JP2004521091A - トランスフォーミング増殖因子アルファを含有するワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、自己ＴＧＦαに対して特異的な免疫応答を起こすことができるワクチン組成物であって、ＴＧＦαまたは任意のその誘導体および活性成分および適切なアジュバントを含むワクチン組成物に関する。該ワクチン調製物はまた、ＴＧＦαとその他の増殖因子、たとえば上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、前記因子に依存して進行する腫瘍の増殖を阻害するような方法で組み合わせて含むことができる。類表皮癌の成長および増殖は前記組成物を使用することによって制御することができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学およびヒト用薬剤の分野に関するもので、特に自己ＴＧＦαに対する免疫除去反応を引き起こすことができるワクチン調製物に関する。このワクチンは、ある種の癌およびその他のＴＧＦα関連疾患を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）はアミノ酸５０個のポリペプチドで、当初レトロウイルスによって形質転換した細胞の培養上清から単離された。最初、上皮増殖因子（ＥＧＦ）とＥＧＦ−Ｒへの結合について競合することができる分子として定義された。しかし、抗ＥＧＦ抗体はＴＧＦαを認識できなかった（例えば、非特許文献１参照。）。したがって、両増殖因子は免疫学的に異なった単位である。
【０００３】
ＴＧＦαはＥＧＦファミリーに属する。構造的および機能的に関連した蛋白質によってこのファミリーは構成されている。このファミリーのその他の要素は、ＥＧＦ、アンフィレグリン（ＡＲ、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、クリプトール（ｃｒｉｐｔｏｌ、ＣＲ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ、ベータセルリン、エピレグリンである。一方、ポックスウイルスファミリーにはＥＧＦ関連蛋白質が含まれる。これらの中で、最も特徴づけられているのがワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）である。
【０００４】
これらの分子はすべてＥＧＦ−Ｒに結合してＥＧＦ−Ｒを活性化し、そのためこの受容体のリガンドとして知られている。この系は、正常細胞および腫瘍細胞の増殖において役割を担っている。ＥＧＦ−Ｒは１７０ｋＤの糖蛋白質で、その遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。この受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼ蛋白質活性と関係している。これらの蛋白質は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ発癌遺伝子産物と構造的に相同で、このことは悪性形質転換のプロセスと関連している証拠である（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
ＴＧＦαは、アミノ酸１６０個の膜貫通型前駆体（ｐｒｏ−ＴＧＦα）として合成される。アミノ酸５０個の可溶型である成熟ＴＧＦαは、蛋白質分解することによって放出される。ヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）は、ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）と４３％、マウスまたはラットのＴＧＦαと９３％のアミノ酸配列同一性を示す。その上、これらの生物学的作用は種特異的ではない。
【０００６】
多くの研究室が、培養細胞の増殖、移動および分化をＴＧＦαが調節する能力についての研究を報告してきた（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００７】
ＴＧＦαは、ＥＧＦ−Ｒの最も一般的なリガンドである。これは、胚形成中の正常組織および成人の正常組織および腫瘍組織に発現する。しかし、ＴＧＦαノックアウトマウスでは目立った病理学的な欠陥は認められず、これらのマウスは生存可能で、生殖可能である（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
腫瘍形成過程において、ＥＧＦ−Ｒ活性化のパラクリンプロセスおよびオートクリンプロセスの制御解除は、増殖因子発現のアップレギュレートまたはそれらの受容体の多量合成または変異によるものである。
【０００９】
上皮性腫瘍では、ＥＧＦ−Ｒが高濃度に検出された。多くの場合、この受容体の過剰発現は予後の悪さの指標となる。
【００１０】
ＴＧＦαの誘導は、悪性形質転換に頻出する現象である。実際に、数多くの研究によって、胸部、肺、脳、肝臓、前立腺、膀胱、胃腸管、結腸、生殖器（卵巣）および内分泌組織を含めた様々な位置の上皮性腫瘍においてとりわけこの分子が過剰発現することが示されている。
【００１１】
ＴＧＦαが腫瘍形成能を誘導する機構はまだわかっていないが、この増殖因子の過剰発現が腫瘍の程度、患者の生存率およびその他の腫瘍マーカーと相関しているという報告がいくつある。その上、肝臓癌におけるｃ−ｍｙｃなどのその他の発現遺伝子との関連を示唆する研究者も何人かいる。ＴＧＦαはまた、フォンヒッペルリンドウ腫瘍抑制遺伝子（ＶＨＬ）の標的となる（例えば、非特許文献５参照。）。
【００１２】
ＴＧＦαおよびＥＧＦは同等の親和性で同じ受容体に結合するが、ＴＧＦαは一般的にＥＧＦよりも効果があり、場合によってはその効果はより強力で、かつ／またはより長時間続くと記されている（例えば、非特許文献６参照。）。内在化したＴＧＦα／ＥＧＦ−Ｒ複合体の場合、ＴＧＦαおよびＥＧＦ−Ｒは細胞表面に優先的に再利用されるが、一方ＥＧＦ／ＥＧＦ−Ｒ複合体が同じ種類の細胞に内在化されるとき、両成分は効率よく分解されることが報告された（例えば、非特許文献７参照。）。これらの結果から、それぞれの増殖因子の生物学的活性の違いは、細胞内運搬機構の違いによることが示唆された。
【００１３】
他方、ＴＧＦαはＥＧＦよりも効果的な血管形成因子である（例えば、非特許文献８参照。）。
【００１４】
腫瘍での発現に関して、いくつかの上皮性腫瘍の膜内にＥＧＦ前駆体が存在している証拠があるが、ＴＧＦαは上皮性腫瘍に最も発現しており、ＥＧＦとは反対に、その作用はＥＧＦ−Ｒとのオートクリンループによる。他方、我々の施設での結果では、いくつかの上皮性腫瘍生検ではＴＧＦαは発現しているがＥＧＦは発現しておらず（乳腺管癌、喉頭癌）、一方その他の腫瘍ではＴＧＦαよりもＥＧＦが多く存在している（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））。これらの結果から、増殖因子は異なる新生細胞の腫瘍生物学には異なる影響を与えることができることが示唆される。
【００１５】
ＥＧＦ−Ｒ／ＥＧＦ−Ｒリガンド系と癌との関連について近年蓄積された証拠はいずれもこの系が癌の免疫治療のための非常に興味深い標的であることを示唆している。
【００１６】
我々のグループの今までの結果によって、ＥＧＦをベースにしたワクチンによって有効な癌の免疫治療の開発が可能であることが示された。実際に、担体蛋白質に結合したｈＥＧＦを予防接種することによって免疫原性が得られ、かつ毒性が低いという前臨床的および臨床的証拠が得られた（例えば、非特許文献９参照。）。
【００１７】
前臨床試験によって、アジュバントに入れたｈＥＧＦでマウスを免疫するとエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）を移植したマウスの生存率が増加することが示された（例えば、非特許文献９参照。）。
【００１８】
ｈＥＧＦとＰ６４ｋとの融合蛋白質が作製された。この蛋白質は、Ｐ６４ｋのアミノ酸４５／４６の間に挿入されたｈＥＧＦ配列を含有する。この融合蛋白質を使用してマウスを免疫し、ｈＥＧＦに対する特異的な体液性免疫応答を引き起こした。引き起こされた免疫応答は、ＥＡＴマウスの寿命の延長をもたらした（例えば、非特許文献１０参照。）。
【００１９】
ＮＳＣＬＣの患者に対してパイロット臨床試験を２回行ったところ、既存対照と比較して予防接種した患者の生存率が増加する傾向が認められた。ｈＥＧＦに対して高い抗体応答を示す患者において、著しい生存率の増加が認められた（例えば、非特許文献１１参照。）。
【００２０】
一般的に、ＥＧＦを予防接種してもＴＧＦαに対する特異的な抗体応答は生じない。しかし、ネズミモデルにおいて、ＴＧＦαを含有する免疫原調製物で予防接種すると数匹のマウスにのみ抗ＥＧＦ抗体が低濃度生じるという証拠が得られた。場合によっては、この抗体応答はＥＧＦがｉｎ ｖｉｔｒｏでその受容体に結合するのをブロックすることができる。しかし、得られた抗ＥＧＦ抗体の濃度は、効果的なＥＧＦ免疫除去応答を引き起こして抗腫瘍作用に影響を与えるには十分ではない。
【００２１】
これらの増殖因子それぞれの作用はそれぞれの腫瘍および／または原発腫瘍と転移腫瘍との間で異なっているため、ＥＧＦ−Ｒの主要な２種類のリガンド、ＴＧＦαおよびＥＧＦを合わせたワクチンは、一般的な意味において上皮性腫瘍により良好な抗腫瘍効果を発揮する。
【００２２】
本発明の時点まで、効果的な癌の免疫治療において、ｈＴＧＦαまたは任意の誘導体を含有するか、またはＥＧＦ−Ｒのその他のリガンド、ＥＧＦと組み合わせて含有するワクチン調製物を使用することを提案した治療は開発されていない。
【００２３】
【特許文献１】米国特許第４，３０２，３８６号明細書
【非特許文献１】Todaro他 (1976), Nature264, 26〜31
【非特許文献２】Heldin C.H. (1984), Cell 37,9〜20
【非特許文献３】CarpenterおよびWahl.(1990), Springer-Verlag, Berlin, pp.69〜171
【非特許文献４】Bruce Mann他(1993), Cell, 73、249〜261
【非特許文献５】Lee他(1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease,Volume1B,277〜318
【非特許文献６】Barrandon and Green(1987),Cell 50,1131〜1137
【非特許文献７】Ebner and Derynck(1991),Cell Regul.2,599〜612
【非特許文献８】Schreiber他(1986),Science 232,1250〜1253
【非特許文献９】Gonzalez他(1996),Vaccine Research 5(4),233〜243
【非特許文献１０】Gonzalezand cols(1997),Vaccine Research 6(2),91〜100
【非特許文献１１】Gonzalez他(1998),Annals of oncology 9,1〜5
【非特許文献１２】Kapp他(1993) J Dermatol Sci,Jun 5(3),133〜42
【非特許文献１３】Office of National Registration of Medications, HEBERMIN Not 1266
【非特許文献１４】Lowry他(1951),J.Biol.Chem.191,495〜498
【非特許文献１５】Hunter and Greenwood(1962,Nature,358:495〜498）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、担体蛋白質に遺伝子的（融合蛋白質）に、または化学的方法によって結合した、ｈＴＧＦαまたは任意の供給源由来の誘導体を含有し、悪い副作用を伴わないで上皮性腫瘍の増殖を阻害することができるワクチン組成物を提供する。この作用は、増殖因子の免疫除去機構による。担体蛋白質と共にｈＴＧＦａとｈＥＧＦまたは任意の誘導体の組み合わせを含有するワクチン組成物も特許請求の範囲に記載する。
【００２５】
該ワクチン組成物は、ＴＧＦαまたはＴＧＦα／ＥＧＦ依存性の上皮性腫瘍、または乾癬などＴＧＦαに関連したその他の疾患の治療に使用することができる（例えば、非特許文献１２参照。）。
【００２６】
ＴＧＦαの説明では、元の分子と同じ免疫学的特性および／または同様の効果を有するＴＧＦα由来の断片が含まれる。得られたものには、とりわけアミノ酸の新規な置換、安定性および／または活性を増大させる特異的なアミノ酸の変更、化学的修飾が含まれるが、その他のものを排除するわけではない。
【００２７】
さらに具体的には、本発明は、ある種の癌およびＴＧＦαに関連したその他の疾患の治療に使用できる、自己ＴＧＦαの免疫除去反応を引き起こすことができるワクチン組成物を含む。
【００２８】
他方では、本発明には、ＴＧＦαおよびＥＧＦの組み合わせによって構成されたワクチン調製物の使用が含まれる。このワクチンは、発病過程においてこれらの２種類の増殖因子に依存している新生物の治療に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
１−免疫原調製物
本発明において、使用するワクチン調製物は、遺伝子工学的方法（融合蛋白質）または化学的な結合方法のいずれかで担体蛋白質に結合したｈＴＧＦαを含む。これらの免疫原調製物のいずれかで使用されるｈＴＧＦαは、組換体、合成物または天然源から得られたものとすることができる。様々な蛋白質を担体として使用することができる。使用できる担体蛋白質の例は、とりわけ破傷風毒素、ＫＬＨ、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得られたＰ６４ｋ蛋白質である。ワクチン調合物中の最適なｈＴＧＦαの量は、用量あたり５μｇと１０００μｇとの間で変動する。
【００３０】
他方では、ｈＴＧＦαとｈＥＧＦとの組み合わせを含有するワクチン調製物を使用する（例えば、非特許文献１３参照。）。ＴＧＦαまたはＥＧＦの説明では、元の分子と同じ免疫学的特性および／または同様の効果を有するＴＧＦαまたはＥＧＦ由来の断片が含まれる。得られたものには、とりわけアミノ酸の新規置換、安定性および／または活性を増大させる特異的なアミノ酸の変更、化学的修飾が含まれるが、その他のものを排除するわけではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
Ａ）遺伝子工学的方法による融合蛋白質ＴＧＦα−担体蛋白質の獲得
ｈＴＧＦａをコードする遺伝子（５００ｂｐ）を特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。得られたＤＮＡ断片を消化して、担体蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターの特定の部位にクローニングする。得られた蛋白質には、両分子のコピーが１個または複数個含まれている。ほ乳類細胞、細菌または酵母の発現ベクターを使用することができる。このベクターにはまた、担体蛋白質のＮ末端に６個のヒスチジンを含めることができる。得られたプラスミドは、アガロースゲルによる制限分析、シークエナーゼ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を使用したＤＮＡ配列決定、および最終的にはｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用したウェスタンブロット技術による任意のＥ．ｃｏｌｉ発現種での融合蛋白質の発現分析によって確認した。蛋白質を得るために、強力な破壊方法を使用して細菌壁を粉砕し、次に硫酸アンモニウムによる分別沈殿法とクロマトグラフィ法を組み合わせて該蛋白質を精製する。最終的に、無菌条件下で該蛋白質を濾過し、その後使用するまで−２０℃で保存するか凍結乾燥して４℃で保存する。
【００３２】
Ｂ）ｈＴＧＦαを含有する化学的結合物の獲得
（Ｐ６４ｋのような）様々な担体蛋白質に結合したｈＴＧＦαを含有する様々な調製物を得る。任意の化学的結合方法を使用することができる。好ましい化学的方法として、米国特許公報、Ｌｅｅ他、１９８１（例えば、特許文献１参照。）に記載されたＥＭＣＳ剤を使用した方法を使用する。
【００３３】
あるいは、グルタルアルデヒドによる結合方法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの２種または３種の分子の最終溶液中の濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで０．０５％のグルタルアルデヒドと混合する（全溶液中）。この混合物を室温で１時間インキュベートして、次にＰＢＳ １ｘ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の溶液で透析する。最後に、ＰＢＳ １ｘで４℃で一晩透析を実施する。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【００３４】
Ｃ）ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦを組み合わせたワクチンの獲得
ＥＧＦ−Ｒの２種類の主要なリガンドを組み合わせたワクチンの獲得は、異なる方法で実施することができる。
１−ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦを別々に担体蛋白質に結合させた２種類のワクチンを１：１の割合で注射時に混合する。この目的のために、融合蛋白質またはそれぞれの増殖因子と担体蛋白質との化学的結合物を使用することができる。ワクチン調合物中の最適なｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦの量は、投与あたり５μｇと１０００μｇとの間で変動する。
２−両増殖因子、ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦ、またはその誘導体のいずれかの組み合わせを含有するＡ項で説明したと同様の遺伝子構築物を得る。
３−Ｂ項で説明した方法を使用した、ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦまたはその誘導体のいずれかの組み合わせおよび担体蛋白質を含有する化学的結合物の化学的獲得。
【００３５】
Ｄ）免疫原調製物の獲得
ワクチン組成物の所望する免疫原性効果を得るために、適切なアジュバントを使用し、ワクチン調製物が高い免疫原性を示す投与経路を選択すると都合がよい。
【００３６】
本発明で言及したワクチン調製物は、２種類の具体的な方法で調製する。
１）アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用して、この化合物に吸着したワクチン調製物から水性溶液を得る。この目的のために、ＴＧＦα相当５μｇから１０００μｇの範囲の様々な調製物を２から５ｍｇの範囲のＡｌ（ＯＨ）3に結合させて使用する。この調合物を１時間攪拌したままにする。最終溶液をその後使用するまで４℃で保存する。
２）油中水型または水中油型エマルジョンを形成することができるフロインドの不完全アジュバントを使用する。最終調合物中の融合蛋白質または化学的結合物およびアジュバントの量は４０／６０から６０／４０（量／量）の範囲である。この量は所望する最終エマルジョンに左右される。アジュバントは免疫前に添加し、この調合物を１０から３０分間、室温で攪拌する。
【００３７】
免疫原調製物それぞれの最終体積には、対応する投与経路に適切な範囲が含まれる。
【００３８】
Ｃ項で説明したように注射時に調製する複合ワクチンの場合、既に説明したように適切なアジュバントと混合した２種類のワクチンを攪拌によって混合し、注射するまたは別々に注射することができる。
【００３９】
ワクチン組成物の投与は、様々な経路、筋肉内、皮下、経鼻および皮内で実施することができる。
【実施例１】
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による成熟ＴＧＦαをコードするＤＮＡ部分の獲得
ｈＴＧＦαをコードする遺伝子を、ＰＳＫ／ＴＧＦαベクターを鋳型として使用したＰＣＲによって増幅した（ＣＩＧＢ、キューバ）。このプラスミドは市販のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ−（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングしたｈＴＧＦα相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有する。成熟したＴＧＦαをコードする配列（アミノ酸５０個の長さ（図１））を、前述の特異的プライマーを使用して増幅した。
Ｎ末端：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＣ−３’
（下線部、Ｘｂａｌ制限部位）
Ｃ末端：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣ−３’
（下線部、ＥｃｏＲＩ制限部位）
【００４１】
簡単に言うと、特異的なプライマーそれぞれを５００ｎｇ、それぞれ２００ｍＭの濃度までのデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、ＭｇＣｌ2２５ｍＭおよびＰｒｏｍｅｇａの緩衝液に溶かしたＴａｑ−ポリメラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００単位を含む混合物７５μｌで、ＰＳＫＴＧＦα２００ｎｇを使用した。次に、変性（９４℃で１分）、アニーリング（６０℃で１分）および伸長（７２℃で３０秒）を３０回のプロトコールを行った。初回の前に、ＤＮＡを４分間変性させ、最終回の後で、２分間の最終伸長を実施した。
【００４２】
ＰＣＲ産物を低ゲル化温度（ＬＧＴ）アガロースゲルで電気泳動により分離し、フェノール抽出およびＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ酵素（ＮＥＢ、ＵＳＥＳ）を使用した酵素的分解の従来の方法によって、増幅した遺伝子部分を精製する。このプロトコールによって、成熟したＴＧＦαをコードする遺伝子部分が調製される。
【実施例２】
【００４３】
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋの発現ベクターの獲得
発現ベクターｐＭ９２を使用した（ＣＩＧＢ、キューバ）。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファンオペロンプロモータ（ｐｔｒｐ）およびＴ４ファージ転写終結因子（ｔＴ４）の制御下に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｂ３８５株）から得られたＰ６４ｋ蛋白質をコードするｌｐｄＡ遺伝子を含有する。ｐＭ９２は、アンピシリンおよびカナマイシン抗生物質耐性をコードする。Ｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＧＣ−３６６）をｐＭ９２で形質転換し、このプラスミドを市販のキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコールに従って精製する。ＰＭ９２ベクターを消化して、ＬＧＴアガロースゲルから精製する。その後、Ｔ４リガーゼ酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ＰＭ９２ベクターを、既に調製した成熟ｈＴＧＦαのｃＤＮＡと連結する。得られたプラスミドｐＭＴＧＦαはＰ６４ｋのアミノ酸４５／４６に挿入されたｈＴＧＦαを含有する融合蛋白質をコードする。この組換えプラスミドを、アガロースゲルによる制限分析、シークエナーゼ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を使用したＤＮＡ配列決定、および最終的にはｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用したウェスタンブロット技術によるＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９９株での融合蛋白質の発現分析によって確認した。図２に、発現ベクターｐＭＴＧＦαを獲得する方法の概略を示す。このベクターは、融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋをコードする。
【実施例３】
【００４４】
Ｎ末端に６個のヒスチジンを有する融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋの発現ベクター（ｐＭＨｉｓＴＧＦα）の獲得
開始ベクターとしてｐＭ２２４を使用して、前の実施例で説明したと同様の方法に従って、Ｐ６４ｋのＮ末端に６個のヒスチジンをコードする部分を含む発現ベクターｐＭＨｉｓＴＧＦαを得た。Ｃｕ２＋またはその他の金属を結合したキレートセファロースへの結合が増加するので、この６個のヒスチジンタグの存在は、この蛋白質を精製する際に有利である。
【実施例４】
【００４５】
融合蛋白質（ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ）の精製
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌（ＭＭ２９９株）をＬＢＡ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよびアンピシリン５０ｍｇ／Ｌ）で３７℃で１０時間増殖させた。細胞収集後は全ての段階を０〜４℃で実施した。細菌破砕はフレンチプレスで１５００ｋｇ／ｃｍ2で実施し、不溶性画分を１１０００ｘｇで３０分間の高速遠心することによって除去した。最初の精製段階として、硫酸アンモニウム４０％による沈殿を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の一部を除去した。得られたペレットは、４℃で１１０００ｘｇで３０分間さらに遠心することによって除去した。上清を疎水性相互反応クロマトグラフィ（ＴＳＫ−ｂｕｔｉｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で、ＮａＣｌ０．１５Ｍを含有するＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ＝７．２に溶かした硫酸アンモニウム４０％から０％の濃度低下勾配によって分画した。その後、得られた試料をＰＢＳ１ｘで平衡化したＧ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過によって分離して、９５％以上の最終純度を実現した。蛋白質濃度は比色方法を使用して測定した（例えば、非特許文献１４参照。）。融合蛋白質の特徴付けは、Ｐ６４ｋおよびＴＧＦαに対する特異的抗体を使用したウェスタンブロット技術によって実施した。
【実施例５】
【００４６】
融合蛋白質（ＨｉｓＴＧＦα−Ｐ６４ｋ）の精製
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌（ＭＭ２９９株）をＬＢＡ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよびアンピシリン５０ｍｇ／Ｌ）で３７℃で１０時間増殖させた。細胞収集後は全ての段階を０〜４℃で実施した。細菌破砕はフレンチプレスで１５００ｋｇ／ｃｍ2で実施し、不溶性画分を１１０００ｘｇで３０分間高速遠心することによって除去した。最初の精製段階として、硫酸アンモニウム４０％による沈殿を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の一部を除去した。得られたペレットを４℃で１１０００ｘｇで３０分間さらに遠心することによって除去した。蛋白質中に６個のヒスチジンが存在するので、上清をキレートアフィニティクロマトグラフィ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で、イミダゾールを２５ｍＭから５００ｍＭの勾配で増加させたＮａＣｌ０．５Ｍを含有するＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ５．５によって分画した。その後、得られた試料をＰＢＳ１ｘで平衡化したゲル濾過Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させ、塩を除去して純度９５％を実現した。蛋白質濃度は比色方法を使用して測定した（例えば、非特許文献１４参照。）。融合蛋白質の特徴付けは、Ｐ６４ｋおよびＴＧＦαに対する特異的抗体を使用したウェスタンブロット技術によって実施した。
【実施例６】
【００４７】
組換え蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４ＫのｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）による認識
ＴＧＦαが融合蛋白質の状態で抗ｈＴＧＦαＭａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって認識されることができるかどうかを決定するために、ウェスタンブロット技術を実施した。ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ、ＴＧＦａ−Ｐ６４ＫまたはＰ６４Ｋ２５μｇを２枚のポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離し、次いで従来の方法に従って０．４５μｍのニトロセルロース膜に移した。移した後、膜をスキムミルク５％を有するＴＢＳ１ｘのブロック溶液と共に一晩４℃でインキュベートした。ＴＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で素早く洗浄した後、１枚の膜を抗Ｐ６４Ｋ抗体（１／５００）（図３Ａ）と反応させ、もう１枚は抗ＴＧＦαＭａｂ（１／１００）（図３Ｂ）と共に室温で２時間インキュベートした。その後、同溶液で３回洗浄を実施し、膜をアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１／１０００）で同条件で１時間インキュベートした。最後に、２０ｍＬ中にＴｒｉｓ−Ｃｌ０．１Ｍ ｐＨ＝８．２、Ｎａｐｈｔｏｌ ＡＣＥ−ＭＸ ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）０．００４ｇおよびＮＮ’ジメチルホルムアミド４００μＬを含有する緩衝液に溶かしたＦａｓｔ Ｎｅｔ酵素基質（Ｓｉｇｍａ）０．００４ｇを添加した。この反応を同洗浄液で停止させた。抗ｈＴＧＦαＭａｂによるＴＧＦα−Ｐ６４ｋの特異的認識が確認された（図３）。この結果は、融合蛋白質中のＴＧＦαが特異的抗体によって認識されうる構造を保持していることを示している。
【実施例７】
【００４８】
化学的に結合したｈＴＧＦα−Ｐ６４ｋの獲得
ＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に２ｍｇ／ｍＬで溶かしたＴＧＦα１ミリリットルを、同じ溶媒に２ｍｇ／ｍＬで溶かしたＰ６４ｋ１ミリリットルと混合する。次に、０．５％グルタルアルデヒド溶液０．２ｍＬを最終的な割合が０．０５％になるように添加した。この混合物を室温で１時間インキュベートして、ＰＢＳ１ｘ／１０ｍＭＭｇＣｌ2溶液で透析した。最後に、４℃で一晩ＰＢＳ１ｘで透析した。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【実施例８】
【００４９】
ｈＴＧＦα、ｈＥＧＦおよびＰ６４ｋの融合蛋白質の獲得
ｈＥＧＦをコードする遺伝子（１５０ｂｐ）は、鋳型としてプラスミドｐＢＥＦ１０を使用してＰＣＲによって増幅する。このプラスミドは市販のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（Ｓｔｒｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした完全なｈＥＧＦを含有する。得られたＤＮＡを実施例２で説明した方法を使用してＰ６４ｋのＣ末端に位置するＢａｍＨＩ部位のｐＭＨｉｓＴＧＦαプラスミドに結合させる。この方法で、融合蛋白質ＴＥ−Ｐ６４ｋをコードするｐＭＴＧＦα−ＥＧＦベクターが得られる。
【実施例９】
【００５０】
化学的に結合したｈＴＧＦα−ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋの獲得
ＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に３ｍｇ／ｍＬで溶かしたＴＧＦα１ミリリットルを、同じ溶媒に３ｍｇ／ｍＬで溶かしたｈＥＧＦおよび３ｍｇ／ｍＬで溶かしたＰ６４ｋ１ミリリットルと混合する。次に、０．５％グルタルアルデヒド溶液０．６ｍＬを最終的な割合が０．０５％になるように添加した。この混合物を室温で１時間インキュベートして、ＰＢＳ１ｘ／１０ｍＭＭｇＣｌ2溶液で透析した。最後に、４℃で一晩ＰＢＳ１Ｘで透析した。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【実施例１０】
【００５１】
ｈＴＧＦαを含有する調合物の調製
実施例２、３、７、８および９で説明した異なる免疫原調製物を、本発明の詳細な説明で説明したようにＡｌ（ＯＨ）3またはモンタニドＩＳＡ ５１と混合する。使用した量は、全ての調製物中で５０μｇのｈＴＧＦαと等しく、実施例８および９で説明したような複合ワクチンの場合、５０μｇのｈＴＧＦαとｈＥＧＦに等しい。ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦ相当５０μｇをそれぞれ含有する融合蛋白質または化学的結合物の調製物それぞれにＡｌ（ＯＨ）3２ミリグラムを使用した。
【実施例１１】
【００５２】
ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ蛋白質およびＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ蛋白質を含有する複合ワクチンの調製
組換え体０．６ｍｇ中の各増殖因子５０Ｍｇを等量のモンタニドＩＳＡ ５１と全量０．５ｍＬ中で混合し、室温で１０分間攪拌してから注射する。
【００５３】
アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用する場合、Ａｌ（ＯＨ）3２ｍｇ中に各蛋白質０．６ｍｇを含有する２種類の調製物を注射前に混合する。
【実施例１２】
【００５４】
化学的に結合したＴＧＦα／Ｐ６４ＫおよびＥＧＦ／Ｐ６４Ｋを含有する複合ワクチンの調製
０．２５ｍＬ中に実施例７で説明したＰ６４ｋに結合したｈＴＧＦα５０μｇを含有する免疫原調製物を、ｈＥＧＦを含有する等量の免疫原調製物０．２５ｍＬと混合し、実施例１０で説明したように０．５ｍＬのモンタニドＩＳＡ ５１とシリンジを使用して室温で１０分間混合する。
【００５５】
アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用する場合、ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦそれぞれ５０μｇをＡｌ（ＯＨ）3２ｍｇに吸着して含有する前述した化学結合物それぞれ０．５ｍＬを混合する。
【実施例１３】
【００５６】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）の免疫原性
ワクチンの免疫原性を示すために、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに５８ｍｇ（ＴＧＦα５μｇに相当）、１１６ｍｇ（１０μｇ）または０，６ｍｇ（５０μｇ）のＴＧＦα−Ｐ６４ｋをモンタニドＩＳＡ ５１と共に１：１の割合で皮下注射した。免疫原を本発明の詳細な説明で説明したように調製し、免疫前に１０分間攪拌した。動物それぞれに４回投与した。免疫前、１週間後、その後は隔週に血液を採取した。動物から採取した血液から血清を分離し、間接ＥＬＩＳＡ技術によってｈＴＧＦαに対して特異的な抗体の力価を測定した。
【００５７】
簡単に説明すると、マイクロタイターＥＬＩＳＡ用プレート（ＣＯＳＴＡＲ）を炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ＝７．２に２．５μｇ／ｍＬで溶かしたｈＴＧＦαの溶液５０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄後、このプレートをＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）−ＳＦＴ（５％）の溶液で３７℃で１時間ブロックした。直ちに免疫したマウスの血清を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）−ＳＦＴ（５％）で１／１０００に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）（５０μＬ／ウェル）で同じ温度で１時間インキュベートした。最後に、洗浄後、酵素の基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ））をジエタノールアミン緩衝液ｐＨ＝９．８に１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で添加した（５０μＬ／ウェル）。形成された酵素−基質複合体の４０５ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
【００５８】
図４は、ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスで得られた多価抗ｈＴＧＦα抗体応答の速度論を示す図である。
【００５９】
ｈＴＧＦαとラットまたはマウスの同等物の間には高い相同性があるため（９３％）、この免疫応答は自己ＴＧＦα（マウス）に対する応答と考えることができる。
【実施例１４】
【００６０】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ／Ａｌ（ＯＨ）３の免疫原性
免疫方法は、以前の実施例で説明した通りに、アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3２ｍｇを使用して実施した。免疫原調製物は本発明の詳細な説明で説明した通りに準備した。ＴＧＦαについて１／１００００までの抗体力価が得られた。抗体力価を測定するために使用した技術は、実施例１３で説明した間接ＥＬＩＳＡであった。
【実施例１５】
【００６１】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）で免疫したマウスのＩｇＧサブクラス分布
ＩｇＧサブクラス分布は、１／１０００まで希釈した異なるＩｇＧサブクラス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に対するビオチン結合特異的抗血清を使用し、後でストレプトアビジン−ホスファターゼ複合体（１／１０００）によって、実施例１３で説明した間接ＥＬＩＳＡ技術によって測定した。
【００６２】
各ＩｇＧサブクラスの割合は、免疫した動物の血清全ＩｇＧに対して測定した。実施例１３で説明した免疫方法に従って、動物を融合蛋白質中のＴＧＦα５０μｇによって皮下（１群）または筋肉内（２群）経路を使用して免疫した。この研究で使用した両群のマウスでは、大量のＩｇＧ１が得られた。
【実施例１６】
【００６３】
放射性受容体アッセイ技術（ＲＲＡ）によるＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）で免疫した動物血清のＩ125−ＴＧＦα結合阻害能力の測定
既に説明した免疫方法で得られた抗体によってＴＧＦαがその受容体に結合するのを阻害できるかどうかを測定するために、ＲＲＡと呼ばれるｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を実施した。組み立てでは、実施例１３で説明したように得られた免疫マウスの血清を、ヒト胎盤膜１００ｍＬおよびＩ125−ＴＧＦα（１０００００ｒｐｍ）２０ｍＬおよびＴｒｉｓ−Ｃｌ１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭおよびＢＳＡ１％、ｐＨ＝７．４の緩衝液３３０ｍＬを含む混合物とインキュベートした。クロラミンＴの方法を使用してＴＧＦαをＩ125放射性同位元素に結合させた（例えば、非特許文献１５参照。）。この混合物を室温で１時間インキュベートして、前述した緩衝液１ｍＬで反応を停止させた。最後に、この試験管を１０００ｒｐｍで３０分間遠心した。ペレットを洗浄して、乾燥させた。放射活性をガンマ線計測器（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）で測定した。測定した放射活性値の減少は、試験血清の作用によってＴＧＦαとその受容体との結合が阻害されたことを示している。試験血清全てにおいて、５０％〜８０％の範囲の阻害が得られた。
【実施例１７】
【００６４】
ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫することによって得られた抗ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）の体液性応答の測定
前述の間接ＥＬＩＳＡ技術を使用して高い抗ＴＧＦα抗体力価を示すマウス血清において、抗ＥＧＦ抗体が存在することが測定された。１／１００、１／１０００および１／１００００に希釈した血清をｈＥＧＦ（ＣＩＧＢ）でコーティングしたプレートに添加した。図６は、ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫したマウスの血清で得られた抗ＥＧＦ抗体力価を示している。１群の免疫マウスにおいてのみ、陽性の抗ＥＧＦ抗体応答が得られている。
【００６５】
しかし、１種類の化学結合ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスでは、いかなる濃度の抗ＴＧＦα抗体も認められなかった。
【実施例１８】
【００６６】
ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）の免疫によって得られたポリクローナル抗ｈＴＧＦα抗血清によるヒト腫瘍の認識
モンタニドＩＳＡ ５１中のＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫したマウスで得られたポリクローナル抗ｈＴＧＦα抗血清を使用して、パラフィンに埋入した腫瘍生検中のＴＧＦαの発現を測定した。これらの生検は、ＥＧＦに基づくワクチンを予防接種した患者から得た。高い抗ｈＥＧＦ抗体応答を示す患者では、ＮＳＣＬＣ腫瘍の退縮が認められた。しかし、後に咽頭の二次腫瘍が検出された。これら２種類の腫瘍の生検を分析したところ、そのうちのそれぞれにＥＧＦおよびＴＧＦαの異なる発現が観察された。図７に、異なる抗体で得られた反応値を示す。これらの結果から、ＴＧＦα−Ｐ６４ｋを含有するワクチン調製物による免疫によって、ヒト腫瘍においてこの分子を認識できるｈＴＧＦαに対する特異的抗体が生じることは確実である。
【実施例１９】
【００６７】
乳癌生検におけるＥＧＦ、ＴＧＦαおよびＥＧＦ−ＲのｍＲＮＡ発現
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して乳癌腫瘍生検から単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した。これらの分子それぞれについて特異的なプライマーを使用して、全ｃＤＮＡにＰＣＲを３０回行った。内部対照として、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を使用した。得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して単離し、エチジウムブロミドで視覚化した。図８では、２２の乳癌においてＥＧＦ、ＴＧＦα、ＥＧＦ−ＲおよびＧＡＰＤＨ（内部対照）に対する特異的プライマーを使用して得られた結果を示した。ＥＧＦｍＲＮＡは１／２２の生検にのみ認められたが、試料のほとんどにおいてＴＧＦαおよびＥＧＦ−ＲｍＲＮＡ の高い発現が認められた。これらの２分子の発現が強く相関していることによって、この種類の腫瘍の増殖においてＴＧＦα／ＥＧＦ−Ｒのオートクリンループの重要性が示唆される（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】成熟ｈＴＧＦαの遺伝子配列およびアミノ酸配列を示す図である（下線で示した太字）。
【図２】発現ベクターｐＭＴＧＦαを得る方法の概略を示す図である。
【図３】抗Ｐ６４ＫＭａｂ（Ａ）および抗ｈＴＧＦαＭａｂ（Ｂ）によるウェスタンブロット技術によるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ融合蛋白質の認識を示す図である。Ｐ６４Ｋ（１）、ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ（２）およびＴＧＦα−６４Ｋ（３）について１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。次いで蛋白質をニトロセルロース膜に移し、ＴＧＦαとＰ６４Ｋとの融合蛋白質を特徴づける目的で、Ｐ６４Ｋ（Ａ）またはＴＧＦα（Ｂ）に対する特異的抗体と共にインキュベートした。
【図４】抗ｈＴＧＦα抗体応答の速度論を示す図である。ｈＴＧＦαに対して特異的な抗体を間接ＥＬＩＳＡ技術によって測定した。ｈＴＧＦα相当５μｇ（Ａ）、１０μｇ（Ｂ）および５０μｇ（Ｃ）のＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ蛋白質をモンタニドＩＳＡ ５１と混合してマウスを免疫した。ｘ軸は各マウスで試料を収集した日を表し、ｙ軸は到達した抗体力価の逆数を表している。免疫した日は、図Ａの矢印で示す（０、１４、２８および４２日）。
【図５】ＴＧＦα相当５０μｇの融合蛋白質で免疫することによって誘導されたＩｇＧサブクラスの分布を示す図である。ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で皮下（１）または筋肉内（２）で免疫して誘発された抗体応答のＩｇＧサブクラスの割合を比較した。標準偏差の値は５匹の免疫動物群それぞれについて図示した。
【図６】ＴＧＦａ−Ｐ６４Ｋ融合蛋白質で免疫したマウスの抗ＥＧＦ特異的抗体応答を示す図である。図で、ＴＧＦａ−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスで到達した抗ｈＴＧＦαおよび抗ＥＧＦ抗体の力価を示す。
【図７】ＥＧＦワクチンのパイロットＩＩ臨床試験に含まれる予防接種した患者の腫瘍生検の免疫組織化学によって、発現したＥＧＦ−Ｒ、ＥＧＦおよびＴＧＦαの測定を示す図である。肺の原発腫瘍およびその後に出現する咽頭の第２の原発腫瘍におけるこれら３種類の分子の異なる反応性を図中のプラスの印で示す。
【図８】２２の乳癌におけるＥＧＦ、ｈＴＧＦαおよびＥＧＦ−Ｒ ＡＲＮｍ発現を示す図である。この図は、分子それぞれについて特異的プライマーで３０回のＰＣＲで得られた産物を、１．５％アガロースゲルで分離した後エチジウムブロミドで視覚化して示している。内部対照として使用したＧＡＰＤＨ ＡＲＮｍ発現もまた認められる。
【図９】乳癌生検におけるｈＴＧＦαとＥＧＦ−Ｒ ＡＲＮｍ濃度の相関を示す図である。エチジウムブロミドで得られたバンドの強度を算出プログラム（ＩｍａｇＱｕａｎｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）の手段によって分析した。ｘ軸はＥＧＦ−Ｒの特異的プライマーを使用したＰＣＲ産物の強度値とそれぞれの試料について得られたＧＡＰＤＨの強度値との関係（相対強度）を示しており、ｙ軸はｈＴＧＦαの同相対強度を示している。これら２種類の分子には正の相関が認められた（Ｒ2＝０．６５７、ｐ＝０．００１２１）。
【０００１】
本発明は、免疫学およびヒト用薬剤の分野に関するもので、特に自己ＴＧＦαに対する免疫除去反応を引き起こすことができるワクチン調製物に関する。このワクチンは、ある種の癌およびその他のＴＧＦα関連疾患を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）はアミノ酸５０個のポリペプチドで、当初レトロウイルスによって形質転換した細胞の培養上清から単離された。最初、上皮増殖因子（ＥＧＦ）とＥＧＦ−Ｒへの結合について競合することができる分子として定義された。しかし、抗ＥＧＦ抗体はＴＧＦαを認識できなかった（例えば、非特許文献１参照。）。したがって、両増殖因子は免疫学的に異なった単位である。
【０００３】
ＴＧＦαはＥＧＦファミリーに属する。構造的および機能的に関連した蛋白質によってこのファミリーは構成されている。このファミリーのその他の要素は、ＥＧＦ、アンフィレグリン（ＡＲ、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、クリプトール（ｃｒｉｐｔｏｌ、ＣＲ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ、ベータセルリン、エピレグリンである。一方、ポックスウイルスファミリーにはＥＧＦ関連蛋白質が含まれる。これらの中で、最も特徴づけられているのがワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）である。
【０００４】
これらの分子はすべてＥＧＦ−Ｒに結合してＥＧＦ−Ｒを活性化し、そのためこの受容体のリガンドとして知られている。この系は、正常細胞および腫瘍細胞の増殖において役割を担っている。ＥＧＦ−Ｒは１７０ｋＤの糖蛋白質で、その遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。この受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼ蛋白質活性と関係している。これらの蛋白質は、ｖ−ｅｒｂ−Ｂ発癌遺伝子産物と構造的に相同で、このことは悪性形質転換のプロセスと関連している証拠である（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
ＴＧＦαは、アミノ酸１６０個の膜貫通型前駆体（ｐｒｏ−ＴＧＦα）として合成される。アミノ酸５０個の可溶型である成熟ＴＧＦαは、蛋白質分解することによって放出される。ヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）は、ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）と４３％、マウスまたはラットのＴＧＦαと９３％のアミノ酸配列同一性を示す。その上、これらの生物学的作用は種特異的ではない。
【０００６】
多くの研究室が、培養細胞の増殖、移動および分化をＴＧＦαが調節する能力についての研究を報告してきた（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００７】
ＴＧＦαは、ＥＧＦ−Ｒの最も一般的なリガンドである。これは、胚形成中の正常組織および成人の正常組織および腫瘍組織に発現する。しかし、ＴＧＦαノックアウトマウスでは目立った病理学的な欠陥は認められず、これらのマウスは生存可能で、生殖可能である（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
腫瘍形成過程において、ＥＧＦ−Ｒ活性化のパラクリンプロセスおよびオートクリンプロセスの制御解除は、増殖因子発現のアップレギュレートまたはそれらの受容体の多量合成または変異によるものである。
【０００９】
上皮性腫瘍では、ＥＧＦ−Ｒが高濃度に検出された。多くの場合、この受容体の過剰発現は予後の悪さの指標となる。
【００１０】
ＴＧＦαの誘導は、悪性形質転換に頻出する現象である。実際に、数多くの研究によって、胸部、肺、脳、肝臓、前立腺、膀胱、胃腸管、結腸、生殖器（卵巣）および内分泌組織を含めた様々な位置の上皮性腫瘍においてとりわけこの分子が過剰発現することが示されている。
【００１１】
ＴＧＦαが腫瘍形成能を誘導する機構はまだわかっていないが、この増殖因子の過剰発現が腫瘍の程度、患者の生存率およびその他の腫瘍マーカーと相関しているという報告がいくつある。その上、肝臓癌におけるｃ−ｍｙｃなどのその他の発現遺伝子との関連を示唆する研究者も何人かいる。ＴＧＦαはまた、フォンヒッペルリンドウ腫瘍抑制遺伝子（ＶＨＬ）の標的となる（例えば、非特許文献５参照。）。
【００１２】
ＴＧＦαおよびＥＧＦは同等の親和性で同じ受容体に結合するが、ＴＧＦαは一般的にＥＧＦよりも効果があり、場合によってはその効果はより強力で、かつ／またはより長時間続くと記されている（例えば、非特許文献６参照。）。内在化したＴＧＦα／ＥＧＦ−Ｒ複合体の場合、ＴＧＦαおよびＥＧＦ−Ｒは細胞表面に優先的に再利用されるが、一方ＥＧＦ／ＥＧＦ−Ｒ複合体が同じ種類の細胞に内在化されるとき、両成分は効率よく分解されることが報告された（例えば、非特許文献７参照。）。これらの結果から、それぞれの増殖因子の生物学的活性の違いは、細胞内運搬機構の違いによることが示唆された。
【００１３】
他方、ＴＧＦαはＥＧＦよりも効果的な血管形成因子である（例えば、非特許文献８参照。）。
【００１４】
腫瘍での発現に関して、いくつかの上皮性腫瘍の膜内にＥＧＦ前駆体が存在している証拠があるが、ＴＧＦαは上皮性腫瘍に最も発現しており、ＥＧＦとは反対に、その作用はＥＧＦ−Ｒとのオートクリンループによる。他方、我々の施設での結果では、いくつかの上皮性腫瘍生検ではＴＧＦαは発現しているがＥＧＦは発現しておらず（乳腺管癌、喉頭癌）、一方その他の腫瘍ではＴＧＦαよりもＥＧＦが多く存在している（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））。これらの結果から、増殖因子は異なる新生細胞の腫瘍生物学には異なる影響を与えることができることが示唆される。
【００１５】
ＥＧＦ−Ｒ／ＥＧＦ−Ｒリガンド系と癌との関連について近年蓄積された証拠はいずれもこの系が癌の免疫治療のための非常に興味深い標的であることを示唆している。
【００１６】
我々のグループの今までの結果によって、ＥＧＦをベースにしたワクチンによって有効な癌の免疫治療の開発が可能であることが示された。実際に、担体蛋白質に結合したｈＥＧＦを予防接種することによって免疫原性が得られ、かつ毒性が低いという前臨床的および臨床的証拠が得られた（例えば、非特許文献９参照。）。
【００１７】
前臨床試験によって、アジュバントに入れたｈＥＧＦでマウスを免疫するとエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）を移植したマウスの生存率が増加することが示された（例えば、非特許文献９参照。）。
【００１８】
ｈＥＧＦとＰ６４ｋとの融合蛋白質が作製された。この蛋白質は、Ｐ６４ｋのアミノ酸４５／４６の間に挿入されたｈＥＧＦ配列を含有する。この融合蛋白質を使用してマウスを免疫し、ｈＥＧＦに対する特異的な体液性免疫応答を引き起こした。引き起こされた免疫応答は、ＥＡＴマウスの寿命の延長をもたらした（例えば、非特許文献１０参照。）。
【００１９】
ＮＳＣＬＣの患者に対してパイロット臨床試験を２回行ったところ、既存対照と比較して予防接種した患者の生存率が増加する傾向が認められた。ｈＥＧＦに対して高い抗体応答を示す患者において、著しい生存率の増加が認められた（例えば、非特許文献１１参照。）。
【００２０】
一般的に、ＥＧＦを予防接種してもＴＧＦαに対する特異的な抗体応答は生じない。しかし、ネズミモデルにおいて、ＴＧＦαを含有する免疫原調製物で予防接種すると数匹のマウスにのみ抗ＥＧＦ抗体が低濃度生じるという証拠が得られた。場合によっては、この抗体応答はＥＧＦがｉｎ ｖｉｔｒｏでその受容体に結合するのをブロックすることができる。しかし、得られた抗ＥＧＦ抗体の濃度は、効果的なＥＧＦ免疫除去応答を引き起こして抗腫瘍作用に影響を与えるには十分ではない。
【００２１】
これらの増殖因子それぞれの作用はそれぞれの腫瘍および／または原発腫瘍と転移腫瘍との間で異なっているため、ＥＧＦ−Ｒの主要な２種類のリガンド、ＴＧＦαおよびＥＧＦを合わせたワクチンは、一般的な意味において上皮性腫瘍により良好な抗腫瘍効果を発揮する。
【００２２】
本発明の時点まで、効果的な癌の免疫治療において、ｈＴＧＦαまたは任意の誘導体を含有するか、またはＥＧＦ−Ｒのその他のリガンド、ＥＧＦと組み合わせて含有するワクチン調製物を使用することを提案した治療は開発されていない。
【００２３】
【特許文献１】米国特許第４，３０２，３８６号明細書
【非特許文献１】Todaro他 (1976), Nature264, 26〜31
【非特許文献２】Heldin C.H. (1984), Cell 37,9〜20
【非特許文献３】CarpenterおよびWahl.(1990), Springer-Verlag, Berlin, pp.69〜171
【非特許文献４】Bruce Mann他(1993), Cell, 73、249〜261
【非特許文献５】Lee他(1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease,Volume1B,277〜318
【非特許文献６】Barrandon and Green(1987),Cell 50,1131〜1137
【非特許文献７】Ebner and Derynck(1991),Cell Regul.2,599〜612
【非特許文献８】Schreiber他(1986),Science 232,1250〜1253
【非特許文献９】Gonzalez他(1996),Vaccine Research 5(4),233〜243
【非特許文献１０】Gonzalezand cols(1997),Vaccine Research 6(2),91〜100
【非特許文献１１】Gonzalez他(1998),Annals of oncology 9,1〜5
【非特許文献１２】Kapp他(1993) J Dermatol Sci,Jun 5(3),133〜42
【非特許文献１３】Office of National Registration of Medications, HEBERMIN Not 1266
【非特許文献１４】Lowry他(1951),J.Biol.Chem.191,495〜498
【非特許文献１５】Hunter and Greenwood(1962,Nature,358:495〜498）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、担体蛋白質に遺伝子的（融合蛋白質）に、または化学的方法によって結合した、ｈＴＧＦαまたは任意の供給源由来の誘導体を含有し、悪い副作用を伴わないで上皮性腫瘍の増殖を阻害することができるワクチン組成物を提供する。この作用は、増殖因子の免疫除去機構による。担体蛋白質と共にｈＴＧＦａとｈＥＧＦまたは任意の誘導体の組み合わせを含有するワクチン組成物も特許請求の範囲に記載する。
【００２５】
該ワクチン組成物は、ＴＧＦαまたはＴＧＦα／ＥＧＦ依存性の上皮性腫瘍、または乾癬などＴＧＦαに関連したその他の疾患の治療に使用することができる（例えば、非特許文献１２参照。）。
【００２６】
ＴＧＦαの説明では、元の分子と同じ免疫学的特性および／または同様の効果を有するＴＧＦα由来の断片が含まれる。得られたものには、とりわけアミノ酸の新規な置換、安定性および／または活性を増大させる特異的なアミノ酸の変更、化学的修飾が含まれるが、その他のものを排除するわけではない。
【００２７】
さらに具体的には、本発明は、ある種の癌およびＴＧＦαに関連したその他の疾患の治療に使用できる、自己ＴＧＦαの免疫除去反応を引き起こすことができるワクチン組成物を含む。
【００２８】
他方では、本発明には、ＴＧＦαおよびＥＧＦの組み合わせによって構成されたワクチン調製物の使用が含まれる。このワクチンは、発病過程においてこれらの２種類の増殖因子に依存している新生物の治療に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
１−免疫原調製物
本発明において、使用するワクチン調製物は、遺伝子工学的方法（融合蛋白質）または化学的な結合方法のいずれかで担体蛋白質に結合したｈＴＧＦαを含む。これらの免疫原調製物のいずれかで使用されるｈＴＧＦαは、組換体、合成物または天然源から得られたものとすることができる。様々な蛋白質を担体として使用することができる。使用できる担体蛋白質の例は、とりわけ破傷風毒素、ＫＬＨ、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得られたＰ６４ｋ蛋白質である。ワクチン調合物中の最適なｈＴＧＦαの量は、用量あたり５μｇと１０００μｇとの間で変動する。
【００３０】
他方では、ｈＴＧＦαとｈＥＧＦとの組み合わせを含有するワクチン調製物を使用する（例えば、非特許文献１３参照。）。ＴＧＦαまたはＥＧＦの説明では、元の分子と同じ免疫学的特性および／または同様の効果を有するＴＧＦαまたはＥＧＦ由来の断片が含まれる。得られたものには、とりわけアミノ酸の新規置換、安定性および／または活性を増大させる特異的なアミノ酸の変更、化学的修飾が含まれるが、その他のものを排除するわけではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
Ａ）遺伝子工学的方法による融合蛋白質ＴＧＦα−担体蛋白質の獲得
ｈＴＧＦａをコードする遺伝子（５００ｂｐ）を特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。得られたＤＮＡ断片を消化して、担体蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターの特定の部位にクローニングする。得られた蛋白質には、両分子のコピーが１個または複数個含まれている。ほ乳類細胞、細菌または酵母の発現ベクターを使用することができる。このベクターにはまた、担体蛋白質のＮ末端に６個のヒスチジンを含めることができる。得られたプラスミドは、アガロースゲルによる制限分析、シークエナーゼ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を使用したＤＮＡ配列決定、および最終的にはｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用したウェスタンブロット技術による任意のＥ．ｃｏｌｉ発現種での融合蛋白質の発現分析によって確認した。蛋白質を得るために、強力な破壊方法を使用して細菌壁を粉砕し、次に硫酸アンモニウムによる分別沈殿法とクロマトグラフィ法を組み合わせて該蛋白質を精製する。最終的に、無菌条件下で該蛋白質を濾過し、その後使用するまで−２０℃で保存するか凍結乾燥して４℃で保存する。
【００３２】
Ｂ）ｈＴＧＦαを含有する化学的結合物の獲得
（Ｐ６４ｋのような）様々な担体蛋白質に結合したｈＴＧＦαを含有する様々な調製物を得る。任意の化学的結合方法を使用することができる。好ましい化学的方法として、米国特許公報、Ｌｅｅ他、１９８１（例えば、特許文献１参照。）に記載されたＥＭＣＳ剤を使用した方法を使用する。
【００３３】
あるいは、グルタルアルデヒドによる結合方法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの２種または３種の分子の最終溶液中の濃度が１ｍｇ／ｍＬになるまで０．０５％のグルタルアルデヒドと混合する（全溶液中）。この混合物を室温で１時間インキュベートして、次にＰＢＳ １ｘ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2の溶液で透析する。最後に、ＰＢＳ １ｘで４℃で一晩透析を実施する。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【００３４】
Ｃ）ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦを組み合わせたワクチンの獲得
ＥＧＦ−Ｒの２種類の主要なリガンドを組み合わせたワクチンの獲得は、異なる方法で実施することができる。
１−ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦを別々に担体蛋白質に結合させた２種類のワクチンを１：１の割合で注射時に混合する。この目的のために、融合蛋白質またはそれぞれの増殖因子と担体蛋白質との化学的結合物を使用することができる。ワクチン調合物中の最適なｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦの量は、投与あたり５μｇと１０００μｇとの間で変動する。
２−両増殖因子、ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦ、またはその誘導体のいずれかの組み合わせを含有するＡ項で説明したと同様の遺伝子構築物を得る。
３−Ｂ項で説明した方法を使用した、ｈＴＧＦαおよびｈＥＧＦまたはその誘導体のいずれかの組み合わせおよび担体蛋白質を含有する化学的結合物の化学的獲得。
【００３５】
Ｄ）免疫原調製物の獲得
ワクチン組成物の所望する免疫原性効果を得るために、適切なアジュバントを使用し、ワクチン調製物が高い免疫原性を示す投与経路を選択すると都合がよい。
【００３６】
本発明で言及したワクチン調製物は、２種類の具体的な方法で調製する。
１）アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用して、この化合物に吸着したワクチン調製物から水性溶液を得る。この目的のために、ＴＧＦα相当５μｇから１０００μｇの範囲の様々な調製物を２から５ｍｇの範囲のＡｌ（ＯＨ）3に結合させて使用する。この調合物を１時間攪拌したままにする。最終溶液をその後使用するまで４℃で保存する。
２）油中水型または水中油型エマルジョンを形成することができるフロインドの不完全アジュバントを使用する。最終調合物中の融合蛋白質または化学的結合物およびアジュバントの量は４０／６０から６０／４０（量／量）の範囲である。この量は所望する最終エマルジョンに左右される。アジュバントは免疫前に添加し、この調合物を１０から３０分間、室温で攪拌する。
【００３７】
免疫原調製物それぞれの最終体積には、対応する投与経路に適切な範囲が含まれる。
【００３８】
Ｃ項で説明したように注射時に調製する複合ワクチンの場合、既に説明したように適切なアジュバントと混合した２種類のワクチンを攪拌によって混合し、注射するまたは別々に注射することができる。
【００３９】
ワクチン組成物の投与は、様々な経路、筋肉内、皮下、経鼻および皮内で実施することができる。
【実施例１】
【００４０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による成熟ＴＧＦαをコードするＤＮＡ部分の獲得
ｈＴＧＦαをコードする遺伝子を、ＰＳＫ／ＴＧＦαベクターを鋳型として使用したＰＣＲによって増幅した（ＣＩＧＢ、キューバ）。このプラスミドは市販のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ−（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングしたｈＴＧＦα相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有する。成熟したＴＧＦαをコードする配列（アミノ酸５０個の長さ（図１））を、前述の特異的プライマーを使用して増幅した。
Ｎ末端：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＣ−３’
（下線部、Ｘｂａｌ制限部位）
Ｃ末端：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣ−３’
（下線部、ＥｃｏＲＩ制限部位）
【００４１】
簡単に言うと、特異的なプライマーそれぞれを５００ｎｇ、それぞれ２００ｍＭの濃度までのデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、ＭｇＣｌ2２５ｍＭおよびＰｒｏｍｅｇａの緩衝液に溶かしたＴａｑ−ポリメラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００単位を含む混合物７５μｌで、ＰＳＫＴＧＦα２００ｎｇを使用した。次に、変性（９４℃で１分）、アニーリング（６０℃で１分）および伸長（７２℃で３０秒）を３０回のプロトコールを行った。初回の前に、ＤＮＡを４分間変性させ、最終回の後で、２分間の最終伸長を実施した。
【００４２】
ＰＣＲ産物を低ゲル化温度（ＬＧＴ）アガロースゲルで電気泳動により分離し、フェノール抽出およびＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ酵素（ＮＥＢ、ＵＳＥＳ）を使用した酵素的分解の従来の方法によって、増幅した遺伝子部分を精製する。このプロトコールによって、成熟したＴＧＦαをコードする遺伝子部分が調製される。
【実施例２】
【００４３】
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋの発現ベクターの獲得
発現ベクターｐＭ９２を使用した（ＣＩＧＢ、キューバ）。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファンオペロンプロモータ（ｐｔｒｐ）およびＴ４ファージ転写終結因子（ｔＴ４）の制御下に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｂ３８５株）から得られたＰ６４ｋ蛋白質をコードするｌｐｄＡ遺伝子を含有する。ｐＭ９２は、アンピシリンおよびカナマイシン抗生物質耐性をコードする。Ｄａｍ−Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＧＣ−３６６）をｐＭ９２で形質転換し、このプラスミドを市販のキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコールに従って精製する。ＰＭ９２ベクターを消化して、ＬＧＴアガロースゲルから精製する。その後、Ｔ４リガーゼ酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ＰＭ９２ベクターを、既に調製した成熟ｈＴＧＦαのｃＤＮＡと連結する。得られたプラスミドｐＭＴＧＦαはＰ６４ｋのアミノ酸４５／４６に挿入されたｈＴＧＦαを含有する融合蛋白質をコードする。この組換えプラスミドを、アガロースゲルによる制限分析、シークエナーゼ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を使用したＤＮＡ配列決定、および最終的にはｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用したウェスタンブロット技術によるＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９９株での融合蛋白質の発現分析によって確認した。図２に、発現ベクターｐＭＴＧＦαを獲得する方法の概略を示す。このベクターは、融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋをコードする。
【実施例３】
【００４４】
Ｎ末端に６個のヒスチジンを有する融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋの発現ベクター（ｐＭＨｉｓＴＧＦα）の獲得
開始ベクターとしてｐＭ２２４を使用して、前の実施例で説明したと同様の方法に従って、Ｐ６４ｋのＮ末端に６個のヒスチジンをコードする部分を含む発現ベクターｐＭＨｉｓＴＧＦαを得た。Ｃｕ２＋またはその他の金属を結合したキレートセファロースへの結合が増加するので、この６個のヒスチジンタグの存在は、この蛋白質を精製する際に有利である。
【実施例４】
【００４５】
融合蛋白質（ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ）の精製
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌（ＭＭ２９９株）をＬＢＡ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよびアンピシリン５０ｍｇ／Ｌ）で３７℃で１０時間増殖させた。細胞収集後は全ての段階を０〜４℃で実施した。細菌破砕はフレンチプレスで１５００ｋｇ／ｃｍ2で実施し、不溶性画分を１１０００ｘｇで３０分間の高速遠心することによって除去した。最初の精製段階として、硫酸アンモニウム４０％による沈殿を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の一部を除去した。得られたペレットは、４℃で１１０００ｘｇで３０分間さらに遠心することによって除去した。上清を疎水性相互反応クロマトグラフィ（ＴＳＫ−ｂｕｔｉｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で、ＮａＣｌ０．１５Ｍを含有するＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ＝７．２に溶かした硫酸アンモニウム４０％から０％の濃度低下勾配によって分画した。その後、得られた試料をＰＢＳ１ｘで平衡化したＧ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過によって分離して、９５％以上の最終純度を実現した。蛋白質濃度は比色方法を使用して測定した（例えば、非特許文献１４参照。）。融合蛋白質の特徴付けは、Ｐ６４ｋおよびＴＧＦαに対する特異的抗体を使用したウェスタンブロット技術によって実施した。
【実施例５】
【００４６】
融合蛋白質（ＨｉｓＴＧＦα−Ｐ６４ｋ）の精製
融合蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌（ＭＭ２９９株）をＬＢＡ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよびアンピシリン５０ｍｇ／Ｌ）で３７℃で１０時間増殖させた。細胞収集後は全ての段階を０〜４℃で実施した。細菌破砕はフレンチプレスで１５００ｋｇ／ｃｍ2で実施し、不溶性画分を１１０００ｘｇで３０分間高速遠心することによって除去した。最初の精製段階として、硫酸アンモニウム４０％による沈殿を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質の一部を除去した。得られたペレットを４℃で１１０００ｘｇで３０分間さらに遠心することによって除去した。蛋白質中に６個のヒスチジンが存在するので、上清をキレートアフィニティクロマトグラフィ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で、イミダゾールを２５ｍＭから５００ｍＭの勾配で増加させたＮａＣｌ０．５Ｍを含有するＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ５．５によって分画した。その後、得られた試料をＰＢＳ１ｘで平衡化したゲル濾過Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させ、塩を除去して純度９５％を実現した。蛋白質濃度は比色方法を使用して測定した（例えば、非特許文献１４参照。）。融合蛋白質の特徴付けは、Ｐ６４ｋおよびＴＧＦαに対する特異的抗体を使用したウェスタンブロット技術によって実施した。
【実施例６】
【００４７】
組換え蛋白質ＴＧＦα−Ｐ６４ＫのｈＴＧＦαに特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）による認識
ＴＧＦαが融合蛋白質の状態で抗ｈＴＧＦαＭａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって認識されることができるかどうかを決定するために、ウェスタンブロット技術を実施した。ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ、ＴＧＦａ−Ｐ６４ＫまたはＰ６４Ｋ２５μｇを２枚のポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離し、次いで従来の方法に従って０．４５μｍのニトロセルロース膜に移した。移した後、膜をスキムミルク５％を有するＴＢＳ１ｘのブロック溶液と共に一晩４℃でインキュベートした。ＴＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で素早く洗浄した後、１枚の膜を抗Ｐ６４Ｋ抗体（１／５００）（図３Ａ）と反応させ、もう１枚は抗ＴＧＦαＭａｂ（１／１００）（図３Ｂ）と共に室温で２時間インキュベートした。その後、同溶液で３回洗浄を実施し、膜をアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１／１０００）で同条件で１時間インキュベートした。最後に、２０ｍＬ中にＴｒｉｓ−Ｃｌ０．１Ｍ ｐＨ＝８．２、Ｎａｐｈｔｏｌ ＡＣＥ−ＭＸ ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）０．００４ｇおよびＮＮ’ジメチルホルムアミド４００μＬを含有する緩衝液に溶かしたＦａｓｔ Ｎｅｔ酵素基質（Ｓｉｇｍａ）０．００４ｇを添加した。この反応を同洗浄液で停止させた。抗ｈＴＧＦαＭａｂによるＴＧＦα−Ｐ６４ｋの特異的認識が確認された（図３）。この結果は、融合蛋白質中のＴＧＦαが特異的抗体によって認識されうる構造を保持していることを示している。
【実施例７】
【００４８】
化学的に結合したｈＴＧＦα−Ｐ６４ｋの獲得
ＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に２ｍｇ／ｍＬで溶かしたＴＧＦα１ミリリットルを、同じ溶媒に２ｍｇ／ｍＬで溶かしたＰ６４ｋ１ミリリットルと混合する。次に、０．５％グルタルアルデヒド溶液０．２ｍＬを最終的な割合が０．０５％になるように添加した。この混合物を室温で１時間インキュベートして、ＰＢＳ１ｘ／１０ｍＭＭｇＣｌ2溶液で透析した。最後に、４℃で一晩ＰＢＳ１ｘで透析した。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【実施例８】
【００４９】
ｈＴＧＦα、ｈＥＧＦおよびＰ６４ｋの融合蛋白質の獲得
ｈＥＧＦをコードする遺伝子（１５０ｂｐ）は、鋳型としてプラスミドｐＢＥＦ１０を使用してＰＣＲによって増幅する。このプラスミドは市販のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（Ｓｔｒｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした完全なｈＥＧＦを含有する。得られたＤＮＡを実施例２で説明した方法を使用してＰ６４ｋのＣ末端に位置するＢａｍＨＩ部位のｐＭＨｉｓＴＧＦαプラスミドに結合させる。この方法で、融合蛋白質ＴＥ−Ｐ６４ｋをコードするｐＭＴＧＦα−ＥＧＦベクターが得られる。
【実施例９】
【００５０】
化学的に結合したｈＴＧＦα−ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋの獲得
ＰＢＳ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に３ｍｇ／ｍＬで溶かしたＴＧＦα１ミリリットルを、同じ溶媒に３ｍｇ／ｍＬで溶かしたｈＥＧＦおよび３ｍｇ／ｍＬで溶かしたＰ６４ｋ１ミリリットルと混合する。次に、０．５％グルタルアルデヒド溶液０．６ｍＬを最終的な割合が０．０５％になるように添加した。この混合物を室温で１時間インキュベートして、ＰＢＳ１ｘ／１０ｍＭＭｇＣｌ2溶液で透析した。最後に、４℃で一晩ＰＢＳ１Ｘで透析した。免疫原調製物を無菌条件下で濾過して、使用するまで４℃で保存する。
【実施例１０】
【００５１】
ｈＴＧＦαを含有する調合物の調製
実施例２、３、７、８および９で説明した異なる免疫原調製物を、本発明の詳細な説明で説明したようにＡｌ（ＯＨ）3またはモンタニドＩＳＡ ５１と混合する。使用した量は、全ての調製物中で５０μｇのｈＴＧＦαと等しく、実施例８および９で説明したような複合ワクチンの場合、５０μｇのｈＴＧＦαとｈＥＧＦに等しい。ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦ相当５０μｇをそれぞれ含有する融合蛋白質または化学的結合物の調製物それぞれにＡｌ（ＯＨ）3２ミリグラムを使用した。
【実施例１１】
【００５２】
ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ蛋白質およびＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ蛋白質を含有する複合ワクチンの調製
組換え体０．６ｍｇ中の各増殖因子５０Ｍｇを等量のモンタニドＩＳＡ ５１と全量０．５ｍＬ中で混合し、室温で１０分間攪拌してから注射する。
【００５３】
アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用する場合、Ａｌ（ＯＨ）3２ｍｇ中に各蛋白質０．６ｍｇを含有する２種類の調製物を注射前に混合する。
【実施例１２】
【００５４】
化学的に結合したＴＧＦα／Ｐ６４ＫおよびＥＧＦ／Ｐ６４Ｋを含有する複合ワクチンの調製
０．２５ｍＬ中に実施例７で説明したＰ６４ｋに結合したｈＴＧＦα５０μｇを含有する免疫原調製物を、ｈＥＧＦを含有する等量の免疫原調製物０．２５ｍＬと混合し、実施例１０で説明したように０．５ｍＬのモンタニドＩＳＡ ５１とシリンジを使用して室温で１０分間混合する。
【００５５】
アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3を使用する場合、ｈＴＧＦαまたはｈＥＧＦそれぞれ５０μｇをＡｌ（ＯＨ）3２ｍｇに吸着して含有する前述した化学結合物それぞれ０．５ｍＬを混合する。
【実施例１３】
【００５６】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）の免疫原性
ワクチンの免疫原性を示すために、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに５８ｍｇ（ＴＧＦα５μｇに相当）、１１６ｍｇ（１０μｇ）または０，６ｍｇ（５０μｇ）のＴＧＦα−Ｐ６４ｋをモンタニドＩＳＡ ５１と共に１：１の割合で皮下注射した。免疫原を本発明の詳細な説明で説明したように調製し、免疫前に１０分間攪拌した。動物それぞれに４回投与した。免疫前、１週間後、その後は隔週に血液を採取した。動物から採取した血液から血清を分離し、間接ＥＬＩＳＡ技術によってｈＴＧＦαに対して特異的な抗体の力価を測定した。
【００５７】
簡単に説明すると、マイクロタイターＥＬＩＳＡ用プレート（ＣＯＳＴＡＲ）を炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ＝７．２に２．５μｇ／ｍＬで溶かしたｈＴＧＦαの溶液５０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で３回洗浄後、このプレートをＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）−ＳＦＴ（５％）の溶液で３７℃で１時間ブロックした。直ちに免疫したマウスの血清を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）−ＳＦＴ（５％）で１／１０００に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）（５０μＬ／ウェル）で同じ温度で１時間インキュベートした。最後に、洗浄後、酵素の基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ））をジエタノールアミン緩衝液ｐＨ＝９．８に１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で添加した（５０μＬ／ウェル）。形成された酵素−基質複合体の４０５ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
【００５８】
図４は、ＴＧＦα−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスで得られた多価抗ｈＴＧＦα抗体応答の速度論を示す図である。
【００５９】
ｈＴＧＦαとラットまたはマウスの同等物の間には高い相同性があるため（９３％）、この免疫応答は自己ＴＧＦα（マウス）に対する応答と考えることができる。
【実施例１４】
【００６０】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ／Ａｌ（ＯＨ）３の免疫原性
免疫方法は、以前の実施例で説明した通りに、アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）3２ｍｇを使用して実施した。免疫原調製物は本発明の詳細な説明で説明した通りに準備した。ＴＧＦαについて１／１００００までの抗体力価が得られた。抗体力価を測定するために使用した技術は、実施例１３で説明した間接ＥＬＩＳＡであった。
【実施例１５】
【００６１】
マウスモデルにおけるＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）で免疫したマウスのＩｇＧサブクラス分布
ＩｇＧサブクラス分布は、１／１０００まで希釈した異なるＩｇＧサブクラス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に対するビオチン結合特異的抗血清を使用し、後でストレプトアビジン−ホスファターゼ複合体（１／１０００）によって、実施例１３で説明した間接ＥＬＩＳＡ技術によって測定した。
【００６２】
各ＩｇＧサブクラスの割合は、免疫した動物の血清全ＩｇＧに対して測定した。実施例１３で説明した免疫方法に従って、動物を融合蛋白質中のＴＧＦα５０μｇによって皮下（１群）または筋肉内（２群）経路を使用して免疫した。この研究で使用した両群のマウスでは、大量のＩｇＧ１が得られた。
【実施例１６】
【００６３】
放射性受容体アッセイ技術（ＲＲＡ）によるＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）で免疫した動物血清のＩ125−ＴＧＦα結合阻害能力の測定
既に説明した免疫方法で得られた抗体によってＴＧＦαがその受容体に結合するのを阻害できるかどうかを測定するために、ＲＲＡと呼ばれるｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を実施した。組み立てでは、実施例１３で説明したように得られた免疫マウスの血清を、ヒト胎盤膜１００ｍＬおよびＩ125−ＴＧＦα（１０００００ｒｐｍ）２０ｍＬおよびＴｒｉｓ−Ｃｌ１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭおよびＢＳＡ１％、ｐＨ＝７．４の緩衝液３３０ｍＬを含む混合物とインキュベートした。クロラミンＴの方法を使用してＴＧＦαをＩ125放射性同位元素に結合させた（例えば、非特許文献１５参照。）。この混合物を室温で１時間インキュベートして、前述した緩衝液１ｍＬで反応を停止させた。最後に、この試験管を１０００ｒｐｍで３０分間遠心した。ペレットを洗浄して、乾燥させた。放射活性をガンマ線計測器（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）で測定した。測定した放射活性値の減少は、試験血清の作用によってＴＧＦαとその受容体との結合が阻害されたことを示している。試験血清全てにおいて、５０％〜８０％の範囲の阻害が得られた。
【実施例１７】
【００６４】
ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫することによって得られた抗ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）の体液性応答の測定
前述の間接ＥＬＩＳＡ技術を使用して高い抗ＴＧＦα抗体力価を示すマウス血清において、抗ＥＧＦ抗体が存在することが測定された。１／１００、１／１０００および１／１００００に希釈した血清をｈＥＧＦ（ＣＩＧＢ）でコーティングしたプレートに添加した。図６は、ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫したマウスの血清で得られた抗ＥＧＦ抗体力価を示している。１群の免疫マウスにおいてのみ、陽性の抗ＥＧＦ抗体応答が得られている。
【００６５】
しかし、１種類の化学結合ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスでは、いかなる濃度の抗ＴＧＦα抗体も認められなかった。
【実施例１８】
【００６６】
ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質／フロインド不完全アジュバント（モンタニドＩＳＡ ５１）の免疫によって得られたポリクローナル抗ｈＴＧＦα抗血清によるヒト腫瘍の認識
モンタニドＩＳＡ ５１中のＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で免疫したマウスで得られたポリクローナル抗ｈＴＧＦα抗血清を使用して、パラフィンに埋入した腫瘍生検中のＴＧＦαの発現を測定した。これらの生検は、ＥＧＦに基づくワクチンを予防接種した患者から得た。高い抗ｈＥＧＦ抗体応答を示す患者では、ＮＳＣＬＣ腫瘍の退縮が認められた。しかし、後に咽頭の二次腫瘍が検出された。これら２種類の腫瘍の生検を分析したところ、そのうちのそれぞれにＥＧＦおよびＴＧＦαの異なる発現が観察された。図７に、異なる抗体で得られた反応値を示す。これらの結果から、ＴＧＦα−Ｐ６４ｋを含有するワクチン調製物による免疫によって、ヒト腫瘍においてこの分子を認識できるｈＴＧＦαに対する特異的抗体が生じることは確実である。
【実施例１９】
【００６７】
乳癌生検におけるＥＧＦ、ＴＧＦαおよびＥＧＦ−ＲのｍＲＮＡ発現
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して乳癌腫瘍生検から単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した。これらの分子それぞれについて特異的なプライマーを使用して、全ｃＤＮＡにＰＣＲを３０回行った。内部対照として、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を使用した。得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して単離し、エチジウムブロミドで視覚化した。図８では、２２の乳癌においてＥＧＦ、ＴＧＦα、ＥＧＦ−ＲおよびＧＡＰＤＨ（内部対照）に対する特異的プライマーを使用して得られた結果を示した。ＥＧＦｍＲＮＡは１／２２の生検にのみ認められたが、試料のほとんどにおいてＴＧＦαおよびＥＧＦ−ＲｍＲＮＡ の高い発現が認められた。これらの２分子の発現が強く相関していることによって、この種類の腫瘍の増殖においてＴＧＦα／ＥＧＦ−Ｒのオートクリンループの重要性が示唆される（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】成熟ｈＴＧＦαの遺伝子配列およびアミノ酸配列を示す図である（下線で示した太字）。
【図２】発現ベクターｐＭＴＧＦαを得る方法の概略を示す図である。
【図３】抗Ｐ６４ＫＭａｂ（Ａ）および抗ｈＴＧＦαＭａｂ（Ｂ）によるウェスタンブロット技術によるＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ融合蛋白質の認識を示す図である。Ｐ６４Ｋ（１）、ＥＧＦ−Ｐ６４Ｋ（２）およびＴＧＦα−６４Ｋ（３）について１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。次いで蛋白質をニトロセルロース膜に移し、ＴＧＦαとＰ６４Ｋとの融合蛋白質を特徴づける目的で、Ｐ６４Ｋ（Ａ）またはＴＧＦα（Ｂ）に対する特異的抗体と共にインキュベートした。
【図４】抗ｈＴＧＦα抗体応答の速度論を示す図である。ｈＴＧＦαに対して特異的な抗体を間接ＥＬＩＳＡ技術によって測定した。ｈＴＧＦα相当５μｇ（Ａ）、１０μｇ（Ｂ）および５０μｇ（Ｃ）のＴＧＦα−Ｐ６４Ｋ蛋白質をモンタニドＩＳＡ ５１と混合してマウスを免疫した。ｘ軸は各マウスで試料を収集した日を表し、ｙ軸は到達した抗体力価の逆数を表している。免疫した日は、図Ａの矢印で示す（０、１４、２８および４２日）。
【図５】ＴＧＦα相当５０μｇの融合蛋白質で免疫することによって誘導されたＩｇＧサブクラスの分布を示す図である。ＴＧＦα−Ｐ６４ｋ蛋白質で皮下（１）または筋肉内（２）で免疫して誘発された抗体応答のＩｇＧサブクラスの割合を比較した。標準偏差の値は５匹の免疫動物群それぞれについて図示した。
【図６】ＴＧＦａ−Ｐ６４Ｋ融合蛋白質で免疫したマウスの抗ＥＧＦ特異的抗体応答を示す図である。図で、ＴＧＦａ−Ｐ６４Ｋで免疫したマウスで到達した抗ｈＴＧＦαおよび抗ＥＧＦ抗体の力価を示す。
【図７】ＥＧＦワクチンのパイロットＩＩ臨床試験に含まれる予防接種した患者の腫瘍生検の免疫組織化学によって、発現したＥＧＦ−Ｒ、ＥＧＦおよびＴＧＦαの測定を示す図である。肺の原発腫瘍およびその後に出現する咽頭の第２の原発腫瘍におけるこれら３種類の分子の異なる反応性を図中のプラスの印で示す。
【図８】２２の乳癌におけるＥＧＦ、ｈＴＧＦαおよびＥＧＦ−Ｒ ＡＲＮｍ発現を示す図である。この図は、分子それぞれについて特異的プライマーで３０回のＰＣＲで得られた産物を、１．５％アガロースゲルで分離した後エチジウムブロミドで視覚化して示している。内部対照として使用したＧＡＰＤＨ ＡＲＮｍ発現もまた認められる。
【図９】乳癌生検におけるｈＴＧＦαとＥＧＦ−Ｒ ＡＲＮｍ濃度の相関を示す図である。エチジウムブロミドで得られたバンドの強度を算出プログラム（ＩｍａｇＱｕａｎｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）の手段によって分析した。ｘ軸はＥＧＦ−Ｒの特異的プライマーを使用したＰＣＲ産物の強度値とそれぞれの試料について得られたＧＡＰＤＨの強度値との関係（相対強度）を示しており、ｙ軸はｈＴＧＦαの同相対強度を示している。これら２種類の分子には正の相関が認められた（Ｒ2＝０．６５７、ｐ＝０．００１２１）。
Claims (14)
- 自己ＴＧＦαに対して特異的な免疫応答を誘発するワクチン組成物であって、活性成分として自己ＴＧＦαまたはその誘導体および適切なアジュバントを含むことを特徴とするワクチン組成物。
- ヒト組換えＴＧＦαを含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
- 活性成分として自己ＴＧＦαを単独またはその他のＥＧＦ−Ｒリガンドと組み合わせて含むことを特徴とする請求項１および２に記載のワクチン組成物。
- 活性成分として使用した前記自己ＴＧＦαおよび前記ＥＧＦ−Ｒリガンドは任意選択で、化学的結合または遺伝子的手段によって担体蛋白質に結合させることができることを特徴とする請求項１から３に記載のワクチン組成物。
- 担体蛋白質として髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質を含むことを特徴とする請求項４に記載のワクチン組成物。
- 活性成分としてＴＧＦαと髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質との化学的結合物を含むことを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。
- 活性成分としてＴＧＦαと髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質との化学的結合物、およびさらにＥＧＦを含むことを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。
- 活性成分としてＴＧＦαと髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質との組換え融合蛋白質を含むことを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。
- 活性成分としてＴＧＦαと髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質との組換え融合蛋白質であって、前記Ｐ６４Ｋ蛋白質のＮ末端に６個のヒスチジン末尾を有する組換え融合蛋白質を含むことを特徴とする請求項８に記載のワクチン組成物。
- 活性成分としてＴＧＦα、髄膜炎菌のＰ６４Ｋ蛋白質およびＥＧＦとの組換え融合蛋白質を含むことを特徴とする請求項９に記載のワクチン組成物。
- アジュバントとしてフロインド不完全アジュバントを含むことを特徴とする請求項１から１０に記載のワクチン組成物。
- アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）３を含むことを特徴とする請求項１から１０に記載のワクチン組成物。
- 請求項１から１２のいずれかのワクチン組成物を使用することを特徴とするＴＧＦαまたは任意のＥＦＧ−Ｒリガンドを発現する上皮由来の腫瘍における悪性疾患を治療する方法。
- 請求項１から１２のいずれかに記載のワクチン組成物を使用することを特徴とする肺、胸部、前立腺、胃および卵巣の類表皮癌などの腫瘍を治療するための請求項１３に記載の方法。
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