DE69434279T2

DE69434279T2 - Impfstoff, der einen menschlichen autologenen epidermalen Wachstumsfaktor enthält und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69434279T2
Application number: DE69434279T
Authority: DE
Inventors: Bienvenido Lage Plaza Dávila; Gisela González Marinello; Belinda Sánchez Centro Habana Ramirez; Eduardo Suárez 10 de Octubre Peztana; Irene Beausoleil Flores Delgado; Gilda Nunez Regla Gandolf
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-08
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2014-12-09
Also published as: EP0657175A3; JP2823519B2; CA2137639C; JPH07285883A; CA2137639A1; EP0657175A2; DE69434279D1; CN1142973A; EP0657175B1; CN1106858C; ES2237750T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, die eine Autoimmunreaktion gegen den autologen (eigenen) epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) hervorrufen können.
Eine wichtige Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, eine Impfstoffzusammensetzung für die aktive Immuntherapie bei von EGF abhängigen malignen Tumoren zu erhalten, die die Proliferation dieser Tumore hemmen kann und die folglich für die Behandlung von malignen Tumoren und anderen mit dem EGF in Zusammenhang stehenden Erkrankungen nützlich ist. Die Erfindung betrifft folglich auch das Gebiet der Krebstherapie.
BESCHREIBUNG DES EINSCHLÄGIGEN STANDES DER TECHNIK:
Es wurde in Betracht gezogen, daß der epidermale Wachstumsfaktor, ein Polypeptid, das die Epithelzellproliferation stimuliert, einer der Wachstumsfaktoren ist, die an malignen Transformationen beteiligt sind. Seine Wirkung erfolgt hauptsächlich über seine Membranrezeptoren.
Der epidermale Wachstumsfaktor EGF ist ein Polypeptid mit 53 Aminosäuren, sein Molekulargewicht beträgt etwa 6.045 D. Er wurde aus der Drüse im Unterkiefer der Maus zum ersten Mal abgetrennt und gereinigt (Cohen S. J. Biol. Chem. (1962) 237, 1.5551, später wurde ein ähnliches Molekül aus dem menschlichen Urin gewonnen (Cohen S. Human Epidermal Growth factor: Isolation and Chemical and Biological Properties PNAS USA 72, 1975 1 317).
EGF kann die Proliferation von Epithel- und Mesenchymzellen sowohl in vitro als auch in vivo stimulieren (Cohen S., Carpenter G., PNAS USA 72, 1317, 1975) und der EGF führt bei einigen Brustkrebszellinien zu einer spezifischen Stimulation (Osborne C. K. et al., Can Res. 40, 2.361 (1980)). Die Rolle des EGF bei diesem Differenzierungsprozeß der Brustdrüse, hauptsächlich bei der Ausbildung des alveolären Lobulussystems, ist bereits nachgewiesen worden (Tonelli C. J. Nature (1980) 285, 250–252).
Diese bioregulierende Wirkung wird über einen Membranrezeptor (EGF-R), ein Glycoprotein mit 1.186 Aminosäuren mit etwa 170 kD, ausgeübt, dessen Gen geklont und einer Sequenzanalyse unterzogen worden ist. Die intrazelluläre Domäne des Rezeptors ist mit der Aktivität der für Tyrosin spezifischen Proteinkinase verbunden, die eine Strukturhomologie mit dem onkogenen Produkt v-erb-B aufweist, was den Zusammenhang mit dem malignen Transformationsprozeß zeigt (Heldin C. H. Cell 37, 9–20 (1984)).
EGF und dessen Rezeptor bilden einen Molekülkomplex mit hoher Spezifität, und durch die Wechselwirkung zwischen ihnen entsteht der wichtige Mechanismus der Zellwachstumsregulierung.
Hohe Werte des EGF-R wurden in vom Epithel stammenden malignen Tumoren, wie Brust-, Nieren-, Eierstocks-, Gebärmutter-, Kolon-, Lungen-, Gehirn- und Speiseröhrenkrebs, nachgewiesen. Die Rolle, die EGF und dessen Rezeptor bei der Regelung des Tumorwachstums spielen, ist unbekannt, es gibt jedoch Hinweise, daß die Expression des EGF-R in Tumorzellen einen Mechanismus für die autokrine Wachstumsstimulation liefert, der zu einer unkontrollierten Proliferation führt (Schlessinger J., Schreiber A. B., Levi A., Liberman T., Yarden Y. Crit. Rev. Biochem. 1983, 14 (2) 93–111).
Das Vorhandensein des EGF-R in Tumorzellen hat sich als Hinweis auf eine schlechte Prognose bei Humanbrustkrebs gezeigt. Etwa 40% der Brusttumore zeigen spezifische Bindungsorte mit einer hohen Affinität für den EGF, es gibt auch einen umgekehrten Zusammenhang mit dem Vorhandensein des Östrogenrezeptors, was auf den EGF-R als Dedifferenzierungsmarker oder einen Indikator der möglichen Proliferationskapazität der malignen Zellen hinweist. (Perez R., Pascual M. R., Macias A., Lage A., Breast Cancer Research and Treatment 4, 189–193, 1984).
Es wurde auch berichtet, daß die Expression von EGF-R in örtlichen Ganglionmetastasen stärker als in primären Brustkarzinomen ist (Sainsbury J. R., et al. (1985): Lancet 1 (8.425), 364–366), und daß die Expression des Rezeptors in den verschiedenen histologischen Unterarten der Brustkrebszellen unterschiedlich ist, wodurch dessen Vorhandensein ebenfalls zu einem Hinweis für eine schlechte Prognose wird (Macias A., et al. (1986); Anticancer Res. 6: 849–852).
Frühere Untersuchungen, die beim Ehrlich-Aszitestumor-Modell (EAT-Modell) bei einer Balb-c-Maus durchgeführt wurden, zeigten die Hemmwirkung von EGF in vivo (Lombardero J., et al. Neoplasma 33, 4 (1987)), was die Möglichkeit nahelegt, dieses Molekül als einen Modifikator für die biologische Reaktion zu betrachten.
Vom Vorhandensein eines EGF-Vorläufermoleküls in der Zellmembran von von EGF abhängigen Tumoren ist bereits berichtet worden. Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben dies als eine wichtige Tatsache angesehen, um dieses Molekül als Ziel für die Wirkung von Antikörpern in Betracht zu ziehen.
Die bei verschiedenen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse haben dazu veranlaßt, das EGF/EGF-R-System als mögliches Ziel für therapeutische Wirkungen in Betracht zu ziehen.
Die passive Immuntherapie unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen den EGF-R war Aufgabe vieler Untersuchungen, die nachgewiesen haben, daß die spezifische Erkennung durch den Antikörper des Rezeptors die EGF-Bindung mit einer Hemmwirkung auf die mitogene Stimulierung der malignen Zellen hemmt (SATO J. D., et al. Methods in Enzymology, Bd. 146, S. 63–81, (1987)), diese Antikörper, die von der Maus stammen, erzeugen jedoch gewöhnlich eine Human-Anti-Maus-Antikörperreaktion (HAMA).
Bis zur vorliegenden Erfindung wurde keine wirksame Immuntherapie gegen von EGF abhängige Tumore vorgeschlagen, die die Proliferation hemmen kann, da auf diesem Fachgebiet ständig berichtet wird, daß "Selbst"-Moleküle keine Immunreaktion hervorrufen, da der Wirt gelernt hat, gegenüber sich selbst tolerant zu sein.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die einen humanen autologen EGF enthält, der an ein Transportprotein gekoppelt ist, wobei dieser Komplex durch eine Autoimmunwirkung das Wachstum von von EGF abhängigen Tumoren ohne die Nebenwirkungen der Einführung eines heterologen Proteins in den menschlichen Körper hemmt.
Diese Impfstoffzusammensetzung kann bei der Behandlung von von EGF abhängigen Tumoren oder irgendeiner mit dem EGF verbundenen malignen Erkrankung verwendet werden.
Es ist selbstverständlich, daß EGF in dieser Beschreibung so verstanden werden muß, daß er irgendein Fragment und/oder Derivat des EGF einschließt, das ähnliche immunologische Eigenschaften und/oder Wirkungen wie das ursprüngliche Molekül hat. Zu den Derivaten gehören herkömmliche Aminosäuresubstitutionen, der ortsspezifische Austausch von Aminosäuren für eine bessere Stabilität und/oder Aktivität, chemische Modifizierungen oder dergleichen, sie sind jedoch nicht darauf begrenzt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
I. ERHALT EINES IMMUNOGENEN PRÄPARATS:
Es wurden zwei Präparate erhalten. Das erste ist ein EGF der Maus (mu-EGF), der an ein Transportprotein gekoppelt ist, und das zweite ist ein rekombinanter Human-EGF (hu-re-EGF) (National Medicament Register Office, Kuba, HEBERMIN, Nr. 1266), der ebenfalls an ein Transportprotein gekoppelt ist.
Das Präparat, das hu-rec-EGF enthält, der an ein Transportprotein gekoppelt ist, wurde erhalten, um es nur bei Nicht-Humanprimaten und beim Menschen zu verwenden. Es wird ein geeignetes Adjuvans verwendet.
Der mit einem Transportprotein konjugierte mu-EGF wird bei Untersuchungen verwendet, die bei Mäusen als Modell durchgeführt wurden, um die Immunogenität und die Antitumorwirkung eines Präparats zu bestimmen, das ein autologes EGF-Molekül enthält.
Bei Primaten wurden Immunogenitätsuntersuchungen mit dem Konjugat aus hu-EGF-Transportprotein-Träger durchgeführt, da hu-EGF dem EGF von Primaten sehr ähnlich ist, obwohl es als Selbst-Molekül erkannt worden ist. Diese Ergebnisse ermöglichten den Nachweis, daß eine immunogene Reaktion eines autologen Moleküls auftreten kann.
Um die Präparate zu erhalten, wurde eine Lösung des Maus- oder hu-rec-EGF in 10 mM PBS/MgCl₂ mit einer Lösung des Transportproteins im gleichen Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 bis 5 Mol EGF pro Mol Protein gemischt.
Danach wird 0,5% Glutaraldehyd zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,1 bis 0,05% zu erhalten.
Das Gemisch wird 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend in 10 mM PBS/MgCl₂ dialysiert, wobei die Dialyselösung mindestens dreimal gewechselt wird.
KENNZEICHNUNG DES KONJUGATS:
Der Test der Wirksamkeit der Konjugation und des Erhalts der Antigenität wird mit dem Assay ELISA durchgeführt.
ELISA-Platten aus aktiviertem PVC (NUNC) wurden mit 50 μl eines Antiserums gegen das verwendete Transportprotein mit einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml bestrichen. Im Falle des Choleratoxins Chaim B (CTB) als Träger wurden die Platten mit dem Gangliosid GMI bestrichen.
Anschließend wurden drei Waschungen mit PBS/Tween (Handelsbezeichnung) durchgeführt, und danach wurden die Platten mit einer BSA-Lösung mit 0,5 bis 1% in PBS/Tween blockiert, dann wurden sie für einen Zeitraum von 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Den Platten wurden Verdünnungen von 0,1 bis 0,001 mg/ml der zu prüfenden Konjugate zugesetzt, 50 μl/Vertiefung, und 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
Im nächsten Schritt wurde ein Maus-Anti-hu-rec-EGF-Antiserum mit einer Verdünnung von 1:500 bis 1:1.000, 50 μl/Vertiefung, zugesetzt und 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Als letzter Schritt wurden die Platten 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37°C mit einem Anti-Maus-alkalische Phosphatase-Antiserum mit einer Verdünnung von 1:500 bis 1:1.000, 50 μl/Vertiefung, inkubiert.
Die Farbe der Reaktion wurde mit p-Nitrophenylphosphat mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Diethanolamin, 50 μl/Vertiefung, hervorgebracht, es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die optische Dichte wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
Die Ergebnisse zeigten die Aktivität des Moleküls und die Wirksamkeit der Konjugation, da das Konjugat seinen Erkennungsort für das die Platten überziehende Molekül beibehält, das das Transportprotein spezifisch erkennt und gleichzeitig von einem Antiserum für EGF erkannt werden kann.
II. CHARAKTERISIERUNG DER EFFEKTE, DIE VOM mu-EGF ENTHALTENDEN PRÄPARAT HERVORGERUFEN WURDEN; VORKLINISCHE UNTERSUCHUNGEN.
IIa) ENDOGENE EGF-IMMUNOGENITÄT: HERVORRUFEN DER AUTOIMMUNITÄT BEI MÄUSEN.
Um die Leistungsfähigkeit des mu-EGF enthaltenden immunogenen Präparats nachzuweisen, das nach dem im Punkt I beschriebenen Verfahren erhalten wurde, bei dem die Autoimmunität gegenüber dem endogenen EGF hervorgerufen worden war, wurde ein Test mit Balb/C-Mäusen durchgeführt.
Gruppen von Tieren wurden für 4 bis 6 Wochen mit unterschiedlichen Dosen im Bereich von 50 bis 100 μg mu-EGF, das mit dem Transportprotein konjugiert war, pro Tier pro Woche geimpft.
In der ersten Woche wurde das immunogene Präparat in einem Verhältnis von 1:1 mit komplettem Freund'schem Adjuvans hergestellt, alle folgenden Dosen wurden mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt.
Das gleiche Verfahren wurde in einer Kontrollgruppe durchgeführt, diesen Tieren wurde jedoch nur das Adjuvans verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, das Serum wurde vom Rest des Blutes abgetrennt, und der Titer der Antikörper gegen mu-EGF wurde durch die ELISA-Technik bestimmt.
IIb) IMMUNOGENITÄT VON hu-rec-EGF:
Um die Immunogenität des hu-rec-EGF bei Mäusen nachzuweisen und aufzuzeigen, daß die Antikörper gegen hu-rec-EGF den mu-EGF erkennen, wurde der Versuch bei Balb/C-Mäusen durchgeführt.
Gruppen von Tieren wurden für 4 bis 6 Wochen mit unterschiedlichen Dosen im Bereich von 50 bis 100 μg des hu-rec-EGF-Proteins pro Tier pro Woche geimpft.
In der ersten Woche wurde das immunogene Präparat in einem Verhältnis von 1:1 mit komplettem Freund'schem Adjuvans hergestellt, alle folgenden Dosen wurden mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt.
Das gleiche Verfahren wird bei einer Kontrollgruppe durchgeführt, diesen Tieren wird jedoch nur das Adjuvans verabreicht.
Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, das Serum wurde vom Rest des Blutes abgetrennt, und der Titer der Antikörper gegen mu-EGF wurde durch die ELISA-Technik bestimmt.
IIc) ANTITUMORWIRKUNG:
Die Hauptaufgabe dieses Versuchsverfahrens besteht in der Bestimmung, ob die gegen den autologen EGF erhaltene Immunreaktion irgendeine Antitumorwirkung bei von EGF abhängigen Tumoren zeigen kann.
Die Tiere mit einem höheren Titer der Antikörper, der nach dem bereits beschriebenen Verfahren bestimmt worden war, wurden mit dem Ehrlich-Aszitestumor (EAT) in Zellkonzentrationen von 0,2 bis 2 Millionen Zellen/Tier geimpft. Die Kontrollgruppe wurde in der gleichen Weise behandelt.
Bei den Tieren wurden sowohl die Übertragung als auch das Überleben beobachtet.
III. KENNZEICHNUNG DER IMMUNREAKTION:
IIIa) ISOTYP DER ANTIKÖRPERREAKTION
Um zu bestimmen, ob die bei der Immunisierung der Mäuse mit dem autologen EGF erhaltene Autoimmunreaktion eine Reaktion ist, die Antikörper des Isotyps IgM oder IgG erzeugt, wurde der Assay ELISA durchgeführt, wobei die Seren der Tiere getestet wurden, die nach den in den Punkten IIa) und b) beschriebenen Verfahren mit dem EGF immunisiert worden waren. Im Falle der IgM-Kennzeichnung wurde ein Antiserum gegen dieses Molekül mit den Proben inkubiert. Die IgG-Kennzeichnung erfolgte mit einem Antiserum gegen IgG.
IIIb) KENNZEICHNUNG DES GEDÄCHTNISSES DER IMMUNREAKTION
Die Entwicklung eines Produktes, das als Impfstoff bei einer wirksamen Therapie verwendet werden soll, erfordert die Bestimmung seiner Fähigkeit, ein immunologisches Gedächtnis hervorzubringen, und die Bestimmung der Dauer dieses Gedächtnisses, wenn es hervorgebracht worden ist.
Diese Information erlaubt die Möglichkeit einer exakten Gestaltung der Immunisierungsschemata, die mit dem Produkt ergänzt werden können.
Gruppen von Mäusen werden mit einer Dosis von 50 bis 100 μg hu-rec-EGF pro Tier in komplettem Freund'schem Adjuvans in einem Verhältnis von 1:1 immunisiert.
Die Kinetik der Antikörperproduktion gegenüber mu-EGF wurde bei unterschiedlichen Tiergruppen untersucht. Diese Untersuchung wurde nach der ersten Immunisierung und nach erneuten Immunisierungen, als der Titer abnahm, durchgeführt. Die Antikörperwerte werden unter Anwendung der ELISA-Technik bestimmt.
IV. UNTERSUCHUNGEN DER IMMUNOGENITÄT BEI NICHT-HUMAN-PRIMATEN.
Die Kriterien der Immunogenität des immunogenen Präparats basieren auf Ergebnissen, die bei Nicht-Human-Primaten erhalten wurden, da diese Spezies darstellen, die dem Menschen am ähnlichsten sind.
Eine Gruppe von Primaten wird mit dem immunogenen Präparat immunisiert, das hu-rec-EGF in einer Dosis von 500 μg (mit Tetanus erzeugendem Toxoid konjugiert) zusammen mit dem Adjuvans enthält. Nach der letzten Immunisierung wurde eine Blutprobe entnommen, und es wurden die Titer der Antikörper gegen hu-EGF bestimmt.
VERSUCHE
BEISPIEL 1
UNTERSUCHUNG DES VORHANDENSEINS EINES EGF-VORLÄUFERMOLEKÜLS IN DER ZELLMEMBRAN VON VON EGF ABHÄNGIGEN TUMOREN
Diese Untersuchung wurde mit einem Western-Blotting-Verfahren durchgeführt. Es wurden Proben von 5 Ductus-Karzinomen der Brust in unterschiedlichen Stadien, ein Kopf- und Genicktumor, 4 Proben von Fibrozysten-Dysplasie und 5 als Kontrollen erhaltene normale Proben untersucht.
Die Zellmembranen wurden nach einem Verfahren von den Proben erhalten, das anderswo beschrieben ist (Grimaux M., Rev Neurol. 1988, 144: 101–103).
Die Elektrophorese wurde bei 250 V, 10 mA, 3,0 W, 15°C und 150 Vh durchgeführt. Es wurden Molekulargewichtsstandards im Bereich von 14.300 D (Lysozym) bis 340.000 D (α₂-Makroglobulin) verwendet.
Die bei der Elektrophorese abgetrennten Proteine wurden in einer Pufferübertragungslösung auf eine Nitrozellulosemembran mit 0,45 μm in einem Phast-System-Gerät übertragen. Nach der Übertragung wurde die Membran über Nacht unter konstantem Rühren mit 10% Magermilch blockiert.
Nach drei Waschungen in der Pufferlösung wurde ein monoklonaler Antikörper der Maus, der Human-EGF erkennt, zugesetzt und für 1 Stunde inkubiert.
Nach drei Waschungen wurde ein biotinylierter Antikörper für die Maus zugesetzt und für 1 Stunde inkubiert. Ein Peroxidase-Streptavidin-Konjugat wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde nach einstündigem Inkubieren mittels Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid hervorgebracht.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die untersuchten Proben, die normalen Geweben entsprechen, keine Bande in der Zone des hohen Molekulargewichts entsprechend der Standards aufwiesen. Die der Brustpathologie (Dysplasie und Karzinome) entsprechenden Proben zeigten eine diffuse Bande in der Zone des hohen Molekulargewichts. Das ist ein experimenteller Beweis des Vorhandenseins einer EGF-Vorläuferverbindung mit hohem MW in den Tumormembranen.
BEISPIEL 2
ERHALT DES mu-EGF/CTB-KONJUGATS
1 ml mu-EGF in 10 mM PBS/MgCl₂ mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde mit 2 ml einer Lösung von CTB im gleichen Lösungsmittel in einem Verhältnis von 1 Mol mu- EGF pro Mol CTB gemischt. Es wurde Glutaraldehyd (3 ml, 0,5%) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,05% zu erhalten.
Es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und danach in 10 mM PBS/MgCl₂ dialysiert, wobei die Dialyselösung mindestens dreimal ausgetauscht wurde.
BEISPIEL 3
KENNZEICHNUNG DES mu-EGF/CTB
Assay ELISA für den Konjugattest: aktivierte ELISA-Platten aus PVC (NUNC) wurden mit 50 μl Gangliosid GM1 (erkennt das CTB-Molekül) mit einer Konzentration von 4 μg/ml in Methanol bestrichen, sie konnten für 1 Stunde in dem Strom austrocknen.
Anschließend wurden drei Waschungen mit PBS/Tween durchgeführt, und dann wurden die Platten mit einer Lösung von 1% BSA in PBS/Tween blockiert und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Konjugatverdünnungen mit 0,1 bis 0,001 mg/ml wurden den Platten mit 50 μl/Vertiefung zugesetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach wurde ein Anti-mu-EGF-Antiserum mit einer Verdünnung von 1:1.000, 50 μl/Vertiefung, zugesetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Dann wurden die Platten 1 Stunde bei 37°C mit dem Konjugat von Anti-Maus-Antiserum-alkalische Phosphatase (Verdünnung 1:1.000), 50 μl/Vertiefung, inkubiert. Die Farbe wurde mit p-Nitrophenylphosphat mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Diethanolamin, 50 μl/Vertiefung, hervorgebracht, es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, die optische Dichte wurde bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen der Konzentration des Konjugats und den Absorptionswerten. Das zeigt die Aktivität des Konjugats und die Wirksamkeit der Konjugation, da das Molekül die Erkennung für das Gangliosid GM1 beibehält (identifiziert CTB) und gleichzeitig von einem Anti-mu-EGF-Antiserum erkannt wird (1).
BEISPIEL 4
IMMUNOGENITÄT EINES AUTOLOGEN EGF: HERVORRUFEN DER AUTOIMMUNITÄT BEI MÄUSEN
Um nachzuweisen, daß das immunogene Präparat, das den autologen EGF enthält, eine Autoimmunität hervorrufen kann, wurde der Versuch bei Balb/c-Mäusen durchgeführt.
Gruppen von Tieren wurden für 4 bis 6 Wochen wöchentlich subkutan mit einer Dosis von 50 μg des konjugierten mu-EGF pro Tier geimpft.
Während der ersten Woche wurde das immunogene Präparat in einem Verhältnis von 1:1 mit komplettem Freund'schem Adjuvans hergestellt, alle folgenden Dosen wurden mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt.
Das gleiche Verfahren wurde bei einer Kontrollgruppe durchgeführt, diesen Tieren wurde jedoch nur das Adjuvans verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, das Serum wurde erhalten, und der Titer der Antikörper gegen mu-EGF wurde durch die ELISA-Technik bestimmt.
Costar-Platten wurden mit mu-EGF mit einer Konzentration von 10 μg/ml in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) bestrichen und über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten gewaschen worden waren, wurden die Proben in unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde lang. Das Konjugat von alkalischer Phosphatase-Anti-Maus-Antikörper wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert, danach wurde die Farbe hervorgebracht, und die optische Dichte wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
Alle mit dem mu-EGF-CTB-Präparat immunisierte Tiere bildeten bis zu einer Verdünnung von 1:1.000 einen Titer der Antikörper gegen den mu-EGF heraus. Die Kontrollgruppe zeigte keinen Titer der Antikörper (2).
BEISPIEL 5
IMMUNOGENITÄT VON hu-rec-EGF: HERVORRUFEN DER AUTOIMMUNITÄT BEI MÄUSEN
Um nachzuweisen, daß das immunogene Präparat, das hum-rec-EGF enthielt, einen Titer der Antikörper gegen mu-EGF produzieren kann, wurde der Versuch bei Balb/c-Mäusen durchgeführt.
Gruppen von Tieren wurden für 4 bis 6 Wochen wöchentlich subkutan mit einer Dosis von 50 μg des konjugierten hum-rec-EGF pro Tier geimpft.
In der ersten Woche wurde das immunogene Präparat in einem Verhältnis von 1:1 mit komplettem Freund'schem Adjuvans hergestellt, alle folgenden Dosen wurden mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt.
Das gleiche Verfahren wurde bei einer Kontrollgruppe durchgeführt, diesen Tieren wurde jedoch nur das Adjuvans verabreicht.
Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, das Serum wurde erhalten, und der Titer der Antikörper gegen mu-EGF wurde durch die ELISA-Technik bestimmt.
Costar-Platten wurden mit mu-EGF in einer Konzentration von 10 μg/ml in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) bestrichen und über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten gewaschen worden waren, wurden die Proben in unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde lang. Das Konjugat von alkalischer Phosphatase-Anti-Maus-Antikörper wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert, danach wurde die Farbe hervorgebracht, und die optische Dichte wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
Alle mit dem hum-rec-EGF-Präparat immunisierte Tiere bildeten bis zu einer Verdünnung von 1:20.000 einen Titer der Antikörper gegen den mu-EGF heraus.
Die Kontrollgruppe zeigte keinen Titer der Antikörper (3).
BEISPIEL 6
IMMUNOGENITÄT DES hu-rec-EGF IN EINEM PRÄPARAT MIT ALUMINIUMHYDROXID
Um nachzuweisen, daß das immunogene Präparat, das hum-rec-EGF und Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthielt, einen Titer der Antikörper gegen mu-EGF produzieren kann, wurde der Versuch bei Balb/c-Mäusen durchgeführt.
Gruppen von Tieren wurden für 4 bis 6 Wochen wöchentlich subkutan mit einer Dosis von 50 μg hum-rec-EGF (mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans) pro Tier geimpft.
Das gleiche Verfahren wurde bei einer Kontrollgruppe durchgeführt, diesen Tieren wurde jedoch nur das Adjuvans verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurde den Tieren Blut entnommen, es wurde das Serum erhalten, und der Titer der Antikörper gegen mu-EGF wurde durch die ELISA-Technik bestimmt.
Costar-Platten wurden mit mu-EGF mit einer Konzentration von 10 μg/ml in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) bestrichen und über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten gewaschen worden waren, wurden die Proben in unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde lang. Das Konjugat von alkalischer Phosphatase-Anti-Maus-Antikörper wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert, danach wurde die Farbe hervorgebracht, und die optische Dichte wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
Alle mit dem hum-rec-EGF/AIOH-Präparat immunisierte Tiere bildeten bis zu einer Verdünnung von 1:4.000 einen Titer der Antikörper gegen den mu-EGF heraus.
Die Kontrollgruppe zeigte keinen Titer der Antikörper (4).
BEISPIEL 7
ANTITUMORWIRKUNG
Die Hauptaufgabe dieses Versuchsverfahrens bestand in der Bestimmung, ob die gegen den autologen EGF erhaltene Immunreaktion irgendeine Antitumorwirkung bei von EGF abhängigen Tumoren zeigen konnte.
Die Tiere mit dem höheren Titer der Antikörper, der bereits nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt worden war, wurden mit dem Ehrlich-Aszitestumor (EAT) mit Zellkonzentrationen von 2 Millionen Zellen EAT pro Tier geimpft. Die Kontrollgruppe (nicht immunisierte Mäuse) wurde in der gleichen Weise behandelt.
Bei den Tieren wurden die Übertragung als auch das Überleben beobachtet. Die Kurven für das Überleben der behandelten Tiere und der Kontrolltiere sind in 5 gezeigt.
Die Erhöhung des Index der Lebensspanne betrug gemäß der Mantel-Haenszel- und Wilcoxon-Tests 22,5%, was eine Verlängerung des Überlebens der behandelten Tiere im Vergleich mit der statistisch signifikanten Kontrolle zeigt.
BEISPIEL 8
ZUSAMMENHANG ZWISCHEN DEM TITER DER ANTIKÖRPER GEGEN mu-EGF UND DER BIOLOGISCHEN VERTEILUNG VON ¹²⁵I EGF
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um nachzuweisen, daß es eine unterschiedliche biologische Verteilung des ¹²⁵I EGF bei Tieren mit einem Titer der Antikörper gegen mu-EGF im Verhältnis zu den Tieren gibt, die keinen Titer der Antikörper gegen mu-EGF aufweisen.
Für diesen Zweck wurde ein Versuch mit vier Gruppen von Mäusen durchgeführt:
Gruppe 1: 30 Mäuse mit einem Titer der Antikörper gegen mu-EGF.
Gruppe 2: 30 Mäuse ohne einem Titer der Antikörper gegen mu-EGF.
Gruppe 3: 30 Mäuse mit einem Titer der Antikörper gegen mu-EGF, mit übertragenem EAT.
Gruppe 4: 30 Mäuse ohne einem Titer der Antikörper gegen mu-EGF, mit übertragenem EAT.
Proben aus der Gruppe 1 und 2 wurden zu folgenden Zeitpunkten aus dem Blut, der Lunge, den Nieren, der Leber und der Haut entnommen: 2, 5, 8, 11, 15, 20, 30, 60, 120 und 150 Minuten, und zu jedem entsprechenden Zeitpunkt wurden drei Tiere getötet, wobei die Radioaktivität in den entnommenen Organen gemessen wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten einen zeitlichen Unterschied bei der Ansammlung des ¹²⁵I EGF, hauptsächlich in der Niere und der Leber (6a, b), was darauf hinweist, daß das Vorhandensein von Antikörpern gegen EGF die biologische Verteilung dieses Moleküls verändert.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten auch, daß es einen Unterschied zwischen den Tieren mit oder ohne Titer der Antikörper gibt (8a, b, c, d), was darauf hinweist, daß Tiere mit dem Titer der Antikörper Immunkomplexe mit dem zirkulierenden EGF erzeugen können, was einen unterschiedlichen Reinigungsmechanismus des markierten EGF zeigt.
Proben von der Gruppe 3 und 4 wurden zu folgenden Zeitpunkten aus dem Blut, der Lunge, den Nieren, der Leber, der Haut und aus dem Bauchwasser entnommen: 2, 5, 8, 11, 15, 20, 30, 60, 120 und 150 Minuten, und zu jedem entsprechenden Zeitpunkt wurden drei Tiere getötet, und in den entnommenen Organen wurde die Radioaktivität gemessen.
Es kann eine geringere Ansammlung des markierten EGF im Bauchwasser von Tieren mit dem Titer der Antikörper als bei Tieren ohne Titer der Antikörper festgestellt werden (7), was auf eine schnellere Reinigung des bei diesen Tieren im Bauchwasser vorhandenen EGF und/oder einen beschränkten Zutritt des EGF zum Bauchwasser hinweist.
BEISPIEL 9
KENNZEICHNUNG DER IMMUNREAKTION: ERHALTENER ISOTYP GEGEN DEN AUTOLOGEN EGF
Um festzustellen, ob die bei der Immunisierung der Mäuse mit dem autologen EGF erhaltene Autoimmunreaktion eine Reaktion war, die Antikörper des Isotyps IgM oder IgG produziert, wurde der Assay ELISA durchgeführt, bei dem Platten bis zu einer Konzentration von 10 μg/ml mit EGF, 50 μg/Vertiefung, bestrichen wurden und 1 Stunde bei 37°C inkubiert wurden.
Anschließend wurden Verdünnungen von 1:10 bis 1:1.000 der Sera der Tiere, die gemäß Beispiel 5 mit mu-EGF-CTB immunisiert worden waren, 50 μg/Vertiefung, aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Es wurde eine parallele Gestaltung der Platten vorgenommen, um die IgG- oder IgM-Reaktion mit dem entsprechenden Antiserum zu messen (Anti-IgG bzw. Anti-IgM).
Die Farbe in den Platten wurde mit p-Nitrophenylphosphat mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Diethanolamin hervorgebracht, es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und es wurden die Werte der optischen Dichte bei 405 nm abgelesen.
Die IgG-Reaktion wurde bei allen behandelten Tieren erhalten (8).
BEISPIEL 10
KENNZEICHNUNG DES GEDÄCHTNISSES DER IMMUNREAKTION AUF DEN AUTOLOGEN EGF
Zwei Gruppen mit 10 Mäusen wurden mit einer einzigen Immunisierung mit 50 μg hu-re-EGF in komplettem Freund'schem Adjuvans untersucht.
Gruppe I – Bei dieser Gruppe von Tieren wurde die Kinetik der Produktion von Antikörpern für mu-EGF untersucht. Alle 4 Tage wurden Blutproben entnommen. Die Antikörperwerte wurden durch die ELISA-Technik bestimmt.
Gruppe II – Entsprach den Tieren mit abnehmenden Titern der Antikörper aus der Gruppe I und erneut immunisiert. Alle 2 Tage wurden Blutproben entnommen. Die Antikörperwerte wurden durch die ELISA-Technik bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten eine Gedächtnisreaktion, wenn die Tiere erneut mit dem Präparat immunisiert wurden (9).
BEISPIEL 11
ERHALT (OBTENTION) DES IMMUNOGENEN PRÄPARATS: hu-rec-EGF-TETANUS ERZEUGENDES TOXOID
Eine Lösung des hu-EGF in 10 mM PBS/MgCl2 mit einer Konzentration von 1,4 mg/ml wurde mit 2 ml einer Lösung von TT mit einer Konzentration von 4 mg/ml im gleichen Lösungsmittel gemischt. Es wurde Glutaraldehyd (3 ml, 0,5%) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,5% zu erhalten.
Das Inkubieren wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt, und anschließend wurde in 10 mM PBS/MgCl₂ dialysiert, wobei die Dialyselösung mindestens dreimal ausgetauscht wurde.
BEISPIEL 13
KENNZEICHNUNG DES KONJUGATS: hu-rec-EGF-TETANUS ERZEUGENDES TOXOID, ELISA-Assay für den Konjugattest:
Costar-Platten (stark bindend) wurden mit 50 μl eines Antiserums für TT, das vom Schaf erhalten worden war, mit einer Konzentration von 10 μg/ml bestrichen und über Nacht inkubiert.
Anschließend wurden drei Wäschen mit PBS/Tween durchgeführt, und danach wurden die Platten mit einer Lösung von 1% BSA in PBS/Tween blockiert und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Den Platten wurden Verdünnungen des Konjugats mit 0,1 bis 0,001 mg/ml mit 50 μl/Vertiefung zugesetzt, und sie wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach wurde ein Maus-Anti-hu-EGF-Antiserum mit einer Verdünnung von 1:1.000, 50 μl/Vertiefung, zugesetzt und es wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Danach wurden die Platten mit dem Konjugat von Anti-Maus-Antiserum-alkalische Phosphatase (Verdünnung 1:1.000), 50 μl/Vertiefung, 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Farbe wurde mit p- Nitrophenylphosphat mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Diethanolamin, 50 μl/Vertiefung, hervorgebracht, es wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und es wurde die optische Dichte bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen der Konzentration des Konjugats und den Absorptionswerten.
Das zeigt die Aktivität des Konjugats und die Wirksamkeit der Konjugation, da das Molekül die Erkennung für Anti-Serum-Anti-TT beibehält und es gleichzeitig von einem Anti-mu-EGF-Antiserum erkannt wird (10).
BEISPIEL 13
UNTERSUCHUNG DER IMMUNOGENITÄT VON hu-EGF, DAS AN EIN TRANSPORTPROTEIN (TT) GEBUNDEN IST, BEI NICHT-HUMAN-PRIMATEN
Die Untersuchung wurde mit 4 Rhesusaffen durchgeführt, die einer klinischen Veterinäruntersuchung unterzogen wurden, dazu gehören:
Körperliche Prüfung
Röntgen des Thorax
Bluttests.
Diese Tiere wurden mit einem hu-EGF immunisiert, der gemäß Beispiel 10 an ein TT gekoppelt war.
Die Immunisierung erfolgte in der 1., 2., 3., 4., 6. und 12. Woche subkutan. Bei der ersten Immunisierung wurde komplettes Freund'sches Adjuvans verwendet und bei allen anderen unvollständiges Freund'sches Adjuvans.
Den Tieren wurde Blut entnommen, und die Titer der Antikörper wurden durch eine ELISA bestimmt.
Costar-Platten wurden mit hu-EGF mit einer Konzentration von 10 μg/ml in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) bestrichen und über Nacht inkubiert. Nachdem die Platten gewaschen worden waren, wurden die Proben in unterschiedlichen Verdünnungen zugesetzt, es wurde 1 Stunde lang inkubiert. Das Konjugat von alkalischer Phosphatase-Anti-Human-Antikörper wurde zugesetzt und eine Stunde inkubiert, danach wurde die Farbe hervorgebracht, und es wurde die optische Dichte bei 405 nm mit einem ELISA-Lesegerät gemessen.
Alle mit dem hu-EGF-TT-Präparat immunisierten Tiere bildeten bis zu einer Verdünnung von 1:20.000 einen Titer der Antikörper gegen den hu-EGF aus (11).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Assay ELISA zur Bestimmung der Wirksamkeit der Konjugation zwischen CTB und hu-rec-EGF.
X-Achse: serielle Verdünnungen des Konjugats (von 0,1 mg/ml bis 0,001 mg/ml)
Y-Achse: optische Dichte bei 405 nm, mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
2: Assay ELISA zur Bestimmung des Titers der Antikörper gegen mu-EGF bei fünf Mäusen, die mit dem konjugierten mu-EGF-CTB immunisiert worden waren.
X-Achse: Antiserumverdünnungen (1:10, 1:100, 1:1.000)
Y-Achse: optische Dichte bei 405 nm, mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
Die Kurven geben den Titer von fünf getesteten Tieren im Vergleich mit den selben Tieren vor der Immunisierung an.
3: Assay ELISA zur Bestimmung des Titers der Antikörper gegen mu-EGF bei fünf Mäusen, die mit dem hu-rec-EGF immunisiert worden waren.
x-Achse: Verdünnungen der Seren 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:20.000
y-Achse: optische Dichte bei 405 nm.
4: Assay ELISA zur Bestimmung des Titers der Antikörper gegen mu-EGF bei fünf Mäusen, die mit dem hu-rec-EGF in Aluminiumhydroxid als Adjuvans immunisiert worden waren.
x-Achse: Verdünnungen der Seren 1:100, 1:500, 1:1.000, 1:2.000, 1:4.000, 1:8.000
y-Achse: optische Dichte bei 405 nm.
5: Überleben der Tiere, die mit mu-EGF-CTB immunisiert und anschließend mit dem Ehrlich-Aszitestumor geimpft worden waren, im Vergleich mit Kontrolltieren (nicht immunisiert, die mit dem gleichen Tumor geimpft worden waren.
6–a: Ansammlung von ¹²⁵I EGF in der Leber von Mäusen, die mit dem hu-rec-EGF immunisiert worden waren, in Zusammenhang mit nicht immunisierten Kontrollen.
6–b: Ansammlung von ¹²⁵I EGF in den Nieren von Mäusen, die mit dem hu-rec-EGF immunisiert worden waren, in Zusammenhang mit nicht immunisierten Kontrollen.
7: Ansammlung von mu-EGF I¹²⁵ im Bauchwasser von Tieren, denen der EAT transplantiert worden war, die vorher mit dem hu-rec-EGF immunisiert worden waren.
8: Assay ELISA zur Bestimmung des IgG oder IgM der Immunreaktion bei Tieren, die mit mu-EGF-CTB immunisiert worden waren.
9: Kinetik der Antikörperreaktion (IgG) gegenüber mu-EGF bei Tieren, die gegenüber hu-rec-EGF immunisiert worden waren (Gedächtnis).
x-Achse: Zeit (Tage)
y-Achse: Antilogarithmus des Titers der Antikörper (Durchschnittswert).
10: Assay ELISA zur Bestimmung der Wirksamkeit der Konjugation mit einem Tetanus erzeugenden Toxoid und hu-rec-EGF.
x-Achse: Verdünnungen des Konjugats
y-Achse: optische Dichte bei 405 nm.
11: Titer der Antikörper gegen hu-rec-EGF bei Nicht-Human-Primaten, die mit hu-rec-EGF immunisiert worden waren, der mit einem Tetanus erzeugenden Toxoid gekoppelt war.

Claims

Impfstoffzusammensetzung, um eine Autoimmunreaktion auf einen autologen epidermalen Wachstumsfaktor hervorzurufen, umfassend einen humanen autologen epidermalen Wachstumsfaktor, der mit einem Trägerprotein konjugiert ist, und ferner ein Adjuvans umfassend, wobei der humane autologe epidermale Wachstumsfaktor ein Antigen zum Auslösen der Autoimmunreaktion ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die B-Kette von Choleratoxin als Trägerprotein enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Tetanus erzeugendes Toxoid als Trägerprotein enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen monoklonalen Antikörper als Trägerprotein enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Protein der Außenmembran von Neisseria meningitidis als Trägerprotein enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthält.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Behandlung einer vom epidermalen Wachstumsfaktor abhängigen malignen Erkrankung.
Verwendung eines autologen epidermalen Wachstumsfaktors eines Säugers bei der Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Behandlung einer vom epidermalen Wachstumsfaktor abhängigen malignen Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff für die Behandlung einer vom epidermalen Wachstumsfaktor abhängigen malignen Erkrankung beim Menschen dient.