II) 05 ûdi?·' H ^ COOCH, Z' / /jO 15 1 „„ »3C0 i 3 11 ; *2 - 1 i 20 f dans laquelle R2, R3, R4, R5, Hg et X ont les significatio'ns mentionnées, et en ce qu'on condense le produit intermédiaire, obtenu avec une protéine ou un fragment de protéine.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on effectue la première étape de condensation au moyen à' un chloroformiate d'alkyle, de préférence le chloroformiate d'éthyle ou d'isobutyle, en présence d'une base aminée, telle que la triéthylamine, la N-mé- 30 thyl-pipéridine ou la N-méthylmorpholine, dans un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle, le tétrahy-drofuranne ou le chlorure de méthylène, et en ce qu'on .isole le composé intermédiaire obtenu du milieu réactionnel, en ce qu'on purifie et en ce qu'on effectue la 35 deuxième étape de condensation de manière classique, en milieu aqueux, à une température comprise entre 4°C et J25°C et un pH de 7,5 à 9,5. . -- - 22 17. À titre de composé intermédiaire, le composé de formule générale (III) 05 _ί Ιχγ^··»1
10 N ‘ H ^ " ^COOCH V *»- J L/x) L I °H 1 °v_ τΛΑιΛιΑ,,η' i r, : Il >- 3 · ; -oo kj • ί < 20 dans laquelle R2/ R3, R4, R5, R5 et X ont les significations mentionnées aux revendications 1 et 2.
18. Composition pharmaceutique comportant, à titre de substance active, le conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 en combinaison avec des 25 supports et excipients pharmaceutiquement acceptables selon une dose unitaire variant de 50 mg à plusieurs grammes, éventuellement en combinaison avec d'autres " substances actives.
19. Composition pharmaceutique selon la revendi- 30 cation 18 comportant le conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 à l'état dissous dans un solvant pharmaceutiquement acceptable, tel que l'eau physiologique ou des solutions tamponnées au moyen d'un tampon phosphate.
20. Utilisation du conjugué selon l'une quelcon que des revendications 1 à 14 pour la préparation de médicaments à activité anti-tumorale et cytostatique. _
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