ES2336770T3 - Medicamentos para el tratamiento de tumores y sus metastasis utilizando una molecula de union contra la sialoproteina osea. - Google Patents
Medicamentos para el tratamiento de tumores y sus metastasis utilizando una molecula de union contra la sialoproteina osea. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2336770T3 ES2336770T3 ES02748771T ES02748771T ES2336770T3 ES 2336770 T3 ES2336770 T3 ES 2336770T3 ES 02748771 T ES02748771 T ES 02748771T ES 02748771 T ES02748771 T ES 02748771T ES 2336770 T3 ES2336770 T3 ES 2336770T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- bsp
- bone
- antibodies
- tumor
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 92
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 26
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title description 11
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 title description 3
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 title description 3
- 108010028750 Integrin-Binding Sialoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 102000016921 Integrin-Binding Sialoprotein Human genes 0.000 claims abstract description 225
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 61
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 claims description 22
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 17
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 claims description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 108010001160 IgY Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 9
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 claims description 4
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000002425 cardiocirculatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims description 2
- 108091027076 Spiegelmer Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 87
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 52
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 22
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 19
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 10
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 10
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 8
- BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N (6r,7r)-7-amino-3-(hydroxymethyl)-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@H]21 BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N 0.000 description 7
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 5
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 5
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 5
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 5
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 3
- 102100030386 Granzyme A Human genes 0.000 description 3
- 101001009599 Homo sapiens Granzyme A Proteins 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001373 regressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 2
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 102100035432 Complement factor H Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 2
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 2
- KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N Peracetic acid Chemical compound CC(=O)OO KFSLWBXXFJQRDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 2
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000320529 Allobates femoralis Species 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101150079550 BSP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101710108797 Bone sialoprotein-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102100036899 Parathyroid hormone-related protein Human genes 0.000 description 1
- 101710123753 Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- KCRSJPCXPQESIU-SEYXRHQNSA-N [(z)-docos-13-enyl] 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCCOP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C KCRSJPCXPQESIU-SEYXRHQNSA-N 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 230000004712 cancer cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002082 fibula Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003559 hypertrophic chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007434 lytic lesion Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008883 metastatic behaviour Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004416 odontoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 208000013076 thyroid tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Anticuerpos, inmunotoxinas, moléculas con estructura de unión a BSP de receptores de BSP naturales o moléculas de factor H y aptámeros o Spiegelmer® basados en ADN o ARN, que se unen a sialoproteína ósea o fragmentos de la misma en suero o plasma, para uso como principio activo en el tratamiento de metástasis óseas y tumores que expresan BSP que colonizan preferiblemente tejidos óseos.
Description
Medicamentos para el tratamiento de tumores y
sus metástasis utilizando una molécula de unión contra la
sialoproteína ósea.
La invención se refiere a medicamentos para el
tratamiento y el combate de tumores y de metástasis que colonizan
con especial frecuencia tejidos óseos.
Están actualmente en desarrollo numerosos
medicamentos que deben combatir tumores y sus metástasis dispersadas
en huesos. A pesar de todos los avances médicos, sin embargo, las
metástasis óseas no son consideradas curables y tratables. Hay
intentos, mediante anticuerpos contra antígenos de superficie de
células tumorales, de combatir sus metástasis. Sin embargo, a pesar
de ello las metástasis óseas son en tumores de mama en el 73% de los
casos y en tumores de próstata en el 68% de los casos la causa de
la muerte. Para tumores de otros tejidos, son válidos los
siguientes números: cuello del útero 50%, tiroides 42%, vejiga 40%,
pulmón 36%, ovario 9% y colon 6%.
Las células tumorales que expresan la denominada
sialoproteína ósea tienen la particularidad de que anidan
preferiblemente en tejidos óseos y forman allí metástasis,
especialmente en tumores de próstata, mama, pulmón, riñón y
tiroides y menos frecuentemente en tumores malignos y semimalignos.
La sialoproteína ósea (BSP) es una glucoproteína ósea fosforilada
con una masa relativa de aprox. 80 kDa en PAGE-SDS.
El ADNc de BSP codifica una secuencia peptídica de aprox. 33 kDa
(Fisher L.W. y col. (1990), J. Biol. Chem., 265,
2347-51; US 5.340.934). La BSP es una de las pocas
proteínas de matriz cuya presencia está limitada a tejidos
mineralizados como huesos, dentina y cartílago calcificado. La BSP
representa aprox. el 10 al 15% de las proteínas no colagénicas
totales en la matriz ósea. Se expresa generalmente en células que
participan en la formación de dentina, hueso y cartílago, por
ejemplo de osteoblastos, osteocitos emergentes, condrocitos
hipertróficos, odontoblastos y cementoblastos, pero también de
trofoblastos en la placenta, así como de algunos tipos de células
cancerosas, por ejemplo, en tumores primarios y secundarios de
pulmón, mama, próstata, riñón, tiroides y neuroblastoma, en mieloma
múltiple y en metástasis óseas. El grado de expresión de la BSP por
el tumor se correlaciona estrechamente con la gravedad de la
enfermedad cancerosa (Waltregny D. y col., "Increased expression
of bone sialoprotein in bone metastases compared with visceral
metastases in human breast and prostate cancers", en J. Bone
Miner. Res., 2000, 15(5), 834-43;
Bellahcène, A. y col., "Bone sialoprotein expression in primary
human breast cancer is associated with bone metastases
development", en J. Bone Miner. Res., 1996, 11,
665-670; Waltregny, D. y col., "Prognostic value
of bone sialoprotein expression in clinically localized human
prostate cancer", en Journal of the National Cancer
Institute, 1998, 90, 1000-1008; Bellahcène, A. y
col., "Expression of bone sialoprotein in primary breast cancer is
associated with poor survival", en Int. J. Cancer, 1996,
69, 350-353).
La BSP debe causar como molécula de adhesión el
anclaje y la difusión de células en la matriz de tejido, ya que
in vitro forma núcleos de cristalización para apatita
biológica e in vivo participa en las mineralizaciones. La
desactivación del gen de BSP en ratones con inactivación génica no
condujo a ninguna alteración perceptible de la formación y función
esquelética. En tumores, se atribuye a la BSP la participación en la
microcalcificación (Castronovo, V. y col., "Evidence that breast
cancer associated microcalcifications are mineralized malignant
cells", en Int. J. Oncol., 1998, 12,
305-308) y la colonización del hueso por células
tumorales metastásticas (Bellahcène, A. y col., "Expression of
bone sialoprotein in primary breast cancer is associated with poor
survival", en Int. J. Cancer, 1996, 69,
350-353).
El valor de concentración de BSP en el suero de
pacientes con carcinomas primarios sirve para el diagnóstico de si
estos pacientes poseen metástasis óseas o éstas provienen
probablemente del tumor primario (Tesina de la Sra.
Ina-Alexandra Meier, "Sntwicklung eines
Radioimmunoassays zur Bestimmung von Bonesialoprotein (BSP)",
1996, Darmstadt, Fachhochschule, FB Chemische Technologie; discurso
del Sr. Markus Karmatschek, "Isolierung von Bonesialoprotein aus
humanem Knochen, Aufbau eines Radioimmunoassays zu dessen Messung im
Serum", 1996; FB Biologie der Technischen Hochschule Darmstadt;
Diel I.J. y col., "Elevated bone sialoprotein in primary breast
cancer patients is a potent marker for bone metastases"; en
Proceedings of ASCO, 1998, 17, Resumen 461; Diel I.J. y col.,
"Serum bone sialoprotein in patients with primary breast cancer is
a prognostic marker for subsequent bone metástasis", en Clin.
Cancer Res., 1999, 5, 3914-19; DE 19.813.633; DE
19.821.533; WO 99/50666).
La BSP libre se une sin embargo con alta
afinidad en fluidos corporales al factor de complemento H. Además,
la BSP puede unirse a distintos receptores. Así, se han preparado
anticuerpos en conejos contra distintas estructuras parciales
peptídicas de la BSP (Fisher, L.W. y col., "Antisera and cDNA
probes to human and certain animal model bone matrix noncollagenous
proteins". Acta Orthop. Scand. Suppl. 1995, 266,
61-655), contra BSP recombinante (Stubbs JT 3º y
col., "Characterization of native and recombinant bone
sialoprotein: delineation of the mineralbinding and cell adhesión
domains and structural analysis of the RGD domain". J. Bone
Miner. Res. 1997, 12 (8), 1210-22) y contra BSP
aislada de hueso, que no reconocen la BSP completa en suero humano.
La gran molécula de factor H de 150 kDa enmascara supuestamente la
BSP más pequeña (de aprox. 65 kDa) de modo que los anticuerpos no
pueden unirse. Además, el factor H se presenta en el suero en exceso
(0,5 mg de factor H/ml en comparación con BSP < 20 ng/ml de
suero en personas sanas y como máximo 160 ng/ml en pacientes de
tumores). Se afirma que la detección directa inmunológica de la BSP
en fluidos corporales es imposible debido a la unión al factor H
sin procesamiento reductor de muestra y posiblemente los
trofoblastos y células tumorales productoras de BSP se protegen así
del ataque del sistema inmunitario, porque el factor H pertenece al
sistema de complemento y causa conocidamente la inhibición de la
ruta alternativa a la lisis de complemento (Fedarko N. S. y col.,
"Factor H binding of bone sialoprotein and osteopontin enables
tumor cell evasión of complement-mediated
attack", en J. Biol. Chem., 2000, 275, 16666- 16672; WO
00/062065). Además, la BSP puede unirse mediante la secuencia de
reconocimiento propia
(arginina-glicina-aspartato, RGD)
específicamente a los receptores de integrina en la superficie
celular. En la expresión de BSP, las células tumorales deben unirse
entonces al factor H en la sangre y en los fluidos tisulares en su
superficie celular o concentrarse alrededor. Dicha protección de
BSP ante el sistema de complemento de la sangre de la madre se
supone también para los trofoblastos en la placenta (Fedarko N. S.
y col., "Factor H binding of bone sialoprotein and osteopontin
enables tumor cell evasión of complement-mediated
attack", en J. Biol. Chem., 2000, 275,
16666-16672; WO 00/62065). Se supone además una
función de la BSP en la angiogénesis. Además de la adhesión de
osteoclastos y osteoblastos a la matriz ósea mediante la unión de
la secuencia de reconocimiento RGD en la matriz a los receptores de
integrina alfa(v)beta(3) sobre la pared
celular, se observa también que la adhesión, difusión y orientación
de las células endoteliales está mediada supuestamente por BSP. A
saber, la formación de vasos sanguíneos alrededor de un tumor está
acompañada por la expresión de BSP en las células tumorales
(Bellahcène A y col., "Bone sialoprotein mediates human
endothelial cell attachment and migration and promotes
angiogenesis", en Circ. Res. 2000, 86(8),
885-91).
Estas propiedades hacen por tanto de la BSP un
punto de partida para medicamentos de todo tipo. Asi, la unión de
BSP por la secuencia RGD a receptores de vitronectina o integrina de
células tumorales y epiteliales puede inhibirse mediante
antagonistas (documentos US 6.069.158; US 60.008.213; US 5.849.865;
van der Pluijm y col., "Bone-sialoprotein peptides
are potent inhibitors of breast cancer cell adhesión to bone in
vitro", en Cancer Res., 1996, 56,
1948-1955). El documento EP 1.084.719 Al enseña una
composición farmacéutica con BSP como sustancia activa para apoyar
la reparación de tejidos óseos y conectivos dañados. El documento WO
94/13310 enseña una composición con una proteína de unión a BSP de
Staphylococcus aureus como principio activo. El documento WO
00/36919 da a conocer elementos reguladores para el control o la
supresión específicos de la expresión de BSP en células de tejidos
tumorales y conectivos que promueve la calcificación. O sea,
generalmente las sustancias de regulación del crecimiento celular y
la migración celular son especialmente interesantes para
diagnóstico y terapia. Pero hay todavía demasiados factores
desconocidos que controlan el crecimiento del cáncer, al
interaccionar los tumores primarios y secundarios y los órganos
colonizados. Son etapas importantes en este momento la invasión, la
adhesión, la migración y la división celular de las células
tumorales. Además de metaloproteinasas de matriz, las moléculas de
adhesión y factores quimiotácticos desempeñan aquí un papel
especial. No es conocido un medicamento para combatir ni tampoco
para curar metástasis óseas basado en anticuerpos contra y
moléculas de unión a BSP. Tampoco es conocido que la BSP de células
tumorales es distinta de la BSP de células sanas normales.
Es objeto de la invención un medicamento
definido en la reivindicación 1 para la terapia de tumores y sus
metástasis, que colonizan preferiblemente tejidos óseos, que
comprende como principio activo al menos una molécula de unión que
se une a sialoproteína ósea o un fragmento de la misma en suero o
plasma. El principio activo es preferiblemente un anticuerpo o un
aptámero o Spiegelmer® (Noxxon, Berlín, Alemania) basado en ADN o
ARN y que se une en un sentido amplio a una molécula que corresponde
a una sialoproteína ósea modificada química o naturalmente en la
glucosilación. La molécula de unión puede ser un anticuerpo o
aptámero que se une específicamente a sialoproteína ósea de células
tumorales, o también a la estructura de unión del receptor de BSP
natural o de la molécula del factor H. La molécula de unión se une a
o puede prepararse contra sialoproteína ósea modificada en la
glucosilación a partir de material óseo cuyo donante no era capaz de
glucosilación normal de las proteínas óseas.
En una forma de realización especialmente
preferida, el medicamento contiene como principio activo un
anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos contra la sialoproteína
ósea humana (BSPh), en el que los anticuerpos se unen a epítopos
que están presentes en sialoproteína ósea humana de células
tumorales cuya glucosilación postraduccional está modificada o
incompleta en el intervalo de los aminoácidos 120 a 135 (SWISSPROT:
SIAL_HUMAN, Nº de acceso P21815, incl. secuencia señal), que
contiene los aminoácidos TGLAA, frente a sialoproteína ósea normal
de hueso. El medicamento según la invención puede contener como
principio activo también un anticuerpo y/o un aptámero producido
contra un epítopo de BSPh, que comprende la secuencia aminoacídica
TGLAA o YTGLAA y opcionalmente grupos de azúcar así como una
molécula portadora. El principio activo es preferiblemente un
anticuerpo IgY de gallina. El anticuerpo IgY de gallina puede ser
también un correspondiente anticuerpo humano o humanizado. Además,
se prefieren medicamentos en que la molécula de unión contenga como
anticuerpo biespecífico otro paratopo adicional que sea
preferiblemente específico del epítopo de CD3. El principio activo
puede ser también una inmunotoxina que sea un conjugado de molécula
de unión y un resto con actividad citotóxica. La inmunotoxina puede
ser por ejemplo un conjugado que contenga la cadena A de ricina o un
fragmento no de unión de la toxina de la difteria. La molécula de
unión puede estar acoplada además con un radionucleido, de modo que
el medicamento pueda utilizarse también para inmunoescintografía o
para la localización y observación de la progresión de metástasis
óseas.
El medicamento según la invención puede contener
adicionalmente al menos un anticuerpo, ligando o inhibidor del
grupo de moléculas de adhesión, proteasas asociadas a membrana,
receptores que median el quimiotactismo, receptores de quimiocina y
sustancias inductoras de la apoptosis. Los inhibidores pueden
elegirse de modo que bloqueen al menos parcialmente la BSP y
modulen su función. El medicamento según la invención es por tanto
especialmente adecuado en el campo de aplicación para el tratamiento
de tumores del grupo de tumores de próstata, mama, pulmón, riñón y
tiroides, enfermedades tumorales del sistema sanguíneo, del sistema
linfático, del sistema cardiocirculatorio, del sistema nervioso,
del tracto respiratorio, del tracto digestivo, del sistema
endocrino, de la piel incluyendo anejos, del aparato locomotor y
del tracto urogenital.
Se describen ahora otros rasgos y ventajas con
referencia a los ejemplos y las figuras adjuntas.
Se muestran:
Fig. 1 una transferencia Western con isoformas
específicas de tumor y de hueso de la BSP;
Fig. 2 una transferencia Western del
sobrenadante de cultivo celular de células EBNA-293
no transfectadas (controles negativos) y células
EBNA-293 transfectadas con los constructos de
expresión GST-EK-BSP e
his_{6}-myc-EK-BSP
usando un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-BSP;
Fig. 3 la secuencia aminoacídica de la BSP
secretada (SEQ ID N° 2) según Fisher y col. (1991);
Fig. 4a curva de los tamaños de lesión en
milímetros cuadrados de una metástasis ósea en la tibia de la rata
988 durante el periodo de observación y terapia;
Fig. 4b radiografía 31 días después de la
operación de la lesión en la tibia antes del inicio de la
terapia;
Fig. 4c radiografía 52 días después de la
operación de la lesión con lisis aún progresiva del hueso después
del inicio de la terapia;
Fig. 4d radiografía 73 días después de la
operación de la lesión regresiva;
Fig. 4e radiografía 126 días después de la
operación de la lesión curada;
Fig. 4f reconstrucción por TC de la lesión 31
días después de la operación;
Fig. 4g reconstrucción por TC de la lesión
regresiva 80 días después de la operación;
Fig. 5a curva de los tamaños de lesión en
milímetros cuadrados de una metástasis ósea en fémur distal de la
rata 987 durante el periodo de observación y terapia;
Fig. 5b radiografía 52 días después de la
operación de la lesión en fémur distal;
Fig. 5c radiografía 96 días después de la
operación de la lesión regresiva y la formación de callo.
Es por tanto objeto de la invención un
medicamento para la terapia de enfermedades tumorales que contiene
el principio activo definido en la reivindicación 1. En una forma de
realización, la molécula de unión es un anticuerpo o un aptámero
basado en ARN o ADN que reconoce la BSP en presencia de factor H.
Las moléculas de unión especialmente preferidas reconocen la BSP
especifica de células tumorales. El medicamento puede reforzarse
con las siguientes sustancias: anticuerpos, ligandos o inhibidores
que interaccionan con moléculas de adhesión, con proteasas
asociadas a membrana o con receptores que median el quimiotactismo
como, por ejemplo, los receptores de quimiocina, así como
sustancias inductoras de la apoptosis como preferiblemente
anticuerpos, aptámeros o proteínas/péptidos que se obtienen a
partir de peptidotecas naturales o artificiales. Una interacción
proteína(péptido) especifica, preferiblemente con moléculas
inespecíficas que se obtienen de extractos naturales, de proteínas
de unión preparadas sintéticas o recombinantes, así como de otras
peptidotecas-proteotecas, basta sin embargo para
causar el efecto de la apoptosis de células tumorales. Según el
correspondiente diagnóstico, puede emplearse una terapia
especifica. En este momento, se observa sorprendentemente en el
empleo de anticuerpos anti-BSP o proteínas de unión
un inicio acelerado de la muerte de las células tumorales
(apoptosis).
Son tumores así tratables particularmente del
grupo de tumores de mama, próstata, pulmón, riñón y tiroides, así
como enfermedades tumorales del sistema sanguíneo, del sistema
linfático, del sistema cardiocirculatorio, del sistema nervioso,
del tracto respiratorio, del tracto digestivo, del sistema
endocrino, de la piel incluyendo anejos, del aparato locomotor y
del tracto urogenital incluyendo riñones.
La administración de las proteínas de unión y
anticuerpos permite una nueva terapia de las enfermedades tumorales
basadas en el sistema de BSP y el reforzamiento por inclusión de
otros agrupamientos de proteoma asociados a superficies tumorales.
El medicamento se basa en el uso de anticuerpos, aptámeros, ligandos
o inhibidores específicos de BSP contra tumor primario o secundario
y metástasis dispersantes, es decir, para la supresión del
crecimiento canceroso, incluyendo la metastatización. El medicamento
según la invención se basa en la comprobación de que la BSP actúa
sobre células tumorales específicas de modo autocrino, paracrino y
endocrino mediante la configuración específica de enfermedad del
proteoma de células tumorales. Se controla en tumores primarios y
determinados secundarios su comportamiento de adhesión, migración y
proliferación. Mediante la detección diagnóstica de los factores
expresados y regulados elevados localmente así como la presencia de
BSP, resulta la posibilidad de suprimir decisivamente o impedir
completamente el crecimiento canceroso, incluyendo la
metastatización tumoral.
Una forma de realización adicional de la
invención se refiere al uso de los anticuerpos según la invención
en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores y
metástasis. Los anticuerpos según la invención así como sus
estructuras parciales o conjugados pueden aplicarse mediante
inyección o mediante supositorios y se unen a la BSP circulante
libre o unida a factor H en la sangre o fluido tisular y la
neutralizan. En caso de que existiera una función protectora no
documentada hasta ahora del complejo de factor H frente al modo
alternativo de activación por complemento, se desactiva éste y las
células tumorales se hacen atacables por el sistema inmunitario.
Además, se desactiva el efecto angiogénico de la BSP.
Para la unión al complejo de factor H y BSP, los
anticuerpos deben reconocer los epítopos de BSP que no estén
enmascarados por la pareja de unión. La preparación de dichos
anticuerpos no era posible hasta ahora. La invención pone a
disposición dichos anticuerpos porque los anticuerpos están
dirigidos contra una isoforma de la sialoproteína ósea (BSP)
plegada y se unen a epítopos que sólo se forman en una sialoproteína
ósea plegada de células tumorales cuyas glucosilaciones en el
intervalo de los aminoácidos 120 a 135 (con secuencia señal), que
comprende la secuencia aminoacídica TGLAA o YTGLAA, están
modificadas o incompletas o faltan frente a la sialoproteína ósea
normal de hueso. Normalmente, no pueden obtenerse anticuerpos
específicos contra estructuras de azúcar postraduccionales o
complejas de proteínas, debido a que dichas estructuras de azúcar se
unen de igual forma a muchas proteínas distintas.
Correspondientemente, los anticuerpos reaccionan contra determinadas
estructuras de azúcar con muchas proteínas distintas y se
consideran entonces generalmente como inespecíficos y sin valor. Al
contrario en la sialoproteína ósea de células tumorales. La
estructura de azúcar modificada o faltante causa otro plegamiento
de la sialoproteína ósea y crea nuevos epítopos en los que
participan tanto aminoácidos o estructuras peptídicas como los
múltiples restos de azúcar restantes. Estos epítopos son sin embargo
característicos de la BSP de células tumorales degeneradas.
Los anticuerpos contra estos epítopos pueden
producirse con una BSP modificada química o naturalmente en la
glucosilación como antígeno, y dado el caso mediante la purificación
o absorción de la isoforma de BSP ósea. Preferiblemente, se
preparan los anticuerpos usando BSP de células tumorales como
antígeno. Después de poder aislar difícilmente la BSP de células
tumorales en cantidades suficientes, la expresión por ingeniería
genética de la BSP modificada en la glucosilación en células
tumorales es el procedimiento de elección. Se ha encontrado también
que algunos pacientes contienen la BSP modificada en la
glucosilación en material óseo. Es decir, estos pacientes
mayoritariamente muy ancianos y aquejados de osteoporosis grave
producían una BSP que al menos en parte no estaba glucosilada
normalmente. También esta BSP es adecuada en principio para la
obtención de los anticuerpos según la invención. El aislamiento de
la isoforma parcialmente glucosilada que es igual a la isoforma
tumoral de la BSP, puede realizarse análogamente a procedimientos
descritos (Karmatschek M. y col., "Improved purification of human
bone sialoprotein and development of a homologous
radioimmunoassay", en Clin. Chem. 1997, 43(11),
2076-82).
Los anticuerpos pueden prepararse en ratón,
conejillos de Indias, conejos, perros, cabras, cerdos, seres
humanos, asnos o caballos, pero también en todos los mamíferos. Se
prefiere especialmente la inmunización de aves, particularmente
gallina, ya que pueden obtenerse con especial facilidad anticuerpos
contra la isoforma tumoral de BSP a causa de las grandes
diferencias en la historia evolutiva. Además, la presencia de
anticuerpos IgY no conduce a una activación del sistema de
complemento, lo que a causa de la posible unión entre factor H y
BSP puede ser problemático. Los anticuerpos según la invención
reconocen la isoforma tumoral de BSP en la unión con factor H.
Son por tanto objeto de la invención isoformas
de BSP, anticuerpos específicos contra las isoformas formadas en
tumores y su utilización para terapia de anticuerpos o también para
inmunoescintografía. Como efectos secundarios causados por
anticuerpos anti-BSP se tienen en cuenta: daños
directos e indirectos de hueso y dentina por la activación del
sistema inmunitario contra la matriz ósea y las células óseas y/o la
destrucción directa por el uso de conjugados de anticuerpos con
venenos celulares o radioisótopos. Además, es impensable una
inmunoescintografía con anticuerpos anti-BSP que se
unen a la matriz ósea. La matriz se marcaría radiactivamente y la
localización de los tumores sería imposible. Los anticuerpos
específicos de BSP tumoral son adecuados de modo especial para una
terapia y localización tumorales, ya que no se unen o sólo en poca
extensión a la matriz ósea o a las células productoras de BSP del
esqueleto y de la dentina.
En una aplicación especialmente preferida de la
invención, se utilizan anticuerpos para terapia tumoral que son
específicos de BSP tumoral y reconocen adicionalmente la BSP en
complejo con factor H. Dichos anticuerpos se suministran por la
invención. Tras la aplicación de dichos anticuerpos específicos en
pacientes de tumores, se marca en la sangre y el fluido tisular la
BSP tumoral presente libre y unida al factor H y por tanto se eleva
la protección contra la activación del complemento. Por tanto, se
marcan las células tumorales específicamente para destrucción por
el sistema inmunitario (por ejemplo, mediante activación clásica de
la cascada de complemento) y se evitan los efectos secundarios
como, por ejemplo, por activación del sistema inmunitario frente a
la matriz ósea o la dentina.
Para la terapia tumoral e inmunoescintografía
posibilitadas por la invención pueden usarse, por ejemplo,
anticuerpos policlonales que pueden prepararse mediante
inmunización de gallinas con BSP recombinante o de BSP modificada
en la glucosilación aislada en hueso. Los anticuerpos se aíslan
entonces de modo conocido de la yema del huevo y se purifican
mediante cromatografía de afinidad.
En otra aplicación de la invención, se aíslan
anticuerpos policlonales humanos anti-BSP del huevo
de gallinas transgénicas con el sistema inmunitario humanizado.
Son igualmente adecuados anticuerpos
monoclonales de ratón o de gallina que satisfagan las condiciones
anteriormente descritas y puedan obtenerse mediante una selección.
En una aplicación especial de la patente, se usan para ello las
líneas celulares monoclonales descritas en los ejemplos. Además, son
adecuados fragmentos de anticuerpos como, por ejemplo, fragmentos
Fab proteolíticos u obtenidos por ingeniería genética.
Para terapia tumoral, son adecuados además los
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anteriormente descritos en
conjugación con venenos celulares y radioisótopos para la
destrucción directa de células tumorales después de la unión de BSP
a la superficie celular.
Son especialmente adecuados anticuerpos
policlonales y monoclonales humanizados que reconocen la BSP en
complejo con factor H y no se unen a BSP en la matriz ósea. En el
uso de anticuerpos de ratón y de gallina, ha de esperarse
ciertamente un efecto terapéutico especial por la formación de
anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) o
anti-gallina (HACA). Los HAMA y HACA pueden inducir
y reforzar una respuesta inmunitaria del organismo sobre el antígeno
tumoral. En la determinación de los marcadores tumorales, se
generan sin embargo interferencias con los HAMA y HACA que
perturban el procedimiento de medida in vitro. De este modo,
aparecen altos valores de medida falsos para los marcadores
tumorales. Esto sucede después de inmunoescintografía o
inmunoterapia con los correspondientes anticuerpos, de modo que
puede realizarse una determinación correcta de los marcadores
tumorales sólo después de la absorción de los HAMA o HACA in
vitro.
Estos efectos pueden desactivarse mediante el
uso de anticuerpos humanizados. Los anticuerpos policlonales
humanizados anti-BSP pueden obtenerse, por ejemplo,
mediante inmunización de gallinas transgénicas con BSP en las que
se ha intercambiado en las células madre embrionarias la zona del
gen de la parte Fe de la inmunoglobulina (IgY) específica de
gallina por una específica humana (documentos US 5.340.740; US
5.656.479). Los anticuerpos humanizados se depositan entonces en
los huevos de gallina y pueden aislarse de la yema de huevo
(Mohammed S. M. y col., "Deposition of genetically engineered
human antibodies into the egg yolk of hens".
Immunotechnology, 1998, 4: 115-125).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
humanizados, pueden obtenerse células de hibridoma de ratón o de
gallina con anticuerpos anti-BSP adecuados según
procedimientos estándar y desarrollarse anticuerpos humanizados a
partir de material genético contenido en estas células mediante
recombinación (documentos US 5.585.089; US 5.565.332; US 5.225.539;
US 5.693.761; US 5.585.089; US 5.530.101).
La BSP puede utilizarse con la secuencia
completa SEQ ID Nº 1 y la secuencia parcial ID Nº 2 en su totalidad
o con sus epítopos específicos para generar anticuerpos.
Son fragmentos de BSP preferidos para la
preparación de anticuerpos específicos:
en las que la T marcada no está
glucosilada o lo está incompletamente o en otra forma y X y Z
representan un resto aminoacídico o peptídico de hasta 30
aminoácidos. En la SEQ ID Nº 2, pueden presentarse las siguientes
variaciones: en la posición 179 Gly \rightarrow Val; en la
posición 252 Val \rightarrow Ala; en la posición 254 Glu
\rightarrow Asp; en la posición 279
Asp \rightarrow Gly.
Asp \rightarrow Gly.
Para la preparación de anticuerpos, se acoplan
los péptidos que normalmente son no inmunogénicos a la proteína
portadora KLH (hemocianina de lapa bocallave). Este acoplamiento
puede realizarse mediante NBS (éster
N-hidroxisuccinimida de
N-maleimidobenzoilo) por una cisteína añadida
terminal al péptido o directamente mediante carbodiimida.
\newpage
Los anticuerpos se obtienen con procedimientos
convencionales mediante inmunización preferiblemente de gallinas,
conejos, ratones, conejillos de Indias, etc. Pueden utilizarse
también procedimientos de biología molecular como la preparación
recombinante de los anticuerpos. Los anticuerpos se coprocesan
entonces para purificación y galénicamente. Pueden utilizarse
también preparaciones celulares, extractos celulares así como
particularmente aislamientos de membrana de células que expresan
BSP transfectadas artificialmente de forma sobreexpresada para la
generación de anticuerpos específicos.
Los medicamentos según la invención pueden
administrarse en formas de aplicación galénicas adecuadas,
particularmente en forma liofilizada, incorporada con manita o
azúcares similares a ampollas estériles para disolución en
disolución de sal común fisiológica y/o disolución de infusión para
inyección individual repetida y/o infusión continua en cantidades
de 300 mg a 30 mg de anticuerpo puro o ligandos de BSP por unidad
terapéutica. Preferiblemente, se administra el medicamento según la
invención en una forma de aplicación galénica en la que el
medicamento se utiliza en microesferas biocompatibles y por vía
sistémica o local mediante aerosol, aplicación intravenosa o
subcutánea.
Es comprobable con distintos procedimientos
rutinarios que las células tumorales reaccionan de forma
antiapoptótica, adhesiva, mitótica y quimiotáctica con la toma de
agonistas que se unen a las correspondientes moléculas de proteoma.
Se causa la inhibición de su obtención, adhesión, mitosis o
migración mediante incubación previa con antagonistas o
anticuerpos.
Con el uso de anticuerpos altamente purificados
contra BSP en cultivos celulares de lineas celulares tumorales que
expresan BSP, pudo comprobarse que éstos son capaces en modelos
in vitro de causar la apoptosis de células tumorales. Si se
cultivan líneas celulares o células tumorales extraídas con el uso
de procedimientos de cultivo celular habituales, se reduce en gran
medida su tiempo supervivencia in vitro por la adición de
anticuerpos de BSP cuando se había detectado BSP en sus
correspondientes superficies celulares. A este respecto, se observa
la apoptosis de un gran número de estas células cultivadas. También
en modelos in vivo, puede comprobarse sorprendentemente una
reducción de las células tumorales por apoptosis.
Además, en ensayos en cultivo celular de células
tumorales que expresan BSP, el empleo de anticuerpos específicos de
BSP puede inducir la lisis celular mediada por complemento así como
la lisis tumoral mediada por célula.
Ya que los ratones desnudos o ratas desnudas
poseen un sistema inmunitario deficiente, puede investigarse el
comportamiento de metastatización en un cuerpo hospedador en un
modelo de ratón/rata desnudo sin que tenga lugar la conocida
reacción inmunitaria entre especies ni se realice un rechazo de las
células extrañas. Se inocularon los ratones desnudos de modo
conocido con células tumorales o líneas celulares tumorales cuya
expresión de BSP se había determinado y se ensayó la
metastatización por estas células en el tratamiento con anticuerpos
de BSP y en el tratamiento con ligados de BSP. A este respecto,
resulta sorprendentemente que en los tumores positivos de BSP
encontrados se inhibe o impide claramente la formación de
metástasis, porque la toma de anticuerpos conduce a una modulación
del crecimiento tumoral. Sorprendentemente, resulta igualmente que
los preparados analizados mediante inmunohistoquímica muestran una
distribución específica de BSP y otros agrupamientos de proteoma
asociados a la superficie tumoral en tumor y tejidos circundantes de
tumor. Por tanto, se identifican otras posibilidades de
intervención selectiva.
Resulta la ampliación de la preparación
terapéutica, particularmente emplear aditivamente antagonistas
dirigidos contra otros agrupamientos del proteoma de superficie de
célula tumoral. Puede conseguirse un reforzamiento de este efecto
especialmente mediante la combinación de anticuerpos de BSP con
anticuerpos, ligandos o inhibidores que interaccionen con (i)
moléculas de adhesión, (2) proteasas asociadas a membrana o (3)
receptores que medien el quimotactismo como, por ejemplo,
receptores de quimiocina, así como (4) sustancias inductoras de la
apoptosis como, preferiblemente, anticuerpos o proteínas/péptidos
que puedan obtenerse a partir de peptidotecas naturales o
artificiales.
Para confirmar estos hallazgos, pueden
transfectarse también establemente líneas de células tumorales con
BSP. Después de la inyección de estas células (en las que BSP está
sobreexpresada) en animales, colonizan dichas células tumorales
preferiblemente la matriz ósea. Dichas células modificadas forman
por tanto particularmente metástasis en tejido óseo mediante las
cuales el principio terapéutico es igualmente detectable.
La invención se ilustra con detalle a
continuación mediante los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se separaron los sobrenadantes exentos de suero
de líneas celulares de osteosarcoma humano UMR-108,
MHH-ES1 y de la línea celular de cáncer de mama
MCF-7 (positiva de receptor de estrógeno) así como
BSP humana purificada a partir de hueso (K-BSP)
mediante PAGE-SDS sobre gel al 10% en condiciones
reductoras y desnaturalizantes y se transfirieron
electroforáticamente a nitrocelulosa. Se incubó la membrana con
anticuerpo monoclonal de ratón. Se realizó la detección de la BSP
mediante un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado
con peroxidasa y detección de quimioluminiscencia en una película
de rayos X. Se representa el resultado en la Fig 1. Se dan los
pesos moleculares y recorridos de los marcadores en el lado
izquierdo. Las puntas de flecha individuales y dobles muestran el
distinto comportamiento de migración de la BSP ósea/de osteosarcoma
y la MCF-7-BSP. Esta última
contiene adicionalmente una banda de alto peso molecular (triple
punta de flecha) que en las otras trazas está ausente. La BSP de
una línea celular tumoral presenta por tanto un peso molecular
claramente mayor que la BSP ósea y de líneas celulares de
osteosarcoma, observándose además una segunda isoforma de peso
molecular aún mayor.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron gallinas y conejos con BSP que se
había aislado de pacientes según el procedimiento descrito por
Karmatschek y col. (1997).
Se aislaron de las yemas de huevo y los sueros
inmunoglobulinas policlonales y en un procedimiento ELISA se ensayó
la unión de BSP frente a distintas estructuras parciales peptídicas.
La Tabla 1 muestra los resultados de esta cartografía epitópica. A
este respecto, se sintetizaron químicamente estructuras parciales
peptídicas a partir de la secuencia peptídica de preproBSP
(incluyendo secuencias líder) de 317 aminoácidos de largo en total,
se unieron a una placa de microvaloración y se incubaron los
anticuerpos sobre la placa. Se realizó el ensayo de unión después
de incubación con un conjugado de peroxidasa con inmunoglobulinas
anti-IgY o anti-IgG de conejo y
posterior reacción enzimática con reacción de un cromógeno como
sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que los anticuerpos de
gallina obtenidos se unen preferiblemente a la secuencia
C-terminal de BSP, mientras que los anticuerpos de
conejo se unen por un amplio intervalo.
Además, se obtuvieron anticuerpos policlonales
(A0001) mediante inmunización de conejos con la estructura parcial
peptídica TyrThrGlyLeuAlaAlalleGlnLeuProLysLysAlaGlyAsp (posición
124-138) de BSP que reaccionan preferiblemente con
esta estructura parcial peptídica, pero también específicamente con
BSP ósea humana.
Sin embargo, los anticuerpos policlonales
(AK_tBSP) que se obtuvieron mediante inmunización de conejos con
las estructuras parciales peptídicas ThrGlyLeuAlaAla (posición
125-130), por ejemplo TyrThrGlyLeuAlaAla (posición
124 a 130), es decir, después de acoplamiento con tireoglobulina
bovina como portador, reaccionaban ciertamente con la estructura
parcial peptídica sintética, pero no con la BSP ósea humana. Estos
anticuerpos reconocen sorprendentemente exclusivamente BSP de
células tumorales.
Para los ensayos, se usaron además los
anticuerpos policlonales A002 (obtenido de L. W. Fisher) y A003
(obtenido del Dr. van Ryden). Estos anticuerpos se obtuvieron
después de inmunización con las estructuras parciales peptídicas
TyrGluSerGluAsnGlyGluProArgGlyAspAsnTyrArgAlaTyrGluAsp (A002)
o LeuLysArgPheProValGlnGlyGly. El primer péptido procede del
extremo C de BSP (posición 278-295) y contiene la
secuencia de reconocimiento RGD (ArgGlyAsp) de BSP para
receptores de tipo integrina. El último péptido procede del extremo
N de la estructura primaria de BSP. También estos péptidos
reconocieron preferiblemente las estructuras parciales respectivas
y reaccionaron específicamente con BSP ósea humana.
Se amplificó a partir del plásmido
B6-5g (Fisher L. W. y col., "Human bone
sialoprotein. Deduced protein sequence and chromosomal
localisation", en J. Biol. Chem., 1990, 265(4),
2347-51) el ADNc completo de BSP humana (sin
péptido señal) mediante PCR y se clonó en el vector de expresión
eucariótico episómico pCEP-Pu (Kohfeldt E y col.,
"Properties of the extracellular calcium binding module of the
proteoglycan testican", en FEBS Lett. 1997, 414(3),
557-61). Los cebadores fueron los siguientes:
Nhe I BSP (codificante)
5'-GCCCGCTAGCCTTCTCAATGAAAAATTTGCATCG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Not I BSP (no codificante):
5'-CAATGACTGCGGCCGCTCACTGGTGGTGGTAGTAATTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Los sitios de corte Nhe I y Not I insertados con
los cebadores eran necesarios para la clonación en el vector de
expresión PCEP-PU. Este vector está equipado además
en el extremo 5' del sitio de clonación múltiple con distintos
marcadores para facilitar la purificación de proteína (por ejemplo,
His, Myc, G8T). Estos marcadores pueden escindirse después de la
purificación de la proteína con una proteasa (por ejemplo, factor X
o enterocinasa). Se comprobó el cumplimiento del marco de lectura
correcto mediante secuenciación.
Se insertaron los constructos de expresión
mediante transfección estable mediada por liposomas
(FUGENE^{TM}-reactivo de transfección de la
compañía Roche) entre otras en las siguientes líneas celulares
humanas:
\bullet la línea celular renal embrionaria
EBNA-293,
\bullet las líneas celulares de osteosarcoma
SAOS-2 y MG-63
\bullet la línea celular de cáncer de mama
humana MCF-7.
Se obtuvo la expresión recombinante sólo en
células MCF-7 y EBNA-293 (véase la
figura 2). Las líneas celulares de osteosarcoma no se expresan
tampoco después de ensayos de transfección repetidos.
Se cultivaron células transitorias durante 48
horas después de transfección de dos días en medio exento de suero.
Puesto que las proteínas en FCS no dificultaban la purificación de
la BSP recombinante, se cultivaron células que expresaban BSP
después de alcanzar la confluencia en condiciones exentas de suero.
En estas condiciones, sólo pudieron sobrevivir las células
EBNA-293 más de 2 a 4 horas. Se controló la
expresión de la BSP recombinante mediante PAGE-SDS e
inmunotransferencia.
El análisis de sobrenadantes de cultivo celular
exentos de suero resultó con todas estas líneas celulares en señales
positivas en transferencia Western tanto con respecto a la BSP como
a la presencia de los distintos marcadores.
Se purificaron 2,5 l de sobrenadante de cultivo
exento de suero de la línea celular MCF-7
transfectada por una columna de Sepharose^{TM} y se obtuvieron de
ella 250 \mug de
His-myc-EK-BSP
homogénea. El producto de expresión así purificado estaba
parcialmente glucosilado, pero no poseía glucosilación en la
treonina 125, es decir, la treonina en la secuencia de BSP
YT^{125}LPAA.
Para el análisis de azúcares, se separaron los
N-glucanos de la BSP recombinante (BSPr) o de la BSP
ósea enzimáticamente con el péptido N-glucosidasa F
(PNGasa F, Roche). La enzima causa una escisión catalítica de todos
los tipos de N-glucano de las asparaginas. Para la
digestión, se precipitaron 20 a 200 \mug de BSP con etanol y se
incubó el residuo de precipitación en SDS al 1%,
\beta-mercaptoetanol, EDTA 0,1 M durante 30
minutos a temperatura ambiente con un exceso de enzima. Siguió una
digestión con N-glucosidasa F durante una noche a
37ºC. Para el desalado de la disolución de
N-glucano, se circuló la digestión por una columna
de carbono de 150 mg (Carbograph SPE, Alltech) y se eluyó el
N-glucano con ACN al 25% en 0,05% de TFA.
Se escindió el O-glucano de la
BSP mediante hidrazinólisis anhidra con un kit (Oglycan release kit,
Glyco). Para ello, se liofilizaron aproximadamente 200 \mug de BSP
exenta de sal durante 24 horas, se mezclaron con atmósfera de gas
protector de argón con 50 \mul de reactivo de hidrazina, se
disolvieron y se incubaron durante 5 horas a 60ºC. Se retiró la
hidrazina a vacío. Siguió una
re-N-acetilación de los grupos
N-acetilo con anhídrido acético.
Se marcaron los N- y O-glucanos
con el colorante fluorescente 2-aminobenzamida
(Fluka) y se digirieron los oligosacáridos marcados con
2-AB secuencialmente con glucosidasas terminales
específicas y se analizaron mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF.
La secuencia aminoacídica de BSP humana contiene
cuatro sitios de N-glucosilación potenciales en las
posiciones 88 (NTT), 161 (NGT), 166 (NST) y 174 (NGS). Para la
O-glucosilación, no es conocida ninguna secuencia
consenso comparable. Todas las estructuras de
N-glucano identificadas se encontraban tanto en la
BSP aislada de hueso como en la BSP recombinante de
EBNA-293. Sin embargo, había diferencias en la
proporción porcentual de las estructuras respectivas en los
N-glucanos totales. Así, la proporción principal de
BSP-N-glucanos en hueso consistía en
estructuras trirramificadas (58%) y en la línea celular EBNA en
estructuras tetrarramificadas (48%).
Para la localización de los sitios de
O-glucosilación de la BSP recombinante, se
eliminaron los O-glucanos mediante digestión
secuencial de la proteína con neuraminidasa,
\beta-galactosidasa y
\beta-N-acetilhexosaminidasa
hasta el núcleo de GalNAc. Se escindió entonces en fragmentos
peptídicos la proteína parcialmente desglucosilada mediante
tratamiento con tripsina y proteasa V8. Mediante espectrometría de
masas MALDI-TOF, se determinaron las masas de los
péptidos y se secuenció una parte de los péptidos mediante
espectrometría de masas
PSD-MALDI-TOF. Con este
procedimiento, pudieron determinarse ocho sitios de
O-glucosilación de la BSP recombinante, 5 en el
péptido 211-229 (TTTSP... QVYR) y como máximo 3 en
el péptido entre los aa 120 y aa 135 con la secuencia TGLAA. Por
ello, las treoninas están glucosiladas en la secuencia DATPGTG de la
BSP recombinante. En la BSP ósea, se realiza una tercera
O-glucosilación. En la BSP recombinante, no está
presente un tercer sitio de glucosilación. Presuntamente, este sitio
de glucosilación se encuentra en la estructura parcial
TGLAA-BSP.
Para la purificación cié grandes cantidades de
anti-BSP-IgY para terapia e
inmunoescintografía, se describen distintos procedimientos. Se
prefiere emplear el procedimiento de Akita y Nakal (Akita E.M. y
col., "Comparison of four purification methods for the production
of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an
enterotoxigenic E. coli strain", en J. Immunol.
Methods. 1993, 160 (2), 207-14).
Para la producción de huevos, se usa una raza de
alto rendimiento como "Lohmann blancas" o "Lohmann
marrones" con un rendimiento de 4,5 huevos por semana y una
producción de más de 10 mg de IgY específica por yema. La
inmunización se realiza con antígeno de BSP aislada de hueso humano
o recombinante en coadyuvante de Freund, aplicándose inyecciones de
recuerdo cada 6 semanas después de una inmunización básica con
aprox. 0,1 mg de BSP. Aproximadamente un 30% de estas gallinas
normalmente no reaccionan a la inmunización. Se desinfectan
externamente los huevos con ácido peracético, se cascan entonces y
se separan las yemas de las claras. Se baten entonces las yemas con
5 a 10 volúmenes de agua destilada enfriada con hielo a entre pH 5 y
5,2 y se incuban a 2 a 5ºC durante 2 a 6 h. Sedimentan así los
gránulos de yema, que están compuestos esencialmente por
lipoproteínas. Se filtra entonces por papel de filtro para aclarar
el sobrenadante acuoso (por ejemplo, Whatman Nº 1).
A partir de este sobrenadante, pueden
purificarse homogéneamente los
anti-BSP-IgY directamente mediante
cromatografía de afinidad. Se une por enlace químico covalente a una
columna de Sepharose-4B activada con bromuro de
cianógeno BSP aislada de hueso humano o de sobrenadantes de cultivo
de líneas celulares humanas recombinantes. Para la unión de 1 g de
IgY, es necesario 0,5 g de BSP inmovilizada (unida covalentemente a
aprox. 5 ml de Sepharose^{TM}).
\newpage
La IgY unida se eluye con un gradiente ácido y
después se neutraliza la disolución. Esta disolución debe entonces
desalarse y concentrarse los anticuerpos, lo que es posible en gran
medida con un procedimiento de flujo cruzado (por ejemplo,
Amicon^{TM} Spiralfilter SY100 con una exclusión de 100.000
Da).
La baja reacción de los anticuerpos policlonales
de gallina con BSP en la matriz ósea puede superarse mediante la
selección de aquel anticuerpo que reaccione con BSP en el complejo
con factor H. Así, se une por enlace químico covalente el factor H
o la BSP aislada de hueso o preparada por ingeniería genética a
Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno y después, por mucho
BSP o factor H aplicados o unidos a la columna, todos los ligandos
en la matriz están complejados con la pareja. Se aplica entonces
extracto de yema filtrado sobre esta columna de afinidad y se
obtiene como en el ejemplo 4 sólo aquella fracción de anticuerpo que
se une específicamente al epítopo libre del complejo
BSP-factor H.
Los anti-BSP-IgY
presentan algunas dificultades en terapia o diagnóstico humano. Así,
han de esperarse efectos secundarios como reacciones contra
proteínas extrañas y la semivida biológica asciende en comparación
con los anticuerpos humanos sólo a 12 a 24 horas. La IgY no activa
tampoco el sistema de complemento.
Los anticuerpos humanos contra BSP pueden
prepararse en gallinas transgénicas especiales en las que se ha
intercambiado mediante modificación genética dirigida la región
constante de inmunoglobulina aviar en los genes responsables de la
formación de anticuerpos por la región constante de inmunoglobulina
humana. Se describen células de gallina y sistemas de vector
adecuados en las patentes de EE.UU. nº 5.340.740, nº 5.656.479 y nº
5.464.764. Después de inmunización con BSP, dichas gallinas
reaccionan con la producción de anticuerpos humanos en el huevo.
Se extrajeron las líneas celulares tumorales
MDA-MB-231 (línea celular de cáncer
de mama, negativa de receptor de estrógeno), MCF-7
(línea de cáncer de mama, positiva de receptor de estrógeno) y
T-47-D (línea de cáncer de mama,
positiva de receptor de estrógeno) con tampón de inmunoprecipitación
y se precipitó la BSP con la mezcla de anticuerpos policlonales
A0001 de conejo contra BSP humana. Se aplicaron los precipitados
después de desnaturalización sobre geles de SDS, se llevó a cabo la
electroforesis y se transfirieron las proteínas a membranas de
nitrocelulosa. Después, se realizó una inmunotinción con el
antisuero de conejo anti-BSP A0001 y un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-BSP (BSP 1.2), usándose
como segundo anticuerpo conjugados de peroxidasa de anticuerpos de
cabra contra IgG de conejo y contra IgG de ratón. En ambas
transferencias A y B, era claramente reconocible la banda de BSP
inmunoprecipitada a 70.000 Da.
Para mostrar la presencia o ausencia de BSP en
la superficie celular de células tumorales, se biotinilaron las
superficies celulares de las líneas de cáncer de mama
MDA-MB-231 y MCF-7,
se extrajeron con tampón de inmunoprecipitación y precipitó la BSP
con la mezcla de anticuerpos policlonales A0001 de conejo contra BSP
humana. Se aplicaron los precipitados después de desnaturalización
sobre geles de SDS, se llevó a cabo la electroforesis y se
transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. Se
detectaron entonces las proteínas biotiniladas sobre esta membrana
con un conjugado de peroxidasa y estreptavidina con el sistema ECL
(Amersham).
Se marcaron por inmunofluorescencia células de
cáncer de mama humanas de las líneas
T-47-D y
MDA-MB-231 con y sin
permeabilización previa con un anticuerpo de conejo
anti-BSP de cerdo y un anticuerpo de cabra
anti-conejo conjugado con fluoresceína. La BSP
marcada fluorescentemente es reconocible en ambas líneas celulares
después de la permeabilización. Sólo en las células
T-47-D podía detectarse BSP mediante
inmunofluorescencia también sin permeabilización.
Se aisló ARNm de las líneas celulares tumorales
MDA-MB-231 (línea celular de cáncer
de mama, negativa de receptor de estrógeno), MCF-7
(línea celular de cáncer de mama, positiva de receptor de estrógeno)
y T-47-D (línea celular de cáncer
de mama, positiva de receptor de estrógeno) y fibroblastos humanos
(HGF) como células de control, se preparó el ADN complementario
mediante transcriptasa inversa y se amplificó el ADNc de BSP
mediante PCR con cebadores específicos de BSP. La expresión de ARNm
de BSP era especialmente alta en la línea celular de cáncer de mama
MCF-7, baja en las células
MDA-MB-231 y
T-47-D y no detectable en la linea
celular de control.
El anticuerpo monoclonal BSP1.2 puede utilizarse
debido a su unión especifica a BSP tumoral para la terapia de
tumores primarios y metástasis. A este respecto, el anticuerpo se
une a BSP en la superficie celular de determinadas células
tumorales y estimula el sistema inmunitario para la destrucción de
estas células, por ejemplo, mediante la activación de la cascada de
complemento. Igualmente, pueden utilizarse también los IgY
anti-BSP policlonales o monoclonales para terapia.
Con el empleo de estos anticuerpos, el sistema inmunitario humano
reacciona con la formación de anticuerpos endógenos humanos
anti-IgG de ratón (HAMA) o anticuerpos
anti-IgY de gallina (HACA). Los HAMA y HACA pueden
inducir y reforzar una respuesta inmunitaria del organismo ante el
antígeno tumoral. En la determinación de los marcadores tumorales,
se generan sin embargo interferencias con los HAMA y HACA que
alteran los procedimientos de medida in vitro. De este modo,
aparecen altos valores de medida falsos para marcadores
tumorales.
Por tanto, son especialmente adecuados para la
terapia e inmunoescintografía los anticuerpos monoclonales
humanizados. Se describen muchos procedimientos de cómo se derivan
los correspondientes anticuerpos humanizados a partir de líneas
celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales
anti-BSP.
En una aplicación adicional de la invención,
pueden unirse por enlace químico covalente venenos celulares y
radioisótopos con anticuerpos anti-BSP o sus
fragmentos Fab. Con radioisótopos como yodo 125 o yodo 131, los
anticuerpos marcados son adecuados en la aplicación de bajas
cantidades para la localización tumoral mediante
inmunoescintografía y en la aplicación de grandes cantidades para la
destrucción directa de los tumores. Dichos conjugados químicos
pueden prepararse, por ejemplo, mediante yodación de anticuerpos con
yodo 125 ó 131 (Garvey, J.S. y col., "Methods in Immunology".
3ª ed., W. A. Benjamin Publ., 1977, 171-182). Se
encuentra una visión general sobre los procedimientos adecuados
para radioinmunoterapia e inmunoescintografía en Vuillez,
"Radioimmunotargeting: diagnosis and therapeutic use", en
Bull. Cáncer. 2000, 87(11),
813-27.
Se comprobó en primer lugar en material de
biopsia si la BSP se expresa sobre la superficie de células
tumorales. Los pacientes en que es detectable BSP sobre la
superficie de células tumorales se tienen en cuenta para terapia
con anticuerpos anti-BSP de gallina, de ratón, los
correspondientes anticuerpos humanizados y con conjugados de estos
anticuerpos con venenos celulares o radioisótopos.
El tratamiento de tumores con anticuerpos
terapéuticos que están dirigidos contra marcadores tumorales
expresados sobre superficies celulares es estado de la técnica.
Así, puede someterse exitosamente a terapia con el anticuerpo
humanizado herceptina contra el receptor del factor de crecimiento
epitelial humano incluso cáncer de mama en forma metastatizada en
aproximadamente un 25% de los afectados. (Hotaling TE y col., "The
humanized anti-HER2 antibody rhuMAb HER2 mediates
antibody dependent cell-mediated cytotoxicity vía
FcgR III" [resumen]. Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer.
Res. 1996; 37: 47; Pegram MD y col., "Antibody dependent cell-
mediated cytotoxicity in breast cáncer patients in Phase III
clinical triáis of a humanized anti-HER2
antibody" [resumen] Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 1997; 38:
602.
Igualmente que con la herceptina, el
correspondiente anticuerpo anti-BSP puede aplicarse
en forma de infusión, por ejemplo de infusión de 90 minutos, en la
primera aplicación y después en forma de infusión de 30 minutos. La
frecuencia de las infusiones y la cantidad de anticuerpos se ajusta
según la vida media del anticuerpo en la sangre (aprox. 6 días en
un anticuerpo humanizado y menos de 24 horas en un anticuerpo de
gallina) y el peso corporal.
Se comprobó con los procedimientos anteriormente
descritos que las células tumorales de pacientes expresan BSP que
no puede detectarse sobre la superficie celular. En estos tumores,
puede suponerse que las células suministran BSP a la sangre o
fluidos tisulares y, por ejemplo, sirve para la unión de factor H
para inactivar la ruta alternativa de la cascada de complemento o
para la emigración a tejidos óseos. Son un posible indicador
adicional para este tipo tumoral las concentraciones elevadas de BSP
en suero sanguíneo (> 20 ng/ml de suero). En estos casos, los
anticuerpos anti-BSP pueden utilizarse para
neutralizar la BSP tumoral libre o complejada con factor H. La
dosis puede determinarse a este respecto por la cantidad presente de
BSP libre en suero y en fluido tisular. Para la terapia, se tienen
en cuenta anticuerpos anti-BSP de gallina, de ratón
y anticuerpos anti-BSP humanizados que pueden
reconocer el epítopo de BSP libre en complejo con factor H. También
se tienen en cuenta los fragmentos Fab de estos anticuerpos, que
pueden prepararse según un procedimiento estándar mediante
digestión proteolítica (Garvey, J.S. y col., "Methods in
Immunology". 3ª ed., W. A. Benjamín Publ., 1977,
256-266). También se tienen en cuenta para dicha
terapia fragmentos Fab preparados por ingeniería genética derivados
a partir de los anticuerpos anti-BSP anteriores.
La invención procura por tanto anticuerpos
contra la sialoproteína ósea humana (BSPh) que se unen
específicamente sólo a epítopos de BSPh de células tumorales, porque
la BSPh tumoral no contiene O-glucosilación
postraduccional en el intervalo de los aminoácidos 120 a 135
(SWISSPROT: SIAL_HUMAN. N° de acceso P21815, sin secuencia señal),
que contiene los aminoácidos TGLAA. Al contrario la BSPh normal de
hueso. Los anticuerpos pueden reconocer BSPh sérica tumorigénica en
complejo con el factor H de complemento y formar por tanto un
instrumento de diagnóstico y terapéutico valioso.
Para la preparación de anticuerpos específicos
contra las proteínas citadas, se ha mostrado sorprendentemente que,
además del uso de moléculas completas, también son adecuadas
secuencias aminoacídicas específicas de epítopos especialmente para
la inmunización, cuando los péptidos sintéticos se acoplan con
moléculas portadoras según los procedimientos habituales y se
inyectan en ratones. Además, son adecuados también múltiples
péptidos antigénicos (véase anteriormente las secuencias) que se
unen mediante lisina a moléculas grandes, o líneas celulares
transfectadas con BSP, para preparar estos anticuerpos. Se ha
probado como otro procedimiento sorprendentemente bueno el uso de
inmunógenos de células transfectadas establemente que expresan BSP,
en el que se usaban aislamientos de membrana, extractos celulares
con receptores completos o fragmentados o también preparados
completos liofilizados.
Se utilizaron ratones (de tipo NZW X NZB) para
la preparación de anticuerpos monoclonales, lo que se realizó con
los procedimientos rutinarios de Immundiagnostik AG e IPF
PharmaCeuticals GmbH. Los anticuerpos examinados mediante
transferencia Western y ELISA pueden utilizarse después de alta
purificación para los fines de diagnóstico y terapéuticos
citados.
Los análisis de expresión en distintas lineas
celulares han mostrado, entre otros, que las líneas celulares de
tumor de próstata, así como las líneas celulares de tumor de mama,
expresan BSP. Se llevó a cabo este análisis de expresión a nivel de
ARNm mediante PCR-TI y a nivel de proteína mediante
transferencia Western y análisis FACS. Un tratamiento de estas
líneas celulares tumorales que expresan BSP con anticuerpos
específicos de BSP ha conducido en células cultivadas a la muerte
celular programada, lo que pudo detectarse entre otros mediante
citometría de flujo.
Después de la aplicación de líneas celulares
tumorales que expresan BSP en ratones/ratas desnudos
inmunodeficientes, se llega regularmente a una metastatización
ósea. Con la toma simultánea del anticuerpo específico de BSP, se
llegó sorprendentemente a una clara reducción de la formación de
metástasis óseas manifiestas, lo que pudo documentarse mediante
análisis histológico de los tejidos.
Este modelo animal comprendía la inyección de
células de cáncer de mama y la posterior terapia de las lesiones
líticas generadas con los anticuerpos anti-BSP, que
representan una mezcla de anticuerpos policlonales IgY de gallina
con especificidad predominante por BSP humana de células tumorales,
que además se unen cuantitativamente a BSPh en suero humano en
presencia de factor H y que se unen predominantemente a un epítopo
en el intervalo de aminoácidos 120 a 135 de la BSPh, modificándose
la glucosilación postraduccional en este intervalo en BSPh de las
células tumorales frente a la BSP natural de hueso.
Se inyectaron células MDA-MB 231
(ATCC, HTB-26) que se aplicaron por vía
intracardiaca en un estudio precedente a ratones desnudos (T. A.
Guise, 1997; "PTH-rP and Bone Metastases";
American Cáncer Society). Se obtuvo la línea celular a partir de un
adenocarcinoma humano metastatizado, no posee además receptores de
estrógeno. En este caso, estaba marcada con proteína fluorescente
verde (GFP), lo que facilitaba el descubrimiento de las células en
preparado histológico. Como animales de ensayo, se usaron ratas
desnudas de 6 a 8 semanas de edad (RNU, Charles River Breeding,
Sulzfeld, Alemania) a las que se había reducido su
inmunocompetencia, de modo que las células humanas inyectadas no se
reconocieran como tal y se combatieran. Los análisis previos con
distintos recuentos celulares en hombres y mujeres dieron como
resultado que las metástasis fueran visibles en ratas masculinas
después de la inyección de 10^{5} células MDA-MB
231 después de aproximadamente 1 mes en forma de lesiones
líticas.
\newpage
Se inyectaron las células (1 x 10^{5} en
tampón PBS) por vía intraarterial en la A. femoralis (0,2
ml; n=8). Para ello, se canuló una rama lateral de este vaso y
después de la inyección se ligó para impedir la salida de las
células incorporadas. El animal compensa sin problemas la pérdida
del vaso mediante formación colateral. Las células cancerosas
llegan entonces con la sangre a las ramificaciones finas de las
ramas alimentadas de fémur, tibia y peroné. Tiene lugar aquí en los
vasos terminales extravasación y la consiguiente adhesión de
células a la matriz ósea. Probablemente, se realiza aquí también la
interacción con BSP.
La vigilancia posterior del crecimiento de
metástasis se realizó durante 10 días con radiografías de rayos X
anteroposteriores y posteroanteriores convencionales con anestesia
con éter del animal. Se efectuó la cuantificación aproximada de la
lesión mediante medida de la longitud y anchura de su extensión.
Después de dos controles de rayos X positivos,
se trataron los animales con anticuerpo anti-BSP o
patrón. Se realizó la terapia en los animales descritos una vez por
semana por vía subcutánea a una concentración de 10 mg/kg de peso
corporal.
Se realizó la observación posterior de los
animales además mediante tomografía computerizada e histología
(todavía no completada). La TC permite una reconstrucción
tridimensional del hueso y del defecto así como una medida exacta
del tamaño de la lesión. Después del tiempo de observación, se
sacrificaron los animales y se analizaron histológicamente.
Mediante el mareaje con GFP, las células son visibles bajo luz UV en
el preparado de corte óseo. Además, pueden encontrarse evidencias
histológicas más exactas mediante la remodelación previa del tejido
óseo.
Se documentan por ejemplo los resultados en las
siguientes series de figuras 4 a 5. Se observaron los animales más
de 3 meses después de la operación por diagnóstico con rayos X
(Siemens Opti 150/30/50 HC-100). En los desarrollos
de las curvas, ha de observarse que los datos de superficie
aplicados a las ordenadas de tamaño de lesión en mm^{2} son
distintos en ambos animales mostrados. En total, se trataron 8
animales.
Los animales 987 y 988 (véanse las figuras) se
trataron por vía subcutánea con el anticuerpo
anti-BSP (10 mg/kg) una vez por semana. La duración
total del tratamiento ascendió a aprox. 50 días. La terapia empezó
después de 2 ó 3 controles de rayos X positivos. Esto corresponde en
el animal 987 al día 46 después de la operación y en el animal 988
al día 32 después de la operación.
A un rápido aumento del tamaño de la lesión a
partir del día 24 después de la operación en el animal 988 siguió
una lisis continua del hueso, que condujo a partir del día 38 a una
fractura del tercio medio de la tibia. Esto tuvo lugar con la
terapia empezada (a partir del día 32). Las primeras tendencias de
curación se mostraron a partir del día 52 en forma de formación de
callo en el sitio de fractura y también las lesiones en la tibia
proximal y el fémur distal se hicieron menores. Los límites
exteriores de las lesiones estaban inicialmente delimitados
nítidamente, después durante la curación estaban cada vez menos
nítidamente limitados. La neoplasia del hueso se realizó desde el
borde exterior de fuera a dentro hasta el centro de la lesión. A
partir del día 89, el tamaño de la lesión era difícilmente
cuantificable, ya que por la formación de callo creciente no eran
ya reconocibles los bordes exactos. Después del día 126, puede
hablarse de una remisión total, como muestra la imagen adjunta
(desaparición completa de la lesión lítica reconocible por rayos X).
Las reconstrucciones por TC tridimensionales (Siemens Somato Plus
4, Volume Zoom) muestran los cambios de la lesión de la tibia
después de 31 y 80 días después de la operación. Es visible un claro
aumento del tejido óseo.
Se trató el animal 987 después de 3 hallazgos de
rayos X positivos también con 10 mg/kg s.c. una vez por semana a
partir del día 46. Aquí se mostró sólo una metástasis en el fémur
distal, que ya desde el día 89 después de la operación (o sea 42
días de terapia) estaba curada en el hueso.
Se sometieron a terapia otros animales en las
mismas condiciones hasta cinco veces por semana con 10 mg/kg s.c. y
hasta dos veces por semana con 10 mg/kg i.v. Se observó sin embargo
un aumento del tamaño de la lesión durante y después de la
terminación de la terapia, cuando se indujo mediante el tratamiento
una reacción inmunitaria contra los anticuerpos de BSP
inyectados.
Comparativamente, se sometieron a terapia
animales con alquilfosfocolina Er-PC_{3} 40
\mumol/kg i.v. dos veces por semana, que a esta concentración pudo
remitir el carcinoma de mama primario (control positivo), pero en
metástasis óseas no mostró efecto [Berger, M. R. y col., (1998)
"Erucylphosphocholine is the prototype of i.v. injectable
alkylphosphocholines". Drugs of Today, 34 (supl. F),
73-81]. Aquí no se mostró ningún cambio después de
la terminación de la terapia en un animal, en otro incluso un
empeoramiento de la situación (progresión) en comparación con el
inicio de la terapia.
Es por tanto objeto de la presente invención un
medicamento que contiene anticuerpos o moléculas de unión como
aptámeros contra BSP específica de tumor u otros ligandos de la
misma proteína. Puede reforzarse también el uso de la aplicación de
medicamento propuesta mediante el empleo de las siguientes
sustancias: anticuerpos, ligandos o inhibidores que interaccionan
con moléculas de adhesión, proteasas asociadas a membrana o
receptores que median el quimiotactismo como, por ejemplo,
receptores de quimiocina, así como sustancias inductoras de la
apoptosis como preferiblemente anticuerpos o proteínas/péptidos que
pueden obtenerse a partir de peptidotecas naturales o artificiales.
El medicamento puede emplearse solo o en combinación con las
sustancias anteriormente citadas particularmente para terapia de
enfermedades tumorales, preferiblemente de metástasis óseas.
La invención se refiere además a un
procedimiento para la terapia y el uso médico y comercial de los
anticuerpos contra BSP citados u otros ligandos de la misma
proteína o su combinación con anticuerpos, ligandos o inhibidores
reforzantes que interaccionan con moléculas de adhesión, proteasas
asociadas a membrana o receptores que median el quimiotactismo
como, por ejemplo, receptores de quimiocina, así como sustancias
inductoras de la apoptosis como preferiblemente anticuerpos o
proteínas/péptidos que pueden obtenerse a partir de peptidotecas
naturales o artificiales, para inhibir el crecimiento canceroso
incluyendo la metástasis. El procedimiento se basa en la
comprobación de que la BSP puede actuar sobre células tumorales
específicas mediante la configuración específica de enfermedad de
la expresión. Se controla el comportamiento de migración y
proliferación de tumores primarios y secundarios, entre otros,
mediante la BSP. Así, resulta la posibilidad de impedir
decisivamente o reprimir completamente el crecimiento del cáncer
así como la metastatización tumoral mediante el citado
procedimiento/terapia.
<110> Osteopep-Pharma
GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Medicamento para el tratamiento de
tumores y sus metástasis
\vskip0.400000\baselineskip
<130> HL-77234.003/UMB
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 01114388.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-06-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm17
Claims (18)
1. Anticuerpos, inmunotoxinas, moléculas con
estructura de unión a BSP de receptores de BSP naturales o moléculas
de factor H y aptámeros o Spiegelmer® basados en ADN o ARN, que se
unen a sialoproteína ósea o fragmentos de la misma en suero o
plasma, para uso como principio activo en el tratamiento de
metástasis óseas y tumores que expresan BSP que colonizan
preferiblemente tejidos óseos.
2. Principios activos según la reivindicación 1
que se unen específicamente a sialoproteína ósea humana (BSPh) o
fragmentos de la misma en suero o plasma.
3. Principios activos según la reivindicación 1
ó 2 que se unen específicamente a sialoproteína ósea de células
tumorales.
4. Principios activos según una de las
reivindicaciones precedentes, preparados contra sialoproteína ósea
modificada química o naturalmente en la glucosilación o un fragmento
de la misma.
5. Principios activos según la reivindicación 4,
preparados contra sialoproteína ósea de material óseo cuyo donante
no es capaz de una glucosilación normal de las proteínas óseas.
6. Principios activos según una de las
reivindicaciones precedentes que se unen específicamente a
sialoproteína ósea humana (BSPh) cuya glucosilación postraduccional
en el intervalo de los aminoácidos 120 a 135 (SWISSPROT:
SIAL_HUMAN, n° de acceso P21816), que incluye los aminoácidos TGLAA,
está modificada o incompleta frente a la sialoproteína ósea normal
de hueso.
7. Principios activos según una de las
reivindicaciones precedentes, preparados contra un epítopo de BSPh
que comprende la secuencia aminoacídica TGLAA o YTGLAA y grupos de
azúcar opcionales.
8. Principios activos según una de las
reivindicaciones precedentes, preparados contra un antígeno de BSPh
con la secuencia aminoacídica YTGALAAIQLPKKAGD (SEQ ID N° 1).
9. Principio activo según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el principio activo es un
anticuerpo IgY de gallina.
10. Principio activo según la reivindicación 9,
en el que el anticuerpo es humano o humanizado.
11. Principio activo según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el principio activo es un
anticuerpo biespecífico que incluye un paratopo adicional que
preferiblemente es especifico del epítopo de CD3.
12. Principio activo según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el principio activo es una
inmunotoxina que es un conjugado de molécula de unión y un resto
con actividad citotóxica.
13. Principio activo según la reivindicación 11,
en el que el conjugado incluye la cadena A de ricina o un fragmento
no de unión de la toxina de la difteria.
14. Principio activo según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que el principio activo se
acopla con un radionucleido.
15. Composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades por tumores y sus metástasis que colonizan
preferiblemente tejidos óseos, que contiene un principio activo
según una de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Composición farmacéutica según la
reivindicación 15, que contiene al menos otro anticuerpo, ligando o
inhibidor seleccionado de moléculas de adhesión, proteasas asociadas
a membrana, receptores mediadores del quimiotactismo, receptores de
quimiocina y sustancias inductoras de la apoteosis.
17. Composición farmacéutica según la
reivindicación 16, en la que los inhibidores bloquean al menos
parcialmente la BSP y por tanto modulan su función.
18. Principio activo o composición farmacéutica
según una de las reivindicaciones precedentes para el tratamiento
de tumores que expresan BSP del grupo de tumores de próstata, mama,
pulmón, riñón y tiroides, enfermedades tumorales del sistema
sanguíneo, del sistema linfático, del sistema cardiocirculatorio,
del sistema nervioso, del tracto respiratorio, del tracto
digestivo, del sistema endocrino, de la piel incluyendo anejos, del
aparato locomotor y del tracto urogenital, incluyendo los
riñones.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP01114388 | 2001-06-13 | ||
EP01114388 | 2001-06-13 | ||
DE10128639 | 2001-06-15 | ||
DE10128639 | 2001-06-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2336770T3 true ES2336770T3 (es) | 2010-04-16 |
Family
ID=26009516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES02748771T Expired - Lifetime ES2336770T3 (es) | 2001-06-13 | 2002-06-12 | Medicamentos para el tratamiento de tumores y sus metastasis utilizando una molecula de union contra la sialoproteina osea. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7825219B2 (es) |
EP (1) | EP1399186B1 (es) |
JP (1) | JP4570355B2 (es) |
AT (1) | ATE448796T1 (es) |
AU (1) | AU2002319223A1 (es) |
DE (1) | DE50214008D1 (es) |
DK (1) | DK1399186T3 (es) |
ES (1) | ES2336770T3 (es) |
PT (1) | PT1399186E (es) |
WO (1) | WO2002100899A2 (es) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1514929A1 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-16 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Antisense oligonucleotides for prevention of metastasis formation of cancer cells |
WO2006128689A2 (de) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Ralf Jochem | Therapeutsche zusammensetzung zur vorbeugung und bekämpfung von knochenmetastasen |
JP2009509966A (ja) * | 2005-09-26 | 2009-03-12 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 骨転移に関連した分子マーカー |
AU2009287165A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Symphogen A/S | Method for cloning avian-derived antibodies |
AU2015306108B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-12-10 | Immundiagnostik Ag | Medicament and apparatus for treating chronic kidney disease |
CA3226401A1 (en) * | 2021-07-20 | 2023-01-26 | William Marsh Rice University | Engineered compositions for bone-targeted therapy |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4853219A (en) * | 1987-08-06 | 1989-08-01 | President And Fellows Of Harvard College | Antibodies to angiogenin: immunotherapeutic agents |
US5601819A (en) * | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
US5340934A (en) * | 1989-11-03 | 1994-08-23 | The United States Of Americas As Represented By The Secretary Of Health & Human Services | CDNA sequences of human bone matrix proteins |
CA2103059C (en) * | 1991-06-14 | 2005-03-22 | Paul J. Carter | Method for making humanized antibodies |
EP1169642B1 (en) | 1999-04-09 | 2006-01-04 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Complex formed by n-linked glycoproteins (siblings) and factor h |
-
2002
- 2002-06-12 AU AU2002319223A patent/AU2002319223A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-12 JP JP2003503665A patent/JP4570355B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-12 WO PCT/EP2002/006456 patent/WO2002100899A2/de active Application Filing
- 2002-06-12 EP EP02748771A patent/EP1399186B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-12 DE DE50214008T patent/DE50214008D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-12 DK DK02748771.9T patent/DK1399186T3/da active
- 2002-06-12 ES ES02748771T patent/ES2336770T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-12 PT PT02748771T patent/PT1399186E/pt unknown
- 2002-06-12 US US10/480,465 patent/US7825219B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-12 AT AT02748771T patent/ATE448796T1/de active
-
2010
- 2010-10-08 US US12/901,399 patent/US8808691B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1399186A2 (de) | 2004-03-24 |
WO2002100899A3 (de) | 2003-12-18 |
DE50214008D1 (de) | 2009-12-31 |
AU2002319223A1 (en) | 2002-12-23 |
ATE448796T1 (de) | 2009-12-15 |
US7825219B2 (en) | 2010-11-02 |
PT1399186E (pt) | 2010-02-23 |
US20050069547A1 (en) | 2005-03-31 |
US8808691B2 (en) | 2014-08-19 |
WO2002100899A2 (de) | 2002-12-19 |
JP2005506959A (ja) | 2005-03-10 |
US20110091379A1 (en) | 2011-04-21 |
DK1399186T3 (da) | 2010-03-29 |
EP1399186B1 (de) | 2009-11-18 |
JP4570355B2 (ja) | 2010-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2646168T3 (es) | Anticuerpos monoclonales para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 | |
ES2208773T5 (es) | Apoptosis inducida por el anticuerpo monoclonal anti-Her2 | |
ES2307824T3 (es) | Uso de anticuerpos contra el antigeno muc18. | |
ES2286831T3 (es) | Anticuerpos para el dominio ed-b de fibronectina, la construccion de estos y sus usos. | |
ES2645663T3 (es) | Proteínas de unión específica y uso de las mismas | |
ES2609094T3 (es) | Uso de anticuerpos anti-EGFR en el tratamiento de enfermedades mediadas por un EGFR mutante | |
ES2201076T3 (es) | Factor-8 de diferenciacion del crecimiento. | |
ES2253223T3 (es) | Diagnostico y tratamiento de tumores neuroectodermicos. | |
ES2363765T3 (es) | Agonistas de fgfr. | |
ES2239032T3 (es) | Anticuerpo terapeutico contra el antigeno muc-1 y metodos para su uso. | |
US20100069303A1 (en) | Methods of treating bone disease using vascular endothelial growth factor fusion constructs | |
ES2549362T3 (es) | Antígenos asociados a endometriosis | |
ES2647472T3 (es) | Anticuerpos contra TGF-BETA para uso en el tratamiento de lactantes con riesgo de desarrollar displasia broncopulmonar | |
US8808691B2 (en) | Method for treating tumors and their metastases | |
US7060275B2 (en) | Use of protein biomolecular targets in the treatment and visualization of brain tumors | |
JP2014500278A (ja) | 二重特異性scFvコンジュゲートの投薬量および投与 | |
EP0868434B1 (fr) | Anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance endotheliale vasculaire et leur utilisation comme medicaments | |
JP2004524269A (ja) | ノッチレセプターアゴニスト及び用途 | |
ES2865303T3 (es) | Ligante de adrenomedulina para su uso en la terapia del cáncer | |
CN109562141A (zh) | 预防或减少急性尿潴留发生的方法 | |
JP4438987B2 (ja) | 腫瘍学的目的のための体液中の骨シアロ蛋白(bonesialoprotein)の測定方法 | |
ES2245048T3 (es) | Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso. | |
JP5138680B2 (ja) | 増殖抑制作用を有するペプチド | |
ES2326978T3 (es) | Procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular. | |
JP2005508870A6 (ja) | 腫瘍学的目的のための体液中の骨シアロ蛋白(bonesialoprotein)の測定方法 |