ES2332125T3 - Composicion de vacuna que contiene el factor de crecimiento transformante alfa. - Google Patents
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Abstract
La presente invención está relacionada con el campo de la inmunología y la medicina humana, en particular con la inmunoterapia activa específica de tumores malignos dependientes del TGFa para su crecimiento, así como para el tratamiento de otras enfermedades que dependan del TGFa, mediante un preparado vacunal capaz de provocar una reacción de inmunocastración del TGFa autólogo.Otro objeto importante de esta invención es la obtención de un preparado vacunal que incluya una combinación del TGFa con otros ligandos del EGF-R, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), capaz de inhibir la proliferación de tumores cuya progresión dependen de estos factores de crecimiento. De esta manera se evita la resistencia que puede generar el tumor a vacunas que contenga cada uno de estas moléculas por separado.
Description
Composición de vacuna que contiene el factor de
crecimiento transformante \alpha.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y la medicina humana, en particular a una preparación
de vacuna capaz de provocar una reacción de supresión inmune frente
a TGF\alpha autólogo. Esta vacuna puede usarse para el
tratamiento de determinados cánceres y otras enfermedades
relacionadas con TGF\alpha.
El Factor de Crecimiento transformante
(TGF\alpha) es un polipéptido de 50 aminoácidos aislado
originalmente del medio condicionado de células transformadas con
retrovirus. Al principio, se definió como una molécula capaz de
competir con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) para la unión
a EGF-R. Sin embargo, los anticuerpos
anti-EGF no fueron capaces de reconocer TGF\alpha
(Todaro et al. (1976), Nature 264, 26-31).
Por lo tanto, los dos factores de crecimiento son entidades
inmunológicamente diferentes.
TGF\alpha pertenece a la familia de EGF. Está
familia está constituida por proteínas relacionadas estructural y
funcionalmente. Los demás miembros de esta familia son EGF,
anfirregulina (AR), criptol (CR1), EGF que se une a heparina,
betacelulina, epirregulina. Por otra parte, la familia de poxvirus
incluye proteínas relacionadas con EGF. De ellas, la mejor
caracterizada es el factor de crecimiento del virus vaccinia
(VGF).
Todas estas moléculas se unen a y activan
EGF-R, por esta razón se conocen como ligandos de
este receptor. Este sistema juega un papel en el crecimiento de las
células normales y neoplásicas.
EGF-R es una glicoproteína de
170 kD cuyo gen ha sido clonado y secuenciado. El dominio
intracelular de este receptor está asociado con la actividad de
proteínas tirosina quinasa. Estas proteínas muestran una homología
estructural con el producto del oncogén
v-erb-B, lo que es una evidencia de
una relación con el proceso de transformación neoplásica (Heldin
C.H. (1984), Cell 37, 9-20).
TGF\alpha se sintetiza como una forma
precursora transmembrana (pro-TGF\alpha) de 160
aminoácidos. El TGF\alpha maduro, una forma soluble de 50
aminoácidos, se libera por escisión proteolítica. El TGF\alpha
humano (hTGF\alpha) muestra una identidad de secuencia de
aminoácidos del 43% con el EGF humano (hEGF) y del 93% con el
TGF\alpha de ratón o de rata. Además, sus efectos biológicos no
son específicos de especie.
El trabajo de muchos laboratorios ha documentado
la capacidad de TGF\alpha para regular la proliferación,
migración y diferenciación de células en cultivo (Carpenter y Wahl.
(1990), Springer-Verlag, Berlín, p.
69-171).
TGF\alpha es el ligando más extendido de
EGF-R. Se expresa en los tejidos normales durante la
embriogénesis y en los tejidos normales y tumorales en los adultos.
Sin embargo, no se observan defectos patológicos importantes en
ratones que carecen del gen de TGF\alpha y estos ratones son
viables y fértiles (Bruce Mann et al. (1993), Cell, 73,
249-261).
En el proceso de tumorigénesis, la desregulación
de los procesos paracrinos y autocrinos de la activación de
EGF-R se debe a la regulación al alza de la
expresión del factor de crecimiento o a la síntesis elevada o
mutación de su receptor.
En los tumores epiteliales, se han detectado
altos niveles de EGF-R. En muchos casos, la
sobreexpresión de este receptor constituye un indicador de un mal
pronóstico.
La inducción de TGF\alpha es un evento
frecuente en la transformación neoplásica. De hecho, existen
numerosos estudios que muestran la sobreexpresión de esta molécula
en tumores epiteliales de diferentes localizaciones que incluyen,
mama, pulmón, cerebro, hígado, próstata, vejiga, tracto
gastrointestinal, colon, tejidos reproductores (ovario) y
endocrinos, entre otros.
Aunque el mecanismo por el que TGF\alpha
induce tumorigenicidad sigue sin conocerse, existen algunas
publicaciones que correlacionan la sobreexpresión de este factor de
crecimiento con el grado tumoral, supervivencia del paciente y
otros marcadores tumorales. Además, algunos investigadores han
demostrado su relación con otros oncogenes como
c-myc en hepatocarcinomas. TGF\alpha también
constituye una diana del gen supresor tumoral de von
Hippel-Lindau (VHL) (resumido en Lee et al.
(1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volumen
1B, 277-318).
Aunque TGF\alpha y EGF se unen al mismo
receptor con afinidades comparables, TGF\alpha es generalmente
más potente que EGF y, en algunos contextos, se ha descrito que sus
efectos son más potentes y/o más prolongados (Barandon y Green
(1987), Cell 50, 1131-1137). Se ha publicado que en
el caso de un complejo TGF\alpha/EGF-R
internalizado, TGF\alpha y EGF-R se reciclaron
preferentemente de nuevo a la superficie celular mientras que
cuando se internalizó un complejo EGF/EGF-R en el
mismo tipo de célula, ambos componentes se degradaron eficazmente
(Ebner y Derynck (1991), Cell Regul. 2, 599-612).
Estos resultados sugieren que las diferencias en la actividad
biológica de cada factor de crecimiento puede deberse a diferencias
en los mecanismos de tráfico intracelular.
Por otra parte, TGF\alpha es un factor
angiogénico más potente que EGF (Schreiber et al. (1986),
Science 232, 1250-1253).
Respecto a la expresión en tumores, existen
evidencias de la presencia del precursor de EGF en las membranas de
algunos tumores epiteliales pero TGF\alpha se expresa
mayoritariamente en los tumores epiteliales y su acción, al
contrario que EGF, es por un bucle autocrino con el
EGF-R. Por otra parte, los resultados de nuestro
centro indican que en algunas biopsias de tumores epiteliales existe
una expresión de TGF\alpha y no de EGF (carcinoma ductal de mama,
carcinoma de laringe), mientras que otros tumores presentan más EGF
que TGF\alpha (cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)).
Estos resultados sugieren que los factores de crecimiento pueden
tener diferentes impactos en la biología del tumor de diferentes
células neoplásicas.
Todas las evidencias acumuladas en estos años
acerca de la relación entre el sistema
EGF-R/ligandos de EGF-R y cáncer,
hacen de este sistema una diana muy atractiva para la inmunoterapia
del cáncer.
Los resultados previos de nuestro grupo han
demostrado la posibilidad de desarrollar una inmunoterapia activa
del cáncer con una vacuna basada en EGF. De hecho, se han obtenido
evidencias preclínicas y clínicas acerca de la inmunogenicidad y
baja toxicidad causadas por la vacunación con hEGF acoplado a una
proteína vehicular (González et al. (1996), Vaccine Research
5(4), 233-243).
Los estudios preclínicos han mostrado que la
inmunización de ratones con hEGF en adyuvante incrementa la
supervivencia de los ratones transplantados con tumor ascítico de
Ehrlich (EAT) (González et al. (1996), Vaccine Research
5(4), 233-243).
Se produjo una proteína de fusión entre hEGF y
P64k. Esta proteína contiene la secuencia de hEGF insertada entre
los aminoácidos 45/46 de P64k. Esta proteína de fusión se usó para
inmunizar ratones, causando una respuesta inmune humoral específica
frente a hEGF. La respuesta inmune generada provocó un incremento de
la vida de los ratones que presentaban EAT (González et al.
(1997), Vaccine Research 6(2), 91-100).
En dos ensayos clínicos piloto con pacientes con
NSCLC, se observó una tendencia de incremento de la supervivencia
en pacientes vacunados comparada con un control histórico. En
pacientes con una alta respuesta de anticuerpos frente a hEGF se
observó un marcado incremento de la supervivencia (González et
al. (1998), Annals of oncology, 9, 1-5).
En general, la vacunación con EGF no genera una
respuesta de anticuerpos específica frente a TGF\alpha. Sin
embargo, se han obtenido evidencias de que la vacunación con una
preparación inmunogénica que contiene TGF\alpha en un modelo
murino genera bajos niveles de anticuerpos anti-EGF
sólo en algunos ratones. Esta respuesta de anticuerpos es capaz de
bloquear en algunos casos la unión de EGF a su receptor in
vitro. Sin embargo, los niveles de anticuerpos
anti-EGF obtenidos no son suficientes para generar
una respuesta de supresión de EGF inmune eficaz con impacto en la
acción anti-tumoral.
Debido a que la acción de cada uno de estos
factores de crecimiento es diferente en cada tumor y/o entre el
tumor primario y sus metástasis, una vacuna que combina los dos
ligandos principales de EGF-R, TGF\alpha y EGF,
tiene un efecto anti-tumoral mejor en los tumores
epiteliales, en un sentido general.
Hasta el momento de la presente invención, no se
ha desarrollado ninguna terapia que proponga el uso de una
preparación de vacuna que contenga hTGF\alpha o cualquier
derivado, o una combinación con el otro ligando de
EGF-R, EGF, en la inmunoterapia activa del
cáncer.
La presente invención proporciona una
composición de vacuna para incitar una respuesta inmune frente a
TGF\alpha autólogo que contiene, como principio activo, una
proteína de fusión entre una proteína vehicular y TGF\alpha
humano o cualquier derivado peptídico del mismo y que comprende
adicionalmente un adyuvante, en la que dicha proteína de fusión es
capaz de incitar la respuesta inmune frente a TGF\alpha. La vacuna
es capaz de inhibir el crecimiento de los tumores epiteliales sin
efectos colaterales adversos.
Esta acción es a través de un mecanismo de
supresión inmune del factor de crecimiento. También se revindica
una composición de vacuna que contiene además EGF y una proteína
vehicular.
La composición de vacuna puede usarse en el
tratamiento de tumores epiteliales dependientes de TGF\alpha o
TGF\alpha/
EGF, o en cualquier otra enfermedad asociada con TGF\alpha tal como psoriasis (Kapp et al. (1993) J. Dermatol. Sci. Jun; 5(3): 133-42).
EGF, o en cualquier otra enfermedad asociada con TGF\alpha tal como psoriasis (Kapp et al. (1993) J. Dermatol. Sci. Jun; 5(3): 133-42).
En la especificación de TGF\alpha se incluye
cualquier fragmento obtenido de TGF\alpha que tiene las mismas
propiedades inmunológicas y/o efectos similares que la molécula
original.
Estos derivados incluyen, pero no se excluyen
otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de
aminoácidos específicos que incrementa la estabilidad y/o la
actividad, modificaciones químicas, entre otros.
Más específicamente, la invención consiste en
una composición de vacuna capaz de causar una reacción de supresión
inmune de TGF\alpha propio que puede usarse para el tratamiento de
determinados cánceres y otras enfermedades relacionadas con
TGF\alpha.
Por otra parte, esta invención incluye el uso de
una preparación de vacuna constituida por una combinación de
TGF\alpha y EGF. Esta vacuna puede usarse para el tratamiento de
neoplasias que dependen de estos dos factores de crecimiento
durante su patogénesis. La composición de vacuna puede usarse en el
tratamiento de enfermedades malignas en tumores de origen epitelial
que expresan TGF\alpha o EGF tales como carcinoma epidermoide de
pulmón, mama, próstata, gástrico o de ovario.
En la presente invención, una preparación de
vacuna usada incluye una proteína de fusión entre hTGF\alpha y
una proteína vehicular. El hTGF\alpha usado en una cualquiera de
estas preparaciones inmunogénicas puede ser recombinante, sintético
u obtenido a partir de una fuente natural. Como vehículos pueden
usarse diferentes proteínas. Un ejemplo de una proteína vehicular
que puede usarse es la proteína P64k del complejo proteico de la
membrana externa de Neisseria meningitidis y puede comprender
una cola de seis histidinas en el extremo
N-terminal. La cantidad óptima de hTGF\alpha en la
formulación de vacuna oscila entre 5 \mug y 1.000 \mug por
dosis. El adyuvante puede ser Adyuvante Incompleto de Freund o
Al(OH)_{3}.
Por otra parte, se usa una preparación de vacuna
que contiene una combinación de hTGF\alpha con hEGF (Office of
National Registration of Medications, HEBERMIN No 1266).
En la especificación de TGF\alpha o EGF se
incluye cualquier fragmento obtenido de TGF\alpha o EGF que tiene
las mismas propiedades inmunológicas y/o efectos similares que la
molécula original. Estos derivados incluyen, pero no se excluyen
otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de
aminoácidos específicos que incrementa la estabilidad y/o la
actividad, modificaciones químicas, entre otros.
El gen que codifica hTGF\alpha (500 bp) se
amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
cebadores específicos. El fragmento de ADN resultante se digirió y
clonó en un sitio específico de un vector de expresión que contiene
el gen que codifica la proteína vehicular. La proteína resultante
incluye una o múltiples copias de ambas moléculas. Se puede usar un
vector de expresión de células de mamíferos, bacterias o levaduras.
El vector también puede incluir seis histidinas en el extremo
N-terminal de la proteína vehicular. El plásmido
resultante se verifica por análisis de restricción en geles de
agarosa, secuenciación de ADN usando Secuenasa 2.0
(Amersham-USB), y finalmente, análisis de la
expresión de la proteína de fusión en cualquier cepa de expresión
de E. coli por la técnica de Transferencia Western, usando un
anticuerpo monoclonal específico frente a hTGF\alpha (R&D
System). Para obtener la proteína, las paredes bacterianas se rompen
usando un método de ruptura fuerte y la proteína se purifica
mediante una combinación de métodos de precipitación diferencial
con sulfato de amonio y métodos cromatográficos. Finalmente, la
proteína se filtra en condiciones estériles y se conserva a -20ºC o
se liofiliza y se conserva a 4ºC hasta su uso posterior.
Se obtienen diferentes preparaciones que
contienen hTGF\alpha conjugado con diferentes proteínas
vehiculares (como P64k). Puede usarse cualquier método de
conjugación química. Como método químico preferente se usa el
método que usa el agente EMCS descrito en la patente de EEUU, Pat.
EEUU No. 4.302.386; Lee et al., 1981.
Alternativamente, puede usarse el método de
conjugación con glutaraldehído. Brevemente, estas dos o tres
moléculas a una concentración de 1 mg/mL en la disolución final se
mezclan con glutaraldehído al 0,05% (en la disolución total). La
mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente y se dializa
frente a una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}. Finalmente, se
realiza una diálisis frente a PBS 1X durante toda la noche a 4ºC.
La preparación inmunogénica se filtra en condiciones estériles y se
almacena a 4ºC hasta su uso.
La obtención de una vacuna que combina los dos
ligandos principales de EGF-R puede realizarse de
diferentes maneras:
1. Mezclando las dos vacunas que contienen
hTGF\alpha o hEGF por separado unidos a una proteína vehicular en
una relación 1:1 justo en el momento de la inyección. Para este
propósito, pueden usarse las proteínas de fusión o los conjugados
químicos de cada factor de crecimiento y la proteína vehicular. La
cantidad óptima de hTGF\alpha y hEGF en la formulación de vacuna
oscila entre 5 \mug y 1.000 \mug por dosis.
2. Obteniendo una construcción genética similar
a la descrita en la sección A que contiene ambos factores de
crecimiento, hTGF\alpha y hEGF o una combinación de uno cualquiera
de sus derivados.
\newpage
3. Obteniendo químicamente un conjugado químico
que contiene hTGF\alpha y hEGF o una combinación de uno
cualquiera de sus derivados y una proteína vehicular usando la
metodología descrita en la sección B.
Para obtener el efecto inmunogénico deseado de
las composiciones de vacuna es conveniente usar un adyuvante
apropiado y seleccionar una vía de administración en la que la
preparación de vacuna exhiba una alta inmunogenicidad.
Las composiciones de vacuna referidas en esta
invención se preparan de dos maneras específicas:
1) Usando Al(OH)_{3} como
adyuvante para obtener disoluciones acuosas de la preparación de
vacuna adsorbidas a este compuesto. Para este propósito, se usa un
intervalo de 5 \mug a 1.000 \mug de TGF\alpha equivalente en
las diferentes preparaciones unido a un intervalo de 2 a 5 mg de
Al(OH)_{3}. Esta formulación se deja con agitación
durante 1 hora. La disolución final se conserva a 4ºC hasta su uso
posterior.
2) Usando adyuvante incompleto de Freund que
permite la formación de emulsiones acuosas/oleosas u
oleosas/acuosas. Las cantidades de la proteína de fusión o
conjugado químico y adyuvante en la formulación final están en el
intervalo de 40/60 a 60/40 (volumen/volumen). Los volúmenes dependen
de la emulsión final deseada. El adyuvante se añade antes de la
inmunización y la formulación se agita durante un periodo de 10 a 30
minutos, a temperatura ambiente.
Los volúmenes finales de cada preparación
inmunogénica abarcan el intervalo apropiado para la vía de
administración correspondiente.
En el caso de las vacunas combinadas preparadas
justo en el momento de la inyección como se ha descrito en la
sección C, las dos vacunas mezcladas con el adyuvante apropiado como
se ha descrito previamente pueden mezclarse por agitación e
inyectarse o inyectarse por separado.
La administración de las composiciones de vacuna
puede hacerse por diversas vías: intramuscular, subcutánea,
intranasal e intradérmica.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica hTGF\alpha se amplificó
mediante PCR usando como molde el vector PSK/TGF\alpha (CIGB,
Cuba). Este plásmido contiene el ADN complementario de hTGF\alpha
(ADNc) clonado en el sitio EcoR V del vector comercial pbluescript
KS-(Stragene). La secuencia que codifica el TGF\alpha maduro
(longitud de 50 aminoácidos (Fig. 1)) se amplificó usando los
cebadores específicos descritos a continuación:
- N-Terminal: 5'-GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3'
- (Subrayado, sitio de restricción XbaI)
\vskip1.000000\baselineskip
- C-terminal: 5'-CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC-3'
- (Subrayado, sitio de restricción de EcoRI)
\vskip1.000000\baselineskip
Brevemente, se usaron 200 ng de PSKTGF\alpha
en 75 \muL de una mezcla que contiene: 500 ng de cada uno de los
cebadores específicos, una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato a
una concentración de 200 mM cada uno, 25 mM MgCl_{2} y 100
Unidades de enzima Polimerasa Taq (Promega) en una disolución
tamponada proporcionada por Promega. Se siguió un protocolo de 30
ciclos de desnaturalización (1 minuto a 94ºC), hibridación (1
minuto a 60ºC) y extensión (30 segundos a 72ºC). Antes del primer
ciclo, el ADN se desnaturalizó durante 4 minutos y después del
último ciclo se realizó una extensión final de 2 minutos.
El producto de PCR se separó por electroforesis
en geles de agarosa de baja temperatura de gelificación (LGT) y el
segmento génico amplificado se purificó según los procedimientos
convencionales de extracción con fenol y se digirió enzimáticamente
usando las enzimas XbaI y EcoRI (NEB, USES). Siguiendo este
protocolo se prepara el segmento génico que codifica el TGF\alpha
maduro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el vector de expresión pM 92 (CIGB,
Cuba). Este plásmido contiene el gen IpdA que codifica la proteína
P64k de Neisseria meningitidis (cepa B385) bajo el control
del promotor del operón de triptófano de E. coli (ptrp) y el
terminador transcripcional del fago T4 (tT4). pM 92 codifica
resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. Se
transformó una cepa Dam- de E. coli (GC-366)
con pM92 y el plásmido se purifica usando un kit comercial
(Quiagen) según el protocolo del fabricante. El vector PM92 se
digirió y purificó a partir de geles de agarosa LGT.
Posteriormente, el vector PM92 se ligó con el ADNc de hTGF\alpha
maduro previamente preparado, usando la enzima ligasa T4 (Gibco
BRL). El plásmido resultante pMTGF\alpha codifica la proteína de
fusión que contiene hTGF\alpha insertado entre los aminoácidos
45/46 de P64k. Este plásmido recombinante se verificó por análisis
de restricción en geles de agarosa, secuenciación de ADN usando
Secuenasa 2.0 (Amersham-USB), y finalmente,
análisis de la expresión de la proteína de fusión en la cepa MM299
de E. coli por la técnica de Transferencia Western usando un
anticuerpo monoclonal específico para hTGF\alpha (R&D
System). La Figura 2 muestra una representación esquemática del
proceso de obtención del vector de expresión pMTGF\alpha. Este
vector codifica la proteína de fusión
TGF\alpha-P64K.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión pMHisTGF\alpha se
obtuvo según el mismo protocolo que el descrito en el ejemplo previo
usando como vector de partida pM224, que incluye un segmento que
codifica seis histidinas en el extremo N-terminal
de P64k. La etiqueta de seis histidinas presenta ventajas en la
purificación de la proteína porque incrementa la unión a la
Sefarosa quelante cargada con Cu^{2+} u otros metales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crecieron bacterias E. coli (cepa
MM299) que expresan la proteína de fusión
TGF\alpha-P64K en medio LBA (10 g/L Triptona, 5
g/L Extracto de Levadura, 10 g/L NaCl y 50 mg/L ampicilina) durante
10 horas a 37ºC. Después de la recogida de las células, todas las
etapas se realizaron a 0-4ºC. La ruptura de las
bacterias se consiguió en una prensa French a 1.500 kg/cm^{2}, y
la fracción insoluble se eliminó por centrifugación a alta
velocidad durante 30 minutos a 11.000 xg. Como primera etapa de
purificación, se realizó una precipitación con sulfato de amonio al
40% para eliminar parte de las proteínas de E. coli. El
sedimento resultante se eliminó por una centrifugación más a 4ºC
durante 30 minutos a 11.000 xg. El sobrenadante se fraccionó por
cromatografía de interacción hidrofóbica
(TSK-butilo, Pharmacia, Suecia) con un gradiente
decreciente de sulfato de amonio de 40% a 0% en tampón
Tris-HCl, pH=7,2 que contiene 0,15M NaCl.
Posteriormente, la muestra resultante se separó por filtración en
gel en una columna G200 (Pharmacia) equilibrada con PBS 1X,
consiguiendo una pureza final de más del 95%. La concentración de
proteínas se determina usando un método colorimétrico descrito por
Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 191,
495-498). La caracterización de la proteína
fusionada se hizo por la técnica de Transferencia Western, usando
anticuerpos específicos frente a P64k y TGF\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crecieron bacterias E. coli (cepa
MM299) que expresan la proteína de fusión
TGF\alpha-P64K en medio LBA (Triptona 10 g/L,
Extracto de Levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L y 50 mg/L ampicilina)
durante 10 horas a 37ºC. Después de la recogida de las células,
todas las etapas se realizaron a 0-4ºC. La ruptura
de las bacterias se consiguió en una prensa French a 1.500
kg/cm^{2}, y la fracción insoluble se eliminó por centrifugación
a alta velocidad durante 30 minutos a 11.000 xg. Como primera etapa
de purificación, se realizó una precipitación con sulfato de amonio
al 40% para eliminar parte de las proteínas de E. coli. El
sedimento resultante se eliminó por una centrifugación más a 4ºC
durante 30 minutos a 11.000 xg. El sobrenadante se fraccionó por
cromatografía de afinidad quelante (Chelating Sepharose Fast Flow,
Pharmacia, Suecia), debido a la presencia de seis histidinas en la
proteína, con un gradiente creciente de imidazol de 25 mM a 500 mM
en tampón Tris-HCl, pH=5,5 que contiene 0,5 M NaCl.
Posteriormente, la muestra resultante se pasó a través de una
columna de filtración en gel G25 (Pharmacia) equilibrada con PBS 1X
para eliminar las sales, consiguiendo un nivel de pureza del 95%. La
concentración de proteínas se determina usando un método
colorimétrico descrito por Lowry et al (1951) J. Biol. Chem.
191, 495-498). La caracterización de la proteína
fusionada se hizo por la técnica de Transferencia Western, usando
anticuerpos específicos frente a P64k y TGF\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si TGF\alpha podría ser
reconocido por un Mab anti-hTGF\alpha (Calbiochem)
en el contexto de la proteína fusionada, se hizo una técnica de
Transferencia Western. Se separaron por electroforesis 25 \mug de
EGF-P64K, TGF\alpha-P64K o P64K en
dos geles de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa de 0,45 \mum según procedimientos convencionales.
Después de la transferencia, las membranas se incubaron con una
disolución de bloqueo de TBS 1X con leche desnatada al 5% toda la
noche a 4ºC. Después de un breve lavado con TBS
1X-Tween 20 (0,05%), las membranas se incubaron una
con un anticuerpo anti-P64K (1/500) (Fig. 3A) y la
otra con un Mab anti-TGF\alpha (1/100) (Fig. 3B)
durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se
realizaron 3 lavados con la misma disolución y las membranas se
incubaron con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón
marcadas con fosfatasa alcalina (1/1.000) durante 1 hora en las
mismas condiciones. Finalmente, se añadieron 0,004 g de sustrato de
la enzima Fast Net (Sigma) en un tampón que contiene 0,1 M
Tris-HCl pH=8,2, 0,004 g de Naftol
ACE-MX Fosfato (Sigma) y 400 \muL de NN'Dimetil
Formamida en 20 mL. La reacción se paró con lavados similares. Se
observó un reconocimiento específico de
TGF\alpha-P64k por el Mab
anti-hTGF\alpha (Fig. 3). Este resultado
demuestra que TGF\alpha en la proteína de fusión mantiene una
estructura capaz de ser reconocida por un anticuerpo
específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla un mililitro de TGF\alpha en PBS/10
mM MgCl_{2} a 2 mg/mL con un mililitro de P64k a 2 mg/mL en el
mismo disolvente. Después, se añaden 0,2 mL de la disolución de
glutaraldehído al 0,5% para un porcentaje final del 0,05%. La
mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente y se dializó frente a
una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}. Finalmente, se realizó
una diálisis frente a PBS 1X toda la noche a 4ºC. La preparación
inmunogénica se filtra en condiciones estériles y se almacena a 4ºC
hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica hEGF (150 bp) se amplificó
por PCR usando el plásmido pBEF 10 como molde. Este plásmido
contiene el hEGF completo clonado en el sitio EcoR V del vector
comercial pbluescript SK II (Stragene). El ADN obtenido se une al
plásmido pMHis TGF\alpha en un sitio Bam HI localizado en el
extremo C-terminal de P64k usando la metodología
descrita en el ejemplo 2. De esta manera, se obtiene el vector
pMTGF\alpha-EGF que codifica la proteína de
fusión TE-P64k.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla un mililitro de TGF\alpha en PBS/10
mM MgCl_{2} a 3 mg/mL con un mililitro de hEGF a 3 mg/mL y P64k a
3 mg/mL en el mismo disolvente. Después, se añadieron 0,6 mL de la
disolución de glutaraldehído al 0,5% para un porcentaje final del
0,05%. La mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente y se
dializó frente a una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}.
Finalmente, se realizó una diálisis frente a PBS 1X toda la noche a
4ºC. La preparación inmunogénica se filtra en condiciones estériles
y se almacena a 4ºC hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes preparaciones inmunogénicas
descritas en los ejemplos 2, 3, 7, 8 y 9 se mezclaron con
Al(OH)_{3} o Montanide ISA 51 como se ha descrito
en la descripción detallada de la invención. Las cantidades usadas
eran igual a 50 \mug de hTGF\alpha en todas las preparaciones y
50 \mug de hTGF\alpha y hEGF, en el caso de las vacunas
combinadas descritas en los ejemplos 8 y 9. Se usaron dos miligramos
de Al(OH)_{3} para cada preparación de proteína
fusionada o conjugado químico que contienen respectivamente 50
\mug de hTGF\alpha o hEGF equivalente.
\newpage
Se mezclaron cincuenta microgramos de cada
factor de crecimiento en 0,6 mg de recombinante en un volumen total
de 0,5 mL con el mismo volumen de Montanide ISA 51 y se agitaron
durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la
inyección.
En el caso de usar Al(OH)_{3}
como adyuvante, se mezclan dos preparaciones que contienen 0,6 mg de
cada proteína en 2 mg de Al(OH)_{3} antes de la
inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla una preparación inmunogénica que
contiene 50 \mug de hTGF\alpha unido a P64k como se ha descrito
en el ejemplo 7 en 0,25 mL con 0,25 mL de una preparación
inmunogénica igual que contiene hEGF y se mezcla con 0,5 mL de
Montanide ISA 51 según se ha descrito en el ejemplo 10, usando una
jeringa, durante un periodo de 10 minutos a temperatura
ambiente.
En el caso de usar Al(OH)_{3}
como adyuvante, se mezclan 0,5 mL de cada uno de estos conjugados
químicos descritos anteriormente que contienen 50 \mug de
hTGF\alpha o hEGF respectivamente adsorbidos en 2 mg de
Al(OH)_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la inmunogenicidad de la vacuna,
se inyectaron subcutáneamente a ratones Balb/c, hembras entre
6-8 semanas, 58 mg (5 \mug equivalente de
TGF\alpha), 116 mg (10 \mug) ó 0,6 mg (50 \mug) de
TGF\alpha-P64k con Montanide ISA 51 en una
proporción 1:1. El inmunógeno se preparó como se ha descrito en la
descripción detallada de la invención y se agitó durante 10 minutos
antes de la inmunización. Cada animal recibió 4 dosis. La sangre se
extrajo antes de la inmunización, una semana después y
quincenalmente desde ese momento. El suero se separó de la sangre
extraída de los animales y se determinó la titulación de anticuerpos
específicos frente a hTGF\alpha por una técnica de ELISA
indirecto.
Brevemente, se recubrieron placas de
microtitulación de ELISA (COSTAR) con 50 \muL/pocillo de una
disolución de hTGF\alpha a 2,5 \mug/mL en tampón
carbonato-bicarbonato pH=7,2 y se incubaron toda la
noche a 4ºC. Después de tres lavados con PBS
1X-Tween 20 (0,05%), las placas se bloquearon con
una disolución de PBS 1X-Tween 20
(0,05%)-SFT (5%) durante 1 hora a 37ºC.
Inmediatamente, se añadieron los sueros de los ratones inmunizados
y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar, las placas
se incubaron con inmunoglobulinas de cabra
anti-ratón marcadas con fosfatasa alcalina (Sigma)
diluidas 1/1.000 en PBS 1X-Tween 20
(0,05%)-SFT (5%) (50 \muL/pocillo) durante 1 hora
a la misma temperatura. Finalmente, después de lavar, se añadió el
sustrato de la enzima (p-nitrofenilfosfato (Sigma))
a una concentración final de 1 mg/mL en tampón Dietanolamina pH=9,8
(50 \muL/pocillo). Se midió la absorbancia a 405 nm del complejo
enzima-sustrato formado en un lector de placas
ELISA.
La Figura 4 muestra las cinéticas de la
respuesta de anticuerpo polivalente
anti-hTGF\alpha obtenida en ratones inmunizados
con TGF\alpha-P64K.
Debido a la alta homología entre hTGF\alpha y
los equivalentes de rata o ratón (93%) se puede considerar esta
respuesta inmune frente a hTGF\alpha como una respuesta frente al
TGF\alpha propio (murino).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un protocolo de inmunización
según se ha descrito en el ejemplo previo, usando 2 mg de
Al(OH)_{3}
como adyuvante. La preparación inmunogénica se preparó según se ha descrito en la descripción detallada de la invención. Se obtuvieron titulaciones de anticuerpo de hasta 1/10.000 para TGF\alpha. La técnica usada para determinar las titulaciones de anticuerpo fue el ELISA indirecto descrito en el ejemplo 13.
como adyuvante. La preparación inmunogénica se preparó según se ha descrito en la descripción detallada de la invención. Se obtuvieron titulaciones de anticuerpo de hasta 1/10.000 para TGF\alpha. La técnica usada para determinar las titulaciones de anticuerpo fue el ELISA indirecto descrito en el ejemplo 13.
\vskip1.000000\baselineskip
La distribución de las subclases de IgG se
determinó por una técnica de ELISA indirecto descrita en el ejemplo
13, usando antisuero específico frente a las diferentes subclases de
IgG conjugado con biotina (Jackson) a una dilución de 1/1.000 y
después en el complejo estreptavidina-fosfatasa
(1/1.000).
Se determinó la proporción de cada subclase de
IgG respecto a la IgG total en el suero de los animales inmunizados.
Los animales se inmunizaron con 50 \mug de TGF\alpha en la
proteína fusionada usando la vía subcutánea (Grupo 1) o
intramuscular (Grupo 2) siguiendo el protocolo de inmunización
descrito en el ejemplo 13. En la Figura 5 se observa la
distribución de las subclases obtenida. Se obtuvo una mayor
proporción de IgG1 en los dos grupos de ratones usados en el
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si los anticuerpos generados en
los protocolos de inmunización descritos previamente eran capaces
de inhibir la unión de TGF\alpha a su receptor, se realizó una
técnica in vitro denominada RRA. En síntesis, los sueros de
los ratones inmunizados obtenidos como se ha descrito en el ejemplo
13 se incubaron con una mezcla que incluye 100 mL de membrana de
placenta humana y 20 mL de ^{125}I-TGF\alpha
(100.000 cpm) y 330 mL de tampón: 10 mM Tris-HCl,
10 mM MgCl_{2} y BSA al 1%, pH=7,4. TGF\alpha se acopló al
radioisótopo ^{125}I usando el método de la cloramina T (Hunter y
Greenwood (1962, Nature, 358:495-498). La mezcla se
incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción se paró
con 1 mL del tampón mencionado anteriormente. Finalmente, los tubos
se centrifugaron a 1.000 rpm durante 30 minutos. Los sedimentos se
lavaron y se dejaron secar. La radiactividad se midió en un
contador de emisión gamma (Wallac, Finlandia). El descenso en los
valores medidos de radiactividad indica la inhibición de la unión
entre TGF\alpha y su receptor, debido a la acción de los sueros
ensayados. Se obtuvo un intervalo de 50%-80% de porcentaje de
inhibición en todos los sueros ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presencia de anticuerpos
anti-EGF se determinó en sueros de ratones que
mostraban titulaciones altas de anticuerpos
anti-TGF\alpha usando la técnica de ELISA
indirecto descrita. Se añadieron diluciones de 1/100, 1/1.000 y
1/10.000 de los sueros a placas recubiertas con hEGF (CIGB). La
Figura 6 muestra las titulaciones de anticuerpo
anti-EGF obtenidas en el suero de ratones
inmunizados con la proteína TGF\alpha-P64k. Sólo
se obtuvo una respuesta de anticuerpos anti-EGF
positiva en un grupo de ratones inmunizados.
Sin embargo, los ratones inmunizados con un
EGF-P64K conjugado químicamente no mostraron ningún
nivel de anticuerpos anti-TGF\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los antisueros policlonales
anti-hTGF\alpha obtenidos en la inmunización de
ratones con la proteína TGF\alpha-P64k en
Montanide ISA 51 para determinar la expresión de TGF\alpha en
biopsias de tumores incluidas en parafina. Estas biopsias se
obtuvieron de pacientes vacunados con una vacuna basada en EGF. En
un paciente con una alta respuesta de anticuerpos
anti-hEGF, se observó una regresión del tumor NSCLC.
Sin embargo, posteriormente se detectó un segundo tumor en la
laringe. Se analizaron las biopsias de estos dos tumores y se
observó una expresión diferencial de EGF y TGF\alpha en cada una
de ellas. En la Figura 7, se muestran los valores de reactividad
obtenidos con los diferentes anticuerpos. Estos resultados confirman
el hecho de que la inmunización con la preparación de vacuna que
contiene TGF\alpha-P64k provoca anticuerpos
específicos frente a hTGF\alpha capaces de reconocer esta
molécula en tumores humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló el ácido ribonucleico mensajero (ARNm)
de biopsias de tumor de carcinoma de mama usando el reactivo TRIZOL
(Life technologies) y se convirtió en ADNc por la enzima
transcriptasa inversa. El ADNc total se sometió a 30 ciclos de PCR
usando cebadores específicos para cara una de estas moléculas. Como
control interno se usó un gen doméstico (GAPDH). Los productos de
PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa
al 1,5% y se visualizaron con bromuro de Etidio.
En la Figura 8 se muestran los resultados
obtenidos usando los cebadores específicos para EGF, TGF\alpha,
EGF-R y GAPDH (Control interno) en 22 carcinomas de
mama. El ARNm de EGF se observó sólo en 1/22 biopsias, sin embargo
se observó una alta expresión de los ARNm de TGF\alpha y
EGF-R en la mayoría de las muestras. La alta
correlación entre la expresión de estas dos moléculas, sugiere la
importancia del bucle autocrino TGF\alpha/EGF-R
en el crecimiento de este tipo de tumores (Figura 9).
Figura 1: Secuencia genética y de aminoácidos
(letras subrayadas en negrita) del hTGF\alpha maduro.
Figura 2: Representación esquemática del proceso
de obtención del vector de expresión pMTGF\alpha.
Figura 3: Reconocimiento de la proteína de
fusión TGF\alpha-P64K por el Mab
anti-P64K (A) y el Mab
anti-hTGF\alpha (B) por la técnica de
Transferencia Western. Se llevó a cabo una SDS-PAGE
al 10% para P64K (1), EGF-P64K (2) y
TGF\alpha-P64K (3). Después, las proteínas se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con
anticuerpos específicos frente a P64K (A) o TGF\alpha (B) con el
objetivo de caracterizar la proteína fusionada entre TGF\alpha y
P64K.
Figura 4: Cinéticas de la respuesta de
anticuerpo anti-hTGF\alpha: Las titulaciones de
anticuerpos específicos frente a hTGF\alpha se midieron por la
técnica de ELISA indirecto. Los ratones se inmunizaron con 5 \mug
(A), 10 \mug (B) y 50 \mug (C) de equivalente de hTGF\alpha en
la proteína TGF\alpha-P64K mezclado con Montanide
ISA 51. El eje de las x representa los días en los que se recogieron
las muestras en cada ratón y el eje de las y el recíproco de la
titulación de anticuerpo alcanzada. Los días de inmunización se
resaltan con flechas en el gráfico A (Día 0, 14, 28 y 42).
Figuras 5: Distribución de las subclases de IgG
inducida por la inmunización con 50 \mug de equivalente de
TGF\alpha en la proteína fusionada. Comparación de la proporción
de las subclases de IgG en la respuesta de anticuerpo inducida con
la inmunización de la proteína TGF\alpha-P64k por
vía subcutánea (1) o intramuscular (2). Los valores de la
desviación estándar se muestran en la figura para cada uno de los
grupos de 5 animales inmunizados.
Figuras 6: Respuesta de anticuerpos específica
anti-EGF en ratones inmunizados con la proteína de
fusión TGF\alpha-P64K. En el gráfico se muestran
las titulaciones de anticuerpo anti-hTGF\alpha y
anti-EGF alcanzadas en los ratones inmunizados con
TGF\alpha-P64K.
Figuras 7: Determinación de la expresión de
EGF-R, EGF y TGF\alpha por inmunohistoquímica en
biopsias de tumores de pacientes vacunados incluidos en el ensayo
clínico II piloto de la vacuna de EGF. La diferente reactividad de
estas tres moléculas en el tumor primario de pulmón y en un segundo
tumor primario de laringe que apareció después, se muestran con
signos positivos en la figura.
Figuras 8: Expresión de los ARNm de EGF,
hTGF\alpha y EGF-R en 22 carcinomas de mama. La
figura muestra los productos de 30 ciclos de PCR obtenidos con
cebadores específicos para cada molécula y visualizados con bromuro
de etidio después de haber sido separados en geles de agarosa al
1,5%. También se observa la expresión del ARNm de GAPDH, usado como
control interno.
Figuras 9: Correlación entre los niveles de los
ARNm de hTGF\alpha y EGF-R en biopsias de
carcinoma de mama: La intensidad de las bandas obtenida con bromuro
de etidio se analizó mediante un programa de cálculo (ImagQuant,
Amersham). El eje de las x muestra la relación entre los valores de
intensidad para los productos de PCR usando cebadores específicos
para EGF-R y los obtenidos con GAPDH para cada
muestra (intensidad relativa) y el eje de las y el mismo valor de
intensidad relativa para hTGF\alpha. Se observó una correlación
positiva entre las expresiones de estas dos moléculas
(R^{2}=0,657, p=0,00121).
Claims (8)
1. Una composición de vacuna para incitar una
respuesta inmune frente a TGF\alpha autólogo, que comprende como
principio activo una proteína de fusión entre una proteína vehicular
y TGF\alpha humano o cualquier derivado peptídico del mismo y que
comprende adicionalmente un adyuvante, en la que dicha proteína de
fusión es capaz de incitar dicha respuesta inmune frente a
TGF\alpha.
2. La composición de vacuna según la
reivindicación 1 en la que la proteína vehicular es la proteína P64K
del complejo proteico de la membrana exterior de Neisseria
meningitidis.
3. La composición de vacuna según la
reivindicación 2 en la que la proteína vehicular comprende una cola
de seis histidinas en el extremo N-terminal.
4. La composición de vacuna según la
reivindicación 2 en la que la composición de vacuna comprende además
EGF.
5. La composición de vacuna según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adyuvante es Adyuvante
Incompleto de Freund.
6. La composición de vacuna según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adyuvante es
Al(OH)_{3}.
7. Uso de una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un
agente para el tratamiento de enfermedad maligna en tumores de
origen epitelial que expresan TGF\alpha o EGF.
8. El uso de la reivindicación 7 en el que el
tumor es un carcinoma epidermoide de pulmón, mama, próstata,
gástrico o de ovario.
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