ES2237750T3 - Vacuna que comprende factor de crecimiento epidermico autologo humano y su uso. - Google Patents
Vacuna que comprende factor de crecimiento epidermico autologo humano y su uso.Info
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Abstract
Una composición de vacuna para producir una respuesta autoinmune contra factor de crecimiento epidérmico autólogo, que comprende factor de crecimiento epidérmico autólogo humano conjugado a una proteína portadora y que comprende además un adyuvante, siendo dicho factor de crecimiento epidérmico autólogo humano un antígeno para provocar dicha respuesta autoinmune.
Description
Vacuna que comprende factor de crecimiento
epidérmico autólogo humano y su uso.
Este invento se refiere al campo de la
inmunología, en particular a composiciones de vacuna capaces de
producir una reacción autoinmune contra el factor de crecimiento
epidérmico (EGF; del inglés, epidermal growth
factor) autólogo (propio).
Un objeto importante de este invento es obtener
una composición de vacuna para la inmunoterapia activa de tumores
malignos dependientes de EGF, que pueda inhibir la proliferación de
esos tumores y que, por lo tanto, sea útil para el tratamiento de
neoplasias malignas y de otras enfermedades relacionadas con EGF.
Por consiguiente, el invento está también relacionado con el campo
de la terapia del cáncer.
Se ha considerado que el factor de crecimiento
epidérmico, un polipéptido que estimula la proliferación de células
epiteliales, es uno de los factores de crecimiento implicados en
transformaciones malignas. Lleva esencialmente a cabo su acción a
través de sus receptores de membrana.
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es un
polipéptido de 53 aminoácidos; su peso molecular es aproximadamente
6.045 Da. Fue aislado y purificado por vez primera de la glándula
submaxilar murina [S. Cohen, J. Biol. Chem. (1.962) 237, 1.555]; más
tarde se obtuvo una molécula similar a partir de orina humana (S.
Cohen, Human Epidermal Growth Factor: Isolation and Chemical and
Biological Properties (Factor de crecimiento epidérmico humano:
aislamiento y propiedades químicas y biológicas), PNAS USA 72,
1.975, 1.317).
El EGF es capaz de estimular la proliferación de
células epiteliales y mesénquimales, tanto in vitro como
in vivo (S. Cohen y G. Carpenter, PNAS USA 72, 1.317, 1.975),
y proporciona una estimulación específica en algunas líneas
celulares de cáncer de mama [C. K. Osborne et al., Can. Res.
40, 2.361 (1.980)]. Se ha demostrado un papel del EGF en el proceso
de diferenciación de la glándula mamaria, principalmente para el
desarrollo del sistema lóbulo-alveolar [C. J.
Tonelli, Nature (1.980) 285, 250-252].
Esta acción biorreguladora es ejercida a través
de un receptor de membrana (EGF-R), una
glicoproteína de 1.186 aminoácidos y aproximadamente 170 kDa cuyo
gen ha sido clonado y secuenciado. El dominio intracelular del
receptor está asociado con una actividad de proteína quinasa
específica de tirosina que muestra una homología estructural con el
producto oncogénico v-erb-B que
muestra la relación con el proceso de transformación maligna [C. H.
Heldin, Cell 37, 9-20 (1.984)].
El EGF y su receptor constituyen un complejo
molecular de elevada especificidad, y la interacción entre ellos
desarrolla importantes mecanismos de regulación del crecimiento
celular.
Se han detectado niveles elevados de
EGF-R en tumores malignos de origen epitelial, tales
como cánceres de mama, vejiga, ovario, vulva, colon, pulmón, cerebro
y esófago. Se desconoce el papel desempeñado por el EGF y su
receptor en cuanto a la regulación del crecimiento tumoral, pero se
ha sugerido que la expresión del EGF-R en células
tumorales proporciona un mecanismo para la estimulación del
crecimiento autocrino que conduce a una proliferación incontrolada
[J. Schlessinger, A. B. Schreiber, A. Levi, T. Liberman e Y.
Yarden, Crit. Rev. Biochem. 1.983, 14 (2),
93-111].
Se ha demostrado que la presencia de
EGF-R en células tumorales es una señal de una mala
prognosis en el cáncer de mama humano. Aproximadamente el 40% de
los tumores de mama muestran sitios de unión de alta afinidad para
EGF específicos; hay además una correlación inversa con la presencia
del receptor estrogénico que señala al EGF-R como un
marcador de desdiferenciación o un indicador de la posible capacidad
de proliferación de las células malignas (R. Pérez, M. R. Pascual,
A. Macías y A. Lage, Breast Cancer Research and Treatment 4,
189-193, 1.984).
También se ha comunicado que la expresión de
EGF-R es mayor en metástasis ganglionares regionales
que en los carcinomas de mama primarios [J. R. Sainsbury et
al. (1.985), Lancet 1 (8.425), 364-366] y que la
expresión del receptor es diferente en los diferentes subtipos
histológicos de células de carcinomas de mama, lo que también hace
que su presencia sea una señal de mala prognosis [A. Macías et
al. (1.986), Anticancer Res. 6: 849-852].
Estudios previos llevados a cabo en el modelo de
tumor ascítico de Ehrlich (EAT; del inglés, Ehrlich ascitic tumor)
en ratón Balb-C demostraron el efecto inhibidor
in vivo del EGF [J. Lombardero et al., Neoplasma 33, 4
(1.987)], lo que sugiere la posibilidad de considerar esta molécula
como un modificador de respuestas biológicas.
Se ha comunicado previamente la presencia de una
molécula precursora de EGF en la membrana celular de tumores
dependientes de EGF. Los autores del presente invento han
considerado esto un hecho importante para considerar esta molécula
como una diana para la acción de autoanticuerpos.
Los resultados obtenidos en diferentes estudios
han sugerido la consideración del sistema EGF/EGF-R
como una posible diana para acciones terapéuticas.
La inmunoterapia pasiva en que se usan
anticuerpos monoclonales contra el EGF-R ha sido el
objeto de múltiples investigaciones que han demostrado que el
reconocimiento específico del receptor por el anticuerpo inhibe la
unión del EGF, con un efecto inhibidor sobre la estimulación
mitogénica de células malignas [J. D. Sato et al., Methods in
Enzymology, volumen 146, páginas 63-81 (1.987)]; sin
embargo, estos anticuerpos que son de origen murino producirán
normalmente una respuesta de anticuerpos humanos
anti-ratón (HAMA; del inglés, human
anti-mouse antibodies).
Hasta el presente invento, no se ha propuesto una
inmunoterapia activa contra tumores dependientes de EGF, capaz de
inhibir la proliferación, ya que la técnica declara firmemente que
moléculas "propias" no provocarán reacción inmune alguna porque
el huésped ha sido educado para ser tolerante a sí mismo.
El presente invento proporciona una composición
de vacuna que contiene EGF autólogo humano copulado a una proteína
portadora, complejo que inhibirá el crecimiento de tumores
dependientes de EGF por medio de un efecto autoinmune, sin los
efectos colaterales de la introducción de una proteína heteróloga en
el cuerpo humano.
Esta composición de vacuna puede ser usada en el
tratamiento de tumores dependientes de EGF o cualquier enfermedad
maligna asociada al EGF.
Se entenderá que, en esta memoria descriptiva, se
ha de leer que EGF incluye cualquier fragmento y/o derivado de EGF
que tenga propiedades y/o efectos inmunológicos similares a los de
la molécula original. Los derivados incluyen, pero no se limitan a,
sustituciones convencionales de aminoácidos, reemplazo dirigido de
aminoácidos para una estabilidad y/o actividad potenciadas,
modificaciones químicas y similares.
Se obtuvieron dos preparaciones. La primera es
EGF murino (mu-EGF) copulado a un portador proteico
y la segunda es EGF recombinante humano
(hu-rec-EGF) (Oficina Nacional de
Registro de Medicamentos de Cuba,
HEBERMIN, nº 1266) también copulado a una proteína portadora.
HEBERMIN, nº 1266) también copulado a una proteína portadora.
La preparación que contenía
hu-rec-EGF copulado a una proteína
portadora se obtuvo para ser usada sólo en primates no humanos y en
seres humanos. Se aplica un adyuvante apropiado.
El mu-EGF conjugado a un portador
proteico se usa en los estudios llevados a cabo en ratones como un
modelo para determinar la inmunogenicidad y el efecto antitumoral de
una preparación que contiene una molécula de EGF autóloga.
Se llevaron a cabo estudios de inmunogenicidad en
primates con el producto de conjugación de
hu-EGF-proteína portadora ya que el
hu-HGF es muy similar al EGF de primate aunque es
reconocido como una molécula propia. Estos resultados permitieron
demostrar la respuesta inmunogénica que puede provocar una molécula
autóloga.
Para obtener las preparaciones, una disolución de
hu-rec-EGF o EGF murino en
disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate buffered saline)/MgCl_{2} 10 mM es
mezclada con una disolución de la proteína portadora en el mismo
disolvente, en una relación de entre 1 y 5 moles de EGF por mol de
proteína.
A continuación se añade glutaraldehído al 0,5%
para obtener una concentración final de entre 0,1% y 0,05%.
La mezcla es incubada entre 1 y 3 horas a
temperatura ambiental y es posteriormente dializada en
PBS/MgCl_{2} 10 mM con al menos 3 cambios de disolución de
diálisis.
La prueba de la eficacia de la conjugación y del
mantenimiento de la antigenicidad se lleva a cabo por medio de un
ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés,
enzyme-linked immunosorption assay).
Se revistieron placas de poli(cloruro de
vinilo) (PVC; del inglés, polyvinyl chloride)
activado (NUNC) para ELISA con 50 \mul de un antisuero contra la
proteína portadora utilizada, en una concentración de entre 1 y 10
\mug/ml. En el caso de la cadena B de la toxina colérica (CTB; del
inglés, cholera toxin chain B) como portador,
las placas se revistieron con el gangliosido GM1.
Se llevaron posteriormente a cabo 3 lavados con
PBS/Tween (marca comercial registrada), y luego se bloquearon las
placas con una disolución de albúmina sérica bovina (BSA; del
inglés, bovine serum albumin) a entre el 0,5 y
el 1% en PBS/Tween y se incubaron durante un periodo de 30 minutos a
1 hora a 37ºC. Se añadieron los productos de conjugación que se iban
a analizar, en diluciones de entre 0,1 y 0,001 mg/ml, a las placas,
50 \mul/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 a 2 horas
a 37ºC.
En la operación siguiente, se añadió un antisuero
de ratón
anti-hu-rec-EGF en
una dilución de entre 1:500 y 1:1.000, 50 \mul/pocillo, y se
realizó una incubación durante un periodo de entre 30 minutos y 1
hora a 37ºC.
Como operación final, se incubaron las placas con
un antisuero anti-ratón-fosfatasa
alcalina en una dilución de entre 1:500 y 1:1.000, 50
\mul/pocillo, durante un periodo de 30 minutos a 1 hora a
37ºC.
Se desarrolló un color de reacción con fosfato de
p-nitrofenilo en una concentración de 1 mg/ml en
dietanolamina, 50 \mul/pocillo, incubado durante 30 minutos a
37ºC. Se midió la densidad óptica (DO) a 405 nm en un lector de
placas para ELISA.
Los resultados demostraron la actividad de la
molécula y la eficacia de la conjugación porque el producto de
conjugación mantiene su sitio de reconocimiento para la molécula que
reviste las placas, que reconoce específicamente a la proteína
portadora, y, al mismo tiempo, puede ser reconocido por un antisuero
anti-EGF.
Con objeto de demostrar la capacidad de la
preparación inmunogénica que contiene mu-EGF,
obtenida por medio de la técnica descrita en el punto I, para
provocar autoinmunidad contra el EGF endógeno, se llevó a cabo una
prueba en ratones Balb/C.
Se inocularon diferentes dosis de
mu-EGF conjugado a la proteína portadora a grupos de
animales, en el intervalo de 50 a 100 \mug por animal y por
semana, durante 4 a 6 semanas.
La primera semana, la preparación inmunogénica se
preparó con adyuvante completo de Freund en una relación de 1:1;
todas las dosis siguientes se prepararon con adyuvante incompleto de
Freund.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento en un
grupo testigo, pero sólo se administró adyuvante a los animales. Una
semana después de la última inmunización, se extrajo sangre a los
animales, se separó el suero del resto de la sangre y se determinó
el título de anticuerpos contra mu-EGF mediante una
técnica ELISA.
Con objeto de demostrar la inmunogenicidad del
hu-rec-EGF en ratones y mostrar que
los anticuerpos contra hu-rec-EGF
reconocen al mu-EGF, se llevó a cabo el experimento
en ratones Balb/C.
Se inoculan diferentes dosis de
hu-rec-EGF-proteína
a grupos de animales, en el intervalo de 50 a 100 \mug por animal
y por semana, durante 4 a 6 semanas. La primera semana, la
preparación inmunogénica se preparó con adyuvante completo de Freund
en una relación de 1:1; todas las dosis siguientes se prepararon con
adyuvante incompleto de Freund.
Se lleva a cabo el mismo procedimiento en un
grupo testigo, pero sólo se administra adyuvante a los animales.
Una semana después de la última inmunización, se
extrajo sangre a los animales, se separó el suero del resto de la
sangre y se determinó el título de anticuerpos contra
mu-EGF mediante una técnica ELISA.
El objetivo principal de este procedimiento
experimental es determinar si la respuesta inmune obtenida contra el
EGF autólogo es capaz de generar un efecto antitumoral en tumores
dependientes de EGF.
Se inoculó tumor ascítico de Ehrlich (EAT) en
concentraciones celulares de 0,2 a 2 millones de células por animal
a los animales con mayor título de anticuerpos, determinado de
acuerdo con la técnica previamente descrita. El grupo testigo fue
tratado de la misma manera.
Se observaron el injerto y la supervivencia de
los animales.
Con objeto de determinar si la respuesta
autoinmune obtenida tras la inmunización de ratones con el EGF
autólogo es una respuesta que produce anticuerpos del isotipo IgM o
IgG, se llevó a cabo un ensayo ELISA probando con EGF los sueros de
animales inmunizados, de acuerdo con las técnicas descritas en los
puntos II a) y b). En el caso de la caracterización de IgM, las
muestras se incubaron con un antisuero contra esta molécula. La
caracterización de IgG se lleva a cabo con un antisuero contra
IgG.
El desarrollo de un producto que va a ser usado
como una vacuna en una terapia activa requiere la determinación de
su capacidad para provocar una memoria inmunológica y la
determinación de la duración de dicha memoria, si ésta se
provoca.
Esta información permite la posibilidad de un
diseño correcto de los esquemas de inmunización que pueden ser
llevados a la práctica con el producto.
Se inmunizan grupos de ratones con una dosis de
entre 50 y 100 \mug de hu-rec-EGF,
en adyuvante completo de Freund en una proporción de 1:1, por
animal.
Se estudió la cinética de la producción de
anticuerpos contra mu-EGF en diferentes grupos de
animales. Este estudio se llevó a cabo después de la primera
inmunización y después de las reinmunizaciones cuando el título está
decayendo. Los niveles de anticuerpos se determinan usando una
técnica ELISA.
Los criterios de inmunogenicidad de la
preparación inmunogénica se basan en resultados obtenidos en
primates no humanos porque estos son las especies que están más
próximas al ser humano.
Se inmuniza un grupo de primates con la
preparación inmunogénica que contiene
hu-rec-EGF, en una dosis de 500
\mug (conjugado con toxoide tetánico) y junto con el adyuvante.
Después de la última inmunización, se extrajo una muestra de sangre
y se determinaron los títulos de anticuerpos contra
hu-EGF.
Este estudio se llevó a cabo por medio de una
técnica de transferencia Western. Se estudiaron muestras de 5
carcinomas ductales de la mama en diferentes fases, un tumor de
cabeza y cuello, cuatro muestras de displasia fibroquística y cinco
muestras normales obtenidas como testigos.
Se obtuvieron membranas celulares de las muestras
por medio del procedimiento descrito en otro trabajo (M. Grimaux,
Rev. Neurol. 1.988, 144: 101-103).
Se llevó a cabo una electroforesis a 250 V, 10
mA, 3,0 W, 15ºC y 150 Vh. Se usaron patrones de pesos moleculares en
el intervalo de 14.300 Da (lisozima) a 340.000 Da
(alfa-2-macroglobulina).
Las proteínas separadas durante la electroforesis
fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum
en un equipo con sistema Phast en una disolución tampón para
transferencia. Después de la transferencia, la membrana fue
bloqueada durante la noche con leche desnatada al 10%, con
agitación constante.
Después de tres lavados en disolución tampón, se
añadió un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce EGF humano y
se realizó una incubación durante una hora.
Después de tres lavados, se añadió un anticuerpo
biotinilado anti-ratón y se realizó una incubación
durante una hora. Se añadió un producto de conjugación de
peroxidasa-estreptavidina y se desarrolló la
reacción con diaminobencidina y peróxido de hidrógeno después de una
hora de incubación.
Los resultados obtenidos demostraron que las
muestras estudiadas correspondientes a tejidos normales no mostraban
banda alguna en la zona de altos pesos moleculares, de acuerdo con
los patrones. Sin embargo, las muestras correspondientes a una
patología de mama (displasia y carcinomas) mostraban una formación
difusa de bandas en la zona de altos pesos moleculares. Esto es una
evidencia experimental de la presencia de un precursor de EGF de
alto peso molecular en las membranas tumorales.
Se mezcló 1 ml de mu-EGF en
PBS/MgCl_{2} 10 mM, en una concentración de 1 mg/ml, con 2 ml de
una disolución de CTB en el mismo disolvente en una relación de 1
mol de mu-EGF por mol de CTB. Se añadió
glutaraldehído (3 ml, 0,5% ) para obtener una concentración final de
0,05%.
Se llevó a cabo una incubación durante 1 hora a
temperatura ambiental y posteriormente se realizó una diálisis en
PBS/MgCl_{2} 10 mM con al menos 3 cambios de la disolución de
diálisis.
Ensayo ELISA para la prueba del producto de
conjugación: Se revistieron placas activadas de PVC (NUNC) para
ELISA con 50 \mul del gangliosido GM1 (que reconoce a la molécula
de CTB) en una concentración de 4 \mug/ml en metanol, gangliosido
que fue dejado secar durante 1 hora bajo una corriente.
Se llevaron posteriormente a cabo 3 lavados con
PBS/Tween, y luego se bloquearon las placas con una disolución de
BSA al 1% en PBS/Tween y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC.
Se añadieron diluciones de entre 0,1 y 0,001
mg/ml del producto de conjugación a las placas, en una cantidad de
50 \mul/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 hora a
37ºC.
A continuación, se añadió un antisuero de ratón
anti-mu-EGF en una dilución 1:1.000,
50 \mul/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 hora a
37ºC.
Luego se incubaron las placas con un producto de
conjugación de antisuero anti-ratón y fosfatasa
alcalina (dilución 1:1.000), 50 \mul/pocillo, durante 1 hora a
37ºC. Se desarrolló el color con fosfato de
p-nitrofenilo en una concentración de 1 mg/ml en
dietanolamina, 50 \mul/pocillo, se realizó una incubación durante
30 minutos a 37ºC y se midió la densidad óptica a 405 nm.
Los resultados demostraron una relación directa
entre la concentración del producto de conjugación y los valores de
absorbancia. Esto demuestra la actividad del producto de conjugación
y la eficacia de la conjugación ya que la molécula mantiene el
reconocimiento del gangliosido GM1 (identifica a CTB) y, al mismo
tiempo, es reconocida por un antisuero
anti-mu-EGF (Figura 1).
Con objeto de demostrar que la preparación
inmunogénica que contiene EGF autólogo es capaz de provocar
autoinmunidad, se llevó a cabo la experimentación en ratones
Balb/c.
Se inoculó subcutánea y semanalmente una dosis de
50 \mug de mu-EGF conjugado por animal a grupos de
animales, durante 4 a 6 semanas.
La primera semana, la preparación inmunogénica se
preparó con adyuvante completo de Freund en una proporción de 1:1;
todas las dosis siguientes se prepararon con adyuvante incompleto de
Freund.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento en un
grupo testigo, pero sólo se administró adyuvante a los animales. Una
semana después de la última inmunización, se extrajo sangre a los
animales, se obtuvo el suero y se determinó el título de anticuerpos
contra mu-EGF mediante una técnica ELISA.
Se revistieron placas Costar con
mu-EGF en una concentración de 10 \mug/ml en
tampón de carbonato-bicarbonato (pH de 9,6) y se
incubaron durante la noche. Una vez lavadas las placas, se añadieron
las muestras en diferentes diluciones. Tuvo lugar una incubación
durante una hora. Se añadió un producto de conjugación de fosfatasa
alcalina y anticuerpo anti-ratón y se realizó una
incubación durante una hora, después de la cual se desarrolló color
y se midió la densidad óptica a 405 nm en un lector de placas para
ELISA.
Todos los animales inmunizados con la preparación
de mu-EGF-CTB desarrollaron un
título de anticuerpos contra el mu-EGF de hasta una
dilución 1:1.000. El grupo testigo no mostró ningún título de
anticuerpos (Figura 2).
Con objeto de demostrar que la preparación
inmunogénica que contiene
hum-rec-EGF era capaz de producir un
título de anticuerpos contra mu-EGF, se llevó a cabo
la experimentación en ratones Balb/c.
Se inoculó subcutánea y semanalmente una dosis de
50 \mug de hum-rec-EGF por animal
a grupos de animales, durante 4 a 6 semanas.
La primera semana, la preparación inmunogénica se
preparó con adyuvante completo de Freund en una proporción de 1:1;
todas las dosis siguientes se prepararon con adyuvante incompleto de
Freund.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento en un
grupo testigo, pero sólo se administró adyuvante a los animales.
Una semana después de la última inmunización, se
extrajo sangre a los animales, se obtuvo el suero y se determinó el
título de anticuerpos contra mu-EGF mediante una
técnica ELISA.
Se revistieron placas Costar con
mu-EGF en una concentración de 10 \mug/ml en
tampón de carbonato-bicarbonato (pH de 9,6) y se
incubaron durante la noche. Una vez lavadas las placas, se añadieron
las muestras en diferentes diluciones. Tuvo lugar una incubación
durante una hora. Se añadió el producto de conjugación de fosfatasa
alcalina y anticuerpo anti-ratón y se realizó una
incubación durante una hora, después de la cual se desarrolló color
y se midió la densidad óptica a 405 nm en un lector de placas para
ELISA.
Todos los animales inmunizados con la preparación
de hum-rec-EGF desarrollaron un
título de anticuerpos contra el mu-EGF de hasta una
dilución 1:20.000.
El grupo testigo no mostró ningún título de
anticuerpos (Figura 3).
Con objeto de demostrar que la preparación
inmunogénica que contiene
hum-rec-EGF e hidróxido de aluminio
como adyuvante era capaz de producir un título de anticuerpos contra
mu-EGF, se llevó a cabo la experimentación en
ratones Balb/c.
Se inoculó subcutánea y semanalmente una dosis de
50 \mug de hum-rec-EGF (con
hidróxido de aluminio como adyuvante) por animal a grupos de
animales, durante 4 a 6 semanas.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento en un
grupo testigo, pero sólo se administró adyuvante a los animales. Una
semana después de la última inmunización, se extrajo sangre a los
animales, se obtuvo el suero y se determinó el título de anticuerpos
contra mu-EGF mediante una técnica ELISA.
Se revistieron placas Costar con
mu-EGF en una concentración de 10 \mug/ml en
tampón de carbonato-bicarbonato (pH de 9,6) y se
incubaron durante la noche. Una vez lavadas las placas, se añadieron
las muestras en diferentes diluciones. Tuvo lugar una incubación
durante una hora. Se añadió el producto de conjugación de fosfatasa
alcalina y anticuerpo anti-ratón y se realizó una
incubación durante una hora, después de la cual se desarrolló color
y se midió la densidad óptica a 405 nm en un lector de placas para
ELISA.
Todos los animales inmunizados con la preparación
de hum-rec-EGF/AlOH desarrollaron un
título de anticuerpos contra el mu-EGF de hasta una
dilución 1:4.000.
El grupo testigo no mostró ningún título de
anticuerpos (Figura 4).
El objetivo principal de este procedimiento
experimental fue determinar si la respuesta inmune obtenida contra
el EGF autólogo era capaz de generar un efecto antitumoral en
tumores dependientes de EGF.
Se inoculó tumor ascítico de Ehrlich (EAT) en
concentraciones celulares de 2 millones de células EAT por animal a
los animales con mayor título de anticuerpos, determinado de acuerdo
con la técnica previamente descrita en el Ejemplo 5. El grupo
testigo (ratones no inmunizados) fue tratado de la misma manera.
Se observaron el injerto y la supervivencia de
los animales. En la Figura 5 se muestran las curvas de supervivencia
de los animales tratados y testigo.
El aumento del índice del tiempo de vida fue
22,5%, lo que muestra un aumento de supervivencia, para los
animales tratados en relación con los testigo, estadísticamente
significativo de acuerdo con los tests de
Mantel-Haenszel y Wilcoxon.
Este experimento fue llevado a cabo para
demostrar que hay una diferente biodistribución de
^{125}I-EGF en animales con título de anticuerpos
contra mu-EGF en relación con los animales que no
tienen título de anticuerpos contra mu-EGF.
Con este fin se llevó a cabo un experimento con 4
grupos de ratones:
- Grupo 1: 30 ratones con título de anticuerpos contra mu-EGF.
- Grupo 2: 30 ratones sin título de anticuerpos contra mu-EGF.
- Grupo 3: 30 ratones con título de anticuerpos contra mu-EGF injertado con EAT.
- Grupo 4: 30 ratones sin título de anticuerpos contra mu-EGF injertado con EAT.
De los Grupos 1 y 2 se tomaron muestras de
sangre, pulmón, riñones, hígado y piel en los momentos siguientes:
2, 5, 8, 11, 15, 20, 30, 60, 120 y 150 minutos, y se sacrificaron 3
animales en el momento correspondiente, contándose la radiactividad
en los órganos extraídos.
Los resultados obtenidos han mostrado una
diferencia en la acumulación de ^{125}I-EGF con el
tiempo, principalmente en el riñón y el hígado (Figura 6 a,b), lo
que indica que la presencia de anticuerpos contra EGF altera la
biodistribución de esta molécula.
Los resultados obtenidos también han mostrado que
hay una diferencia entre los animales con y sin título de
anticuerpos (Figura 8, a,b,c,d) que indica que los animales con
título de anticuerpos pueden producir inmunocomplejos con el EGF
circulante que muestran un mecanismo de depuración diferente del EGF
marcado.
De los Grupos 3 y 4 se tomaron muestras de
sangre, pulmón, riñones, hígado, piel y el fluido ascítico en los
momentos siguientes: 2, 5, 8, 11, 15, 20, 30, 60, 120 y 150 minutos,
y se sacrificaron 3 animales en el momento correspondiente, y se
contó la radiactividad en los órganos extraídos.
Pudo apreciarse menos acumulación del EGF marcado
en el fluido ascítico de los animales con título de anticuerpos que
en el de los animales sin título de anticuerpos (Figura 7), lo que
indica una depuración más rápida del EGF presente en el fluido
ascítico de estos animales y/o una limitación en el acceso de EGF al
fluido ascítico.
Con objeto de saber si la respuesta autoinmune
obtenida tras la inmunización de ratones con el EGF autólogo era una
respuesta que producía anticuerpos del isotipo IgM o IgG, se llevó a
cabo un ensayo ELISA en que se revistieron las placas con EGF en una
concentración de 10 \mug/ml, 50 \mug/pocillo, y se incubaron
durante 1 hora a 37ºC.
Posteriormente, se aplicaron diluciones de entre
1:10 y 1:1.000 de los sueros de animales inmunizados con
mu-EGF-CTB de acuerdo con el Ejemplo
5, 50 \mug/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 hora a
37ºC.
Se llevó a cabo un diseño paralelo de placas para
medir la respuesta de IgG o IgM con el correspondiente antisuero
(anti-IgG o anti-IgM,
respectivamente).
Se desarrolló color en las placas con fosfato de
p-nitrofenilo en una concentración de 1 mg/ml en
dietanolamina, realizándose una incubación durante 30 minutos a
37ºC, y se leyeron los valores de densidad óptica a 405 nm.
Se obtuvo respuesta de IgG en todos los animales
tratados (Figura 8).
Se estudiaron dos grupos de 10 ratones con una
sola inmunización de 50 \mug de
hu-rec-EGF en adyuvante completo de
Freund.
Grupo I - Se estudió la cinética de la producción
de anticuerpos contra mu-EGF en este grupo de
animales. Se extrajeron muestras de sangre cada 4 días. Se
determinaron los niveles de anticuerpos mediante una técnica
ELISA.
Grupo II - Se conformó con los animales del Grupo
I con títulos de anticuerpos menguantes, que fueron inmunizados de
nuevo. Se extrajeron muestras de sangre cada 2 días. Se determinaron
los niveles de anticuerpos mediante una técnica ELISA.
Los resultados han mostrado una respuesta de
memoria cuando los animales fueron inmunizados de nuevo con la
preparación (Figura 9).
Se mezcló una disolución de
hu-EGF en PBS/MgCl_{2} 10 mM, en una concentración
de 1,4 mg/ml, con 2 ml de una disolución de TT en el mismo
disolvente en una concentración de 4 mg/ml. Se añadió glutaraldehído
(3 ml, 0,5%) para obtener una concentración final de 0,05%.
Se llevó a cabo una incubación durante 1 hora a
temperatura ambiental y posteriormente se realizó una diálisis en
PBS/MgCl_{2} 10 mM con al menos 3 cambios de la disolución de
diálisis.
Se revistieron placas Costar (Alta Fijación) con
50 \mul de un antisuero anti-TT obtenido en oveja,
en una concentración de 10 \mug/ml, y se incubaron durante la
noche.
Se llevaron posteriormente a cabo 3 lavados con
PBS/Tween, y luego se bloquearon las placas con una disolución de
BSA al 1% en PBS/Tween y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC.
Se añadieron diluciones del producto de
conjugación de entre 0,1 y 0,001 mg/ml a las placas, en una cantidad
de 50 \mul/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 hora a
37ºC.
A continuación, se añadió un antisuero de ratón
anti-hu-EGF en una dilución 1:1.000,
50 \mul/pocillo, y se realizaron incubaciones durante 1 hora a
37ºC.
Luego se incubaron las placas con un producto de
conjugación de antisuero anti-ratón y fosfatasa
alcalina (dilución 1:1.000), 50 \mul/pocillo, durante 1 hora a
37ºC. Se desarrolló el color con fosfato de
p-nitrofenilo en una concentración de 1 mg/ml en
dietanolamina, 50 \mul/pocillo, se realizó una incubación durante
30 minutos a 37ºC y se midió la densidad óptica a 405 nm.
Los resultados demostraron una relación directa
entre la concentración del producto de conjugación y los valores de
absorbancia.
Esto demuestra la actividad del producto de
conjugación y la eficacia de la conjugación ya que la molécula
mantiene el reconocimiento del antisuero anti-TT y,
al mismo tiempo, es reconocida por un antisuero
anti-mu-EGF (Figura 10).
El estudio se llevó a cabo con 4 monos Rhesus que
fueron sometidos a un examen veterinario clínico que incluía:
- Examen físico
- Examen del tórax por rayos X
- Pruebas sanguíneas
Estos animales fueron inmunizados con un
hu-EGF copulado a TT, de acuerdo con el Ejemplo
10.
La inmunización se llevó a cabo subcutáneamente
en las semanas 1ª, 2ª, 3ª, 4ª, 6ª y 12ª. Se usó adyuvante completo
de Freund en la primera inmunización y adyuvante incompleto de
Freund en todas las demás.
Se extrajo sangre a los animales y se
determinaron los títulos de anticuerpos por medio de un ELISA.
Se revistieron placas Costar con
hu-EGF en una concentración de 10 \mug/ml en
tampón de carbonato-bicarbonato (pH de 9,6) y se
incubaron durante la noche. Una vez lavadas las placas, se añadieron
las muestras en diferentes diluciones. Tuvo lugar una incubación
durante una hora. Se añadió el producto de conjugación de fosfatasa
alcalina y anticuerpo anti-ser humano y se realizó
una incubación durante una hora, después de la cual se desarrolló
color y se midió la densidad óptica a 405 nm en un lector de placas
para ELISA.
Todos los animales inmunizados con la preparación
de hu-EGF-TT desarrollaron un título
de anticuerpos contra el hu-EGF de hasta una
dilución 1:20.000. (Figura 11).
Figura 1: ensayo ELISA para la determinación de
la eficacia de conjugación entre CTB y
hu-rec-EGF.
- Eje X: diluciones sucesivas del producto de conjugación (de 0,1 mg/ml a 0,001 mg/ml).
- Eje Y: densidad óptica a 405 nm, medida en un lector de placas para ELISA.
Figura 2: ensayo ELISA para la determinación del
título de anticuerpos contra el mu-EGF en 5 ratones
inmunizados con el producto de conjugación
mu-EGF-CTB.
- Eje X: diluciones del antisuero (1:10, 1:100, 1:1.000).
- Eje Y: densidad óptica a 405 nm, medida en un lector de placas para ELISA.
Las curvas representan el título de 5 animales
examinados, en comparación con el de los mismos animales antes de la
inmunización.
Figura 3: ensayo ELISA para la determinación del
título de anticuerpos contra mu-EGF en 5 ratones
inmunizados con hu-rec-EGF.
- Eje X: diluciones de los sueros (1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:20.000)
- Eje Y: densidad óptica a 405 nm.
Figura 4: ensayo ELISA para la determinación del
título de anticuerpos contra mu-EGF en 5 ratones
inmunizados con hu-rec-EGF en
hidróxido de aluminio como adyuvante.
- Eje X: diluciones de los sueros (1:100, 1:500, 1:1.000, 1:2.000, 1:4.000, 1:8.000).
- Eje Y: densidad óptica a 405 nm.
Figura 5: supervivencia de animales inmunizados
con mu-EGF-CTB y posteriormente
sometidos a inoculación con tumor ascítico de Ehrlich, en
comparación con la de animales testigo (no inmunizados) sometidos a
la inoculación del mismo tumor.
Figura 6-a: acumulación de
^{125}I-EGF en el hígado de ratones inmunizados
con hu-rec-EGF en relación con la de
testigos no inmunizados.
Figura 6-b: acumulación de
^{125}I-EGF en los riñones de ratones inmunizados
con hu-rec-EGF en relación con la de
ratones no inmunizados.
Figura 7: acumulación de
^{125}I-mu-EGF en el fluido
ascítico de animales a los que se ha injertado EAT, previamente
inmunizados con hu-rec-EGF.
Figura 8: ensayo ELISA para la determinación de
IgG o IgM de la respuesta inmune en animales inmunizados con
mu-EGF-CTB.
Figura 9: cinética de la respuesta de anticuerpos
(IgG) contra mu-EGF en animales inmunizados contra
hu-rec-EGF (memoria).
- Eje X: tiempo (días)
- Eje Y: logaritmo del inverso del título de anticuerpos (valor medio).
Figura 10: ensayo ELISA para la determinación de
la eficacia de conjugación con toxoide tetánico y
hu-rec-EGF.
- Eje X: diluciones del producto de conjugación.
- Eje Y: densidad óptica a 405 nm.
Figura 11: título de anticuerpos contra
hu-rec-EGF en primates no humanos
inmunizados con hu-rec-EGF copulado
a toxoide tetánico.
Claims (10)
1. Una composición de vacuna para producir una
respuesta autoinmune contra factor de crecimiento epidérmico
autólogo, que comprende factor de crecimiento epidérmico autólogo
humano conjugado a una proteína portadora y que comprende además un
adyuvante, siendo dicho factor de crecimiento epidérmico autólogo
humano un antígeno para provocar dicha respuesta autoinmune.
2. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene factor de
crecimiento epidérmico humano recombinante.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene la cadena B
de la toxina colérica como proteína portadora.
4. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene toxoide
tetánico como proteína portadora.
5. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene un anticuerpo
monoclonal como proteína portadora.
6. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene proteína de
membrana externa de Neisseria meningitidis como proteína
portadora.
7. Una composición de vacuna de acuerdo con la
Reivindicación 1, caracterizada porque contiene hidróxido de
aluminio como adyuvante.
8. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, para el
tratamiento de una enfermedad maligna dependiente del factor de
crecimiento epidérmico.
9. Uso de factor de crecimiento epidérmico
autólogo de un mamífero en la preparación de una vacuna de acuerdo
con cualquiera de las Reivindicaciones 1-7 para el
tratamiento de una enfermedad maligna dependiente del factor de
crecimiento epidérmico.
10. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 9,
caracterizado porque la vacuna es para el tratamiento de una
enfermedad maligna dependiente del factor de crecimiento epidérmico
en seres humanos.
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