DE2548196C2 - Antigene auf Basis von Methaqualon- Hapten sowie deren Verwendung - Google Patents

Antigene auf Basis von Methaqualon- Hapten sowie deren Verwendung

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Description

Methaqualon ist ein Beruhigungs- und Schlafmittel und besitzt die chemische Bezeichnung 2-Methyl-3-o-tolyl-4(3H)-chinazolinon. Es ist im Jahre 1965 in den Vereinigten Staaten von Nordamerika auf den Markt gebracht worden. Wie kürzlich berichtet worden ist, wird mit dieser Verbindung ein erheblicher Mißbrauch getrieben (Smith und Wesson in Ann. Rev. Pharmacol. 14 [1974], 513).
Methaqualon wird offensichtlich sehr stark im Körper abgebaut, so daß nur sehr geringe Mengen unverändertes Methaqualon im Urin aufgefunden werden. Die Stoffwechselprodukte sind größtenteils Glucuronide von monohydroxylierten Derivaten (Bonnichsen und Mitarbeiter in Clin. Chim. Ada 40 [W2], 309). Die Hydroxylierung tritt hauptsächlich in den 3- und 4-Stellungen und an der Methylgruppe des Tolyl-Ringes auf. Offensichtlich ist das Chinazolin-Ringsystem in den Stoffwechselprodukten weitgehend unverändert.
Die US-PS 37 09 868 beschreibt die Bestimmung von Opiumalkaloiden und offenbart die für eine solche Bestimmung notwendigen Opiumalkaloidantigene und Opiumalkaloidantikörper. Die grundlegende Methodik Antigene herzustellen, indem man ein nicht-immunogenes biologisch aktives Material (Hapten) über ein geeignetes Brückenglied kovalent an einem immunogenen Träger, wie beispielsweise Rinderserumalbumin, bindet, ist seit langem bekannt. Die Schwierigkeiten liegen jedoch in der Auswahl des geeigneten Haptens, welches als solches nicht mit dem immunogenen Träger reagieren kann, und welches so /n ilerivatisieren ist, daß ein zu diesem Zweck in das Haptenmolekül eingeführtes Brückenglied nicht die Stellen blockiert, die für die Immunreaktion wichtig sind.
Erfindungsgemäß wird nun ein Antigen, das für Methaqualon und seine Stoffwechselprodukte spezifische Antikörper zu erzeugen vermag, wenn es Wirtssäugern injiziert wird, offenbart, bestehend aus einem Methaqualon-Hapten mit einem Methaqualon-Rest, erhältlich durch Bindung des Tolyl-Ringes des Methaqualone an ein Brückenglied eines Aminocarbonyl-alkylen-carboxy-, eines niederen Hydroxyalkylencarboxy- oder eines niederen Alkylen-carboxy-Restes mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wobei das Hapten mit der Carboxy-Gruppe des Brückengliedes kovalent an Rinderserumalbumin als immunisierendes Trägermaterial gekoppelt ist. Das Hapten isf vorzugsweise ein N-Carbonyl-iniederJalkylen-carboxy-Derivat des
2-Methyl-3-(2-methyl-4-aminophenyl)-3,4-dihydro-4-chinazolinons, wobei vorzugsweise der Carbonyl-(nieder)alkylen-carboxy-Rest die Succinyl-Gruppe ist. Als immunisierendes Trägermaterial wird in den
ίο Beispielen der vorliegenden Erfindung mit Rinderserumalbumin gearbeitet, obwohl dem Fachmann andere gleichwirkende Trägermaterialien bekannt sind. Die erfindungsgemäßen Antigene werden üblicherweise durch Umsetzen der primären Aminogruppe des 4-Aminophenyl-Methaqualonanalogons mit einer niederen Alkylendicarbonsäure oder deren aktivierten funktioneilen Derivaten hergestellt, zum Beispiel dem Anhydrid, dem Mono-p-niirophenyl-ester oder Carbonylhalogenid. Das erhaltene N-Carbonyl-(nieder)aIkylen-carboxy-Derivat (Hapten) wird dann über die freie Carboxygruppe an die freien Amino- oder Hydroxyl-Gruppen des immunisierenden Trägermaterials unter Bildung des gewünschten Antigens kovalent gekoppelt. Auf diese Weise werden die wichtigen entscheidenden als Antigen wirkenden Stellen am Chinazolin-Ringsysiem des Methaqualons nicht beeinträchtigt.
Der in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdruck »immunisierendes Trägermaterial« ist dem Fachmann bekannt und er versteht darunter eine solche Substanz, die die Eigenschaft besitzt, unabhängig einen immunisierenden Reiz beim Wirtstier hervorzurufen, wenn die Substanz injiziert wird, und die mittels einer konvalenten Bindung an das Methaqualon-Hapten gekoppelt werden kann. Beispiele solcher Trägermaterialien sind Proteine, natürliche oder synthetische polymere Verbindungen, wie Polypeptide, zum Beispiel Polylysin, insbesondere Proteine wie Serumproteine, zum Beispiel y-Globuline von Menschen und Rindern oder Serumalbumine von Menschen, Rindern und Kaninchen, ferner Polysaccharide und dergleichen. Für die Durchführung vorliegender Erfindung wird insbesondere Rinderserumalbumin eingesetzt.
Die erste Stufe bei der Herstellung des Antigens besieht darin, daß man 2-Methyl-3-(2-methyl-4-aminophenyl)-3,4-dihydro-4-chinazolinon mit einer niederen Alkylendicarbonsäure oder deren vorstehend genannten Derivaten umsetzt. Vorzugsweise ist der niedere Alkylen-Rest geradkettig und weist 1 bis 6 Kohlenstoffatome auf. Außerdem wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Anhydrid der Dicarbonsäure verwendet. Besonders bevorzugt ist Bernsteinsäureanhydrid.
Die Umsetzung zwischen der niederen Alkylendicarbonsäure oder deren Derivat und der 4-Aminophenyl-Verbindung kann in üblicher Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann Bernsteinsäureanhydrid mit der 4-Aminophenyl-Verbindung in einem organischen Lösungsmittel, wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff, zum Beispiel Benzol, Xylol oder Toluol, durch Erhitzen unter Rückfluß zur Erzeugung des N-Succinamidsäure-Derivats umgesetzt werden.
Die Verwendung des Succinamidsäure-Derivats ist bei vorliegender Erfindung besonders zweckmäßig.
b5 Andere Mittel zur Einführung der Brückenglieder zwischen den wichtigen entscheidenden Haptenen und dem immunisierenden Trägermaterial sind wohlbekannt. Beispielsweise würde eine Alkylierung des
Methaqualone nach Friedel-Crafts mit einem Halogenalkansäureester oder eine Alkylierung eines Alkylimetallsalzes eines phenolischen Methaqualon-Derivats mit einem Halogenalkansäureester nach einer Hydrolyse der Ester Verbindungen liefern, die mit den hier beschriebenen Haptenen vergleichbar sind. Eine andere Alternative besteht in der direkten Synthese des Methaqualon-Haptens aus N-Aretyl-anthranilsäure und einem Ester eines 4-(nieder)Alkylcarboxy-2-methylanilins mit anschließender Esterhydrolyse.
Vorzugsweise besitzen die erfindungsgemäß eingesetzten Brückenglieder 2 bis 7 Kohlenstoffatome in der verbindenden Kette. Es ist von Vorteil, daß die Brückenglieder in dem Methaqualon-Molekül den Tolyl-Ring in der p-Stellung zum tertiären Stickstoffatom substituieren.
Beispiele von hier als Haptene wertvollen Verbindungen sind 2-Methyl-3-[2-methyl-<t-(2-carboxyäthyl)-phenyl]-3,4-dihydro-4-chinazolinon und 2-Methyl-3-[2-
methyl-4-(2-carboxyäthoxy)-phenyl]-3,4-dihydro-4-chinazolinon.
Demgemäß werden ganz allgemein die Haptene vorliegender Erfindung so betrachtet, daß sie einen Methaqualon-Rest mit einem Brückenglied aufweisen, das an den Tolyl-Ring gebunden ist, wobei das Brückenglied aus einem Amino-carbonyl-alkylcn-carboxy-, einem niederen Hydroxyalkylen-carboxy- oder einem niederen Alkylen-carboxy-Rest besteht.
Die erhaltenen Haptene können an das immunisierende Trägermaterial nach beliebigen und verschiedenen an sich bekannten Verfahren gekoppelt werden.
Eines dieser Verfahren sieht die Verwendung eines Kopplungsmittels wie eines wasserlöslichen Carbodiimids, zum Beispiel l-Äthyl-3-(3-dimelhylaminopropyl)-carbodiimid, vor. Das erhaltene Antigen kann durch Abtrennen von nicht umgesetzten Ausgangssubstanzen und niedermolekularen Nebenprodukten nach üblichen Trennverfahren, wie einer Dialyse, gereinigt werden.
Ein anderes bekanntes Verfahren besteht in der Verwendung eines gemischten Anhydrids. Bei diesem Verfahren werden niedere Trialkylamine, wie Triäthylamine, und niedere Alkylfluorformiate unter Bildung der gewünschten Reaktionslösung mit dem Hapten in einem cyclischen Äther, wie Dioxan, als Lösungsmittel verwendet. Diese Lösung wird dann zu einer wäßrigen Lösung des immunisierenden Trägermaterials gegeben, die ebenfalls einen cyclischen Äther als Lösungsmittel enthalten kann, um die Löslichkeit des aktivierten Haplens zu verbessern. Diese Reaktion wird vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, das heißt bei etwa 8°C, durchgeführt. Für diese Reaktion ist ein basischer pH-Wert, wie ein pH-Wert von etwa 9, erwünscht. Das Antigen kann, wie vorstehend angegeben, nach üblichen Verfahren gewonnen werden.
Die Kopplung des Methaqualon-Haptens mittels der Carbodiimid-Methode an Rinderserumalbumin hat ergeben, daß etwa 18 bis 25 Moläquivalente auf ein Mol Protein kommen.
Das Antigen vorliegender Erfindung kann dann zur Herbeiführung einer Bildung von für Methaqualon und Methaqualon-Stoffwechselprodukte spezifischen Antikörpern im Serum der Wirtstiere durch Injizieren des Antigens in diese Wirtstiere eingesetzt werden. Das gesammelte Serum kann als solches als methaqualonspezifisches Antiserum verwendet werden, oder es können gegebenenfalls die Antikörper im Serum noch gereinigt werden, zum Beispiel durch Ausfällen mit einer neutralen Salzlösung mit anschließender Dialyse und Säulen-Chromatographie oder durch andere bekannte Maßnahmen.
Geeignete Wirtstiere zur Erzeugung von Antiserum gegen Methaqualon sind Säugetiere, wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Kühe, Schafe und dergleichen. Die erhaltenen Antikörper besitzen eine Vielzahl von aktiven Stellen, die selektiv mit Methaqualon, mit dem Methaqualon-Antigen vorliegen-
der Erfindung oder mit nahe verwandten Derivaten des Methaqualons, wie den hauptsächlichen Stoffwechselprodukten des Methaqualons Komplexe zu bilden vermögen.
Die spezifischen mit den erfindungsgemäßen Antige-
nen hergestellten Antikörper sind wertvoll als Reagentien bei biochemischen Untersuchungen zur Bestimmung des Vorliegens von Methaqualon und seinen Stoffwechselprodukten in biologischen Flüssigkeiten. Ein besonders bevorzugtes Untersuchungsverfahren ist
das in der US-PS 37 09 868 beschriebene Unempfindlichkeitsuntersu^hungsverfahren. Bevorzugte markierte Methaqualon-Derivate zum Gebrauch bei diesen Unempfindlichkeitsuntersuchungen umfassen die mit Isotopen markierten Methaqualon-Derivate, insbesondere l25Jod-2-methyl-3-(2-methyl-4-hydroxyphenyl)-4(3H)-chinazolinon, sowie solche Methaqualone, die mit einer Elektronenspirresonanzgruppe markiert sind. Beispiele von verschiedenen einsetzbaren mit Elektronenspinrosonanzgruppen markierten Molekülen in biologischen Untersuchungen sind in den US-Patentschriften 34 53 288,34 81 952 und 35 07 876 aufgeführt.
Beispiel 1 Herstellung des Antigens
Zu 100 mg Rinderserumalbumin (»kristallisiert«; 1,47x10" Mol) in 10 ml Wasser werden 19.8 mg (8x10-? Mol) N-[3-Methyl-4-(2-methyl-4-oxo-3,4-dihydrochinazolin^-ylj-phenylj-succinamidsäure in 0,5 ml N-Methyl-pyrroIidon gegeben. Die erhaltene Lösung wird mittels 0,1-n Salzsäure oder 0,1-n Natronlauge auf pH 5,5 eingestellt. Zu dieser Lösung werden 15,4 mg (8x 10-5MoI) 1)Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid-hydrochlorid auf einmal unter Rühren mit einem magnetischen Rührer zugegeben. Diese Lösung wird 4 Stunden gerührt, währenddessen der pH-Wert mittels 0,1 -n Salzsäure zwischen 5,5 und 6,0 gehalten wird. Dann läßt man das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4°C stehen und dialysiert über Nacht gegen 1 Liter
so entsalztes Wasser. Das Dialysat wird dann ausgetauscht, und die Dialyse wird mehrere Stunden fortgesetzt. Das gewünschte Antigen wird aus dem Dialysegefäß gewonnen.
Das Ausmaß einer Kopplung des Haptens bei 2
immunisierenden Präparaten beträgt 18 bis 25 Moläquivalente Methaqualon auf ein Mol Rinderserumalbumin.
Immunisierung und Blutentnahme
Zur Immunisierung von Ziegen wird das dialysierte Antigen des Beispiels 1 mit phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung auf eine Protein-Konzentration von annähernd 2 mg/ml verdünnt. Die verdünnte Antigenlösung wird danach mit dem gleichen Volumen Freund's Adjuvans emulgiert. Die ersten drei Impfungen (unter Verwendung des vollständigen A juvans) werden in wöchentlichen Abständen, die vierte nach weiteren drei Wochen und dann in monatlichen Abständen verabreicht (ab der vierten
Impfung mit dem unvollständigen Adjuvans). Jede Impfung besteht aus zwei subkutanen Injektionen von jeweils 0.5 ml.
Nach zwei, drei und vier Wochen nach der ersten Impfung wird jeweils Blut entnommen. Nach fünf Wochen und danach in zweiwöchigen Abständen werden 300 ml Blut entnommen. Daraus wird nach Standardverfahren das Serum hergestellt.
Beispiel 2
N-[3-Methyl-4-(2-methyl-4-oxo-3,4-dihydrochinazoIin-S-ylJ-phenylJ-succinamidsäure
In einen mit einer Wasserfalle ausgerüsteten 1-Ltr.-Kolben werden unter Stickstoff 12,0 g (0,045 Mol)
2-Methyl-3-(2-methyl-3-aminophenyl)-3,4-dihydro-4-chinazolinon und 300 ml Benzol gegeben. Nach dreistündigem Erhitzen unter Rückfluß haben sich Spuren Wasser in der Wasserfalle angesammelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 4,8 g (0,048 Mol) Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt, und das Gemisch wird unter Rühren über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen und Filtrieren wird der erhaltene Feststoff mit Benzol gewaschen und unter vermindertem Druck bei 50°C getrocknet. Man erhält 13,1 g eines Feststoffes vom Schmelzpunkt 202,5-203,50C (Zers). Der Feststoff wird danach 30 Minuten bei 60°C in 150 ml Wasser aufgeschiämmt. filtriert, mit wenig Wasser gewaschen und dann unter vermindertem Druck bei 500C getrocknet. Anschließend wird der Feststoff 40 Minuten in 1 Liter Acetonitril unter Rückfluß erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und filtriert. Man erhält nach dem Trocknen unter vermindertem Druck bei 50° C 9.1 g der in der Überschrift genannten Verbindung vom Fp. 228,5 -229,5°C. Ausbeute: 55 Prozent der Theorie.
Analyse für C20H19NjO*:
Berechnet: C 65,75. H 5,24, N 11,50%.
gefunden: C 65,67, H 5,11, N 11.70%.
Beispiel 3
Herstellung eines l25Jod-markierten
Methaqualon-Derivats
2-Methyl-3-(2-methyl-4-hydroxyphenyl)-4(3H)-chinazolinon wird in Dimethylsulfoxid gelöst, bis eine Konzentration von 2 mg/ml erreicht ist, und dann mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt. Diese Lösung wird dann unter Verwendung von Na125J und dem Natriumsalz des p-ToluolsuIfonsäure-chloramins unier üblichen Bedingungen jodiert.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Antigen bestehend aus einem Methaqualon-Hapten mit einem Methaqualon-Rest, erhältlich durch Bindung des TViyl-Ringes des Methaqualone an ein Brückenglied eines Aminocarbonylalkylencarboxy-, eines niederen Hydroxyalkylen-carboxy- oder eines niederen Alkylen-carboxy-Restes mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, wobei das Hapten mit der Carboxy-Gruppe des Brückengliedes kovalent an Rinderserumalbumin als immunisierendes Trägermaterial gekoppelt ist.
2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten ein N-Carbonyl-(nieder)alkylencarboxy-Derivat des 2-Methyl-3-(2-methyl-4-aminophenyl)-3,4-dihydro-4-chinazolinons ist.
3. Antigen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Carbonyl-(nieder)alkylen-carboxy-Rest die Succinyl-Gruppe ist.
4. Verwendung der Antigene nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Antikörpern.
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