DK164107B - Konjugater af vinblastin eller derivater deraf, fremgangsmaader til deres fremstilling og farmaceutiske praeparater indeholdende dem - Google Patents
Konjugater af vinblastin eller derivater deraf, fremgangsmaader til deres fremstilling og farmaceutiske praeparater indeholdende dem Download PDFInfo
- Publication number
- DK164107B DK164107B DK473286A DK473286A DK164107B DK 164107 B DK164107 B DK 164107B DK 473286 A DK473286 A DK 473286A DK 473286 A DK473286 A DK 473286A DK 164107 B DK164107 B DK 164107B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- group
- vinblastine
- conjugate
- conjugates
- solvent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
- C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6805—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a vinca alkaloid
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
DK 164107 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte konjugater af vinblastin eller derivater deraf med visse proteiner. Konjugaterne ifølge opfindelsen er brugbare som antisvulstmidler og ejendommelige ved at have den i krav 5 1's kendetegnende del viste almene formel I, hvor A, R , 2 3 R og R har de sammesteds angivne betydninger. Opfindelsen angår også fremgangsmåder til fremstilling af disse konjugater og farmaceutiske præparater som indeholder dem.
Vinblastin og nogle af dets derivater, navnlig vin-10 cristin og vindesin er allerede tidligere blevet koblet til proteiner, fx albumin eller forskellige immunoglobuli- ner. Som resultat heraf fremkommer der koblingsprodukter eller forbindelser der kaldes "konjugater". Specielt kan der henvises til følgende litteraturreferencer: J.D. Teale, 15 Jacqueline M. Clough og V. Marks, Br.J.Clin.Pharmac. 4, 169-172, 1977; C.H.J. Ford, C.E. Newman, J.R. Johnson, C.S. Woodhouse, T.A. Reeder, G.F. Rowland, R.G. Simmonds,
Br.J.Cancer 47, 35-42, 1983; M.J. Embleton, G.F. Rowland, R.G. Simmonds, E. Jacobs, C.H. Marsden, R.W. Baldwin, Br.
20 J. Cancer 47, 43-49, 1983; J.R. Johnson, C.H.J. Ford, C.E.
Newman, C.S. Woodhouse, G.F. Rowland, R.G. Simmond's, Br.J. Cancer 44, 472-475, 1981; Eli Lilly europæisk patentansøgningspublikation nr. 56.322 af 21. juli 1982 (svarende til DK patentansøgning nr. 59/82) og R.A. Conrad, G.J. Cullinan, 25 K. Gerzon, G.A. Poore, J.Med.Chem. 22, 391, 1979.
Europæisk patentansøgning nr. 84 870057.1 (offentliggjort som nr. 124.502 og svarende til DK patentansøgning nr. 2107/84) indeholder en beskrivelse af kobling af bis-indolderivater til et protein, et fragment 30 af protein eller en amin ved hjælp af en arm såsom -CCX^- eller -C0(CH2)n~C0, hvor n varierer fra 1-5, der eventuelt er substitueret med en alkyl- eller aminogruppe.
Kobling af disse bis-indolderivater er gennemført ikke blot med henblik på at udvikle nye immunologiske rea-35 genser, men navnlig med henblik på at fremstille antisvulst- stoffer som er mere aktive, mere selektive og mindre toxi-ske end de kendte.
DK 164107 B
2 I sidstnævnte henseende undersøges for tiden talrige konjugater af proteiner med andre antisvulstmidler.
Dette gælder særlig konjugater af antistoffer og et fragment af ricin eller konjugater af albumin og methotrexat (fransk patentansøgning nr. 2.437.213, C M Industries; og B.C.F.Chu, S.B. Howell, J. of Pharmacology and Exp. Therapeutics, 219 (2), 389-393 (1981).
Der skal også nævnes den kendsgerning at anvendelse af 1:1 komplekser af bis-indolalkaloider med tubulin er 10 blevet beskrevet i belgisk patentskrift nr. 854.053. I nogle tilfælde kan der som resultat heraf opnås lavere toxi-citet og en mere signifikant kemoterapeutisk aktivitet end af de tilsvarende frie alkaloider.
De fra ovennævnte DK 2107/84 (EP 124.502) kendte 15 konjugater kan gengives ved den almene formel I, således at R og R har de i omstående krav 1 angivne betydninger, R^ bl.a. kan have den i krav 1 angivne værdi, men også kan være en substitueret aminogruppe, men hvor forbindelsesgruppen A afviger ved at være en ligekædet gruppe såsom 20 -C0CH2“ eller -C0(CH2)n-C0-, hvor n er et tal 1-5. Gruppen A i konjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse har derimod en sidekæde -NH-R, hvor R er hydrogen eller en acylgruppe.
Der er foretaget sammenligningsforsøg mellem på den 25 ene side to forbindelser repræsenterende de fra DK 2107/84 kendte konjugater (den ene forbindelsen ifølge eksempel 9, hvor A er en hemisuccinatgruppe) og forbindelsen vin-blastin, på de anden side konjugatet ifølge omstående eksempel 3. Forsøgene udførtes som beskrevet i slutningen ^ af eksempel 3 og tog sigte på at bestemme de respektive forbindelsers virkning mod leukæmi hos hunmus.
Resultaterne fremgår af endenstående tabel: 35
DK 164107 B
3
Dosis vin- Dosis al- Overlevende
Forb caalkaloid bumin, MF Antal % ILS mus dag 60 nr. mg Ag mg/kg mus 5 ----------;-- 30 293 8,5 7 > 614 4/7 . 45 370 10 7 > 669 4/7 60 383 13 5 > 650 5/5 60 454 11 8 > 606 5/8 60 644 7,8 7 [ > 532 6/7 10 2__75__356__2ty>__10__57__0 70 536 12,1 7 109 0 3 80 690 12,1 7 120 0 100__844__09__3__-_25____0 3 10 77 0 4 4 10 0 0 15 11 --------- -----------l—......-........ ...
I tabellen står MF for molforholdet mellem vinca-alkaloid og galaktosyleret humant serumalbumin (hvorved do- 20 Ί sis af albumin svarer til mængden af gruppen R ) og ILS er den gennemsnitlige overlevelsestid for behandlede mus, udtrykt som % af overlevelsestiden for ubehandlede mus.
De afprøvede forbindelser er: 25 1: Konjugat ifølge opfindelsen (eksempel 3), nemlig 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vinblastin-galaktosyleret humant albumin, dvs. en forbindelse med formel I hvor A-R^ er en gruppe 30
- C - CH - (CH2) - C - galaktosyleret humant albumin O NHR O
2 3 hvor n = 1, R er en acetylgruppe, R er -OCH^ og R er 35 hydroxyl.
DK 164107 B
4 2: Konjugat ifølge eksempel 9 i DK 2107/84, nemlig vindesin-4-0-hemisuccinat-galaktosyleret humant albumin, dvs. en forbindelse med formel I hvor A-R1 er en gruppe 5 - C - CH^ - CH~ - C - galaktosyleret humant albumin, il λ 2 il 0 0 er -NH2 og R^ er hydroxyl.
3: Konjugat i henhold til krav 3 i DK 2107/84, nem- 10 lig desacetylvinblastin-0-4-hemisuccinat-galaktosyleret hu- mant albumin, dvs. en forbindelse med formel I hvor A-R er en gruppe - C - CH- - CH0 - C - galaktosyleret humant albumin, . _ II 2 2 il 15 0 0 2 3 hvor R er -OCH^ og R er hydroxyl.
4: Vinblastin, der svarer til den almene formel I
1 2 3 hvor A-R er en gruppe - C - CH^, R er -OCH^ og R er
20 hydroxyl. O
Det fremgår af tabellen at flere mus var i live mere end 60 dage efter injektion af konjugatet ifølge op-findlesen, mens ingen af de med sammenligningsforbindelserne behandlede var det. Det fremgår endvidere af kolonnen 25 % ILS at konjugatet ifølge opfindelsen er højstvirksomt mod den afprøvede leukæmistamme, medens de afprøvede forbindelser ifølge DK 2107/84 er væsentligt mindre virksomme; ved den høje dosis er virkningen af forbindelse nr. 3 endog negativ.
30 Derivatet af vinblastin kan være et derivat af 4-0-diacetylvinblastin, vindesin, 4-0-desacetylvinblastin koblet ved C-3 med en aminosyre, 4-0-desacetyl-desoxy-4'-: vinblastin eller 4-0-desacetyl-desoxy-4'-vinblastin koblet ved C-3 med en aminosyre.
35
DK 164107 B
5
Den terapeutiske virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen er højere end den terapeutiske aktivitet af de forbindelser som er blevet beskrevet hidtil, og deres toxicitet er betydelig lavere.
5 Derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse vin des i første trin ved kondensering af et anhydrid, fx as-paraginsyreanhydrid eller glutaminsyreanhydrid eller en højere homolog, eventuelt substitueret på amingruppen, til hydroxylgruppen ved 04 i 4-0-desacetylvinblastin eller 10 af 4-0-desacetyldesoxyvinblastin eller af et af derivater ne af 4-0-desacetyldesoxyvinblastin-3-karboxamid- eller 4-0-desacetyldesoxyvinblastin-4-karboxamidtype.
De således vundne hemiaspartat- eller hemiglutamat-eller homologe derivater kondenseres derefter med 15 det ønskede serumalbumin i et opløsningsmiddel hvori disse forbindelser er opløselige. Til dette formål kan der bruges en blanding af vand og dioxan der holdes på passende pH ved hjælp af en puffer, fx en fosfatpuffer. Kondensationen bekræftes ved kromatografering eller elek-20 troforese. I sidstnævnte tilfælde kan der bruges radioak tivt (fx tritieret) vinblastin for at lette karakteriseringen.
Fra et kemisk synspunkt kan kondensering med albuminet forklares ved dannelse af kovalente bindinger der 25 fremkommer som resultat af reaktion mellem amingrupperne i proteinet lysin med den aktiverede estergruppe stammende fra det eventuelt substitueret hemiaspartat eller hemi-glutamat.
Okseserumalbumin indeholder fx 56 aminrester af ly-30 sin. Antallet af molekyler vinblastin pr. molekyle albu min varierer som funktion af arbejdsbetingelserne, men er i almindelighed mellem 1 og 34.
Aktiveringen kan udføres på konventionel måde ved behandling med et alkylklorformiat, fortrinsvis ætyl- eller 35 isopropylklorformiat, i nærværelse af en aminbase såsom N-metylpiperidin eller N-metylmorfolin.
DK 164107 B
6
Kondenseringen kan udføres in situ på reaktionsblandingen som indeholder det aktiverede anhydrid. I de fleste tilfælde kan det aktiverede anhydrid imidlertid også isoleres.
5 Det vundne konjugat isoleres ved metoder som er konventionelle. Albuminkonjugatet udfældes følgelig fra reaktionsblandingen ved tilsætning af acetone og fracentrifugeres derefter, skylles, frysetørres og renses ved gelfiltrering. Om ønsket kan det således vundne derivat 10 underkastes en konventionel succinyleringsreaktion, hvil ket muliggør at man kan undgå de aggregeringsproblemer der karakteriserer visse konjugater og ikke-konjugeret materiale.
Det anvendte albumin kan være galaktosyleret så 15 der vindes konjugater som under anvendelse i terapien koncentreres fortrinsvis i visse væv, fx i leveren. Galak-tosyleringen udføres fx ved anvendelse af den metode der er besrkevet af G. Wilson i Journal of Biochemistry 253 (7) 2070-2072, 1978.
20 Forsøg udført in vitro med konjugaterne ifølge opfindelsen for at påvise deres antisvulstvirkning viser at dannelse af konjugatet ved en binding ved C-4 kan være mere fordelagtig end hvis bindingen sker ved C-3.
Det er også muligt at kondensere en forbindelse af 1 1 25 typen -A-R , hvor A og R har de foran angivne betydnin ger, i et passende opløsningsmiddel, til hydroxylgruppen i C-4 af 4-0-desacetylvinblastin eller 4-O-desacetyldes-oxyvinblastin eller af et af derivaterne af 4-0-desacetyl-vinblastin-3-karboxamid eller 4-0-desacetyldesoxyvinbla-30 stin-3-karboxamid. Aktiveringen kan med fordel udføres ved behandling med et alkylklorformiat såsom ætyl- eller isobutylklorformiat, i nærværelse af en aminbase såsom N-metylpiperidin, N-metylmorfolin eller triætylamin. De efterfølgende eksempler beskriver nogle konjugater ifølge 35 opfindelsen hvor bis-indolderivater er koblet i stilling C-4 til humant serumalbumin ved hjælp af en forbindelsesgruppe A af den substituerede hemiaspartat- eller hemi-glutamat-type.
DK 164107 B
7
Forbindelserne ifølge opfindelsen har faktisk særlig værdifulde antisvulstegenskaber som kan bruges i humanterapien.
5 Specielt kan disse vinblastinderivater bruges til behandling af leukæmier, gliomer, lymfosarcomer og andre maligne tumorer, herunder såkaldte "faste" svulster.
I humanterapien bruges de således til behandling af Hodgkins syge og mod andre svulster som kan påvirkes af 10 behandling med vinblastin, vineristin eller vindesin.
Til anvendelse i terapien indgives forbindelserne ifølge opfindelsen, eventuelt i frysetørret form, parente-ralt, i opløsning eller i et farmaceutisk acceptabelt opløsningsmiddel .
15 Egnede opløsningsmidler er fysiologisk NaCl-opløs- ning eller andre saltopløsninger som er pufret, fx med fosfat.
Det virksomme stof indgives i almindelighed i en dosis som kan variere fra 50 mg til flere gram. Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også bruges i kombination 20 med andre antisvulstmidler.
Eksempel 1 a) a- og Ø-Isomer af 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemias-2^ partat-vinblastin_ 250 mg N-acetyl-L-asparaginsyreanhydrid sættes til en opløsnign af 700 mg (0,91 mmol) 4-0-desacetylvinblastin i 20 ml vandfrit diklormetan.
Opløsningen omrøres i 20 timer ved stuetemperatur.
20 Efter destillation under vakuum af opløsningsmidlet renses den opnåede remanens ved kromatografering på silika (elue-ring med æter/metanol/25%s NH^OH 60:49,75:0,25).
Efter triturering i en blanding af diklormetan og petroleumsæter vindes der 650 mg 4-0-desacetyl-4-0-L-N-25 acetylhemiaspartat-vinblastin i form af et hvidt pulver og i et udbytte på 77%.
DK 164107 B
8 HPLC-analyse af produktet viser tilstedeværelse af de to isomerer α og M forholdet 85:15.
IR-spektrum (KBr): 3420, 2960, 2880, 1737, 1660, 1613, 1501, 1360, 1430 cm“1.
5 Massespektrum: DCI (isobutan): 925 (M+), 939 (M+ + 14), 857, 769, 693, 635.
b) a- og j3-Isomer af 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemias- partat-metylester-vinblastin_ 10 En opløsning af 500 mg (0,540 mmol) af oc- og Ø-iso- meren af 4-0-desacetyl-*4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vinbla-stin i 10 ml absolut metanol mættet med tørt HC1 omrøres i 20 timer ved stuetemperatur.
Efter destillation af opløsningsmidlet under vakuum 15 udvindes remanensen i en blanding af 15 ml destilleret vand og 15 ml diklormetan. Blandingen gøres alkalisk ved tilsætning af NH^OH. Den vandige fase ekstraheres med 3 x 20 ml diklormetan. De organiske ekstrakter forenes, vaskes successivt med 40 ml vand og 40 ml af en vandig op-20 løsning mættet med NaCl, hvorpå der tørres over magnesiumsulfat og inddampes under nedsat tryk. Remanensen renses ved kromatografering på silika (eluering med CH2C12/CH30H 95:5). Herved vindes der 410 mg a- og Ø-isomer af 4-O-des-acetyl-4-O-L-N-acetylhemiaspartat-metylester-vinblastin 25 i et udbytte på 81%.
Fraktioner resulterende fra kromatografering og in-. deholdende de enkelte isomerer analyseres.
30 Massespektrum (DCI, isobutan): 939 (M+), 940 (M+ + 1 ), 953 (M+ +14).
IR-spektrum (KBr): 2950, 2880, 1740, 1675, 1615, 1503 cm"1.
NMR-spektrum (CDC13, 360 MHz), 6: 9,65 (OH), 8,02 35 (NH), 7,52 (H-9'), 7,16-7,05 (H-10', H-11·, H-12'), 6,61 (H-9), 6,52 (NH), 6,07 (H-12), 5,75 (H-14), 5,52 (H-17), 5,17 (H-15), 4,75 (-CH-NH), 3,95 (H-17A'), 3,80 (-OMe),
DK 164107 B
9 3,77 (-OMe), 3,70 (-OMe), 3,60 (-OMe), 2,80 (H-21A', H-21B'), 2,67 (NMe), 2,62 (H-21), 2,00 (MeCO), 0,92-0,75 (2 Me).
Rf: 0,51 (CH2C12/CH30H 90:10 silika).
5
Isorner_i_mindre_mængde :
Massespektrum (DCI-isobutan): 939 (M+), 940 (M+ + 1).
IR~spektrum (KBr): 1740, 1675, 1615 cm-1.
NMR-spektrum (CDCX3, 360 MHz), 5: 9,25 (OH), 8,02 10 (NH), 7,50 (H-91), 7,16-7,05 (Η-10', Η-11', H-12'), 6,61 (H-9), 6,52 (NH), 6,08 (H-12), 5,82 (H-14), 5,47 (H-17), 5,28 (H—15), 4,75 (CH-NHAc), 3,93 (Η-17A'), 3,77 (2 x OMe), 3,60 (OMe), 2,70 (NMe), 2,02 (MeCo-), 0,95-0,77 (2 Me).
Rf: 0,39 (CH„C19/CH,0H 90:10 silika).
15 J
Eksempel 2 a- og y-Isomer af 4-0-desacetyl-4-0-L-N-karbobenzyloxyhe- miglutamat-vinblastin_ 20 En opløsning af 300 mg (0,39 mmol) 4-O-desacetyl- vinblastin og 144 mg (0,519 mmol) N-karbobenzyloxy-L-glu-taminsyreanhydrid i 5 ml diklormetan omrøres i 20 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet afdampes under vakuum. Den vundne remanens renses ved kromatografering på si-25 lika (eluering: æter/metanol/25%s NH^OH 50:49,5:0,5).
På denne måde vindes der 230 mg 4-0-desacetyl-4-O-L-N-karbobenzyloxyhemiglutamat-vinblastin i form af en blanding af a- og y-isomeren.
HPLC-analyse af produktet viser tilstedeværelse af 30 a- og y-isomeren i mængdeforholdet 60:40.
IR-spektrum (KBr): 3450, 2960, 2880, 1730, 1612, 1593, 1501, 1459, 1432, 1228 cm"1.
Massespektrum (DCI-isobutan): 1032 (M+ + 1), 984, 928, 723.
35
DK 164107 B
Eksempel 3 10
Kobling af 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vinbla- stin med galaktosyleret albumin af human oprindelse_ 5 a) 80,6 g 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat- vinblastin opløses i 2 ml dioxan. Opløsningen udhældes derefter i et isbad. Der tilsættes 24,4 μΐ triætylamin i 0,5 ml dioxan og 22,6 μΐ isobutylklorformiat i 0,5 ml dioxan. Blandingen omrøres i 1 time.
1q Endvidere tilberedes der en opløsning af 200 mg ga laktosyleret humant albumin i 37 ml H20. pH reguleres til 8,5 ved hjælp af 0,1N NaOH.
Opløsningen afkøles til 4°C. Efter 1 time sættes den aktiverede ester til opløsningen af galaktosyleret hu-15 mant albumin. Opløsningen omrøres i 14 timer ved 4°C mens pH holdes på 8,5 ved tilsætnign af 1N NaOH. Derefter renses opløsningen ved filtrering på "Sephadex" ®gel G 25 ækvilibreret ved hjælp af en opløsning af NaCl 9:1000, pH 7,5. De fraktioner som indeholder konjugatet forenes, 2q koncentreres ved filtrering og steriliseres. Proteinindholdet bestemmes ved Lowry-metoden og indholdet af alkaloider bedømmes ved bestemmelse af radioaktiviteten.
Det vundne konjugat indeholder 13 mol vinblastin pr. mol galaktosyleret humant albumin. HPLC-bestemmelse 25 af monomerer, dimerer og polymerer af konjugatsammensætnin-gen viser 82% monomerer og 18% dimerer.
b) 80,6 mg 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vinblastin opløses i 2 ml dioxan. Opløsningen udhældes der-3Q efter i et isbad. Der tilsættes 24,4 μΐ triætylamin i 0,5 ml dioxan og 22,6 μΐ isobutylklorformiat i 0,5 ml dioxan.
Desuden tilberedes der en opløsning af 200 mg galaktosyleret humant albumin i 37 ml 0,1M fosfatpuffer pH 8,2. pH reguleres til 8,5 ved hjælp af 1N NaOH.
55 Opløsningen afkøles til 4°C. Efter 1 time sættes den aktiverede ester til opløsningen af galaktolyseret humant albumin. Opløsningen omrøres i 14 timer ved 4°C mens
DK 164107 B
11 pH holdes på 8,5 ved tilsætning af IN NaOH. Opløsningen renses ved filtrering på "Sephadex" ® gel G 25 ækvilibre-ret med en opløsning af NaCl 9:1000, pH 7,5. De fraktioner som indeholder konjugatet forenes, koncentreres ved 5 ultrafiltering og steriliseres. Proteinindholdet måles ved Lowry-metoden og indholdet af alkaloider bedømmes ved bestemmelse af radioaktiviteten. Det opnåede konjugat inde-Det opnåede konjugat indeholder 9,3 mol vinblastin pr. mol galaktosyleret humant albumin. HPLC-bestemmelse 10 af monomerer, dimerer og polymerer i konjugatsammensætnin-gen viser 91,5% monomerer, 7% dimerer og 1,5% polymerer.
Konjugatets følsomhed for lysosomielle enzymer er undersøgt ved inkubering i 48 timer ved 37°C i nærværelse af 5 mM cystein, 40 mM acetatpuffer og lysosomiale enzy-15 mer. Der udtages prøver og de ikke nedbrudte proteiner udfældes ved tilsætning af et rumfang trikloreddikesyre (TCA? 40% TCA). Efter inkubering ved 4°C i 1 time centrifugeres prøverne og den ovenstående væskes radioaktivitet bedømmes ved tælling af scintillationerne i en prøve af væsken.
20 Den opløselige radioaktivitet er et mål for fordøj elsen af konjugatet. Praktiske forsøg har vist at 75% af konjugatet er blevet fordøjet efter 24 timer. Der er ikke iagttaget nogen yderligere udvikling op til 48 timer.
Den kemoterapeutiske aktivitet af dette konjugat 25 er blevet bestemt på P 388 leukæmi med hunmus af stammen g BDF.J: 10 svulstceller indpodes intraperitonealt på dag 0. Konjugatet indgives intraperitonealt på dag 1. Forsøgsresultaterne viser at konjugatet udviser vigtig virkning ved denne forsøgsmodel fordi den fører til en forøgelse 30 af levetiden på mere end 650% hvis det indgives i en mængde på 60 mg/kg, og antallet af overlevende mus er 5/5 efter 60 dage.
35
Eksempel 4
DK 164107 B
12 a- og β-Isomeren af ætyl-N-(4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetyl- hemiaspartat-vinblastinoyl-23)-L-tryptofanat_ 2 Ved at gå frem på den i eksempel 1 beskrevne måde omdannede man ætyl-N-(desacetyl-4-0-vinblastinoyl-23)-L-tryptofanat til ætyl-N-(4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetyl-hemi-aspartat-vinblastonoyl-23)-tryptofanat (blanding af isome-rerne α og /3).
^0 Den vundne remanens renses ved kromatografering på silika (eluering med æter/metanol/25%s NH^OH 50:49,75:0,25).
Der vindes 200 mg af produktet ud fra 314 mg af udgangsproduktet .
+ 1
Massespektrum (DCL, acetone): 1126 (M ), 1066, 15 984, 970, 951, 911.
IR-spektrum (KBr): 3400, 2960, 2940, 1665, 1618 cm"1. Eksempel 5 a- og Ø-Isomer af ætyl-N-(4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetyl- 20 hemiaspartat-vinblastonoyl-23)-L-isoleucinat_
Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 4 omdannede man ætyl-N-(desacetyl-4-0-vinblastinoyl-23)-L-isoleucinat til ætyl-N-(4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiaspartat-vin-blastinoyl-23)-L-isoleucinat.
Massespektrum (DCI-acetone): 1051 (M+), 1036, 1009, 977, 897, 838, 755, 709, 652.
IR-spektrum (KBr): 3410, 2963, 2929, 2880, 1734, 1676, 1612, 1500, 1460, 1430, 1372, 1333, 1293 cm"1.
Eksempel 6 cc- og γ-Isomer af 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetylhemiglutamat- vinblastin_
Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 2 behandle-35 de man 4-O-desacetylvinblastin med N-acetyl-L-glutaminsy-reanhydrid til dannelse af 271 mg 4-0-desacetyl-4-0-L-N-acetyl-hemiglutamat-vinblastin (blanding af isomererne α
DK 164107 B
13 og r) ud fra 380 mg 4-O-desacetylvinblastin.
Massespektrum (DCI-acetone): 940 (M+1), 871, 707. IR-spektrum (KBr): 3470, 2960, 2880, 1740, 1665, 1617 cm'1.
5 10 15 20 25 30 35
Claims (9)
1. Konjugat af vinblastin eller et derivat deraf, kendetegnet ved at det har den almene formel OT3U h /A/\\ R ch3ooc J 10 / i CH , 0 0-A-R
2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den α-aminosyreester hvoraf R er afledet er ætyl-tryptofanat eller ætylisoleucinat.
3. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet 2 ved at R er en metoxygruppe eller aminogruppe.
3 CH, Γ0Η
15 LcO 23 \-RZ hvor A er en forbindelsesgruppe såsom NH-R NH-R I I -C0CH-(CHo) CO- eller -C0-(CHo) CHCO-2U 2. n 2 n hvor n er et helt tal 1-5, R er et hydrogenatom eller en acylgruppe såsom acetyl, trifluoracetyl eller karbobenzyl-oxy, R^ er en eventuelt galaktosyleret rest af bovint el-ler humant serumalbumin, R en metoxygruppe, en aminogrup-25 pe eller et α-aminosyreesterradikal som er bundet ved hjælp af en binding af amidtype og hvori estergruppen in-deholder 1-6 kulstofatomer, og R er et hydrogenatom eller en hydroxylgruppe, i alle tilfælde i de to mulige konfigurationer.
4. Fremgangsmåde ved fremstilling af konjugater som angivet i et hvilket som helst af kravene 1-3, kende- 15 DK 164107 B tegnet ved at et anhydrid af en syre med formlen NH-R HOOC-CH-(CH2)nCOOH 5 hvor n og R har de i krav 1 angivne betydninger, kondenseres til hydroxylgruppen ved C-4 i vinblastinderivatet, hvorpå det således vundne derivat kondenseres med den eventuelt galaktosylerede rest af bovint eller humant 10 serumalbumin.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at opløsningsmidlet ved den første kondensering i det væsentlige består af diklormetan og at opløsningsmdilet i det andet kondenseringstrin er en blanding af vand og 15 dioxan.
6. Fremgangsmåde til fremstilling af et konjugat som angivet i et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved at en gruppe af typen NH-R NH-R I 1 I 1
20 -C0-CH-(CHo) -COR1 eller -CO-(CH-) -CHCOR 2 n 2 n 35 hvor R er resten af et bovint eller humant serumalbumin og n og R har de i krav 1 angivne betydninger, kondenseres til hydroxylgruppen ved C-4 i vinblastinderivatet.
^ 7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at en aktivering af udgangsproduktet udføres ved behandling med et alkylklorformiat såsom ætylklorformiat, i nærværelse af en aminbase såsom N-metylpiperidin, N-me-tylmorfolin eller triætylamin.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af krave ne 4-7, kendetegnet ved at der yderligere udføres en centrifugering, en skylning, en frysetørring og/ eller en rensning ved gelfiltrering samt om ønsket en konventionel succinyleringsreaktion. DK 164107 B 16
9. Farmaceutisk præparat til behandling af leukæmier, lymfosarcomer eller andre maligne tumorer, herunder såkaldte "faste" svulster samt til behandling af Hodgkins syge, kendetegnet ved at det indeholder et kon-5 jugat som angivet i et hvilket som helst af kravene 1-3 i kombination med et fortyndingsmiddel, et opløsningsmiddel, en excipient eller et farmaceutisk acceptabelt bærestof, hvorhos den aktive forbindelse er i frysetørret form eller i opløsning i et pufret opløsningsmiddel.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU86157A LU86157A1 (fr) | 1985-11-12 | 1985-11-12 | Nouveau procede de fabrication de conjugues de la vinblastine et de ses derives |
| LU86157 | 1985-11-12 | ||
| EP86870042 | 1986-04-08 | ||
| EP86870042A EP0222722B1 (fr) | 1985-11-12 | 1986-04-08 | Nouveaux conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK473286D0 DK473286D0 (da) | 1986-10-03 |
| DK473286A DK473286A (da) | 1987-05-13 |
| DK164107B true DK164107B (da) | 1992-05-11 |
| DK164107C DK164107C (da) | 1992-10-05 |
Family
ID=26106792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK473286A DK164107C (da) | 1985-11-12 | 1986-10-03 | Konjugater af vinblastin eller derivater deraf, fremgangsmaader til deres fremstilling og farmaceutiske praeparater indeholdende dem |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | ATE89567T1 (da) |
| AU (1) | AU577206B2 (da) |
| DK (1) | DK164107C (da) |
| GR (1) | GR862436B (da) |
| HU (1) | HU196217B (da) |
| OA (1) | OA08424A (da) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2508905B1 (da) * | 1981-07-01 | 1984-01-27 | Roussel Uclaf | |
| EP0178683B1 (en) * | 1984-10-19 | 1989-08-09 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Imunoassay for estriol-3-sulfate |
| IL82579A0 (en) * | 1986-05-27 | 1987-11-30 | Lilly Co Eli | Immunoglobulin conjugates |
| US5094849A (en) * | 1988-08-08 | 1992-03-10 | Eli Lilly And Company | Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized vinca analogs via simple organic linkers |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR81790B (da) * | 1983-04-29 | 1984-12-12 | Omnichem Sa |
-
1986
- 1986-04-08 AT AT86870042T patent/ATE89567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-09-24 GR GR862436A patent/GR862436B/el unknown
- 1986-09-30 AU AU63401/86A patent/AU577206B2/en not_active Ceased
- 1986-10-03 DK DK473286A patent/DK164107C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-10-06 HU HU864190A patent/HU196217B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-10-07 OA OA58971A patent/OA08424A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE89567T1 (de) | 1993-06-15 |
| HU196217B (en) | 1988-10-28 |
| AU577206B2 (en) | 1988-09-15 |
| DK473286D0 (da) | 1986-10-03 |
| GR862436B (en) | 1986-12-23 |
| AU6340186A (en) | 1988-04-14 |
| OA08424A (fr) | 1988-06-30 |
| HUT42493A (en) | 1987-07-28 |
| DK473286A (da) | 1987-05-13 |
| DK164107C (da) | 1992-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4870162A (en) | Conjugates of vinblastine, a process for their preparation and their use in therapy | |
| JP6942147B2 (ja) | Ｍｔ１−ｍｍｐに対して特異的な二環式ペプチド−毒素コンジュゲート | |
| JP2930965B2 (ja) | Ｃ―３位に脂肪鎖を有するビンカ誘導体の複合体 | |
| AU2020301289A1 (en) | Antibody-drug conjugate, intermediate thereof, preparation method therefor and application thereof | |
| CN112138171A (zh) | 抗体偶联药物、其中间体、制备方法及应用 | |
| JPH11508911A (ja) | 新規ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、それらの製造および該阻害剤を含む医薬組成物 | |
| US5030620A (en) | Vinblastine derivatives, and pharmaceutical compositions containing them | |
| EP1150999B1 (fr) | Derives de cyclosporine et procede de preparation desdits derives | |
| JP2023053386A (ja) | チューブリシンおよびそれらの中間体の調製のためのプロセス | |
| JP2023550532A (ja) | Ｔｒｏｐ２を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法及び使用 | |
| EP3268046A1 (en) | Conjugates for treating diseases | |
| EP0240200A2 (en) | Cross-linking agents, their use and preparation | |
| CN114191564A (zh) | 一种非天然鹅膏毒肽类抗体偶联物 | |
| DK164107B (da) | Konjugater af vinblastin eller derivater deraf, fremgangsmaader til deres fremstilling og farmaceutiske praeparater indeholdende dem | |
| TWI825169B (zh) | 妥布賴森(tubulysins)及其中間體之製備之替代方法 | |
| Bakas et al. | Immunoproteasome inhibition and bioactivity of thiasyrbactins | |
| EP0222722B1 (fr) | Nouveaux conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués | |
| WO2023097407A1 (en) | Modified amatoxins and uses thereof | |
| LU86212A1 (fr) | Nouveaux conjugues de la vinblastine et de ses derives,procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant | |
| WO2022120476A1 (en) | Amatoxin analogs and uses thereof | |
| LU85161A1 (fr) | Nouveaux conjugues de la vinblastine,leur procede de preparation et leur utilisation therapeutique | |
| EP3313858B1 (en) | Methods for the site-selective coupling of a first agent to a second agent | |
| RU2800137C1 (ru) | Конъюгат антитело-лекарственное средство, промежуточное соединение для его получения, способ его получения и его применение | |
| HK40114433A (zh) | 在包括经修剪的n-聚糖的fc区处涉及转谷氨酰胺酶的缀合方法 | |
| WO1996031518A1 (en) | Novel tumor-inhibiting bisindole derivatives with calmodulin-liberator effect and pharmaceutical composition containing them |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |