ES2332125T3

ES2332125T3 - Composicion de vacuna que contiene el factor de crecimiento transformante alfa.

Info

Publication number: ES2332125T3
Application number: ES01999383T
Authority: ES
Inventors: Aillette Mulet Sierra; Rolando Perez Rodriguez; Gisela Maria Gonzalez Marinello; Anabel Alvarez Acosta; Tamara Menendez Medina; Gerardo Enrique Guillen Nieto; Belinda Sanchez Ramirez
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: UY27060A1; KR100834383B1; EP1339425A2; BR0116017A; EP1339425B1; ATE439855T1; WO2002045738A3; EA006240B1; ZA200304416B; US20030054011A1; AU2002221520B2; JP2004521091A; AR031785A1; NZ526283A; DE60139633D1; CA2430621A1; AU2152002A; PE20020696A1; MXPA03005031A; CN1482916A

Abstract

La presente invención está relacionada con el campo de la inmunología y la medicina humana, en particular con la inmunoterapia activa específica de tumores malignos dependientes del TGFa para su crecimiento, así como para el tratamiento de otras enfermedades que dependan del TGFa, mediante un preparado vacunal capaz de provocar una reacción de inmunocastración del TGFa autólogo.Otro objeto importante de esta invención es la obtención de un preparado vacunal que incluya una combinación del TGFa con otros ligandos del EGF-R, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), capaz de inhibir la proliferación de tumores cuya progresión dependen de estos factores de crecimiento. De esta manera se evita la resistencia que puede generar el tumor a vacunas que contenga cada uno de estas moléculas por separado.

Description

Composición de vacuna que contiene el factor de crecimiento transformante \alpha.

Sector técnico

La presente invención se refiere al campo de la inmunología y la medicina humana, en particular a una preparación de vacuna capaz de provocar una reacción de supresión inmune frente a TGF\alpha autólogo. Esta vacuna puede usarse para el tratamiento de determinados cánceres y otras enfermedades relacionadas con TGF\alpha.

Técnica anterior

El Factor de Crecimiento transformante (TGF\alpha) es un polipéptido de 50 aminoácidos aislado originalmente del medio condicionado de células transformadas con retrovirus. Al principio, se definió como una molécula capaz de competir con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) para la unión a EGF-R. Sin embargo, los anticuerpos anti-EGF no fueron capaces de reconocer TGF\alpha (Todaro et al. (1976), Nature 264, 26-31). Por lo tanto, los dos factores de crecimiento son entidades inmunológicamente diferentes.

TGF\alpha pertenece a la familia de EGF. Está familia está constituida por proteínas relacionadas estructural y funcionalmente. Los demás miembros de esta familia son EGF, anfirregulina (AR), criptol (CR1), EGF que se une a heparina, betacelulina, epirregulina. Por otra parte, la familia de poxvirus incluye proteínas relacionadas con EGF. De ellas, la mejor caracterizada es el factor de crecimiento del virus vaccinia (VGF).

Todas estas moléculas se unen a y activan EGF-R, por esta razón se conocen como ligandos de este receptor. Este sistema juega un papel en el crecimiento de las células normales y neoplásicas.

EGF-R es una glicoproteína de 170 kD cuyo gen ha sido clonado y secuenciado. El dominio intracelular de este receptor está asociado con la actividad de proteínas tirosina quinasa. Estas proteínas muestran una homología estructural con el producto del oncogén v-erb-B, lo que es una evidencia de una relación con el proceso de transformación neoplásica (Heldin C.H. (1984), Cell 37, 9-20).

TGF\alpha se sintetiza como una forma precursora transmembrana (pro-TGF\alpha) de 160 aminoácidos. El TGF\alpha maduro, una forma soluble de 50 aminoácidos, se libera por escisión proteolítica. El TGF\alpha humano (hTGF\alpha) muestra una identidad de secuencia de aminoácidos del 43% con el EGF humano (hEGF) y del 93% con el TGF\alpha de ratón o de rata. Además, sus efectos biológicos no son específicos de especie.

El trabajo de muchos laboratorios ha documentado la capacidad de TGF\alpha para regular la proliferación, migración y diferenciación de células en cultivo (Carpenter y Wahl. (1990), Springer-Verlag, Berlín, p. 69-171).

TGF\alpha es el ligando más extendido de EGF-R. Se expresa en los tejidos normales durante la embriogénesis y en los tejidos normales y tumorales en los adultos. Sin embargo, no se observan defectos patológicos importantes en ratones que carecen del gen de TGF\alpha y estos ratones son viables y fértiles (Bruce Mann et al. (1993), Cell, 73, 249-261).

En el proceso de tumorigénesis, la desregulación de los procesos paracrinos y autocrinos de la activación de EGF-R se debe a la regulación al alza de la expresión del factor de crecimiento o a la síntesis elevada o mutación de su receptor.

En los tumores epiteliales, se han detectado altos niveles de EGF-R. En muchos casos, la sobreexpresión de este receptor constituye un indicador de un mal pronóstico.

La inducción de TGF\alpha es un evento frecuente en la transformación neoplásica. De hecho, existen numerosos estudios que muestran la sobreexpresión de esta molécula en tumores epiteliales de diferentes localizaciones que incluyen, mama, pulmón, cerebro, hígado, próstata, vejiga, tracto gastrointestinal, colon, tejidos reproductores (ovario) y endocrinos, entre otros.

Aunque el mecanismo por el que TGF\alpha induce tumorigenicidad sigue sin conocerse, existen algunas publicaciones que correlacionan la sobreexpresión de este factor de crecimiento con el grado tumoral, supervivencia del paciente y otros marcadores tumorales. Además, algunos investigadores han demostrado su relación con otros oncogenes como c-myc en hepatocarcinomas. TGF\alpha también constituye una diana del gen supresor tumoral de von Hippel-Lindau (VHL) (resumido en Lee et al. (1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volumen 1B, 277-318).

Aunque TGF\alpha y EGF se unen al mismo receptor con afinidades comparables, TGF\alpha es generalmente más potente que EGF y, en algunos contextos, se ha descrito que sus efectos son más potentes y/o más prolongados (Barandon y Green (1987), Cell 50, 1131-1137). Se ha publicado que en el caso de un complejo TGF\alpha/EGF-R internalizado, TGF\alpha y EGF-R se reciclaron preferentemente de nuevo a la superficie celular mientras que cuando se internalizó un complejo EGF/EGF-R en el mismo tipo de célula, ambos componentes se degradaron eficazmente (Ebner y Derynck (1991), Cell Regul. 2, 599-612). Estos resultados sugieren que las diferencias en la actividad biológica de cada factor de crecimiento puede deberse a diferencias en los mecanismos de tráfico intracelular.

Por otra parte, TGF\alpha es un factor angiogénico más potente que EGF (Schreiber et al. (1986), Science 232, 1250-1253).

Respecto a la expresión en tumores, existen evidencias de la presencia del precursor de EGF en las membranas de algunos tumores epiteliales pero TGF\alpha se expresa mayoritariamente en los tumores epiteliales y su acción, al contrario que EGF, es por un bucle autocrino con el EGF-R. Por otra parte, los resultados de nuestro centro indican que en algunas biopsias de tumores epiteliales existe una expresión de TGF\alpha y no de EGF (carcinoma ductal de mama, carcinoma de laringe), mientras que otros tumores presentan más EGF que TGF\alpha (cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)). Estos resultados sugieren que los factores de crecimiento pueden tener diferentes impactos en la biología del tumor de diferentes células neoplásicas.

Todas las evidencias acumuladas en estos años acerca de la relación entre el sistema EGF-R/ligandos de EGF-R y cáncer, hacen de este sistema una diana muy atractiva para la inmunoterapia del cáncer.

Los resultados previos de nuestro grupo han demostrado la posibilidad de desarrollar una inmunoterapia activa del cáncer con una vacuna basada en EGF. De hecho, se han obtenido evidencias preclínicas y clínicas acerca de la inmunogenicidad y baja toxicidad causadas por la vacunación con hEGF acoplado a una proteína vehicular (González et al. (1996), Vaccine Research 5(4), 233-243).

Los estudios preclínicos han mostrado que la inmunización de ratones con hEGF en adyuvante incrementa la supervivencia de los ratones transplantados con tumor ascítico de Ehrlich (EAT) (González et al. (1996), Vaccine Research 5(4), 233-243).

Se produjo una proteína de fusión entre hEGF y P64k. Esta proteína contiene la secuencia de hEGF insertada entre los aminoácidos 45/46 de P64k. Esta proteína de fusión se usó para inmunizar ratones, causando una respuesta inmune humoral específica frente a hEGF. La respuesta inmune generada provocó un incremento de la vida de los ratones que presentaban EAT (González et al. (1997), Vaccine Research 6(2), 91-100).

En dos ensayos clínicos piloto con pacientes con NSCLC, se observó una tendencia de incremento de la supervivencia en pacientes vacunados comparada con un control histórico. En pacientes con una alta respuesta de anticuerpos frente a hEGF se observó un marcado incremento de la supervivencia (González et al. (1998), Annals of oncology, 9, 1-5).

En general, la vacunación con EGF no genera una respuesta de anticuerpos específica frente a TGF\alpha. Sin embargo, se han obtenido evidencias de que la vacunación con una preparación inmunogénica que contiene TGF\alpha en un modelo murino genera bajos niveles de anticuerpos anti-EGF sólo en algunos ratones. Esta respuesta de anticuerpos es capaz de bloquear en algunos casos la unión de EGF a su receptor in vitro. Sin embargo, los niveles de anticuerpos anti-EGF obtenidos no son suficientes para generar una respuesta de supresión de EGF inmune eficaz con impacto en la acción anti-tumoral.

Debido a que la acción de cada uno de estos factores de crecimiento es diferente en cada tumor y/o entre el tumor primario y sus metástasis, una vacuna que combina los dos ligandos principales de EGF-R, TGF\alpha y EGF, tiene un efecto anti-tumoral mejor en los tumores epiteliales, en un sentido general.

Hasta el momento de la presente invención, no se ha desarrollado ninguna terapia que proponga el uso de una preparación de vacuna que contenga hTGF\alpha o cualquier derivado, o una combinación con el otro ligando de EGF-R, EGF, en la inmunoterapia activa del cáncer.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una composición de vacuna para incitar una respuesta inmune frente a TGF\alpha autólogo que contiene, como principio activo, una proteína de fusión entre una proteína vehicular y TGF\alpha humano o cualquier derivado peptídico del mismo y que comprende adicionalmente un adyuvante, en la que dicha proteína de fusión es capaz de incitar la respuesta inmune frente a TGF\alpha. La vacuna es capaz de inhibir el crecimiento de los tumores epiteliales sin efectos colaterales adversos.

Esta acción es a través de un mecanismo de supresión inmune del factor de crecimiento. También se revindica una composición de vacuna que contiene además EGF y una proteína vehicular.

La composición de vacuna puede usarse en el tratamiento de tumores epiteliales dependientes de TGF\alpha o TGF\alpha/
EGF, o en cualquier otra enfermedad asociada con TGF\alpha tal como psoriasis (Kapp et al. (1993) J. Dermatol. Sci. Jun; 5(3): 133-42).

En la especificación de TGF\alpha se incluye cualquier fragmento obtenido de TGF\alpha que tiene las mismas propiedades inmunológicas y/o efectos similares que la molécula original.

Estos derivados incluyen, pero no se excluyen otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de aminoácidos específicos que incrementa la estabilidad y/o la actividad, modificaciones químicas, entre otros.

Más específicamente, la invención consiste en una composición de vacuna capaz de causar una reacción de supresión inmune de TGF\alpha propio que puede usarse para el tratamiento de determinados cánceres y otras enfermedades relacionadas con TGF\alpha.

Por otra parte, esta invención incluye el uso de una preparación de vacuna constituida por una combinación de TGF\alpha y EGF. Esta vacuna puede usarse para el tratamiento de neoplasias que dependen de estos dos factores de crecimiento durante su patogénesis. La composición de vacuna puede usarse en el tratamiento de enfermedades malignas en tumores de origen epitelial que expresan TGF\alpha o EGF tales como carcinoma epidermoide de pulmón, mama, próstata, gástrico o de ovario.

1 - Preparaciones inmunogénicas

En la presente invención, una preparación de vacuna usada incluye una proteína de fusión entre hTGF\alpha y una proteína vehicular. El hTGF\alpha usado en una cualquiera de estas preparaciones inmunogénicas puede ser recombinante, sintético u obtenido a partir de una fuente natural. Como vehículos pueden usarse diferentes proteínas. Un ejemplo de una proteína vehicular que puede usarse es la proteína P64k del complejo proteico de la membrana externa de Neisseria meningitidis y puede comprender una cola de seis histidinas en el extremo N-terminal. La cantidad óptima de hTGF\alpha en la formulación de vacuna oscila entre 5 \mug y 1.000 \mug por dosis. El adyuvante puede ser Adyuvante Incompleto de Freund o Al(OH)_{3}.

Por otra parte, se usa una preparación de vacuna que contiene una combinación de hTGF\alpha con hEGF (Office of National Registration of Medications, HEBERMIN No 1266).

En la especificación de TGF\alpha o EGF se incluye cualquier fragmento obtenido de TGF\alpha o EGF que tiene las mismas propiedades inmunológicas y/o efectos similares que la molécula original. Estos derivados incluyen, pero no se excluyen otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de aminoácidos específicos que incrementa la estabilidad y/o la actividad, modificaciones químicas, entre otros.

A) Obtención de una proteína de fusión TGF\alpha-proteína vehicular por métodos de ingeniería genética

El gen que codifica hTGF\alpha (500 bp) se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos. El fragmento de ADN resultante se digirió y clonó en un sitio específico de un vector de expresión que contiene el gen que codifica la proteína vehicular. La proteína resultante incluye una o múltiples copias de ambas moléculas. Se puede usar un vector de expresión de células de mamíferos, bacterias o levaduras. El vector también puede incluir seis histidinas en el extremo N-terminal de la proteína vehicular. El plásmido resultante se verifica por análisis de restricción en geles de agarosa, secuenciación de ADN usando Secuenasa 2.0 (Amersham-USB), y finalmente, análisis de la expresión de la proteína de fusión en cualquier cepa de expresión de E. coli por la técnica de Transferencia Western, usando un anticuerpo monoclonal específico frente a hTGF\alpha (R&D System). Para obtener la proteína, las paredes bacterianas se rompen usando un método de ruptura fuerte y la proteína se purifica mediante una combinación de métodos de precipitación diferencial con sulfato de amonio y métodos cromatográficos. Finalmente, la proteína se filtra en condiciones estériles y se conserva a -20ºC o se liofiliza y se conserva a 4ºC hasta su uso posterior.

B) Obtención de un conjugado químico que contiene hTGF\alpha

Se obtienen diferentes preparaciones que contienen hTGF\alpha conjugado con diferentes proteínas vehiculares (como P64k). Puede usarse cualquier método de conjugación química. Como método químico preferente se usa el método que usa el agente EMCS descrito en la patente de EEUU, Pat. EEUU No. 4.302.386; Lee et al., 1981.

Alternativamente, puede usarse el método de conjugación con glutaraldehído. Brevemente, estas dos o tres moléculas a una concentración de 1 mg/mL en la disolución final se mezclan con glutaraldehído al 0,05% (en la disolución total). La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente y se dializa frente a una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}. Finalmente, se realiza una diálisis frente a PBS 1X durante toda la noche a 4ºC. La preparación inmunogénica se filtra en condiciones estériles y se almacena a 4ºC hasta su uso.

C) Obtención de una vacuna que combina hTGF\alpha y hEGF

La obtención de una vacuna que combina los dos ligandos principales de EGF-R puede realizarse de diferentes maneras:

1. Mezclando las dos vacunas que contienen hTGF\alpha o hEGF por separado unidos a una proteína vehicular en una relación 1:1 justo en el momento de la inyección. Para este propósito, pueden usarse las proteínas de fusión o los conjugados químicos de cada factor de crecimiento y la proteína vehicular. La cantidad óptima de hTGF\alpha y hEGF en la formulación de vacuna oscila entre 5 \mug y 1.000 \mug por dosis.

2. Obteniendo una construcción genética similar a la descrita en la sección A que contiene ambos factores de crecimiento, hTGF\alpha y hEGF o una combinación de uno cualquiera de sus derivados.

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3. Obteniendo químicamente un conjugado químico que contiene hTGF\alpha y hEGF o una combinación de uno cualquiera de sus derivados y una proteína vehicular usando la metodología descrita en la sección B.

D) Obtención de la preparación inmunogénica

Para obtener el efecto inmunogénico deseado de las composiciones de vacuna es conveniente usar un adyuvante apropiado y seleccionar una vía de administración en la que la preparación de vacuna exhiba una alta inmunogenicidad.

Las composiciones de vacuna referidas en esta invención se preparan de dos maneras específicas:

1) Usando Al(OH)_{3} como adyuvante para obtener disoluciones acuosas de la preparación de vacuna adsorbidas a este compuesto. Para este propósito, se usa un intervalo de 5 \mug a 1.000 \mug de TGF\alpha equivalente en las diferentes preparaciones unido a un intervalo de 2 a 5 mg de Al(OH)_{3}. Esta formulación se deja con agitación durante 1 hora. La disolución final se conserva a 4ºC hasta su uso posterior.

2) Usando adyuvante incompleto de Freund que permite la formación de emulsiones acuosas/oleosas u oleosas/acuosas. Las cantidades de la proteína de fusión o conjugado químico y adyuvante en la formulación final están en el intervalo de 40/60 a 60/40 (volumen/volumen). Los volúmenes dependen de la emulsión final deseada. El adyuvante se añade antes de la inmunización y la formulación se agita durante un periodo de 10 a 30 minutos, a temperatura ambiente.

Los volúmenes finales de cada preparación inmunogénica abarcan el intervalo apropiado para la vía de administración correspondiente.

En el caso de las vacunas combinadas preparadas justo en el momento de la inyección como se ha descrito en la sección C, las dos vacunas mezcladas con el adyuvante apropiado como se ha descrito previamente pueden mezclarse por agitación e inyectarse o inyectarse por separado.

La administración de las composiciones de vacuna puede hacerse por diversas vías: intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica.

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Ejemplos Ejemplo 1 Obtención del segmento de ADN que codifica el TGF\alpha maduro por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El gen que codifica hTGF\alpha se amplificó mediante PCR usando como molde el vector PSK/TGF\alpha (CIGB, Cuba). Este plásmido contiene el ADN complementario de hTGF\alpha (ADNc) clonado en el sitio EcoR V del vector comercial pbluescript KS-(Stragene). La secuencia que codifica el TGF\alpha maduro (longitud de 50 aminoácidos (Fig. 1)) se amplificó usando los cebadores específicos descritos a continuación:

: N-Terminal: 5'-GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3'

: (Subrayado, sitio de restricción XbaI)

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: C-terminal: 5'-CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC-3'

: (Subrayado, sitio de restricción de EcoRI)

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Brevemente, se usaron 200 ng de PSKTGF\alpha en 75 \muL de una mezcla que contiene: 500 ng de cada uno de los cebadores específicos, una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato a una concentración de 200 mM cada uno, 25 mM MgCl_{2} y 100 Unidades de enzima Polimerasa Taq (Promega) en una disolución tamponada proporcionada por Promega. Se siguió un protocolo de 30 ciclos de desnaturalización (1 minuto a 94ºC), hibridación (1 minuto a 60ºC) y extensión (30 segundos a 72ºC). Antes del primer ciclo, el ADN se desnaturalizó durante 4 minutos y después del último ciclo se realizó una extensión final de 2 minutos.

El producto de PCR se separó por electroforesis en geles de agarosa de baja temperatura de gelificación (LGT) y el segmento génico amplificado se purificó según los procedimientos convencionales de extracción con fenol y se digirió enzimáticamente usando las enzimas XbaI y EcoRI (NEB, USES). Siguiendo este protocolo se prepara el segmento génico que codifica el TGF\alpha maduro.

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Ejemplo 2 Obtención del vector de expresión para la proteína de fusión TGF\alpha-P64K

Se usó el vector de expresión pM 92 (CIGB, Cuba). Este plásmido contiene el gen IpdA que codifica la proteína P64k de Neisseria meningitidis (cepa B385) bajo el control del promotor del operón de triptófano de E. coli (ptrp) y el terminador transcripcional del fago T4 (tT4). pM 92 codifica resistencia a los antibióticos ampicilina y kanamicina. Se transformó una cepa Dam- de E. coli (GC-366) con pM92 y el plásmido se purifica usando un kit comercial (Quiagen) según el protocolo del fabricante. El vector PM92 se digirió y purificó a partir de geles de agarosa LGT. Posteriormente, el vector PM92 se ligó con el ADNc de hTGF\alpha maduro previamente preparado, usando la enzima ligasa T4 (Gibco BRL). El plásmido resultante pMTGF\alpha codifica la proteína de fusión que contiene hTGF\alpha insertado entre los aminoácidos 45/46 de P64k. Este plásmido recombinante se verificó por análisis de restricción en geles de agarosa, secuenciación de ADN usando Secuenasa 2.0 (Amersham-USB), y finalmente, análisis de la expresión de la proteína de fusión en la cepa MM299 de E. coli por la técnica de Transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal específico para hTGF\alpha (R&D System). La Figura 2 muestra una representación esquemática del proceso de obtención del vector de expresión pMTGF\alpha. Este vector codifica la proteína de fusión TGF\alpha-P64K.

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Ejemplo 3 Obtención del vector de expresión de la proteína fusionada TGF\alpha-P64K con seis histidinas en el extremo N-terminal (pMHisTGF\alpha)

El vector de expresión pMHisTGF\alpha se obtuvo según el mismo protocolo que el descrito en el ejemplo previo usando como vector de partida pM224, que incluye un segmento que codifica seis histidinas en el extremo N-terminal de P64k. La etiqueta de seis histidinas presenta ventajas en la purificación de la proteína porque incrementa la unión a la Sefarosa quelante cargada con Cu^{2+} u otros metales.

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Ejemplo 4 Purificación de la proteína de fusión (TGF\alpha-P64K)

Se crecieron bacterias E. coli (cepa MM299) que expresan la proteína de fusión TGF\alpha-P64K en medio LBA (10 g/L Triptona, 5 g/L Extracto de Levadura, 10 g/L NaCl y 50 mg/L ampicilina) durante 10 horas a 37ºC. Después de la recogida de las células, todas las etapas se realizaron a 0-4ºC. La ruptura de las bacterias se consiguió en una prensa French a 1.500 kg/cm^{2}, y la fracción insoluble se eliminó por centrifugación a alta velocidad durante 30 minutos a 11.000 xg. Como primera etapa de purificación, se realizó una precipitación con sulfato de amonio al 40% para eliminar parte de las proteínas de E. coli. El sedimento resultante se eliminó por una centrifugación más a 4ºC durante 30 minutos a 11.000 xg. El sobrenadante se fraccionó por cromatografía de interacción hidrofóbica (TSK-butilo, Pharmacia, Suecia) con un gradiente decreciente de sulfato de amonio de 40% a 0% en tampón Tris-HCl, pH=7,2 que contiene 0,15M NaCl. Posteriormente, la muestra resultante se separó por filtración en gel en una columna G200 (Pharmacia) equilibrada con PBS 1X, consiguiendo una pureza final de más del 95%. La concentración de proteínas se determina usando un método colorimétrico descrito por Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 191, 495-498). La caracterización de la proteína fusionada se hizo por la técnica de Transferencia Western, usando anticuerpos específicos frente a P64k y TGF\alpha.

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Ejemplo 5 Purificación de la proteína de fusión (HisTGF\alpha-P64k)

Se crecieron bacterias E. coli (cepa MM299) que expresan la proteína de fusión TGF\alpha-P64K en medio LBA (Triptona 10 g/L, Extracto de Levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L y 50 mg/L ampicilina) durante 10 horas a 37ºC. Después de la recogida de las células, todas las etapas se realizaron a 0-4ºC. La ruptura de las bacterias se consiguió en una prensa French a 1.500 kg/cm^{2}, y la fracción insoluble se eliminó por centrifugación a alta velocidad durante 30 minutos a 11.000 xg. Como primera etapa de purificación, se realizó una precipitación con sulfato de amonio al 40% para eliminar parte de las proteínas de E. coli. El sedimento resultante se eliminó por una centrifugación más a 4ºC durante 30 minutos a 11.000 xg. El sobrenadante se fraccionó por cromatografía de afinidad quelante (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Suecia), debido a la presencia de seis histidinas en la proteína, con un gradiente creciente de imidazol de 25 mM a 500 mM en tampón Tris-HCl, pH=5,5 que contiene 0,5 M NaCl. Posteriormente, la muestra resultante se pasó a través de una columna de filtración en gel G25 (Pharmacia) equilibrada con PBS 1X para eliminar las sales, consiguiendo un nivel de pureza del 95%. La concentración de proteínas se determina usando un método colorimétrico descrito por Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 191, 495-498). La caracterización de la proteína fusionada se hizo por la técnica de Transferencia Western, usando anticuerpos específicos frente a P64k y TGF\alpha.

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Ejemplo 6 Reconocimiento de la proteína recombinante TGF\alpha-P64K por un anticuerpo monoclonal (Mab) específico de hTGF\alpha

Para determinar si TGF\alpha podría ser reconocido por un Mab anti-hTGF\alpha (Calbiochem) en el contexto de la proteína fusionada, se hizo una técnica de Transferencia Western. Se separaron por electroforesis 25 \mug de EGF-P64K, TGF\alpha-P64K o P64K en dos geles de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum según procedimientos convencionales. Después de la transferencia, las membranas se incubaron con una disolución de bloqueo de TBS 1X con leche desnatada al 5% toda la noche a 4ºC. Después de un breve lavado con TBS 1X-Tween 20 (0,05%), las membranas se incubaron una con un anticuerpo anti-P64K (1/500) (Fig. 3A) y la otra con un Mab anti-TGF\alpha (1/100) (Fig. 3B) durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron 3 lavados con la misma disolución y las membranas se incubaron con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón marcadas con fosfatasa alcalina (1/1.000) durante 1 hora en las mismas condiciones. Finalmente, se añadieron 0,004 g de sustrato de la enzima Fast Net (Sigma) en un tampón que contiene 0,1 M Tris-HCl pH=8,2, 0,004 g de Naftol ACE-MX Fosfato (Sigma) y 400 \muL de NN'Dimetil Formamida en 20 mL. La reacción se paró con lavados similares. Se observó un reconocimiento específico de TGF\alpha-P64k por el Mab anti-hTGF\alpha (Fig. 3). Este resultado demuestra que TGF\alpha en la proteína de fusión mantiene una estructura capaz de ser reconocida por un anticuerpo específico.

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Ejemplo 7 Obtención de un conjugado químico hTGF\alpha-P64k

Se mezcla un mililitro de TGF\alpha en PBS/10 mM MgCl_{2} a 2 mg/mL con un mililitro de P64k a 2 mg/mL en el mismo disolvente. Después, se añaden 0,2 mL de la disolución de glutaraldehído al 0,5% para un porcentaje final del 0,05%. La mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente y se dializó frente a una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}. Finalmente, se realizó una diálisis frente a PBS 1X toda la noche a 4ºC. La preparación inmunogénica se filtra en condiciones estériles y se almacena a 4ºC hasta su uso.

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Ejemplo 8 Obtención de una proteína de fusión entre hTGF\alpha, hEGF y P64k

El gen que codifica hEGF (150 bp) se amplificó por PCR usando el plásmido pBEF 10 como molde. Este plásmido contiene el hEGF completo clonado en el sitio EcoR V del vector comercial pbluescript SK II (Stragene). El ADN obtenido se une al plásmido pMHis TGF\alpha en un sitio Bam HI localizado en el extremo C-terminal de P64k usando la metodología descrita en el ejemplo 2. De esta manera, se obtiene el vector pMTGF\alpha-EGF que codifica la proteína de fusión TE-P64k.

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Ejemplo 9 Obtención de un conjugado químico hTGF\alpha-hEGF-P64k

Se mezcla un mililitro de TGF\alpha en PBS/10 mM MgCl_{2} a 3 mg/mL con un mililitro de hEGF a 3 mg/mL y P64k a 3 mg/mL en el mismo disolvente. Después, se añadieron 0,6 mL de la disolución de glutaraldehído al 0,5% para un porcentaje final del 0,05%. La mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente y se dializó frente a una disolución de PBS 1X/10 mM MgCl_{2}. Finalmente, se realizó una diálisis frente a PBS 1X toda la noche a 4ºC. La preparación inmunogénica se filtra en condiciones estériles y se almacena a 4ºC hasta su uso.

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Ejemplo 10 Preparación de formulaciones que contienen hTGF\alpha

Las diferentes preparaciones inmunogénicas descritas en los ejemplos 2, 3, 7, 8 y 9 se mezclaron con Al(OH)_{3} o Montanide ISA 51 como se ha descrito en la descripción detallada de la invención. Las cantidades usadas eran igual a 50 \mug de hTGF\alpha en todas las preparaciones y 50 \mug de hTGF\alpha y hEGF, en el caso de las vacunas combinadas descritas en los ejemplos 8 y 9. Se usaron dos miligramos de Al(OH)_{3} para cada preparación de proteína fusionada o conjugado químico que contienen respectivamente 50 \mug de hTGF\alpha o hEGF equivalente.

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Ejemplo 11 Preparación de una vacuna combinada que contiene proteína TGF\alpha-P64K y proteína EGF-P64K

Se mezclaron cincuenta microgramos de cada factor de crecimiento en 0,6 mg de recombinante en un volumen total de 0,5 mL con el mismo volumen de Montanide ISA 51 y se agitaron durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección.

En el caso de usar Al(OH)_{3} como adyuvante, se mezclan dos preparaciones que contienen 0,6 mg de cada proteína en 2 mg de Al(OH)_{3} antes de la inyección.

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Ejemplo 12 Preparación de una vacuna combinada que contiene un conjugado químico TGF\alpha/P64K y EGF/P64K

Se mezcla una preparación inmunogénica que contiene 50 \mug de hTGF\alpha unido a P64k como se ha descrito en el ejemplo 7 en 0,25 mL con 0,25 mL de una preparación inmunogénica igual que contiene hEGF y se mezcla con 0,5 mL de Montanide ISA 51 según se ha descrito en el ejemplo 10, usando una jeringa, durante un periodo de 10 minutos a temperatura ambiente.

En el caso de usar Al(OH)_{3} como adyuvante, se mezclan 0,5 mL de cada uno de estos conjugados químicos descritos anteriormente que contienen 50 \mug de hTGF\alpha o hEGF respectivamente adsorbidos en 2 mg de Al(OH)_{3}.

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Ejemplo 13 Inmunogenicidad de TGF\alpha-P64K/adyuvante Incompleto de Freund (Montanide ISA 51) en un modelo murino

Para demostrar la inmunogenicidad de la vacuna, se inyectaron subcutáneamente a ratones Balb/c, hembras entre 6-8 semanas, 58 mg (5 \mug equivalente de TGF\alpha), 116 mg (10 \mug) ó 0,6 mg (50 \mug) de TGF\alpha-P64k con Montanide ISA 51 en una proporción 1:1. El inmunógeno se preparó como se ha descrito en la descripción detallada de la invención y se agitó durante 10 minutos antes de la inmunización. Cada animal recibió 4 dosis. La sangre se extrajo antes de la inmunización, una semana después y quincenalmente desde ese momento. El suero se separó de la sangre extraída de los animales y se determinó la titulación de anticuerpos específicos frente a hTGF\alpha por una técnica de ELISA indirecto.

Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de ELISA (COSTAR) con 50 \muL/pocillo de una disolución de hTGF\alpha a 2,5 \mug/mL en tampón carbonato-bicarbonato pH=7,2 y se incubaron toda la noche a 4ºC. Después de tres lavados con PBS 1X-Tween 20 (0,05%), las placas se bloquearon con una disolución de PBS 1X-Tween 20 (0,05%)-SFT (5%) durante 1 hora a 37ºC. Inmediatamente, se añadieron los sueros de los ratones inmunizados y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar, las placas se incubaron con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón marcadas con fosfatasa alcalina (Sigma) diluidas 1/1.000 en PBS 1X-Tween 20 (0,05%)-SFT (5%) (50 \muL/pocillo) durante 1 hora a la misma temperatura. Finalmente, después de lavar, se añadió el sustrato de la enzima (p-nitrofenilfosfato (Sigma)) a una concentración final de 1 mg/mL en tampón Dietanolamina pH=9,8 (50 \muL/pocillo). Se midió la absorbancia a 405 nm del complejo enzima-sustrato formado en un lector de placas ELISA.

La Figura 4 muestra las cinéticas de la respuesta de anticuerpo polivalente anti-hTGF\alpha obtenida en ratones inmunizados con TGF\alpha-P64K.

Debido a la alta homología entre hTGF\alpha y los equivalentes de rata o ratón (93%) se puede considerar esta respuesta inmune frente a hTGF\alpha como una respuesta frente al TGF\alpha propio (murino).

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Ejemplo 14 Inmunogenicidad de TGF\alpha-P64K/Al(OH)_{3} en un modelo murino

Se llevó a cabo un protocolo de inmunización según se ha descrito en el ejemplo previo, usando 2 mg de Al(OH)_{3}
como adyuvante. La preparación inmunogénica se preparó según se ha descrito en la descripción detallada de la invención. Se obtuvieron titulaciones de anticuerpo de hasta 1/10.000 para TGF\alpha. La técnica usada para determinar las titulaciones de anticuerpo fue el ELISA indirecto descrito en el ejemplo 13.

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Ejemplo 15 Distribución de las subclases de IgG en ratones inmunizados con la proteína TGF\alpha-P64k/Adyuvante Incompleto de Freund (Montanide ISA 51) en un modelo murino

La distribución de las subclases de IgG se determinó por una técnica de ELISA indirecto descrita en el ejemplo 13, usando antisuero específico frente a las diferentes subclases de IgG conjugado con biotina (Jackson) a una dilución de 1/1.000 y después en el complejo estreptavidina-fosfatasa (1/1.000).

Se determinó la proporción de cada subclase de IgG respecto a la IgG total en el suero de los animales inmunizados. Los animales se inmunizaron con 50 \mug de TGF\alpha en la proteína fusionada usando la vía subcutánea (Grupo 1) o intramuscular (Grupo 2) siguiendo el protocolo de inmunización descrito en el ejemplo 13. En la Figura 5 se observa la distribución de las subclases obtenida. Se obtuvo una mayor proporción de IgG1 en los dos grupos de ratones usados en el estudio.

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Ejemplo 16 Determinación de la capacidad de los sueros de los animales inmunizados con la proteína TGF\alpha-P64k/Adyuvante Incompleto de Freund (Montanide ISA 51) para inhibir la unión de ^{125}I-TGF\alpha por la técnica del ensayo de radio receptor (RRA)

Para determinar si los anticuerpos generados en los protocolos de inmunización descritos previamente eran capaces de inhibir la unión de TGF\alpha a su receptor, se realizó una técnica in vitro denominada RRA. En síntesis, los sueros de los ratones inmunizados obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 13 se incubaron con una mezcla que incluye 100 mL de membrana de placenta humana y 20 mL de ^{125}I-TGF\alpha (100.000 cpm) y 330 mL de tampón: 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl_{2} y BSA al 1%, pH=7,4. TGF\alpha se acopló al radioisótopo ^{125}I usando el método de la cloramina T (Hunter y Greenwood (1962, Nature, 358:495-498). La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción se paró con 1 mL del tampón mencionado anteriormente. Finalmente, los tubos se centrifugaron a 1.000 rpm durante 30 minutos. Los sedimentos se lavaron y se dejaron secar. La radiactividad se midió en un contador de emisión gamma (Wallac, Finlandia). El descenso en los valores medidos de radiactividad indica la inhibición de la unión entre TGF\alpha y su receptor, debido a la acción de los sueros ensayados. Se obtuvo un intervalo de 50%-80% de porcentaje de inhibición en todos los sueros ensayados.

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Ejemplo 17 Determinación de la respuesta humoral anti-EGF humano (hEGF) generada por la inmunización con la proteína TGF\alpha-P64k

La presencia de anticuerpos anti-EGF se determinó en sueros de ratones que mostraban titulaciones altas de anticuerpos anti-TGF\alpha usando la técnica de ELISA indirecto descrita. Se añadieron diluciones de 1/100, 1/1.000 y 1/10.000 de los sueros a placas recubiertas con hEGF (CIGB). La Figura 6 muestra las titulaciones de anticuerpo anti-EGF obtenidas en el suero de ratones inmunizados con la proteína TGF\alpha-P64k. Sólo se obtuvo una respuesta de anticuerpos anti-EGF positiva en un grupo de ratones inmunizados.

Sin embargo, los ratones inmunizados con un EGF-P64K conjugado químicamente no mostraron ningún nivel de anticuerpos anti-TGF\alpha.

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Ejemplo 18 Reconocimiento de tumores humanos in vitro por un antisuero policlonal anti-hTGF\alpha obtenido por la inmunización con la proteína TGF\alpha-P64k/Adyuvante Incompleto de Freund (Montanide ISA 51)

Se usaron los antisueros policlonales anti-hTGF\alpha obtenidos en la inmunización de ratones con la proteína TGF\alpha-P64k en Montanide ISA 51 para determinar la expresión de TGF\alpha en biopsias de tumores incluidas en parafina. Estas biopsias se obtuvieron de pacientes vacunados con una vacuna basada en EGF. En un paciente con una alta respuesta de anticuerpos anti-hEGF, se observó una regresión del tumor NSCLC. Sin embargo, posteriormente se detectó un segundo tumor en la laringe. Se analizaron las biopsias de estos dos tumores y se observó una expresión diferencial de EGF y TGF\alpha en cada una de ellas. En la Figura 7, se muestran los valores de reactividad obtenidos con los diferentes anticuerpos. Estos resultados confirman el hecho de que la inmunización con la preparación de vacuna que contiene TGF\alpha-P64k provoca anticuerpos específicos frente a hTGF\alpha capaces de reconocer esta molécula en tumores humanos.

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Ejemplo 19 Expresión del ARNm de EGF, TGF\alpha y EGF-R en biopsias de carcinoma de mama

Se aisló el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de biopsias de tumor de carcinoma de mama usando el reactivo TRIZOL (Life technologies) y se convirtió en ADNc por la enzima transcriptasa inversa. El ADNc total se sometió a 30 ciclos de PCR usando cebadores específicos para cara una de estas moléculas. Como control interno se usó un gen doméstico (GAPDH). Los productos de PCR obtenidos se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y se visualizaron con bromuro de Etidio.

En la Figura 8 se muestran los resultados obtenidos usando los cebadores específicos para EGF, TGF\alpha, EGF-R y GAPDH (Control interno) en 22 carcinomas de mama. El ARNm de EGF se observó sólo en 1/22 biopsias, sin embargo se observó una alta expresión de los ARNm de TGF\alpha y EGF-R en la mayoría de las muestras. La alta correlación entre la expresión de estas dos moléculas, sugiere la importancia del bucle autocrino TGF\alpha/EGF-R en el crecimiento de este tipo de tumores (Figura 9).

Descripción breve de los dibujos

Figura 1: Secuencia genética y de aminoácidos (letras subrayadas en negrita) del hTGF\alpha maduro.

Figura 2: Representación esquemática del proceso de obtención del vector de expresión pMTGF\alpha.

Figura 3: Reconocimiento de la proteína de fusión TGF\alpha-P64K por el Mab anti-P64K (A) y el Mab anti-hTGF\alpha (B) por la técnica de Transferencia Western. Se llevó a cabo una SDS-PAGE al 10% para P64K (1), EGF-P64K (2) y TGF\alpha-P64K (3). Después, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos específicos frente a P64K (A) o TGF\alpha (B) con el objetivo de caracterizar la proteína fusionada entre TGF\alpha y P64K.

Figura 4: Cinéticas de la respuesta de anticuerpo anti-hTGF\alpha: Las titulaciones de anticuerpos específicos frente a hTGF\alpha se midieron por la técnica de ELISA indirecto. Los ratones se inmunizaron con 5 \mug (A), 10 \mug (B) y 50 \mug (C) de equivalente de hTGF\alpha en la proteína TGF\alpha-P64K mezclado con Montanide ISA 51. El eje de las x representa los días en los que se recogieron las muestras en cada ratón y el eje de las y el recíproco de la titulación de anticuerpo alcanzada. Los días de inmunización se resaltan con flechas en el gráfico A (Día 0, 14, 28 y 42).

Figuras 5: Distribución de las subclases de IgG inducida por la inmunización con 50 \mug de equivalente de TGF\alpha en la proteína fusionada. Comparación de la proporción de las subclases de IgG en la respuesta de anticuerpo inducida con la inmunización de la proteína TGF\alpha-P64k por vía subcutánea (1) o intramuscular (2). Los valores de la desviación estándar se muestran en la figura para cada uno de los grupos de 5 animales inmunizados.

Figuras 6: Respuesta de anticuerpos específica anti-EGF en ratones inmunizados con la proteína de fusión TGF\alpha-P64K. En el gráfico se muestran las titulaciones de anticuerpo anti-hTGF\alpha y anti-EGF alcanzadas en los ratones inmunizados con TGF\alpha-P64K.

Figuras 7: Determinación de la expresión de EGF-R, EGF y TGF\alpha por inmunohistoquímica en biopsias de tumores de pacientes vacunados incluidos en el ensayo clínico II piloto de la vacuna de EGF. La diferente reactividad de estas tres moléculas en el tumor primario de pulmón y en un segundo tumor primario de laringe que apareció después, se muestran con signos positivos en la figura.

Figuras 8: Expresión de los ARNm de EGF, hTGF\alpha y EGF-R en 22 carcinomas de mama. La figura muestra los productos de 30 ciclos de PCR obtenidos con cebadores específicos para cada molécula y visualizados con bromuro de etidio después de haber sido separados en geles de agarosa al 1,5%. También se observa la expresión del ARNm de GAPDH, usado como control interno.

Figuras 9: Correlación entre los niveles de los ARNm de hTGF\alpha y EGF-R en biopsias de carcinoma de mama: La intensidad de las bandas obtenida con bromuro de etidio se analizó mediante un programa de cálculo (ImagQuant, Amersham). El eje de las x muestra la relación entre los valores de intensidad para los productos de PCR usando cebadores específicos para EGF-R y los obtenidos con GAPDH para cada muestra (intensidad relativa) y el eje de las y el mismo valor de intensidad relativa para hTGF\alpha. Se observó una correlación positiva entre las expresiones de estas dos moléculas (R^{2}=0,657, p=0,00121).

Claims

1. Una composición de vacuna para incitar una respuesta inmune frente a TGF\alpha autólogo, que comprende como principio activo una proteína de fusión entre una proteína vehicular y TGF\alpha humano o cualquier derivado peptídico del mismo y que comprende adicionalmente un adyuvante, en la que dicha proteína de fusión es capaz de incitar dicha respuesta inmune frente a TGF\alpha.

2. La composición de vacuna según la reivindicación 1 en la que la proteína vehicular es la proteína P64K del complejo proteico de la membrana exterior de Neisseria meningitidis.

3. La composición de vacuna según la reivindicación 2 en la que la proteína vehicular comprende una cola de seis histidinas en el extremo N-terminal.

4. La composición de vacuna según la reivindicación 2 en la que la composición de vacuna comprende además EGF.

5. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adyuvante es Adyuvante Incompleto de Freund.

6. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adyuvante es Al(OH)_{3}.

7. Uso de una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un agente para el tratamiento de enfermedad maligna en tumores de origen epitelial que expresan TGF\alpha o EGF.

8. El uso de la reivindicación 7 en el que el tumor es un carcinoma epidermoide de pulmón, mama, próstata, gástrico o de ovario.