WO2002045738A2 - Composicion vacunal que contiene factor de crecimiento transformante alfa - Google Patents

Composicion vacunal que contiene factor de crecimiento transformante alfa Download PDF

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Gisela María GONZALEZ MARINELLO
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Tamara Menendez Medina
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Belinda Sanchez Ramirez
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Definitions

  • the present invention relates to the field of immunology and human medicine, in particular with a vaccine preparation capable of causing an immunocastration reaction against autologous TGF alpha (TGF ⁇ ), which can be used for the treatment of certain Neoplastic diseases and other diseases related to TGF ⁇ .
  • TGF ⁇ autologous TGF alpha
  • TGF ⁇ The Transforming Growth Factor alpha, TGF ⁇ , is a 50 amino acid polypeptide, originally isolated from the culture medium of cells transformed by retroviruses. It was initially defined as a molecule capable of competing with the Epidermal Growth Factor (EGF) for binding to EGF-R.
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • anti-EGF antibodies were not able to recognize TGF ⁇ (Todaro et al. (1976), Nature 264, 26-31), so since then it is known that both growth factors are two immunologically different entities.
  • TGF ⁇ is part of the EGF family, which is made up of structurally and functionally related proteins. The other members of this family are: EGF, anfiregulin (AR), cryptol (CR1), heparin-binding growth factor, betacellulin, epiregulin.
  • the family of poxviruses includes proteins related to EGF, among them the most characterized is the growth factor of vaccinia virus (VGF). All these molecules are capable of binding and activating EGF-R, so they are known as ligands thereof and play an important role in the growth of normal and neoplastic cells to a lesser or greater degree.
  • VGF growth factor of vaccinia virus
  • EGF-R is a glycoprotein of approximately 170 kD, whose gene has been cloned and sequenced. The intracellular domain of this receptor is associated with the activity of tyrosine kinase proteins that show structural homology with the product of the oncogene v-erb-B, which shows a relationship with the malignant transformation process (Heldin CH (1984), Cell 37 , 9-20.).
  • TGF ⁇ is synthesized in the form of a membrane precursor (pro-TGF ⁇ ) of 160 amino acids and a soluble protein of approximately 150 amino acids, mature TGF ⁇ , is released by enzymatic proteolysis.
  • Human TGF ⁇ shows 43% identity in the amino acid sequence with human EGF (hEGF) and 93% with mouse or rat TGF ⁇ . In addition, its biological effects are not specific species.
  • TGF ⁇ is the ligand of the most expressed EGF-R. It is expressed in normal tissues during embryogenesis and in normal and tumor adult tissues. However, no major pathological defects are observed in "Knock-out" TGF ⁇ mice and these mice are viable and fertile (Bruce Mann et al. (1993), Cell, 73, 249-261.). In the tumorigenesis process, the deregulation of the paracrine and autocrine processes of EGF-R activation is given both by the overproduction of growth factors and by the high synthesis and / or mutation of their receptors.
  • TGF ⁇ induction is a frequent event in neoplastic transformation.
  • numerous studies have been conducted that show the overexpression of this molecule in epithelial tumors of different locations, including, breast, lung, brain, liver, prostate, bladder, gastrointestinal tract, colon, rectum, reproductive tissue (ovary) and endocrine, among others.
  • TGF ⁇ tumorigenicity induction by TGF ⁇ is still unknown, there are some reports that correlate the over-expression of this growth factor with the grade of the tumor, the survival of patients and other tumor markers.
  • TGF ⁇ and EGF bind to the same receptor with comparable affinities, TGF ⁇ is generally more potent than EGF, and in some contexts, its effects have been described as stronger and / or longer (Barrandon and Green (1987) , Cell 50, 1131-1137).
  • both TGF ⁇ and EGF-R are preferably recycled to the surface while when the EGF / EGF-R complex is internalized in the same cell type, Two components are efficiently degraded (Ebner and Derynck (1991), Cell Regul. 2,599-612), which suggests that differences in biological activity may be due to differences in the mechanisms that occur inside the cell.
  • TGF ⁇ is a more potent angiogenic factor than EGF (Schreiber et al. (1986), Science 232, 1250-1253.)
  • TGF ⁇ is expressed by a greater number of tumors of the same origin, and it is proposed that its action, unlike EGF, is mainly through the formation of an autocrine loop with the EGF-R.
  • results obtained indicate that in biopsies of epithelial tumors of some types, the presence of TGF ⁇ and non-EGF (ductal carcinoma of the breast, larynx) is observed, while other tumors have more EGF than TGF ⁇ (non-cell lung cancer Small (NSCLC)
  • a vaccine that combines the two main ligands of EGF-R, TGF ⁇ and EGF, would have an effect superior antitumor in tumors of epithelial origin, in a general sense. So far there is no known therapy that involves the use of a vaccine preparation containing human TGF ⁇ (hTGF ⁇ ) or any derivative thereof, or a combination thereof with another EGF-R ligand, EGF, in active cancer immunotherapy . Disclosure of the invention
  • the present invention provides a vaccine composition containing human TGF ⁇ or any derivative thereof of any origin, genetically linked (protein of recombinant fusion) or coupled by chemical methods to a transporter protein, capable of inhibiting the growth of tumors of epithelial origin, through an immunocastration effect, without significant side effects. It also provides a vaccine composition that contains a combination of hTGF ⁇ or any derivative with hEGF or any derivative bound to a carrier protein.
  • the vaccine composition can be used in the treatment of tumors of epithelial origin dependent on TGF ⁇ or TGF ⁇ / EGF, or on any other disease associated with TGF ⁇ such as psoriasis (Kapp, A (1993) J Dermatol Sci, Jun; 5 ( 3): 133-42).
  • any fragment and / or derivative of TGF ⁇ having immunological properties and / or effects similar to the original molecule is included.
  • Derivatives include, but are not excluded, original amino acid substitutions, specific site amino acid changes that increase stability and / or activity, chemical modifications, among others.
  • the invention consists of a vaccine preparation capable of provoking an immunocastration reaction against the autologous TGF ⁇ , which can be used for the treatment of certain neoplastic diseases and other diseases related to TGF ⁇ .
  • said invention includes the use of a vaccine preparation consisting of a combination of TGF ⁇ and EGF, for the treatment of malignant neoplasms that depend on these two growth factors in the course of their pathogenesis.
  • 1- Immunogenic preparations In the present invention a vaccine preparation is used that includes hTGF ⁇ bound to a transporter protein by genetic engineering methods (recombinant fusion protein) or by chemical methods of conjugation.
  • the hTGF ⁇ used in any of the immunogenic preparations is obtained from both natural, recombinant or synthetic sources.
  • hTGF ⁇ can be used as transporters.
  • carrier proteins can be used: Tetanus Toxoid, KLH, the P64K protein from Neisseria meningitidis, among others.
  • the Optimum amounts of hTGF ⁇ in the vaccine formulation range between 5 ⁇ g and 1000 ⁇ g per dose.
  • a vaccine preparation is used that contains a combination of hTGF ⁇ with hEGF (Office of National Registry of Medicines, HEBERMIN No 1266).
  • any fragment and / or derivative of TGF ⁇ or EGF having immunological properties and / or effects similar to the original molecule is included.
  • Derivatives include, but are not excluded, original amino acid substitutions, specific site amino acid changes that increase stability and / or activity, chemical modifications, among others.
  • the gene encoding hTGF ⁇ (500 bp) is amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the resulting DNA fragment is digested and ligated into a specific binding site to an expression vector in which the gene encoding the transporter protein is cloned, so that the resulting protein includes a copy or more of the two molecules .
  • Any expression vector of both upper (mammalian) and lower (bacterial or yeast) cells can be used.
  • the vector can also include six histidines at the N-Terminal end of the transporter protein.
  • the resulting plasmid is verified by restriction analysis on agarose gels, analysis of the DNA sequence using sequencing enzyme 2.0 (Amersham-USB), and finally, analysis of fusion protein production in any Eschericia expression strain coli, by the "Western Blotting" technique, using a specific monoclonal antibody against hTGF ⁇ (R&D System).
  • the bacterial walls are broken using a strong breaking method and then the protein is purified by a combination of differential precipitation methods with ammonium sulfate and chromatographic methods. Finally, the protein is filtered under sterile conditions and stored at -20 ° C or lyophilized and stored at 4 ° C until later use.
  • the glutaraldehyde conjugation method can be used. To this end, these two or three molecules are mixed at a concentration of 1 mg / mL in the final solution with 0.05% glutaraldehyde (in the total solution). The mixture is incubated 1 hour at room temperature, and dialyzed against a solution of 10 mM 1X PBS / MgCl 2 , with three changes of the dialysis solution. Finally, dialysis against 1X PBS is performed overnight at 4 ° C. The immunogenic preparation is filtered under sterile conditions and stored at 4 ° C until use.
  • hTGF ⁇ and hEGF 1- Union of the two vaccines containing hTGF ⁇ or hEGF separately attached to a transporter protein in a 1: 1 ratio at the time of injection. Fusion proteins or chemical conjugates of both molecules can be used for this purpose.
  • the optimal amounts of hTGF ⁇ and hEGF in the vaccine formulation range between 5 ⁇ g and 1000 ⁇ g per dose.
  • the vaccine compositions referred to in this invention are adjuvated in two specific ways. 1) In AI (OH) 3 forming aqueous solutions of the vaccine preparation adsorbed to this compound. From 5 ⁇ g to 1000 ⁇ g of TGF ⁇ per dose of immunogen they are bound at a range between 2 and 5 mg of AI (OH) 3 and left under stirring for 1 hour. The final solution is stored at 4 ° C until later use. 2) In incomplete Freund's adjuvant that allow the formation of aqueous / oily or oily / aqueous emulsions. The amounts of immunogen and adjuvant in the final composition are in a volume / volume range of 40/60 to 60/40. The volumes depend on the desired final emulsion. The adjuvant is added before immunization and stirred for a period of 10 to 30 minutes, at room temperature.
  • the final volumes of each immunogen cover the appropriate range for the corresponding route.
  • the two adjuvant vaccines as described above can both be agitated and injected or injected separately.
  • the administration of the vaccine compositions can be carried out by various routes: intramuscularly, subcutaneously, intranasally and intradermally.
  • V the complementary strand of DNA (cDNA) of hTGF ⁇ (PSK-TGF ⁇ ) (CIGB, Cuba)
  • Example 2 Obtaining the expression vector of the fused TGF ⁇ -P64K protein.
  • the expression vector pM 92 (CIGB, Cuba) containing the IpdA gene encoding the Neisseria meningitidis P64K protein (strain B385) was used under the promoter of the tryptophan operon of E. coli (ptrp) and the transcriptional terminator of phage (tT4).
  • the pM 92 confers resistance to the antibiotics ampicillin and kanamycin.
  • a strain of E. coli Dam- (GC-366) was transformed with the vector pM92 and the plasmid DNA was purified using a set of commercial reagents (Quiagen) according to the manufacturers recommendations.
  • the PM 92 vector was digested and purified from low melting agarose gels.
  • the PM92 vector was then joined with the cDNA corresponding to the mature hTGF ⁇ previously prepared, using the enzyme T4 ligase (Gibco BRL).
  • the resulting plasmid pMTGF encodes the fusion protein containing the h-TGF ⁇ inserted between amino acid 45/46 of P64K.
  • This recombinant plasmid was verified by restriction analysis in agarose gels, sequence analysis of DNA sequencing 2.0 (Amersham-USB), and finally, analysis of the expression of the fusion protein in the MM299 strain of E. coli, by the "Western Blotting" technique using a specific monoclonal antibody against h-TGF ⁇ (R&D System).
  • FIG. 2 shows a schematic of the process of obtaining the pMTGF expression vector encoding the TGF ⁇ -P64K fusion protein.
  • Example 3 Obtaining the expression vector of the fused TGF ⁇ -P64K protein with six histidines at the N-Terminal end (pMHisTGF ⁇ ).
  • the expression vector pMHisTGF ⁇ was constructed following the same protocol described in the previous example using as a vector the PM224, which includes a coding segment for six histidines at the N-terminal end of the P64K.
  • the inclusion of a segment that codes for six histidines has advantages in the purification of the protein by affinity of the same to metal chelates.
  • Example 4 Purification of the TGF ⁇ -P64K fusion protein. E.
  • coli bacteria (strain MM299) expressing the TGF ⁇ -P64K fusion protein were grown in LBA culture medium (Triptona 10 g / L, Yeast Extract 5g / L, NaCI 10 g / L and 50 mg / L of ampicillin) for 10 hours at 37 ° C. After cell collection, all steps were performed at 0-4 ° C. The bacterium was broken using a French press at 1500 kg / cm 2 , and the insoluble fraction was removed by centrifugation at 11,000xg for 30 minutes. As a first purification step, a 40% precipitation of ammonium sulfate was carried out, which removed some of the contaminating proteins of E. coli.
  • LBA culture medium Triptona 10 g / L, Yeast Extract 5g / L, NaCI 10 g / L and 50 mg / L of ampicillin
  • E. coli bacteria (strain MM299) expressing HisTGF ⁇ -P64K fusion protein were grown in LBA culture medium (Triptona 10 g / L, Yeast Extract 5g / L, NaCI 10 g / L and 50 mg / L of ampicillin) for 10 hours at 37 ° C. After cell collection, all steps were performed at 0-4 ° C. The bacterium is broken using a French press at 1500 kg / cm 2 , and the insoluble fraction is removed by centrifugation at 11,000xg for 30 minutes. As a first purification step, a 40% precipitation of ammonium sulfate is carried out, which removes some of the contaminating proteins of E. coli.
  • LBA culture medium Triptona 10 g / L, Yeast Extract 5g / L, NaCI 10 g / L and 50 mg / L of ampicillin
  • the resulting precipitate was removed by centrifugation at 11,000 xg, 4 ° C, for 30 minutes.
  • the resulting sample was subjected to a molecular exclusion chromatography on a G25 column (Pharmacia) equilibrated with 1X PBS to remove salts, showing a purity level of 95%.
  • Example 7 Obtaining a chemical conjugate hTGF ⁇ -P64K.
  • TGF ⁇ in 10 mM PBS / MgCI 2 was mixed at a concentration of 2 mg / mL with one milliliter of P64K at 2 mg / mL in the same solvent.
  • 0.2 mL of 0.5% glutaraldehyde was added for a final concentration of 0.05%.
  • Example 8 Obtaining a fusion protein between hTGF ⁇ , hEGF and P64K.
  • the gene encoding hEGF (150 bp) is amplified by PCR from plasmid pBEF 10 containing the complete hEGF cloned into the EcoR V site of the commercial vector pBluescript SK II (Stragene).
  • the DNA obtained in this way binds to the pMHisTGF ⁇ vector at a Bam Hl site that is located at the end of the C-terminal end of the P64K using the methodology described in Example 2.
  • the pMTGF ⁇ -EGF vector is obtained which encodes for the fusion protein TE-P64K
  • Example 9 Obtaining a chemical conjugate hTGF ⁇ -hEGF-P64K.
  • One milliliter of hTGF ⁇ in 10 mM PBS / MgCl 2 was mixed at a concentration of 3 mg / mL with one milliliter of hEGF at 3 mg / mL and P64K at 3 mg / mL in the same solvent.
  • 0.6 mL of 0.5% glutaraldehyde was added for a final concentration of 0.05%.
  • the mixture was incubated 1 hour at room temperature, and dialyzed against a solution of 10 mM 1X PBS / MgCl 2 , with three changes of the dialysis solution. Finally, dialysis against 1X PBS was performed overnight at 4 ° C.
  • the immunogenic preparation was filtered under sterile conditions and stored at 4 ° C until use.
  • Example 10 Preparation of formulations containing hTGF ⁇ .
  • Example 11 Preparation of a combined vaccine containing the TGF ⁇ / P64K protein and the EGF / P64K protein.
  • each protein was mixed, which is equivalent to 50 ⁇ g of each of the two growth factors, in a total volume of 0.5 mL and joined with the same volume of Montanide ISA 51 and stirred 10 minutes at room temperature before the injection.
  • Example 12 Preparation of a combined vaccine containing a chemical conjugate TGF ⁇ / P64K and EGF / P64K.
  • 0.25 mL of an immunogenic preparation containing 50 ⁇ g of TGF ⁇ bound to P64K was mixed as described in example 7 with 0.25 mL of an immunogenic preparation of equal characteristics containing hEGF and mixed with 0.5 mL of Montanide ISA 51 as described in example 10, using a syringe, for a period of 10 minutes at room temperature.
  • mice of the strain Balb / c females between 6-8 weeks were injected subcutaneously with 58 ⁇ g (5 ⁇ g equivalent of TGF ⁇ ), 116 ⁇ g (10 ⁇ g) or 0.6 mg (50 ⁇ g) of TGF ⁇ -P64K in a 1: 1 ratio with Montanide ISA 51.
  • the immunogen was prepared as described in the detailed description of the invention with stirring for 10 minutes before immunization. Each animal received 4 biweekly doses. Extractions were performed of blood prior to the first dose, one week later and every two weeks thereafter. The serum was separated from the blood drawn from the animals and the specific antibody titer against hTGF was determined by the indirect ELISA technique.
  • Figure 4 shows the kinetics of the polyvalent response of anti-hTGF ⁇ antibodies obtained in mice immunized with TGF ⁇ -P64K. Due to the high homology between hTGF ⁇ and rat or mouse (93%), the response generated against hTGF ⁇ can be considered as a response against the TGF ⁇ antologue.
  • Example 14 Immunogenicity of TGF ⁇ -P64K / AI (OH) 3 in the murine model.
  • An immunization protocol was performed as described in the previous example, using 2 mg AI (OH) 3 as an adjuvant.
  • the immunogen was prepared as described in the detailed description of the invention. Specific antibody titers were obtained by TGF ⁇ of up to 1/10000. The technique used to determine the titer of anti-TGF ⁇ antibodies was that of indirect ELISA described in Example 13.
  • Example 15 Distribution of the IgG isotype immunoglobulin subclasses in mice immunized with TGF ⁇ -P64K / incomplete Freund's adjuvant protein (Montanide ISA 51) in the murine model.
  • the distribution of IgG subclasses obtained by the indirect ELISA technique described in Example 13 was determined, using specific antisera against the different subclasses of murine IgG conjugated with biotin (Jackson) at a dilution of 1/1000 and subsequently the streptavidin-phosphatase complex (1/1000).
  • the proportion of each of the IgG subclasses with respect to total IgG in the serum of animals immunized with 50 ⁇ g of TGF ⁇ in the fused protein was determined using the subcutaneous (Group 1) or intramuscular (Group 2) route following the Immunization protocol described in example 13.
  • Figure 5 shows the subclass distribution obtained. A higher proportion of lgG1 was obtained in the two groups of mice used in the study.
  • Example 16 Determination of the ability of sera from animals immunized with the TGF ⁇ -P64K / incomplete Freund's adjuvant protein (Montanide ISA 51) to inhibit the binding of TGF ⁇ -l 125 by the "radio receptor assay” (RRA) technique ).
  • RRA radio receptor assay
  • the TGF ⁇ mapping was performed using the chloramine T method (Hunter and Greenwood (1962, Nature, 358: 495-498).
  • Example 18 Recognition of human tumors in vitro by an anti-hTGF ⁇ polyclonal antiserum obtained by immunization with the TGF ⁇ -P64K / incomplete Freund's adjuvant protein (Montanide ISA 51).
  • Polyclonal anti-hTGF ⁇ antisera obtained from the immunization of mice with the heterologous protein TGF ⁇ -P64K in Montanide ISA 51 was used to determine TGF ⁇ expression in biopsies of paraffin-included tumors of patients vaccinated with the EGF-based vaccine.
  • a regression of the NSCLC tumor was observed. However, a second larynx tumor was later detected.
  • Example 19 Expression of EGF (mRNA), TGF ⁇ (mRNA) and EGF-R (mRNA) in breast carcinoma biopsies
  • Messenger ribonucleic acid (mRNA) was extracted from breast tumor biopsies using TRIZOL reagent (Life technologies) and cDNA was converted by reverse transcriptase enzyme. The total cDNA was subjected to 30 cycles of PCR using specific primers for each of these molecules. How Internal control was used a cell maintenance gene present in all cells (GAPDH). The PCR product obtained was separated by electrophoresis in 1.5% agarose gels and visualized with ethidium bromide.
  • Figure 1 Genetic and amino acid sequence (underlined letters in bold) of mature h- TGF ⁇ .
  • FIG. 2 Schematic representation of the process of obtaining the expression vector pMTGF ⁇ .
  • Figure 3 Recognition of the TGF ⁇ -P64K fusion protein by anti-P64K (A) and anti-hTGF ⁇ (B) monoclonal antibodies by the "Western Blotting" technique. A 10% SDS-PAGE of the P64K (1), EGF-P64K (2) and TGF ⁇ -P64K (3) was performed and then the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane where they were incubated with specific antibodies against P64K (A ) or TGF ⁇ (B) in order to characterize the fused protein between TGF ⁇ and P64K.
  • FIG. 4 Kinetics of the anti-hTGF ⁇ antibody response: Specific antibody titers against hTGF ⁇ were measured by the indirect ELISA technique. The mice were immunized with 5 ⁇ g (A), 10 ⁇ g (B) and 50 ⁇ g (C) of TGF ⁇ -equivalent in the TGF ⁇ -P64K protein in Montanide ISA 51. The abscissa represents the days when serum samples were obtained of each individual mouse and the recipients of the reciprocal antibody titers achieved. Immunization days are indicated with arrows on graph A (Day 0, 14, 28 and 42).
  • Figure 5 Subclass distribution of antibodies induced from immunization with 50 ⁇ g of TGF ⁇ -equivalent in the fused protein.
  • Figure 6 Response of hEGF-specific antibodies in mice immunized with the TGF ⁇ -P64K fusion protein.
  • the table shows the anti-TGF ⁇ and anti-EGF antibody titer values in mice immunized with TGF ⁇ -P64K.
  • Figure 7 Determination by immunohistochemical methods of the presence of EGF-R, EGF and TGF ⁇ in tumor biopsies of a vaccinated patient included in the pilot clinical trial II of EGF vaccine. The differential reactivity of these three molecules in the primary lung tumor and a second primary larynx tumor that appeared later, are shown with positive signs in the figure.
  • Figure 8 Expression of mRNA from EGF, TGF ⁇ and EGF-R in 22 breast carcinomas. The figure shows the products of 30 PCR cycles obtained with the specific primers for each molecule and visualized with ethidium bromide after being separated in 1.5% agarose gels. The expression of GAPDH mRNA used as internal control is also observed.

Abstract

Composición vacunal capaz de producir una respuesta inmune específica contra el TFG alfa autólogo conteniendo como principio activo al TGF alfa o cualquier derivado del mismo y un adyuvante apropiado. El preparado vacunal puede incluir también una combinación del TGF alfa con otros factores del crecimiento, tales como el factor de crecimiento epidérmico, EGF, de manera que inhiba la proliferación de tumores cuya progresión dependa de estos factores. Mediante el uso de esta composición se pueden controlar el crecimiento y proliferación de carconomas epidermoides.

Description

COMPOSICIÓN VACUNAL QUE CONTIENE FACTOR DE CRECIMIENTO
TRANSFORMANTE ALFA.
Sector Técnico La presente invención está relacionada con el campo de la inmunología y la medicina humana, en particular con un preparado vacunal capaz de provocar una reacción de inmunocastración contra el TGF alfa (TGFα) autólogo, la que puede ser utilizada para el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas y otras enfermedades relacionadas con el TGFα. Técnica Anterior
El Factor de Crecimiento Transformante alfa, TGFα siglas en Inglés, es un polipéptido de 50 aminoácidos, originalmente aislado del medio de cultivo de células transformadas por retrovirus. En un inicio se definió como una molécula capaz de competir con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF, siglas en Inglés) por la unión al EGF-R. Sin embargo, anticuerpos anti-EGF no fueron capaces de reconocer al TGFα (Todaro et al. (1976), Nature 264, 26-31), por lo que desde entonces se conoce que ambos factores de crecimiento son dos entidades inmunológicamente diferentes. El TGFα forma parte de la familia del EGF, que esta constituida por proteínas relacionadas estructural y funcionalmente. Los otros miembros de esta familia son: EGF, anfiregulina (AR), criptol (CR1), factor de crecimiento enlazador de heparina, betacelulina, epiregulina. Por otra parte la familia de los poxvirus incluye proteínas relacionadas con el EGF, dentro de ellas la más caracterizada es el factor de crecimiento de vaccinia virus (VGF). Todas estas moléculas son capaces de unirse y activar al EGF-R, así que son conocidas como ligandos del mismo y juegan un papel importante en el crecimiento de células normales y neoplásicas en menor o mayor grado.
El EGF-R es una glicoproteína de 170 kD aproximadamente, cuyo gen ha sido clonado y secuenciado. El dominio intracelular de este receptor esta asociado con la actividad de proteínas tirosinas quinasas que muestran homología estructural con el producto del oncogen v-erb-B, lo que muestra una relación con el proceso de transformación maligna (Heldin C.H. (1984), Cell 37, 9-20.). El TGFα es sintetizado en forma de un precursor de membrana (pro-TGFα), de 160 aminoácidos y mediante proteolisis enzimática se libera una proteína soluble de 150 aminoácidos aproximadamente, el TGFα maduro.
El TGFα humano (hTGFα) muestra un 43% de identidad en la secuencia aminoacídica con el EGF humano (hEGF) y un 93% con el TGFα de ratón ó rata. Además sus efectos biológicos no son especie específicos.
El trabajo de muchos laboratorios ha documentado la habilidad del TGFα de regular la proliferación, migración y diferenciación de células en cultivo (Carpenter y Wahl. (1990), Springer-Verlag, Berlín, pp.69-171.) El TGFα es el ligando del EGF-R más expresado. Se expresa en tejidos normales durante la embriogénesis y en tejidos adultos normales y tumorales. Sin embargo, no se observan defectos patológicos mayores en ratones TGFα "Knock-out" y estos ratones son viables y fértiles ( Bruce Mann y cols.(1993), Cell, 73, 249-261.). En el proceso de tumorigénesis, la desregulación de los procesos paracrinos y autocrinos de activación del EGF-R, está dada tanto por la sobreproducción de los factores de crecimiento como por la síntesis elevada y/o la mutación de sus receptores.
En tumores de origen epitelial se han detectado altos niveles de EGF-R y en muchos casos, la sobrexpresión de este receptor constituye un indicador de mal pronóstico. La inducción de TGFα es un evento frecuente en la transformación neoplásica. De hecho, se han realizado numerosos estudios que muestran la sobrexpresión de esta molécula en tumores epiteliales de distintas localizaciones, que incluyen, mama, pulmón, cerebro, hígado, próstata, vejiga, tracto gastrointestinal, colon, recto, tejido reproductivo (ovario) y endocrino, entre otros. Aunque el mecanismo de inducción de tumorigenicidad por el TGFα es aún desconocido, si existen algunos reportes que correlacionan la sobrexpresión de este factor de crecimiento con el grado del tumor, la sobrevida de pacientes y otros marcadores tumorales. Algunos investigadores han demostrado su relación con otros oncogenes como c-myc en hepatocarcinomas, además constituye un blanco del gen supresor de tumores (VHL) (Sumarizado en Lee y cois. (1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volume 1 B, 277-318.). Aunque el TGFα y el EGF se unen al mismo receptor con afinidades comparables, generalmente el TGFα es más potente que el EGF, y en algunos contextos, sus efectos se han descrito como más fuertes y/o más prolongados ( Barrandon and Green (1987), Cell 50, 1131-1137). Se ha reportado que en el caso de la intemalización del complejo TGFα/EGF-R, tanto el TGFα como el EGF-R son preferiblemente reciclados a la superficie mientras cuando el complejo EGF/EGF-R es internalizado en el mismo tipo celular, los dos componentes son eficientemente degradados (Ebner y Derynck (1991), Cell Regul.2,599-612), lo que sugiere que las diferencias en la actividad biológica puede estar dada por diferencias en los mecanismos que ocurren en el interior celular. Por otra parte el TGFα es un factor angiogénico más potente que el EGF (Schreiber y cols.(1986), Science 232, 1250- 1253.)
En cuanto a la expresión en tumores, aun cuando hay evidencias de la presencia del precursor de EGF en membranas de algunos tumores epiteliales, el TGFα es expresado por una mayor cantidad de tumores del mismo origen, y se plantea que su acción, a diferencia del EGF, es principalmente mediante la formación de un lazo autocrino con el EGF-R. Por otra parte, resultados obtenidos indican que en biopsias de tumores epiteliales de algunos tipos, se observa la presencia de TGFα y no EGF (carcinoma ductal de mama, laringe), mientras otros tumores presentan más EGF que TGFα (cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Estos resultados sugieren que los factores de crecimiento pueden tener impactos diferentes en la biología tumoral de la célula neoplásica blanco.
Todas las evidencias acumuladas en estos años acerca de la relación entre el sistema EGF-R/ EGF-R ligandos y el cáncer, convierten al mismo, en un blanco muy atrayente para la inmunoterapia de cáncer.
Resultados previos han demostrado la posibilidad de realizar una inmunoterapia activa de cáncer con la vacuna basada en EGF autólogo (Patente US 5,984,018). De hecho, se han obtenido evidencias tanto preclínicas como clínicas acerca de la inmunogenicicidad y la baja toxicidad provocada por la vacunación con hEGF unido a una proteína transportadora (González y cols.(1996), Vaccine Research 5(4), 233- Estudios preclínicos han mostrado que la inmunización de ratones con hEGF en adyuvante, incrementa la sobrevida de ratones transplantados con el tumor ascítico de Erlich (TAE) (González y cois. (1996 ), Vaccine Research 5(4), 233-243.). Se realizó una construcción genética de una proteína de fusión que contiene la secuencia del hEGF insertada entre el aminoácido 45/46 de la P64K. Esta proteína se usó como inmunógeno en ratones, provocando una respuesta inmune humoral específica contra el hEGF con impacto en el aumento de sobrevida de animales transplantados con células de TAE. (González y cois (1997), Vaccine Research 6(2), 91-100.) En dos ensayos clínicos pilotos realizados con pacientes con NSCLC, se observó una tendencia en el aumento de la sobrevida de los pacientes vacunados cuando se comparan contra un control histórico. En los pacientes con alta respuesta sérica contra el hEGF se observó un marcado incremento en la sobrevida (González y cols.(1998), Annals of Oncology 9, 1-5.). En sentido general la vacunación con EGF no genera una respuesta de anticuerpos específicos contra el TGFα. Sin embargo existen evidencias que la vacunación con un preparado inmunogénico que contiene TGFα en el modelo murino genera un nivel de anticuerpos anti-EGF solamente en algunos ratones. Dicha respuesta en algunos casos es capaz de bloquear la unión EGF a su receptor en un ensayo in vitro, sin embargo los niveles de anticuerpos anti-EGF obtenidos no son suficientes para generar una respuesta de inmunocastración del EGF con impacto en la respuesta antitumoral.
Debido a que la acción de cada uno de estos dos factores de crecimiento es diferente en cada tumor y/o entre el tumor primario y sus metástasis, una vacuna que combine los dos ligandos principales del EGF-R, TGFα y EGF, tendría un efecto antitumoral superior en los tumores de origen epitelial, en sentido general. Hasta el momento no existe ninguna terapia conocida que involucre la utilización de un preparado vacunal que contenga TGFα humano (hTGFα) o cualquier derivado del mismo, o una combinación de éste con otro ligando del EGF-R, EGF, en la inmunoterapia activa de cáncer. Divulgación de la invención
La presente invención provee una composición vacunal que contiene TGFα humano o cualquier derivado del mismo de cualquier origen, unido genéticamente (proteína de fusión recombinante) ó acoplado por métodos químicos a una proteína transportadora, capaz de inhibir el crecimiento de tumores de origen epitelial, a través de un efecto de inmunocastración, sin efectos colaterales de importancia. También provee de una composición vacunal que contiene una combinación de hTGFα o cualquier derivado con hEGF o cualquier derivado unidos a una proteína transportadora.
La composición vacunal puede ser utilizada en el tratamiento de tumores de origen epitelial dependientes de TGFα ó TGFα/EGF, o en cualquier otra enfermedad asociada con el TGFα tales como la psoriasis (Kapp, A (1993) J Dermatol Sci , Jun;5(3): 133-42).
En la especificación de TGFα, se incluye cualquier fragmento y/o derivado del TGFα que tenga propiedades inmunológicas y/o efectos semejantes a la molécula original. Los derivados incluyen, pero no se excluyen otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de aminoácidos sitio específico que incrementen la estabilidad y/o la actividad, modificaciones químicas, entre otras.
Más específicamente la invención consiste en un preparado vacunal capaz de provocar una reacción de inmunocastración contra el TGFα autólogo, que pueda ser utilizado para el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas y otras enfermedades relacionadas con el TGFα. Por otra parte dicha invención incluye la utilización de un preparado vacunal constituido por una combinación de TGFα y EGF, para el tratamiento de neoplasias malignas que dependan de estos dos factores de crecimiento en el curso de su patogénesis. 1- Preparaciones inmunogénicas: En la presente invención se utiliza un preparado vacunal que incluye hTGFα unido a una proteína transportadora por métodos de ingeniería genética (proteína de fusión recombinante) o por métodos químicos de conjugación. El hTGFα utilizado en cualquiera de las preparaciones inmunogénicas se obtiene tanto de fuente natural, recombinante ó sintética. Diferentes proteínas pueden ser utilizada como transportadoras. Como ejemplos de proteínas transportadoras se pueden utilizar: Toxoide Tetánico, KLH, la proteína P64K de Neisseria meningitidis, entre otras. Las cantidades óptimas de hTGFα en la formulación vacunal oscilan entre 5 μg y 1000 μg por dosis.
Por otra parte se utiliza un preparado vacunal que contiene una combinación del hTGFα con el hEGF (Oficina de Registro Nacional de Medicamentos, HEBERMIN No 1266).
En la especificación de TGFα ó EGF, se incluye cualquier fragmento y/o derivado del TGFα ó EGF que tenga propiedades inmunológicas y/o efectos semejantes a la molécula original. Los derivados incluyen, pero no se excluyen otros, sustituciones originales de aminoácidos, cambio de aminoácidos sitio específico que incrementen la estabilidad y/o la actividad, modificaciones químicas, entre otras.
A) Obtención de la proteína de fusión TGFα-Proteína transportadora por métodos de ingeniería genética:
El gen que codifica para el hTGFα (500 pb) se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos. El fragmento de ADN resultante es digerido y ligado en un sitio de unión específico a un vector de expresión en el cual se encuentra clonado el gen que codifica para la proteína transportadora, de manera que la proteína resultante incluye una copia o mas de las dos moléculas. Se puede utilizar cualquier vector de expresión tanto de células superiores (mamíferos) como inferiores (bacterias o levaduras). El vector también puede incluir seis hístidinas en el extremo N-Terminal de la proteína transportadora. El plásmido resultante es verificado por análisis de restricción en geles de agarosa, análisis de la secuencia de ADN usando la enzima secuenasa 2.0 (Amersham- USB), y finalmente, análisis de la producción de la proteína de fusión en cualquier cepa de expresión de Eschericia coli, mediante la técnica de "Western Blotting", usando un anticuerpo monoclonal específico contra hTGFα (R&D System). Para obtener la proteína se rompen las paredes bacterianas usando un método de ruptura fuerte y luego se purifica la proteína por una combinación de métodos de precipitación diferencial con sulfato de amonio y métodos cromatográficos. Finalmente, la proteína es filtrada en condiciones estériles y conservada a -20°C o liofilizada y conservada a 4°C hasta su uso posterior.
B) Obtención de conjugados químicos que contiene hTGFα: Se obtienen diferentes preparaciones que contienen hTGFα conjugado con diferentes proteínas transportadoras (como P64K). En principio se puede utilizar cualquier método de acoplamiento químico. Como método químico preferencial se utiliza el método que utiliza el agente EMCS descrito en la patente norteamericana, U. S. No. 4,302,386; Lee y cois., 1981.
Alternativamente, se puede utilizar el método de conjugación con glutaraldehído. Con este fin, se mezclan estas dos ó tres moléculas a una concentración de 1 mg/mL en la solución final con glutaraldehído al 0.05% (en la solución total). La mezcla se incuba 1 hora a temperatura ambiente, y se dializa contra una solución de PBS 1X/MgCI2 10 mM, con tres cambios de la solución de diálisis. Finalmente, se realiza una diálisis contra PBS 1X por toda la noche a 4°C. El preparado inmunogénico se filtra en condiciones estériles y se almacena a 4°C hasta su uso.
C) Obtención de una vacuna que combine el hTGFα y el hEGF.
La obtención de una vacuna que combine los dos principales ligandos del EGF-R puede realizarse de diferentes maneras:
1- Unión de las dos vacunas que contienen el hTGFα o el hEGF por separado unido a una proteína transportadora en una relación 1 :1 en el momento de la inyección. Con este fin se pueden utilizar las proteínas de fusión o los conjugados químicos de ambas moléculas. Las cantidades óptimas de hTGFα y hEGF en la formulación vacunal oscilan entre 5 μg y 1000 μg por dosis.
2- Obtención de una construcción genética similar a la descrita en la sección A que contenga los dos factores de crecimiento, hTGFα y hEGF o una combinación de cualquiera de sus derivados.
3- Obtención de un conjugado químico que contenga el hTGFα, hEGF o una combinación de cualquiera de sus derivados y una proteína transportadora utilizando la metodología descrita en la sección B.
D) Obtención de la preparación inmunogénica:
Para potenciar el efecto inmunogénico deseado de las composiciones vacunales, es conveniente usar un adyuvante adecuado y seleccionar un modo de administración en el cual el preparado vacunal exhiba una alta inmunogenicidad.
Las composiciones vacunales referidas en esta invención son adyuvadas de dos maneras específicas 1) En AI(OH)3 formando soluciones acuosas del preparado vacunal adsorbido a este compuesto. De 5 μg a 1000 μg de TGFα por dosis de inmunógeno se unen a un rango entre 2 y 5 mg de AI(OH)3 y se deja en agitación por espacio de 1 hora. La solución final se conserva a 4°C hasta su uso posterior. 2) En adyuvante incompleto de Freund que permiten la formación de emulsiones acuosas/oleosas u oleosas/acuosas. Las cantidades de inmunógeno y adyuvante en la composición final se encuentran en un rango volumen / volumen de 40/60 a 60/40. Los volúmenes dependen de la emulsión final deseada. El adyuvante se añade antes de la inmunización y se agita por un periodo de 10 a 30 minutos, a temperatura ambiente.
Los volúmenes finales de cada inmunógeno cubren el rango adecuado para la ruta correspondiente.
En el caso de las vacunas que se conjugan en el momento de la inyección descritas en la sección C 1 , las dos vacunas adyuvadas como se ha descrito anteriormente se pueden tanto unir por agitación e inyectar o inyectar por separado.
La administración de las composiciones vacunales se pueden realizar por diversas rutas: vía intramuscular, vía subcutánea, vía ¡ntranasal y vía intradérmica.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN.
Ejemplol: Obtención del segmento de ADN que codifica para TGFα maduro por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .
A partir de un vector comercial pBluescript KS" que tiene clonado en un sitio ECOR
V la cadena complementaria de ADN (ADNc) del hTGFα (PSK-TGFα) (CIGB, Cuba)
, se amplificó la secuencia de 150 aminoácidos correspondiente al TFGα maduro
(Fig.1 ) usando los cebadores específicos para el hTGFα maduro: N-Terrminal:5'- GCTCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3' (Subrayado , secuencia de corte de la enzima de restricción Xbal)
C-Terminal: 5'-CGGAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC-3' (Subrayado, secuencia de corte de la enzima de restricción EcoRI)
Brevemente, Se utilizaron 200 ng del PSK TGFα en 75 μL de una mezcla que contiene: 500ng de cada uno de los cebadores específicos, una mezcla de nucleótidos trifosfatos a una concentración de 200μM cada uno, MgCI2 a 25 mM y
100 Unidades de la enzima Taq Polimerasa (Promega) en solución tampón suministrada por Promega. Se realizaron 30 ciclos de desnaturalización (1 minuto a 94°C), hibridación (1 minuto a 60°C), y extensión (30 segundos a 72°C). Al primer ciclo se antecedió un tiempo de desnaturalización de 4 minutos, y después del último ciclo, se llevo a cabo una extensión de 2 minutos. El producto del PCR se separó por electroforesis en geles de agarosa de bajo punto de fusión y el segmento génico amplificado se purifica según procedimientos convencionales de extracción con fenol y se somete a una digestión enzimática doble usando las enzimas Xba I y EcoR I (NEB, USA). De esta forma queda preparado el segmento génico que codifica para el TGFα maduro. Ejemplo 2: Obtención del vector de expresión de la proteína fusionada TGFα- P64K.
Se utilizó el vector de expresión pM 92 (CIGB, Cuba) que contiene el gen IpdA que codifica para la proteína de Neisseria meningitidis P64K (cepa B385) bajo el promotor del operón de triptofano de E. coli (ptrp) y el terminador transcripcional de fago (tT4). El pM 92 confiere resistencia a los antibióticos ampicillina y kanamicina. Se transforma una cepa de E. coli Dam- (GC-366) con el vector pM92 y se purificó el ADN plasmídico utilizando un juego de reactivos comerciales (Quiagen) según las recomendaciones de los fabricantes. El vector PM 92 se digirió y se purificó a partir de geles de agarosa de bajo punto de fusión Seguidamente se unió el vector PM92 con el ADNc correspondiente al hTGFα maduro anteriormente preparado, usando la enzima T4 ligasa (Gibco BRL). El plásmido resultante pMTGF codifica para la proteína de fusión que contiene el h-TGFα insertado entre el aminoácido 45/46 de la P64K. Este plásmido recombinante fue verificado por análisis de restricción en geles de agarosa, análisis de la secuencia de ADN secuenasa 2.0 (Amersham-USB ), y finalmente, análisis de la expresión de la proteína de fusión en la cepa MM299 de E. coli, mediante la técnica de "Western Blotting" usando un anticuerpo monoclonal específico contra h-TGFα ( R&D System). La figura 2 muestra un esquema del proceso de obtención del vector de expresión pMTGF que codifica para la proteína de fusión TGFα-P64K. Ejemplo 3: Obtención del vector de expresión de la proteína fusionada TGFα- P64K con seis histidinas en el extremo N-Terminal ( pMHisTGFα). El vector de expresión pMHisTGFα se construyó siguiendo el mismo protocolo descrito en el ejemplo anterior utilizando como vector el PM224, que incluye un segmento codificante para seis histidinas en el extremo N-terminal de la P64K. La inclusión de un segmento que codifica para seis histidinas presenta ventajas en la purificación de la proteína por afinidad del mismo a quelatos metálicos. Ejemplo 4: Purificación de la proteína de fusión TGFα-P64K. Se cultivaron bacterias de E. coli (cepa MM299) que expresan la proteína de fusión TGFα-P64K en medio de cultivo LBA (Triptona 10 g/L, Extracto de Levadura 5g/L, NaCI 10 g/L y 50 mg/L de ampicillina) por 10 horas a 37°C. Después de la recolección de las células, todos los pasos fueron realizados de 0-4°C. La ruptura de la bacteria se realizó utilizando una prensa francesa a 1500 kg/cm2, y se removió la fracción insoluble mediante centrifugación a 11 ,000xg por 30 minutos. Como primer paso de purificación se llevó a cabo una precipitación al 40% de sulfato de amonio, que removió algunas de las proteínas contaminantes de E. coli. El precipitado resultante fue removido mediante centrifugación a 11,000 xg, 4°C, por 30 minutos. El sobrenadante fue fraccionado mediante cromatografía de interacciones hidrofóbicas (TSK-butil, Pharmacia, Sweeden), con un gradiente decreciente de sulfato de amonio del 40% al 0% en tampón Tris-CI, pH= 7.2, que contiene 0.15M de cloruro de sodio. Seguidamente la muestra resultante se sometió a una cromatografía de exclusión molecular en una columna G200 (Pharmacia ) equilibrada con PBS 1X, mostrando un nivel de pureza del 95%. La concentración de proteínas se determina usando el método de Lowry y cois ( (1951)J.Biol.Chem. 191, 495-498). La caracterización de la proteína fusionada se llevo a cabo mediante la técnica de "Western Blotting" , usando anticuerpos específicos contra P64K y TGFα. Ejemplo 5: Purificación de la proteína de fusión HisTGFα-P64K.
Se cultivaron bacterias de E. coli (cepa MM299) que expresan la proteína de fusión HisTGFα-P64K en medio de cultivo LBA (Triptona 10 g/L, Extracto de Levadura 5g/L, NaCI 10 g/L y 50 mg/L de ampicillina) por 10 horas a 37°C. Después de la recolección de las células, todos los pasos fueron realizados de 0-4°C. La ruptura de la bacteria se realiza utilizando una prensa francesa a 1500 kg/cm2, y se remueve la fracción insoluble mediante centrifugación a 11 ,000xg por 30 minutos. Como primer paso de purificación se lleva a cabo una precipitación al 40% de sulfato de amonio, que remueve algunas de las proteínas contaminantes de E. coli. El precipitado resultante fue removido mediante centrifugación a 11 ,000 xg, 4°C, por 30 minutos. El sobrenadante fue fraccionado mediante cromatografía de interacciones de afinidad por quelatos metálicos (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Sweeden), debido a la presencia de seis histidinas en la proteína, con un gradiente creciente de Imidazol de 25 mM a 500 mM en tampón Tris-CI, pH= 5.5, que contiene 0.5 M de cloruro de sodio. Seguidamente la muestra resultante se sometió a una cromatografía de exclusión molecular en una columna G25 (Pharmacia ) equilibrada con PBS 1X para eliminar las sales, mostrando un nivel de pureza del 95%. La concentración de proteínas se determinó usando el método de Lowry y cois ( (1951 )J.Biol.Chem. 191 , 495-498). La caracterización de la proteína fusionada se llevó a cabo mediante la técnica de "Western Blotting", usando anticuerpos específicos contra P64K y TGFα. Ejemplo 6: Reconocimiento de la proteína recombinante TGFα-P64K por un anticuerpo monoclonal (AcM) específico por el hTGFα.
Con el objetivo de determinar si el TGFα podía ser reconocido por un AcM anti- hTGFα comercial (Calbiochem) en el contexto de la proteína fusionada, realizamos la técnica de "Western Blotting". Se realizó una electroforesis en geles de poliacrilamida utilizando 25 μg de las proteínas EGF-P64K, TGFα-P64K ó P64K por duplicado y luego fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa de 0.45 μm según los procedimientos convencionales. Después de la transferencia las membranas se incubaron con una solución bloqueadora de TBS 1X mas 5% de leche descremada por toda la noche a 4 °C. Luego de un breve lavado con TBS 1X- Tween 20 (0.05%), las membranas se incubaron , una replica con un anticuerpo anti-P64K (1/ 500) (Fig.3A ) y la otra con un AcM anti-TGFα (1/100) (Fig.3B ) por dos horas a temperatura ambiente. Seguidamente se realizaron tres lavados con la misma solución y se incubaron las membranas con un antisuero anti- inmunoglobulinas totales de ratón 1/1000 conjugado con fosfatasa alcalina por una hora en iguales condiciones. Finalmente se le añadió 0.004 g de sustrato Fast Red ( Sigma) en tampón Tris-CI 0.1 M pH=8.2 que contiene 0.004 g de Naphtol AS-MX Fosfato (Sigma) y 400 μL de NN'Dimetil Formamida en 20 mL. La reacción se detuvo con lavados iguales a los descritos con anterioridad. Se observó un reconocimiento específico del AcM anti-hTGFα por la proteína TGFα-P64K (Fig. 3). Los resultados obtenidos demuestran que el TGFα en la proteína de fusión mantiene una estructura capaz de ser reconocida por un anticuerpo específico. Ejemplo 7: Obtención de un conjugado químico hTGFα-P64K. Se mezcló un mililitro de TGFα en PBS/MgCI2 10 mM a una concentración de 2 mg/mL con un mililitro de P64K a 2 mg/mL en el mismo solvente. Se añadió 0.2 mL de glutaraldehído al 0.5% para una concentración final de 0.05%. La mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente, y se dializó contra una solución de PBS 1X/MgCI2 10 mM, con tres cambios de la solución de diálisis. Finalmente, se realizó una diálisis contra PBS 1X por toda la noche a 4°C. El preparado inmunogénico se filtró en condiciones estériles y se almacenó a 4°C hasta su uso. Ejemplo 8: Obtención de una proteína de fusión entre el hTGFα, hEGF y P64K. El gen que codifica para el hEGF (150 pb) se amplifica mediante PCR a partir del plásmido pBEF 10 que contiene al hEGF completo clonado en el sitio EcoR V del vector comercial pBluescript SK II (Stragene). El ADN obtenido de esta manera se une al vector pMHisTGFα en un sitio Bam Hl que se encuentra en el final del extremo C-terminal de la P64K utilizando la metodología descrita en el ejemplo 2. De esta manera se obtiene el vector pMTGFα-EGF que codifica para la proteína de fusión TE-P64K
Ejemplo 9: Obtención de un conjugado químico hTGFα-hEGF-P64K. Se mezcló un mililitro de hTGFα en PBS/MgCI2 10 mM a una concentración de 3 mg/mL con un mililitro de hEGF a 3 mg/mL y P64K a 3 mg/mL en el mismo solvente. Se añadió 0.6 mL de glutaraldehído al 0.5% para una concentración final de 0.05%. La mezcla se incubó 1 hora a temperatura ambiente, y se dializó contra una solución de PBS 1X/MgCI2 10 mM, con tres cambios de la solución de diálisis. Finalmente, se realizó una diálisis contra PBS 1X por toda la noche a 4°C. El preparado inmunogénico se filtró en condiciones estériles y se almacenó a 4°C hasta su uso. Ejemplo 10: Preparación de formulaciones que contienen hTGFα.
Los diferentes preparados inmunogénicos descritos en los ejemplos 2, 3, 7, 8 y 9 se mezclaron con AI(OH)3 ó Montanide ISA 51 según se describe en la descripción detallada de la invención. Se utilizaron cantidades que equivalen a 50 μg de hTGFα en todos los preparados y 50 μg de hTGFα y hEGF, en el caso de las vacunas combinadas descritas en los ejemplos 8 y 9. Se utilizó 2mg de AI(OH)3 por cada preparado de proteína fusionada o conjugado químico de hTGFα ó hEGF que contiene 50 μg equivalentes de cada factor de crecimiento respectivamente.
Ejemplo 11 : Preparación de una vacuna combinada que contiene la proteína TGFα/P64K y la proteína EGF/P64K.
Se mezclaron 0.6 mg de cada una proteína, lo que equivale a 50 μg de cada uno de los dos factores de crecimiento, en un volumen total de 0.5 mL y se unió con igual volumen de Montanide ISA 51 y se agitó 10 minutos a temperatura ambiente antes de la inyección.
En el caso de utilizar AI(OH)3 como adyuvante, se mezclaron dos preparados vacunales que contienen 0.6 mg de proteína cada una de las proteínas antes mencionadas en 0.5 mL final adsorbidos en 2 mg de AI(OH)3. Ejemplo 12: Preparación de una vacuna combinada que contiene un conjugado químico TGFα/P64K y EGF/P64K.
Se mezcló 0.25 mL de un preparado inmunogénico que contiene 50 μg de TGFα unido a P64K según lo descrito en el ejemplo 7 con 0.25 mL de un preparado inmunogénico de iguales características que contiene hEGF y se mezcló con 0.5 mL de Montanide ISA 51 según lo descrito en el ejemplo 10, utilizando una jeringuilla, por un periodo de 10 minutos a temperatura ambiente.
En el caso de utilizar AI(OH)3 como adyuvante, se mezclaron 0.5 mL de cada uno de los conjugados químicos antes descritos que contenían 50 μg de hTGFα y hEGF respectivamente adsorbidos en 2 mg de AI(OH)3. Ejemplo 13: Inmunogenicidad de la TGFα-P64K / Adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA 51) en el modelo murino.
Con el objetivo de demostrar la inmunogenicidad , ratones de la cepa Balb/c, hembras entre 6-8 semanas fueron inyectados por vía subcutánea con 58 μg (5μg equivalentes de TGFα), 116μg (10μg) ó 0,6 mg (50μg) de la TGFα-P64K en una proporción 1 :1 con Montanide ISA 51. El inmunógeno se preparó según lo descrito en la descripción detallada de la invención agitándose por 10 minutos antes de la inmunización. Cada animal recibió 4 dosis quincenales. Se realizaron extracciones de sangre previo a la primera dosis, una semana después y cada dos semanas a partir de ese momento. El suero se separó de la sangre extraída de los animales y se determinó el título de anticuerpos específicos contra el hTGF mediante la técnica de ELISA indirecto. Brevemente, las placas de ELISA (Costar) fueron recubiertas con 50μL/pozo de una solución de hTGFα a 2.5 μg/mL en tampón carbonato pH= 7.2 é incubadas toda la noche a 4°C. Después de tres lavados con PBS 1X-Tween 20 (0.05%), las placas se bloquearon con una solución de PBS 1X-Tween 20 (0.05%)-SFT (5%) por 1 hora a 37°C. Inmediatamente se añadieron los sueros de los ratones inmunizados, y se incubaron por 2 horas a 37°C. Luego de lavar las placas nuevamente, se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-lnmunoglobulinas totales de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) diluido 1/1000 en PBS 1X-Tween 20 (0.05%)-SFT (5%) (50μL /pozo) por 1 hora a igual temperatura. Finalmente, luego de volver a lavar las placas de la misma manera, se añadió el sustrato de la enzima (p- nitrofenilfosfato(Sigma)) a una concentración de 1 mg/mL en tampón Dietanolamina pH=9.8 (50μL /pozo). La absorbancia del complejo enzima-sustrato formado se midió en un lector de ELISA a 405 nm.
En la figura 4 se observa la cinética de la respuesta polivalente de anticuerpos anti- hTGFα obtenida en ratones inmunizados con la TGFα-P64K. Debido a la alta homología entre el hTGFα y el de rata ó ratón (93%) se puede considerar que la respuesta generada contra el hTGFα como una respuesta contra el TGFα antologo.
Ejemplo 14: Inmunogenicidad de la TGFα-P64K / AI(OH)3 en el modelo murino. Se realizó un protocolo de inmunización según lo descrito en el ejemplo anterior, utilizando 2 mg AI(OH)3 como adyuvante. El inmunógeno se preparó según lo descrito en la descripción detallada de la invención . Se obtuvieron títulos de anticuerpos específicos por TGFα de hasta 1/10000. La técnica utilizada para determinar el título de anticuerpos anti-TGFα fue la de ELISA indirecto descrita en el ejemplo 13. Ejemplo 15: Distribución de las subclases de inmunoglobulinas de isotipo IgG en los ratones inmunizados con la proteína TGFα-P64K / Adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA 51) en el modelo murino. Se determinó la distribución de subclases IgG obtenida mediante la técnica de ELISA indirecto descrita en el ejemplo 13, utilizando antisueros específicos contra la diferentes subclases de IgG murino conjugados con biotina (Jackson) a una dilución de 1/1000 y posteriormente el complejo estreptavidina-fosfatasa (1/1000). Se determinó la proporción de cada una de las subclases de IgG con respecto a la IgG total en el suero de los animales inmunizados con 50 μg de TGFα en la proteína fusionada usando la vía subcutánea (Grupo 1 ) o intramuscular (Grupo 2) siguiendo el protocolo de inmunización descrito en el ejemplo 13. En la figura 5 se observa la distribución de subclases obtenida. Se obtuvo una mayor proporción de lgG1 en los dos grupos de ratones utilizados en el estudio.
Ejemplo 16: Determinación de la capacidad de los sueros de los animales inmunizados con la proteína TGFα-P64K / Adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA 51) de inhibir la unión del TGFα-l125mediante la técnica de "radio receptor assay"(RRA). Con el objetivo de determinar si los anticuerpos generados en los protocolos de inmunización descritos anteriormente eran capaces de inhibir la unión del TGFα a su receptor , se realizó un ensayo in vitro denominado RRA. En síntesis, los sueros de los ratones inmunizados según se describe en el ejemplo 13 se incubaron con una mezcla que incluye 100 μL de membrana de placenta humana y 20 μL de TGFα-l125 ( 100000 cpm) y 330 μL de tampón Tris-CI 10 mM, MgCI2 10 mM y BSA al 1 %, pH=7.4. El mareaje de TGFα se realizó mediante el método de la cloramina T (Hunter y Greenwood (1962, Nature, 358:495-498). La mezcla se incubó por 1 hora a temperatura ambiente y luego se detuvo la reacción con 1 mL del tampón antes mencionados. Finalmente se centrifugaron los tubos a 1000 rpm por 30 minutos. Las células sedimentadas se lavaron y dejaron secar. La radioactividad se midió en un contador gamma (Wallac, Finlandia). La caída en los valores de radioactividad medidos indica la inhibición del enlace entre el TGFα y su receptor, debida a la acción de los sueros ensayados. Se obtuvo un porciento de inhibición entre un 50%- 80% en todos los sueros ensayados. Ejemplo 17: Determinación de la respuesta sérica contra el EGF humano (hEGF) generada por la inmunización con la proteína TGFα-P64K.
Se determinó la presencia de anticuerpos anti-EGF en los sueros de los ratones que mostraron altos títulos de anticuerpos anti-TGFα, mediante la técnica de ELISA indirecto previamente descrita. Diluciones de 1/100, 1/1000 y 1/10000 de los sueros se enfrentaron a placas recubiertas con hEGF (CIGB). En la figura 6 se muestran los títulos anti-EGF que mostraron los sueros de los animales inmunizados con la proteína TGFα-P64K, como se observa se obtiene respuesta de anticuerpos anti- EGF solamente en un grupo de ratones inmunizados. Sin embargo ratones inmunizados con el conjugado químico EGF-P64K no mostraron ningún nivel de respuesta de anticuerpos anti-TGFα. Ejemplo 18: Reconocimiento de tumores humanos in vitro por un antisuero policlonal anti-hTGFα obtenido por la inmunización con la proteína TGFα- P64K / Adyuvante incompleto de Freund (Montanide ISA 51). Se utilizó los antisueros policlonales anti-hTGFα obtenidos a partir de la inmunización de ratones con la proteína heteróloga TGFα-P64K en Montanide ISA 51 para determinar la expresión de TGFα en biopsias de tumores incluidas en parafina de pacientes vacunados con la vacuna basaba en EGF. En un paciente con alta respuesta de anticuerpos anti-hEGF, se observó una regresión del tumor NSCLC. Sin embargo, después se le detectó un segundo tumor de laringe. Biopsias de estos dos tumores fueron analizadas y se observó una expresión diferencial del EGF y el TGFα en cada una de ellas. En la figura 7 se muestran los valores de reactividad obtenidos con los diferentes monoclonales utilizados. Estos resultados confirman que mediante la inmunización con el preparado vacunal TGFα-P64K se generan anticuerpos específicos contra el hTGFα capaces de reconocer a esta molécula en tumores humanos.
Ejemplo 19: Expresión de EGF (ARNm), TGFα (ARNm) y EGF-R (ARNm) en biopsias de carcinomas de mama Se extrajo el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de biopsias de tumores de mama utilizando el reactivo TRIZOL (Life technologies) y se convirtió ADNc mediante la enzima reverso transcriptasa. El ADNc total se sometió a 30 ciclos de PCR utilizando cebadores específicos para cada una de estas moléculas. Como control interno se utilizó un gen de mantenimiento celular presente en todas las células (GAPDH). El producto de PCR obtenido se separó mediante una electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y se visualizó con bromuro de etidio. En la figura 8 se muestran los resultados obtenidos al utilizar los cebadores específicos para el EGF, TGFα , EGF-R y GAPDH (Control interno) en 22 carcinomas de mama. Solamente se observó EGF ARNm en 1/22 biopsias , sin embargo se observó una alta expresión de TGFα y EGF-R en la mayoría de las muestras. La correlación entre estas dos moléculas, sugiere la importancia del lazo autocrino TGFα/ EGF-R en el crecimiento de este tipo de tumores (Figura 9). Breve descripción de las Figuras
Figura 1 : Secuencia genética y aminoacídica (letras subrayadas en negrita) del h- TGFα maduro.
Figura 2: Representación esquemática del proceso de obtención del vector de expresión pMTGFα. Figura 3: Reconocimiento de la proteína de fusión TGFα-P64K por anticuerpos monoclonales anti-P64K (A) y anti-hTGFα (B) mediante la técnica de "Western Blotting". Se realizó una SDS-PAGE al 10 % de la P64K (1 ), EGF-P64K (2) y TGFα-P64K (3) y luego se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa donde se incubaron con anticuerpos específicos contra P64K (A) ó TGFα (B) con el objetivo de caracterizar la proteína fusionada entre el TGFα y la P64K.
Figura 4: Cinética de la respuesta de anticuerpos anti-hTGFα: Los títulos de anticuerpos específicos contra el hTGFα fueron medidos mediante la técnica de ELISA indirecto. Los ratones fueron inmunizados con 5 μg (A), 10 μg (B) y 50 μg (C) de TGFα-equivalente en la proteína TGFα-P64K en Montanide ISA 51. Las abscisas representan los días en que se obtuvieron las muestras de suero de cada ratón individual y las ordenadas el recíproco de los títulos de anticuerpos alcanzados. Los día de inmunización se señalan con flechas en el gráfico A (Día 0, 14, 28 y 42). Figura 5: Distribución de subclases de los anticuerpos inducidos a partir de la inmunización con 50 μg de TGFα-equivalente en la proteína fusionada. Comparación de la proporción de subclases de IgG en la respuesta de anticuerpos inducida con la inmunización de la proteína TGFα-P64K por vía subcutánea (1) ó intramuscular (2). Los valores de desviación estándar se muestran en la figura para cada uno de los grupos de 5 animales inmunizados.
Figura 6: Respuesta de anticuerpos específicos por el hEGF en ratones inmunizados con la proteína de fusión TGFα-P64K. En la tabla se muestran los valores del título de anticuerpos anti-TGFα y anti-EGF en ratones inmunizados con TGFα-P64K.
Figura 7: Determinación por métodos inmunohistoquímicos de la presencia de EGF- R, EGF y TGFα en biopsias de tumores de un paciente vacunado incluido en el ensayo clínico piloto II de vacuna EGF. La reactividad diferencial de estas tres moléculas en el tumor primario de pulmón y de un segundo tumor primario de laringe que apareció con posterioridad, se muestran con signos positivos en la figura. Figura 8: Expresión de ARNm de EGF, TGFα y EGF-R en 22 carcinomas de mama. En la figura se muestran los productos de 30 ciclos PCR obtenidos con los cebadores específicos para cada molécula y visualizados con bromuro de etidio después de ser separados en geles de agarosa al 1.5%. También se observa la expresión de ARNm de GAPDH utilizado como control interno. Figura 9: Correlación entre los niveles de TGFα ARNm y EGF-R ARNm en biopsias de carcinoma de mama: La intensidad de las bandas obtenidas con bromuro de etidio se analizó mediante un programa de computación (ImagQuant, Amersham ) . El eje de las x muestra los valores de intensidad para los productos de PCR utilizando cebadores específicos para EGF-R entre los obtenidos con GAPDH, para cada una de las muestras y el eje de las y muestra los mismo pero para el TGFα. Se observó una correlación positiva entre la expresión de las dos moléculas, R2= 0.657, p=0.00121.

Claims

REIVINDICACIONES
- Una composición vacunal capaz de producir una respuesta inmune específica contra el TGFα autólogo, caracterizada porque comprende como principio activo TGFα autólogo o cualquier derivado del mismo y un adyuvante apropiado. - Una composición vacunal según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende TGFα humano recombinante. - Una composición vacunal capaz según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque emplea como principio activo TGFα autólogo solo o en combinación con otros ligandos del EGF-R. - Una composición vacunal capaz según las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizada porque el TGFα autólogo y los ligandos del EGF-R que se emplean como principios activos, pueden ser opcionalmente enlazados a una proteína transportadora, tanto por conjugación química como genéticamente. - Una composición vacunal según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende la proteína P64K de Neisseria meningitis como proteína transportadora. - Una composición vacunal según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende como principio activo un conjugado químico entre TGFα y P64K de Neisseria meningitidis. - Una composición vacunal según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende como principio activo un conjugado químico entre el TGFα y la proteína P64K de Neisseria meningitidis, y adicionalmente EGF. - Una composición vacunal según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende como principio activo una proteína de fusión recombinante entre el
TGFα y la proteína P64K de Neisseria meningitidis. - Una composición vacunal según la reivindicación 8, caracterizada porque comprende una proteína de fusión recombinante entre el TGFα y la P64K de Neisseria meningitidis, la cual presenta una cola de seis histidinas en el extremo N-terminal de dicha proteína P64K. - Una composición vacunal según reivindicación 9 caracterizada porque comprende como principio activo una proteína de fusión recombinante entre el
TGFα, la proteína P64K de Neisseria meningitidis y el EGF. - Una composición vacunal según las reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizada porque comprende Adyuvante Incompleto de Freund como adyuvante. - Una composición vacunal según la reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizada porque comprende AI(OH)3 como adyuvante. - Método para el control del crecimiento y/o proliferación celular en tumores de origen epitelial que expresan TGFα y otros ligandos del EGF-R, caracterizado porque se emplea la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones dé la 1 a la 12. - Método según la reivindicación 13 para el tratamiento de tumores como carcinomas epidermoides de pulmón, mama, próstata, gástrico, y de ovario caracterizado porque se emplea la composición vacunal de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058297A1 (es) * 2002-12-27 2004-07-15 Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología Combinaciones de factores reguladores del crecimiento y hormonas para el tratamiento de neoplasias

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22979A1 (es) * 2000-12-08 2004-09-09 Centro Inmunologia Molecular Combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores que sobre-expresan receptores con actividad quinasa en residuos de tirosina
EP1493445A1 (en) * 2003-07-04 2005-01-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibition of stress-induced ligand-dependent EGFR activation
CU23297A1 (es) * 2004-11-16 2008-07-24 Ct De Inmunologa A Molecular Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer
CU23652A1 (es) * 2007-06-29 2011-05-27 Centro Inmunologia Molecular Composición vacunal homogénea para el tratamiento del cáncer y su método de obtención
KR101323845B1 (ko) 2011-01-21 2013-10-31 광주과학기술원 외막소포체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물
CN113855792B (zh) * 2021-12-01 2022-03-01 上海惠盾因泰生物科技有限公司 重组hEGF-CRM197肿瘤治疗性疫苗配制剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991001146A1 (en) * 1989-07-14 1991-02-07 Praxis Biologics, Inc. Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5690928A (en) * 1990-06-21 1997-11-25 Merck & Co., Inc. Method of treating bladder cancer cells
US5894018A (en) * 1993-12-09 1999-04-13 Centro De Immunologia Molecular Vaccine composition comprising autologous epidermal growth factor or a fragment or a derivative thereof having anti-tumor activity and use thereof in the therapy of malignant diseases
GB2333706A (en) * 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22302A1 (es) * 1990-09-07 1995-01-31 Cigb Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991001146A1 (en) * 1989-07-14 1991-02-07 Praxis Biologics, Inc. Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5690928A (en) * 1990-06-21 1997-11-25 Merck & Co., Inc. Method of treating bladder cancer cells
US5894018A (en) * 1993-12-09 1999-04-13 Centro De Immunologia Molecular Vaccine composition comprising autologous epidermal growth factor or a fragment or a derivative thereof having anti-tumor activity and use thereof in the therapy of malignant diseases
GB2333706A (en) * 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D'ERRICO A ET AL.: "Role and new perspectives of transforming growth factor-alpha (TGF-a1) adenocarcinoma of the gastro-oesophageal junction." BR J CANCER, vol. 82 (4), February 2000 (2000-02), pages 865-870, XP002210096 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058297A1 (es) * 2002-12-27 2004-07-15 Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología Combinaciones de factores reguladores del crecimiento y hormonas para el tratamiento de neoplasias

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