ES2647472T3

ES2647472T3 - Anticuerpos contra TGF-BETA para uso en el tratamiento de lactantes con riesgo de desarrollar displasia broncopulmonar

Info

Publication number: ES2647472T3
Application number: ES15154393.1T
Authority: ES
Inventors: James B. Streisand; Jesse D. Roberts
Original assignee: General Hospital Corp; Genzyme Corp
Current assignee: General Hospital Corp; Genzyme Corp
Priority date: 2006-10-03
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2017-12-21
Anticipated expiration: 2027-10-03
Also published as: EP2918288B1; EP2083863A1; PL2918288T3; WO2008060371A8; DK2918288T3; MX2009003518A; CN101553254A; DK2083863T3; US8642034B2; US20100008911A1; US20170233464A1; IL251994B; PL2083863T3; IL197797A; EP2083863B1; CN104645328A; IL197797A0; US20140199399A1; WO2008060371A1; IL251994A0

Abstract

Un antagonista de TGF-β para uso en el tratamiento de displasia broncopulmonar incrementando alveologénesis y/o vasculogénesis pulmonar en un lactante, en el que el antagonista de TGF-β es un receptor de TGF-β soluble o un anticuerpo anti-receptor de TGF-β.

Description

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(Publicación de Solicitud de Patente U.S. nº 2004/0266025), proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (un marcador para la probabilidad de ruptura de la membrana); véase la Publicación de Solicitud de Patente

U.S. nº 2004/0053838), y MMP-8 y MMP-9 (Publicación de Solicitud de Patente U.S. nº 2004/0029176). Los métodos para detectar el nivel de marcadores del parto antes de término son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente U.S. nº 2004/0266025.

Aunque BPD se observa mayoritariamente entre bebés prematuros, también puede ocurrir en bebés de término completo que tienen problemas respiratorios durante los primeros días de vida. En consecuencia, los métodos de la presente descripción se pueden usar igualmente para tratar estos lactantes.

Antagonistas de TGF-

TGF- es un dímero enlazado por disulfuro que se sintetiza como una preproproteína de alrededor de 400 aminoácidos (aa) que se escinde antes de la secreción para producir TGF- maduro. El fragmento de escisión Nterminal, conocido como el “péptido asociado a latencia” (LAP), puede permanecer unido no covalentemente al dímero, inactivando de ese modo TGF-. TGF-, aislado in vivo, se encuentra predominantemente en esta forma inactiva, “latente”, es decir, asociada con LAP. El complejo de TGF- latente se puede activar de varias maneras, por ejemplo mediante la unión a un receptor de la superficie celular denominado el receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes/factor II de crecimiento similar a la insulina. La unión se produce a través de restos de manosa-6-fosfato unidos a sitios de glicosilación en LAP. Al unirse al receptor, se libera TGF- en su forma madura. TGF- activo, maduro, es libre entonces de unirse a su receptor y ejercer sus funciones biológicas. El dominio de unión a TGF- principal en el receptor de TGF- tipo II se ha cartografiado a una secuencia de 19 aminoácidos (Demetriou et al., J. Biol. Chem. 271:12755 (1996)).

El término “TGF-”, como se usa aquí, se refiere a una cualquiera o más isoformas de TGF- de mamífero. Igualmente, la expresión “receptor de TGF-”, excepto que se indique de otro modo, se refiere a cualquier receptor que se une a al menos una isoforma de TGF- de mamífero. Actualmente, hay cinco isoformas conocidas de TGF- (TGF-1 a TGF-5), todas las cuales son homólogas entre sí (60-80% de identidad), forman homodímeros de alrededor de 25 kDa, y actúan sobre receptores de TGF- comunes (TR-I, TR-II, TR-IIB, y TR-III). TGF-1, TGF-2, y TGF-3 se encuentran en las mamas. Los aspectos estructurales y funcionales de TGF-, así como receptores de TGF-, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Cytokine Reference, eds. Oppenheim et al., Academic Press, San Diego, CA, 2001). TGF- está notablemente conservado entre especies. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de TGF-1s maduros de rata y de ser humano son casi idénticas. De este modo, se espera que los antagonistas de TGF- tengan una reactividad cruzada entre especies elevada.

La expresión “antagonista de TGF-” y sus cognados tales como “inhibidor”, “neutralizante”, y “reductor” se refieren a un compuesto (o su propiedad, según sea apropiado), u otra molécula, que actúa como un antagonista de la actividad biológica de TGF-. Un antagonista de TGF-, por ejemplo, se puede unir a y neutralizar la actividad de TGF-; disminuir los niveles de expresión de TGF-; afectar a la estabilidad o conversión de la molécula precursora a la forma madura activa; interferir con la unión de TGF- a uno o más receptores; o puede interferir con la señalización intracelular de un receptor de TGF-. La expresión “antagonista directo de TGF-” se refiere generalmente a cualquier compuesto que disminuya directamente la actividad biológica de TGF-. Una molécula “disminuye directamente” la actividad biológica de TGF- si disminuye la actividad al interactuar con un gen de TGF, un transcrito de TGF-, un ligando de TGF-, o un receptor de TGF-.

Los métodos para evaluar la actividad biológica de TGF-, incluyendo la actividad neutralizante de antagonistas de TGF-, son conocidos en la técnica. Ejemplos de algunos de los bioensayos in vitro más frecuentemente usados incluyen los siguientes:

(1): inducción de formación de colonias de células NRK en agar blando en presencia de EGF (Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5339-5343 (1981));

(2): inducción de diferenciación de células mesenquimatosas primitivas para expresar un fenotipo cartilaginoso (Seyedin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2267-2271 (1985));

(3): inhibición del crecimiento de células epiteliales de pulmón de visón Mv1 Lu (Danielpour et al. (1989) J. Cell. Physiol., 138:79-86) y células de riñón de mono BBC-1 (Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5989-5992 (1980));

(4): inhibición de la mitogénesis de timocitos de ratón C3H/HeJ (Wrann et al. (1987) EMBO J., 6:1633-1636);

(5): inhibición de la diferenciación de células de mioblastos L6 de rata (Florini et al., J. Biol. Chem. 261:1650916513 (1986));

(6): medida de la producción de fibronectina (Wrana et al., Cell 71:1003-1014 (1992));

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(7): inducción del promotor del inhibidor 1 activador de plasminógeno (PAI-1) fusionado a un gen informador de luciferasa (Abe et al. (1994) Anal. Biochem., 216:276-284);

(8): medida de los niveles de PAI-1 en tejido pulmonar o el suero o plasma;

(9): ensayo inmunosorbente ligado a enzima de tipo sándwich (Danielpour et al., Growth Factors 2:61-71 (1989)); y

(10): ensayos celulares descritos en Singh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13(24):4355-4359 (2003)).

Los ejemplos de métodos que se pueden usar para evaluar la actividad de TGF- in vivo incluyen la evaluación de fosforilación y/o localización nuclear de SMAD2.

Los ejemplos de antagonistas de TGF- que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra una o más isoformas de TGF- (patente U.S. nº 5.571.714; documentos WO 97/13844; y WO 00/66631; WO 05/097832; WO 05/101149; WO 06/086469); receptores de TGF- dominantes negativos y solubles o anticuerpos dirigidos contra receptores de TGF- (Flavell et al., Nat. Rev. Immunol. 2:46-53 (2002); patente U.S. nº 5.693.607; patente U.S. nº 6.001.969; patente U.S. nº 6.008.011; patente U.S. nº 6.010.872; documentos WO 92/00330; WO 93/09228; WO 95/10610; y WO 98/48024; LAP (documento WO 91/08291); TGF- asociado a LAP (documento WO 94/0981.2); glicoproteínas/proteoglicanos de unión a TGF- tales como fetuína (patente U.S. nº 5.821.227); decorina, betaglicano, fibromodulina, lumicano, y endoglina (patente U.S. nº 5.583.103; patente U.S. nº 5.654.270; patente U.S. nº 5.705.609; patente U.S. nº 5.726.149; patente U.S. nº 5.824.655; patente

U.S. nº 5.830.847; patente U.S. nº 6.015.693; documentos WO 91/04748; WO 91/10727; WO 93/09800; y WO 94/10187); manosa-6-fosfato o manosa-1-fosfato (patente U.S. nº 5.520.926); prolactina (documento WO 97/40848); factor II de crecimiento similar a la insulina (documento WO 98/17304); extractos de plantas, hongos y bacterias (documentos EU 813875; JP 8119984; y patente U.S. nº 5.693.610); oligonucleótidos antisentido (patente U.S. nº 5.683.988; patente U.S. nº 5.772.995; patente U.S. nº 5.821.234; patente U.S. nº 5.869.462; y WO 94/25588); y cualesquiera mutantes, fragmentos, o derivados de las moléculas identificadas anteriormente que retienen la capacidad para inhibir la actividad biológica de TGF-. Numerosos antagonistas de TGF- de tipo pequeña molécula que pueden ser útiles también son bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en los documentos WO 02/62753; WO 02/62776; WO 02/62787; WO 02/62793; WO 02/62794; WO 02/66462; WO 02/94833; WO 03/87304; WO 03/97615; WO 03/97639; WO 04/10929; WO 04/21989; WO 04/22054; WO 04/24159; WO 04/26302; WO 04/26871; patente U.S. nº 6.184.226; WO 04/16606; WO 04/47818; WO 04/48381; WO 04/48382; WO 04/48930; WO 04/50659; WO 04/56352; WO 04/72033; WO 04/87056 WO 05/10049; WO 05/032481; WO 05/065691; WO 05/92894; WO 06/026305; WO 06/026306; y WO 06/052568.

En algunos casos, el antagonista de TGF- es un antagonista directo de TGF-, por ejemplo un anticuerpo que bloquea la unión de TGF- a su receptor.

El término “anticuerpo”, como se usa aquí, se refiere a una inmunoglobulina o una parte de la misma, y engloba cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno independientemente de la fuente, método de producción, y otras características. El término incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, humanizados, humanos, monocatenarios, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, e injertados con CDR. La expresión “dominio de unión a antígeno” se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a o es complementaria a una parte de o a todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo se puede unir solamente a una parte particular del antígeno. El “epítopo” o “determinante antigénico” es una porción de una molécula de antígeno que es responsable de interacciones específicas con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH). Un dominio de unión a antígeno se puede proporcionar mediante uno o más dominios variables del anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fd que consiste en un dominio VH, un fragmento de anticuerpo Fv que consiste en un dominio VH y un dominio VL, o un fragmento de anticuerpo scFv que consiste en un dominio VH y un dominio VL unidos mediante un ligador). La expresión “anticuerpo anti-TGF-”, o “anticuerpo contra al menos una isoforma de TGF-”, se refiere a cualquier anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de TGF-. Las expresiones “anticuerpo contra el receptor de TGF-” y “anticuerpo contra un receptor de TGF-” se refiere a cualquier anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de un receptor de TGF (por ejemplo, tipo I, tipo II, o tipo III).

Los anticuerpos útiles en los métodos de la presente descripción se unen específicamente a al menos una isoforma de TGF- o al dominio extracelular de al menos un receptor de TGF-. Las expresiones “interacción específica”, o “se une específicamente”, o sus cognados, como se usan aquí, significan que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una afinidad elevada y una capacidad baja a moderada. La unión no específica tiene habitualmente una baja afinidad con una capacidad moderada a elevada. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad Ka es mayor que 106 M-1, o preferiblemente mayor que 108 M-1 .

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Un estado pobre de vitamina A durante el primer mes de vida incrementa significativamente el riesgo de desarrollar BPD. Los estudios también han encontrado que la dexametasona puede incrementar los niveles plasmáticos de vitamina A; lo que puede ayudar a desenganchar a los lactantes de la terapia de oxígeno, previniendo de ese modo BPD.

Las medicaciones broncodilatadoras se usan a menudo para abrir las vías respiratorias de los pulmones relajando los músculos alrededor de las vías respiratorias. Las medicaciones antiinflamatorias se usan para reducir el hinchamiento de las vías respiratorias en bebés más gravemente enfermos, cuyas sibilancias y disneas son difíciles de controlar ocasionalmente con broncodilatadores solamente. En consecuencia, los tratamientos para BPD que se pueden usar en combinación con los métodos de la invención incluyen tensioactivo, terapia de oxígeno, terapia de ventilador, esteroides, vitamina A, óxido nítrico inhalado, formulaciones nutricionales ricas en calorías, alimentación intravenosa, antibióticos, restricción de fluidos y diuréticos para disminuir la acumulación de agua en los pulmones, y terapia física para mejorar el rendimiento muscular y ayudar a los pulmones a expeler el moco.

Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas. Los Ejemplos no limitan de ningún modo la invención.

Ejemplos

Diseño experimental. En los días 17 y 19 embriónicos, ratones C57BL/6 preñados fechados en el tiempo (Charles River) se trataron con inyecciones i.p. de 0,5 ml de PBS pH 7,4 con o sin 10 mg/kg de 1 D11 (Genzyme), un anticuerpo IgG1 anti-TGF- pan-específico, o una proteína de mieloma de isotipo coincidente sin antígeno conocido (MOPC21; Sigma-Aldrich). En las 12 horas de nacimiento, las crías de parejas de madres tratadas de forma similar se reunieron y se dividieron al azar en dos camadas que se trataron subsiguientemente de forma continua, con sus madres, con aire o con 85% de oxígeno durante 10 días. Cada 24 horas, las madres lactantes de camadas emparejadas se intercambiaron entre los niveles de exposición a O2 para disminuir los efectos de la respiración de niveles elevados de O2. Se mezclaron oxígeno de grado médico y gases nitrogenados (Airgas) usando caudalímetros separadamente regulados y calibrados. Las mezclas de gases se introdujeron en una cámara de exposición acrílica de 680 l. Un compartimento estanco permitió el intercambio de las madres y la renovación de alimento, agua, y cama sin cambiar el nivel de exposición a oxígeno de las crías. El caudal de gas reciente en la cámara de exposición superó el consumo calculado de oxígeno de los ratones en ella en > 10 veces (Bartlett et al., Respir. Physiol. 29:193-200 (1997)). El nivel de oxígeno se midió usando métodos paramagnéticos (Servomex modelo 572). Este método de exposición produjo una atmósfera gaseosa con niveles estables de oxígeno con humedad relativa y temperatura en la cámara de exposición que no superaron 60% y 70ºC, respectivamente. Todos los protocolos fueron aprobados por el Subcomité para los Estudios con Animales de Investigación del Hospital General de Massachusetts.

Preparación de tejidos. Para obtener pulmones y corazones para el análisis, las crías se pesaron y se sacrificaron mediante inyección i.p. de 200 mg/kg de pentobarbital sódico. Se realizó una toracotomía para permitir que los pulmones colapsasen, la tráquea se identificó mediante una incisión transversal en el cuello, y se aseguró en la tráquea un tubo de polietileno de 0,61 mm de O.D. (PE10; Harvard Apparatus). Los pulmones se inflaron con 3% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en PBS a una presión de H2O de 22 cm durante 30 minutos, seguido de la ligación de las vías respiratorias mientras que los pulmones estaban distendidos. Los cuerpos de las crías se sumergieron en fijador durante 3 días a 4ºC. Los corazones y pulmones se disecaron de los cuerpos y se almacenaron a 4ºC en PBS para el análisis posterior. Para obtener tejido pulmonar para la criosección, las tráqueas se canularon, y los pulmones se distendieron suavemente con Medio de Congelación Tisular (TFM; Triangle Biochemical Sciences) y sacarosa al 20% en PBS (diluido 1:1 en vol.) y se retiraron. Subsiguientemente, los pulmones se cubrieron con TFM, se congelaron en isopentano (mantenido en hielo seco), y se almacenaron a -80ºC hasta el uso.

Detección de TGF- tisular. La inmunorreactividad a la isoforma de TGF- se detectó en pulmones de crías usando inmunohistoquímica. Tras recuperar el antígeno con citrato ácido, las secciones pulmonares se bloquearon y se expusieron a anticuerpos de conejo anti-TGF-1 (Santa Cruz, sc-146), TGF-2, (sc-90), y TGF-3 (sc-82), y a suero de conejo preinmune (control). Después del lavado exhaustivo, las secciones se expusieron a anticuerpo anti-conejo biotinilado, complejos de avidina-biotina-peroxidasa (Vector Labs) y diaminobencidina (DAB; Vector labs) antes de contrateñirlas con hematoxilina. TGF- pulmonar también se detectó usando un anticuerpo anti-TGF- panespecífico e inmunohistoquímica indirecta (Graham et al., Biol. Reprod. 46:561-572 (1992)) y un kit comercialmente disponible optimizado para el uso de anticuerpos murinos en tejidos de ratón (kit de inmunodetección M.O.M.; Vector Labs). Secciones pulmonares, 6 m de grosor, embebidas en parafina, se trataron con xileno, disoluciones de alcohol graduado, y se hidrataron en PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20). Después de incubar en reactivo de bloqueo, el tejido se expuso a 1 D11 (diluido en disolución de bloqueo) toda la noche a 4ºC. Después de lavar el tejido con PBST, se incubó con un anticuerpo antirratón biotinilado, se lavó con PBST, y se expuso a complejos de avidina-biotina-peroxidasa (Vector Labs) y diaminobencidina (DAB; Vector labs) antes de contrateñir con hematoxilina.

Análisis de señalización de TGF-. Se detectó fosfo-SMAD 2 (p-Smad2) nuclear en los pulmones usando inmunohistoquímica indirecta. Se colocaron secciones congeladas de pulmones, 6 m de grosor, en portaobjetos de

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vidrio Superfrost Plus™ (Fisher Scientific), se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS durante 2 minutos, y se permeabilizaron con metanol al 100% durante 10 minutos. Después de bloquear con 5% de suero de cabra en PBST durante 1 hora, las secciones se expusieron a anti-pSmad2 de conejo (Cell Signaling) diluido en tampón de bloqueo toda la noche a 4ºC. Tras lavar las secciones con PBST, se incubaron con un anticuerpo anti-conejo biotinilado, se lavaron con PBST, y se expusieron a complejos de avidina-biotina-peroxidasa y a DAB antes de contrateñir con hematoxilina.

Análisis estereológico de la estructura pulmonar. La patofisiología pulmonar se caracterizó determinando el volumen pulmonar, Lm (la interceptación lineal media o longitud de la cuerda), y %AVD (% de densidad de volumen de espacio aéreo). Los volúmenes pulmonares se determinaron usando el principio de Arquímedes tras la fijación de los pulmones por inflado. Los pulmones en desarrollo lesionados tienen interrumpida la alveolarización y permanecen en una etapa de desarrollo semejante a la sacciforme, con las vías respiratorias distales con mayores diámetros. Estos cambios se cuantifican usando métodos estereológicos y determinando Lm (Massaro et al., Am. J. Physiol. 250:R51-55 (1986); Tomkeieff, Nature 155:24 (1945)), %AVD (Weibel, Stereological methods. London: Academic Press (1979)), y la densidad del tabique secundario (Pierce et al. Am J Physiol. 272: L452-60 (1997)). Lm es inversamente proporcional al área de la superficie interna del pulmón (Thurlbeck, Am. Rev. Respir. Dis. 95:752-764 (1967); Thurlbeck, Am. Rev. Respir. Dis. 95:765-773 (1967)). La densidad del tabique secundario se correlaciona directamente con el desarrollo alveolar.

Se embebieron pulmones de crías fijados por inflado en metacrilato de metilo, y para los estudios estructurales se usaron secciones de 2 m de grosor teñidas con azul de toluidina del pulmón izquierdo. Mientras se obtienen y se procesan los datos de las imágenes pulmonares, el observador desconoce el grupo de tratamiento y las exposiciones del pulmón. Usando un enfoque de muestreo sistemático (similar al enfoque de Tschanz y Burri, Exp. Lung Res. 28:457-471 (2002)), cuatro campos de 0,60 mm2 de secciones transversales orientadas al azar de los pulmones izquierdos que excluyeron grandes estructuras vasculares y de las vías respiratorias se digitalizaron para la determinación de Lm; dentro de estos campos, se capturaron cuatro secciones de 0,15 mm2 para la determinación de %AVD. Usando una macro escrita por el usuario e ImageJ (Rasband, ImageJ, Bethesda, MD (1997-2004)), las imágenes se filtraron y se segmentaron usando métodos descritos previamente (Tschanz et al., 2002). Para determinar Lm, las imágenes se invirtieron y se fusionaron usando una operación AND lógica en forma de bits conteniendo una imagen líneas horizontales separadas 90 m. Las cuerdas resultantes se ordenaron; las cuerdas < 8 m y > 250 m se descartaron para eliminar aquellas asociadas con capilares pulmonares y vías respiratorias conductoras procedentes de los datos (Soutiere et al., Respir. Physiol. Neurobiol 140:283-291 (2004)). Lm se determinó dividiendo la suma de las cuerdas resultantes entre el número de interceptaciones. El %AVD del espacio aéreo distal se determinó usando métodos de recuento de puntos estándar (Weibel, 1979). La densidad del tabique secundario se determinó de forma objetiva mediante recuento.

Tinción de los pulmones para determinar proteínas de la matriz extracelular. La elastina y el colágeno pulmonares se determinaron usando secciones pulmonares de 6 m de grosor embebidas en parafina. La tinción de elastina se llevó a cabo siguiendo el tratamiento con 0,5% de permanganato potásico y 1% de ácido oxálico, usando tinción de elastina de Miller (Miller, Stain Techno. 28:148-149 (1971)). La tinción de colágeno se llevó a cabo usando 0,1% de rojo Sirio en ácido pícrico saturado (Walsh et al., Anal. Biochem. 203:187-190 (1992)). El % de densidad de volumen de elastina en el parénquima se determinó usando un método estándar (Pierce et al. Am J Physiol. 272: L452-60 (1997)).

Evaluación del desarrollo vascular. Se usó tinción de lectina para identificar la microvasculatura pulmonar en la pared de las vías respiratorias distales. Se ha observado que las lectinas de Griffania (Bandeiraea) simplicifolia se unen a -D-galactósidos (Hayes et al., J. Biol. Chem. 249:1904-1914 (1974)) en células endoteliales (Mattsson et al, Pancreatology 2:155-162 (2002)), e identifican preferentemente la microvasculatura pulmonar (King et al., Microvasc. Res. 67:139-151 2004)). Secciones pulmonares de 6 m de grosor embebidas en parafina se bloquearon e incubaron toda la noche con una isoforma IB4 biotinilada de lectina de G. simplicifolia (Molecular Probes). Después de lavar con disolución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST), la lectina unida se detectó usando fosfatasa alcalina complejada con avidina-biotina y sustrato Vector Red (Vector Laboratories), y las secciones se contratiñeron con azul de toluidina. Para la inmunohistoquímica, se usó un anticuerpo anti-SMA monoclonal murino (1A4; Sigma) para identificar células del músculo liso usando secciones pulmonares de 6 m de grosor embebidas en parafina, como se describió previamente (Roberts et al., Circ. Res. 87:140-145(2000)).

La densidad de área de las células microvasculares pulmonares en los pulmones de crías de ratón se analizó usando métodos descritos por Weibel (1979). Se usaron secciones de pulmones que se hicieron reaccionar con lectina biotinilada y anticuerpo anti-SMA y sustrato Vector Red, como se describe anteriormente, para detallar los compartimentos endotelial y de SMC de la microvasculatura, respectivamente. Usando el método de muestreo sistemático detallado anteriormente, se obtuvieron imágenes epifluorescentes del pulmón periférico, evitando la pleura y grandes estructuras de las vías respiratorias y vasculares. Tras usar procedimientos de filtración y segmentación, se determinó el % de densidad de volumen fluorescente (%FVD) dividiendo el número de píxeles correspondientes a los píxeles fluorescentes entre el número total en la imagen. En el análisis se usó el %FVD de la mediana de tres imágenes por sección de pulmón de cría.

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neutralizantes de TGF- mejora el desarrollo alveolar. Se usó la exposición de crías de ratón neonatas a 85% de O2 continuo durante 10 días debido a que se observó en estudios preliminares que este nivel de exposición provoca reducción de alveologénesis pulmonar mientras permite una tasa de supervivencia > 80%. Como se muestra en la Figura 4, la exposición crónica a 85% de O2 estaba asociada con una disminución en el desarrollo del pulmón terminal. Las vías respiratorias distales del pulmón de cría lesionado mostraron una estructura intersticial menos compleja y menores tabiques secundarios y alvéolos (flechas) en comparación con los pulmones de crías de control que respiran aire. Este incremento en el área del espacio aéreo distal resultó probablemente de una disminución en el tejido intersticial debido a que el volumen pulmonar global de los pulmones expuestos a 85% de O2 no fue diferente del de los expuestos a aire (volumen del pulmón, l/g de peso corporal: PBS y 85% de O2 62 ± 8 frente a PBS y aire: 60 ± 5. P > 0,05).

De forma importante, la exposición a anticuerpo anti-TGF- mejoró el desarrollo pulmonar terminal en el pulmón lesionado de neonato puesto que condujo a un nivel de tabicación del pulmón periférico y un área de espacio aéreo que es próximo al observado en los pulmones de control tratados con PBS y que respiran aire. Además, la exposición a 1D11 no pareció estar asociada con toxicidad del pulmón. En los pulmones tratados con 1 D11 y expuestos a aire, no hubo ningún nivel importante de infiltración de células inflamatorias en las vías respiratorias distales. Estas observaciones sugieren que la atenuación de la señalización anormal de TGF- mejora el desarrollo pulmonar distal en el pulmón lesionado de ratón neonato.

El efecto de 1 D11 sobre Lm y %AVD se examinó en pulmones de crías expuestos a 85% de O2 para determinar si el tratamiento con anticuerpos anti-TGF- mejora la alveologénesis en el pulmón lesionado de neonato. La disminución en la alveologénesis en el pulmón lesionado de neonato se ha asociado con una reducción del área superficial pulmonar interna y con un incremento en el área del espacio aéreo alveolar, que se puede cuantificar mediante métodos estereológicos (Weibel, 1979; Bolender et al., Am. J. Physiol. 265:L521-548 (1993)). Por ejemplo, Lm es inversamente proporcional al área superficial del pulmón interno, y %AVD se correlaciona de forma inversa con el área del espacio aéreo alveolar. Otros han dado a conocer que la lesión pulmonar hiperóxica incrementa Lm y %AVD en el pulmón de ratón y rata en desarrollo (Shaffer et al., Pediatr. Res. 21:14-20 (1987); Boros et al., Am. J. Physiol. 272:L433-441 (1997); Warner et al., Am. J. Physiol. 275:L110-117 (1998)).

Como se muestra en las Figuras 5A-5C, respirar crónicamente 85% de O2 estaba asociado con un incremento de 30% en Lm (PBS-aire 50,7 ± 3,4 m frente a PBS-O2 67,3 ± 3,7 m), un incremento de 20% en %AVD (PBS-aire 55,6 ± 3,7% frente a PBS-O2 67,8 ± 4,0%) y una disminución en la densidad del tabique secundario, en comparación con exposición a aire. De forma importante, en comparación con este cambio asociado con exposición a PBS y O2, el tratamiento de pulmones que respiran Os con 1 D11 estaba asociado con una disminución de 30% en Lm (1D11-O2 62,3 ± 4,4 µm), con una disminución de 51% %AVD (1D11-O2 61,6 ± 4,2%), y con una mejora (incremento de 38%) en la densidad del tabique secundario. Estos datos indican que TGF- tiene un papel importante a la hora de mediar el efecto de lesión sobre el desarrollo del pulmón terminal. De forma interesante, el tratamiento con anticuerpo anti-TGF- solo también estaba asociado con una disminución modesta en Lm y %AVD. Puesto que la señalización basal de TGF- observada en los pulmones de control pareció estar también modulada por la exposición a 1D11, estos últimos datos indican que TGF- regula la velocidad de alveolarización postnatal en el pulmón de neonato.

Se llevaron a cabo estudios adicionales para investigar si el efecto protector de 1D11 fue debido a este isotipo, IgG1. Por lo tanto, usando métodos estereológicos, se estudió si IgG1 protege o no el pulmón de ratón neonato hiperóxico frente a la inhibición de la alveologénesis. La exposición antenatal a MOPC21, un anticuerpo monoclonal de control emparejado al isotipo IgG de 1D11 sin un antígeno conocido, no atenuó la inhibición de alveologénesis inducida por exposición crónica a 85% de O2. No se observó diferencia en Lm y %AVD en los pulmones de animales expuestos a 85% de O2 y tratados con MOPC21 o PBS (Lm: MOPC21-O2 70,4 ± 7,1 m frente a PBS-O2 68,0 ± 3,7 m; %AVD: MOPC21-O2 69,4 ± 2,6% frente a PBS-O2 68,9 ± 4,5%, ambos P > 0,05). Estos datos están de acuerdo con otros informes de que IgG no específico no protege el pulmón de neonato frente a la inhibición de alveologénesis inducida por hiperoxia (Padela et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 172:907-914 (2005)).

Ejemplo 3: La organización de elastina del tabique alveolar mejora mediante el tratamiento anti-TGF en el pulmón lesionado de neonato

La elastina es un componente importante de la pared alveolar y de la vasculatura del pulmón, y su biosíntesis y ensamblaje extracelular es crítica para el desarrollo normal del pulmón. En los pulmones de lactantes con BPD, como en ratones neonatos con lesión pulmonar (Veness-Meehan et al., Pediatr. Res. 48:434-444 (2002)), la organización normal de elastina en las puntas de las crestas secundarias está interrumpida, y en su lugar se observa elastina en las paredes de las vías respiratorias distales. Debido a que TGF- regula la expresión y degradación de proteínas de la ECM en células mesenquimatosas (Leask et al., Faseb J. 18:816-827 (2004)) y en el pulmón (Kucich et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17:10-16 (1997); Parks et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17:1-2 (1997)), se examinó el efecto del tratamiento con 1D11 sobre la deposición de proteínas de la matriz extracelular. Como se muestra en la Figura 6, la respiración crónicamente de niveles elevados de O2 se asoció con expresión alterada de elastina en los tabiques secundarios. El patrón típico de expresión de elastina observado en crías tratadas con PBS y que respiran aire (flechas) fue más desordenado y extendido a lo largo de la pared del tabique (punta de flecha).

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Como se muestra en las Figs. 7A y 7B, el patrón desordenado de expresión de elastina estaba asociado con un incremento en el %EVD. De forma importante, el tratamiento con 1D11 estaba asociado con un patrón mejorado de deposición de elastina en las crestas secundarias de pulmones tratados con oxígeno, y con un %EVD que fue normal. Estos datos indican que TGF- tiene un papel importante a la hora de mediar la expresión anormal de elastina en lesión pulmonar hiperóxica. Además, también indica que el tratamiento con un anticuerpo anti-TGF- puede proteger el pulmón lesionado del neonato frente a la formación desordenada de elastina. En esta etapa temprana en la lesión pulmonar, no se observó ningún cambio en la distribución de colágeno en los pulmones de crías de ratón expuestos a oxígeno (datos no mostrados).

Ejemplo 4: El tratamiento con un anticuerpo anti-TGF- mejora el desarrollo microvascular pulmonar en el pulmón hiperóxico en desarrollo

En el ratón y rata en desarrollo, la exposición a niveles elevados de oxígeno altera el desarrollo microvascular pulmonar normal (Roberts et al., Pediatr. Res. 17:368-375 (1983)); D’Angio et al., Front. Biosci. 7:d1609-1623 (2002)). Se ha dado a conocer que TGF- juega un papel en la regulación de la diferenciación de células que forman vasos sanguíneos (Roberts et al., Am. Rev. Respir. Dis. 140:1126-1128 (1989)). Por lo tanto, se realizó un estudio para determinar si un anticuerpo anti-TGF- puede mejorar el desarrollo microvascular pulmonar anormal observado en el pulmón de cría neonata lesionado por O2. Como se muestra en la Figura 8, la exposición crónica a 85% de O2 estaba asociada con ensamblaje microvascular pulmonar dismórfico. El patrón de tinción de células endoteliales microvasculares pulmonares con lectina fue más difuso y menos ordenado que el observado en el pulmón de control expuesto a aire. Esto también estaba asociado con un incremento en la densidad de volumen de células teñidas con lectina en la periferia de los pulmones lesionados de crías; el %FVD para lectina se incrementó en aproximadamente 4 veces en los pulmones de crías expuestos a 85% de O2 durante 10 días (Figura 9). Además, el tratamiento con 1D11 estaba asociado con un patrón similar de ordenación de células endoteliales en las vías respiratorias distales de pulmones tratados con 85% de O2. Además, la exposición a 1D11 estaba asociada con una reducción de casi 50% en %FVD de lectina en pulmones expuestos a un nivel elevado de O2. Estos datos indican que TGF- interrumpe el desarrollo microvascular pulmonar normal en el pulmón lesionado de neonato, y que la neutralización del TGF- con anticuerpos puede atenuar el desarrollo vascular pulmonar anormal.

Puesto que las células del músculo liso (SMC) influyen en el desarrollo microvascular pulmonar, se realizó un examen para determinar si la atenuación de la señalización anormal de TGF- en el pulmón lesionado de neonato con anticuerpo neutralizante de TGF- estaba asociada con una distribución mejorada de miofibroblastos. Como se muestra en la Figura 10, la lesión pulmonar hiperóxica estaba asociada con una disminución en miofibroblastos identificados por SMA en las paredes del pulmón distal. El %FVD de SMA disminuyó en casi 70% en los pulmones de crías expuestos crónicamente a 85% de O2 (Figura 9). Por el contrario, el tratamiento con anticuerpos anti-TGF- incrementó la cantidad de inmunorreactividad a SMA y el %FVD en el pulmón lesionado. Estos datos indican que la neutralización de TGF- tuvo un efecto saludable sobre la microvasculatura pulmonar lesionada del neonato. En este modelo, la inmunohistoquímica con anticuerpos anti-SMA no reveló un incremento en la muscularización de arterias pulmonares en pulmones de crías expuestos a 85% de O2 durante 10 días (datos no mostrados). Además, la masa ventricular derecha de las crías que respiran crónicamente niveles elevados de oxígeno no aumentó (RV:LV+S: PBS-aire 0,32 ± 0,04; PBS-85% O2 0,25 ± 0,05, P > 0,05).

Ejemplo 5: Crecimiento somático y tratamiento con anticuerpos anti-TGF-

La lesión pulmonar hiperóxica en el neonato está asociada con disminución del crecimiento somático. Debido a que el tratamiento con anticuerpo anti-TGF- estaba asociado con alveologénesis y vasculogénesis mejoradas del pulmón periférico, se realizó un estudio para determinar si el tratamiento con 1D11 tiene un efecto saludable sobre el crecimiento de crías expuestas a 85% de O2. La exposición de crías de ratón neonatas a niveles elevados de oxígeno estaba asociada con una disminución de casi 30% en el peso en comparación con crías de control que respiran aire (peso corporal a los 10 días de edad: PBS-aire: 5,26 ± 1,18 g, PBS-85% O2: 3,74 ± 1,0 g; n = 10-15, P < 0,05). El peso de crías tratadas con 1D11 y expuestas a 85% de O2 (4,62 ± 0,85 g) no fue significativamente diferente del peso de los controles que respiran aire.

En los ejemplos anteriores, la exposición a un anticuerpo anti-TGF- pan-específico promovió el desarrollo pulmonar en crías de ratón con lesión pulmonar. Se observó que la inhalación continua de niveles elevados de O2 disminuye la alveologénesis y altera la vasculogénesis durante la etapa terminal crítica del desarrollo del pulmón, como se dio a conocer previamente (Roberts et al., Pediatr. Res. 17:368-375 (1983); Warner et al., Am. J. Physiol. 275:L110-117 (1998); D’Angio et al., Front. Biosci. 7:d1609-1623 (2002)). Esto produjo hallazgos patológicos en la cría de ratón hiperóxica que son similares a los observados en seres humanos neonatos con BPD. De forma importante, la exposición a un anticuerpo anti-TGF-, comenzando en el período antenatal, mejoró el desarrollo alveolar, la deposición de elastina, y la estructura microvascular en los pulmones lesionados de crías neonatas.

Los resultados de estos estudios demuestran por primera vez que las terapias anti-TGF- pueden proteger el pulmón lesionado de neonato frente a la inhibición de la alveologénesis y vasculogénesis, y sirve como un tratamiento para BPD.

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La memoria descriptiva se entiende más detalladamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la memoria descriptiva. Las realizaciones en la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones de la invención, y no se deberían de interpretar para limitar el alcance de la invención. La cita de cualesquiera referencias aquí no es una admisión de que tales referencias son técnica anterior a la presente invención.

Excepto que se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento, etc., usados en la memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones, se han de interpretar como opcionalmente modificados en todos los casos por el término “alrededor de”. En consecuencia, excepto que se indique de otro modo lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener por la presente invención. Excepto que se indique de otro modo, la expresión “al menos” que precede a una serie de elementos se ha de entender que se refiere a cada elemento en la serie. También se describen aquí casos E1 a E25.

E 1. Un método para tratar un lactante con riesgo de desarrollar displasia broncopulmonar, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de TGF- al lactante.

E 2. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se administra al lactante durante el periodo prenatal.

E 3. El método de E 2, en el que el antagonista de TGF- se administra al lactante mediante administración a la madre antes del nacimiento del lactante.

E 4. El método de E 2, en el que el antagonista de TGF- se administra directamente al lactante en el útero.

E 5. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se administra al lactante durante el periodo postnatal.

E 6. El método de E 1, en el que la edad del lactante es alrededor de 24 semanas de gestación a alrededor de 6 meses después del nacimiento.

E 7. El método de E 1, en el que el lactante es un lactante prematuro nacido a una edad de alrededor de 24 a alrededor de 32 semanas de gestación.

E 8. El método de E 1, en el que el peso del lactante en el nacimiento es alrededor de 1500 gramos o menos.

E 9. El método de E 1, en el que el peso del lactante en el nacimiento es alrededor de 1000 gramos o menos.

E 10. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-TGF-, un anticuerpo anti-receptor de TGF-, y un receptor de TGF- soluble.

E 11. El método de E 10, en el que el anticuerpo es una forma humana o humanizada del anticuerpo monoclonal 1 D11.

E 12. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- es un anticuerpo monoclonal administrado a una dosis que tiene una potencia equivalente a la potencia del anticuerpo 1D11 a una dosis de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal.

E 13. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- es un anticuerpo monoclonal administrado a una dosis que tiene una potencia equivalente a la potencia del anticuerpo 1 D11 a una dosis de peso corporal.

E 14. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado pan-específico.

E 15. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se administra intramuscularmente, intravenosamente, o subcutáneamente.

E 16. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se inhala en una forma aerosolizada.

E 17. El método de E 16, en el que el antagonista de TGF- se administra mediante un nebulizador o un inhalador.

E 18. El método de E 16, en el que dicha forma aerosolizada comprende gotitas menores que 10 m de diámetro, comprendiendo dichas gotitas el antagonista de TGF- en un vehículo líquido farmacológicamente aceptable adecuado.

E 19. El método de E 1, en el que el antagonista de TGF- se inhala en forma de polvo que comprende

5 partículas menores de 10 m de diámetro. E 20. El método de E 1, que comprende además administrar al lactante al menos un agente o terapia adicional seleccionado del grupo que consiste en tensioactivo, terapia con oxígeno, terapia con ventilador, un esteroide, vitamina A, óxido nítrico inhalado, formulación nutricional rica en calorías, un diurético, y un broncodilatador.

10 E 21. Uso de un antagonista de TGF- para tratar displasia broncopulmonar en un lactante que lo necesite.

E 22. El uso de E 21, en el que el antagonista de TGF- se usa para mejorar displasia broncopulmonar en un lactante que ha sido diagnosticado con la enfermedad.

E 23. Uso de un antagonista de TGF- en la fabricación de un medicamento para tratar displasia broncopulmonar en un lactante que lo necesite.

15 E 24. Un método para tratar lesión pulmonar en un lactante, que comprende: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista TGF- al lactante; y proporcionar suplementación de oxígeno al lactante tras el nacimiento. E 25. El método de E 24, en el que el antagonista de TGF- se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-TGF-, un anticuerpo anti-receptor de TGF-, y un receptor de TGF- soluble.

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Claims

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