JPH09512910A

JPH09512910A - ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調因子およびそのアッセイ方法

Info

Publication number: JPH09512910A
Application number: JP7528573A
Authority: JP
Inventors: デニス，ジェイムズ・ダブリュー; デメトリオウ，マイケル
Original assignee: マウント・サイナイ・ホスピタル・コーポレイション
Priority date: 1994-05-04
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 1997-12-22
Also published as: DE69523750T2; ATE208494T1; CA2189340A1; DE69523750D1; EP0758452B1; US5821227A; EP0758452A1; US5981483A; WO1995030900A1; US5830671A; AU2404695A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる物質の存在に関するアッセイ方法に関する。ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、およびサイトカインか複合体を形成でき、ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインが既知濃度で存在している条件下にて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる可能性のある物質を、ＴＧＦ−β受容体てなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含むＴＧＦ−β結合化合物、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインと反応させ、複合体、遊離ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインをアッセイし、次いて、対照と比較する。また、本発明は、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物、および医薬上許容される担体、助剤または賦形剤からなる医薬組成物に関する。さらに、本発明は、増殖因子の活性を増強する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調因子およびそのアッセイ方法発明の分野本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状の治療方法ならびに組成物、およびかかる症状の治療に有用な化合物のスクリーニング方法に関する。発明の背景形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、細胞機能の諸相を調節しているサイトカインのグループである。遺伝子スーパーファミリーについての構造上のプロトタイプはＴＧＦ−βである。ＴＧＦ−βは前駆体として生成され、その前駆体構造は大部分のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーと共有されている。該スーパーファミリーは、ＴＧＦ−βファミリー、インヒビンファミリー、ＤＰＰ／ＶＧＩファミリーおよびミュラーの阻害物質ファミリー（Mullerian Inhibiting Substances Family）を包含する。ＴＧＦ−βファミリーは、ＴＧＦ−β１からＴＧＦ−β５と呼ばれる５種のメンバーを包含し、それらのすべてが約２５ｋｄのホモダイマーである（マッサーグ（Massague）、アニュアル・レビュー・セル・バイオロ（Annu.Review Cell B iol.）第６巻：５９７頁、１９９０年に概説されている）。また、該ファミリーはＴＧＦ−β１.２を包含し、それはジスルフィド結合により結合されたβ１およびβ２サブユニットを含むヘテロダイマーである。５種のＴＧＦ−β遺伝子は長い進化距離にわたって高度に保存的である。該遺伝子ファミリーから生成する成熟しプロセッシングされたサイトカインは、種間においてほとんど１００％のアミノ酸同一性を有し、該５種のペプチドは一群となって約６０〜８０％の同一性を示す。ＴＧＦ−βのすべての形態は、正常、上皮、内皮、線維芽細胞、ニューロン、リンパ球および造血細胞タイプにおいて、可逆的に増殖を阻害することが見いだされている（レビューのためには、マッサーグ、アニュアル・レビュー・セル・バイオロ、第６巻：５９７頁、１９９０年参照）。組織培養において、ＴＧＦ− β は、ｃｄｋ−４／サイクリンＤ活性化およびｃｄｋ２／サイクリンＥ活性化の両方、Ｇ１からＳ相までの遷移に必要なイベントをブロックすることにより、細胞の増殖を阻害することが示されている（エム・イー・エウェン（M.E.Ewen）、ヘイチ・ケイ・スルス（H.K.Sluss）、エル・エル・ホワイトハウス（L.L.Whi tehouse）、ディー・エム・リビングストン（D.M.Livingstone）、セル（Cell）、第７４巻、１００９頁（１９９３年）およびエイ・コフ（A.Koff）、エム・オーツキ（M.Ohtsuki）、ケイ・ポリアク（K.Polyak）、ジェイ・エム・ロバーツ（J.M.Roberts）、ジェイ・マッサーグ（J.Massague）、サイエンス（Science）第２６０巻、５３６頁（１９９３年））。また、ＴＧＦ−βの抗増殖作用はインビボにおいても示されている（シルバーステイン（Silberstein）およびダニエル（Daniel）、１９８７年、サイエンス第２３７巻：２９１〜２９３頁；およびラッセル（Russell）ら、１９８８年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８５巻：５１２６〜５１３０頁）。また、ＴＧＦ−βは、その効果が他の細胞応答に対して２次的であるとしても、細胞増殖を刺激しうる。例えば、ＴＧＦ−β１は、正常ラット・肝臓線維芽細胞の固定依存性増殖を促進することが示されており（ロバーツ（Roberts）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ第７８巻：５３３９頁、１９８１年；ロバーツら、ネイチャー（Nature）第２９５巻：４１７頁、１９８２年およびトワージク（Twardzik）ら、１９８５年、ジャーナル・セル・バイオケミ（J.Cell Biochem.）第２８巻：２８９頁、１９８５年）、それはＡＫＲ−２Ｂ線維芽細胞のコロニ形成を誘導する（タッカー（Tucker）ら、サイエンス第２２６巻：７０５頁、１９８４年）。ＴＧＦ−βの阻害／刺激作用は、細胞タイプおよび細胞の生理学的状態に依存する可能性がある。ＴＧＦ−βは細胞付着の媒介に関与している。正常な間葉、上皮ならびにリンパ細胞、およびいくつかの腫瘍細胞系に対するＴＧＦ−β作用は、一般的に、細胞付着においてアップ−レギュレーション（up-regulation）を生じる。このアップ−レギュレーションは、細胞外マトリックス成分の合成ならび沈着の増加、細胞周囲の蛋白分解の減少、および細胞付着受容体の修飾によって媒介される（マッサーグ、１９９０年）。多くの細胞系統の細胞分化プロセスは、ＴＧＦ−βによって、ポジティブまたはネガティブに影響されうる。ＴＧＦ−βは、軟骨細胞および骨形成細胞タイプのポジティブな影響を及ぼすことが示されている（マッサーグ、１９９０年）。上記ＴＧＦ−βの生物学的作用は、生理学的状況におけるＴＧＦ−βの広範な役割を示唆するものである。ＤＮＡ複製、細胞分化、細胞付着および細胞外マトリックスのレイアウトを変調させるＴＧＦ−βの能力は、胚発生の形態学的イベントを誘導するシグナルの発生および修飾におけるＴＧＦ−βの役割を示すものである。細胞外マトリックス形成のプロモーターおよび細胞の移動ならびに発生のレギュレーターとしてのＴＧＦ−β活性は、炎症および組織修復プロセスに大きな影響を及ぼす。実際、傷害チャンバーまたは切開傷へのＴＧＦ−β１の投与は、一般的に、傷の治癒応答を加速することが示されている（スポーン（Sporn ）ら、１９８３年、サイエンス、第２１９巻：１３２９〜１３３１頁；ロバーツ（Roberts）ら、１９８６年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８３巻：４１６７〜４１７１頁；およびマストウ（Mustoe）ら、１９８７年、サイエンス、第２３７巻：１３３３〜１３３６頁）。サイトカインのＴＧＦ−βファミリーは、インビトロおよびインビボにおいて免疫抑制活性を示し、該活性は、一部には、リンパ球（ケール（Kehrl）ら、１９８６年、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immunol.）、第１３７巻：３８５５頁）、Ｔリンパ球（ケールら、１９８６年、ジャーナル・イクスペ・メティ（J.Exp.Med.）第１６３巻：１０３７頁）および胸腺細胞（リストウ（Ristow ）、１９８６年、ＰＮＡＳＵＳＡ第８３巻：５５３１頁）に対するＴＧＦ−βの抗増殖作用によるものである。組織における過剰のＴＧＦ−β活性はバランスを失った細胞外マトリックスの沈着を引き起こす可能性があり、それは線維症の一因となる可能性があり、一方では、ＴＧＦ−βの増殖阻害活性の欠乏は腫瘍原性形質転換を引き起こす可能性がある。ＴＧＦ−βの調節不良は、多くの疾病の病理学的プロセスに関与している。ＴＧＦ−βは、ＨＩＶ感染およびその関連疾患における病理学的メディエイタであると報告されている（ロッツ,エム（Lotz,M.）およびセス,ピー（Seth,P.）、アナルス・オブ・ザ・ＮＹ・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Annals of the NY Acad．of Sciences）第６８５巻：５０１頁、１９９３年）。また、ＴＧＦ−βは、肺の線維症を誘導する線維症（ビーチャー−アラン（Be acher-Allan）およびバース（Barth）、レジオナル・イミュノロジー（Regional Immunology）第５巻（３〜４）：２０７頁、１９９３年）、ならびに慢性肝臓疾患に関連した線維症（バート,エイ・ディー（Burt,A.D.）、ジャーナル・オブ・パソロジー(J.of Pathology)第１７０巻：１０５頁、１９９３年）、肝静脈閉塞および突発間質性肺炎の発症に関与しており、それらは、骨髄移植後（アンシャー,エムエス（Anscher,MS）ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）第３２８巻：１５９２頁、１９９３年）、腎臓疾患（ボーダー(Border)ら、ネイチャー第３６９巻：３６０頁、１９９２年）、および放射線療法もしくは放射線事故（マーチン・エム（Martin,M.）ら、ラジエイション・リサーチ（Radiation Research）第１３４巻：６３頁、１９９３年）の罹患および死亡の主な原因である。ＴＧＦ−β２は、増殖性のガラス体網膜症のヒトの目、および全身性硬化症の皮膚において増加することが見いだされている（コナー（Conner）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J.Clin Invest.）第８３巻：１６６１頁、１９８９年およびクロジク（Kulo zik）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション第８６巻：９１７頁、１９９０年）。血圧を変化させるためのＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βアンタゴニストの使用が、１９９１年１２月２６日公開のＰＣＴ／ＵＳ９１／０４４９に開示されている。チャイニーズ・ハムスター・卵巣細胞から得た組み換えＴＧＦ−βは、組み換え型分子を毎日投与されたシノモルグスのサルの動脈血圧の迅速、有意かつ持続性のある低下を誘導すると報告された。ＤＰＰ／ＶＧ１ファミリーは、ＢＭＰ１からＢＭＰ７と命名された骨髄骨形成蛋白（ＢＭＰ）、ＤＰＰおよびＶｇ１を包含する。ＢＭＰは成人の骨に存在する骨誘導剤である。それらは、新たな骨の形成の有効なイニシエーターであり、それらは間葉性前駆細胞に作用して、その軟骨ならびに骨形成細胞への分化を指令すると思われる。それらは、胚の骨格形成期間において重要な役割を果たしていることも示唆されている（ローゼン（Rosen）およびシース（Thies）、トレンズ・イン・ジェネティクス（Trends in Genetics）第８巻（３）、９７頁、１９９２年におけるレビューおよびその中の引用文献参照）。デカペンタプレジック（ Decapentaplegic(DPP)）は、ショウジョウバエにおける背腹部のパターン化およびイマジナルディスク（imaginal disk）形成において基本的な役割を果たしている（パジェット（Padgett）ら、１９８７年、ネイチャー、第３２５巻：８１〜８４頁）。Ｖｇ１はキセノプス・ラエビス（Xenopus laevis）における胚の発生に関与している。インヒビンファミリーはアクチビンおよびインヒビンを包含する。アクチビンは多くの生物学的プロセスの調節に関与している。例えば、それらは多くの腫瘍細胞の増殖、腹側の下垂体ホルモン（ＥＧ、ＦＳＨ、ＧＨ、およびＡＣＴＨ）の分泌ならびに発現の調節、ニューロンの生存、視床下部オキシトシン分泌、赤血球産生、胎盤ならびに性腺のステロイド生成、初期胚発達等に関与している。また、インヒビン分子は赤血球産生の調節を助け、ＦＳＨ放出を変調させる（メイソン（Mason）ら、１９８５年、ネイチャー第３１８巻：６５９〜６６３頁およびリング（Ling）ら、ネイチャー第３２１巻：７７９頁、１９８６年）。ミュラーの阻害物質ファミリーは、哺乳動物の胚の発達中の再生系における重要な形態形成シグナルであるミュラーの阻害物質（ＭＩＳ）を包含する（ケイト（Cate）ら、セル第４５巻：６８５〜６９８頁）。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、関連受容体のファミリーを通してのシグナル変換を媒介しうる。ＴＧＦ−βおよびアクチビン用の細胞表面受容体はタイプＩおよびタイプＩＩの受容体鎖からなり、いずれもがシステインに富む細胞外ドメインおよび細胞質ゾルにあるセリン／スレオニン蛋白キナーゼドメインを含んでいる。タイプＩおよびタイプＩＩ受容体はヘテロダイマーを形成し、該ヘテロダイマーはサイトカイン依存性細胞内シグナリングに必要であると思われる（マッサーグ、セル、第６９巻：１０６７頁、１９９２年ならびにその中の引用文献、およびリン（Lin）ら、セル、第６８巻７７５頁、１９９２年）。ＴＧＦ−β阻害蛋白が同定されており、それらはシグナリング受容体としては機能しない。プロテオグリカンであるベータグリカンは、受容体ＩおよびＩＩの次に最も広く分布しているＴＧＦ−β結合蛋白である。ベータグリカンは、コア蛋白を介してＴＧＦ−βと結合する膜固定プロテオグリカンであり、ベータグリカンはＴＧＦ−βシステムにおける受容体アクセサリー分子として作用することが示唆されている（マッサーグ、セル、第６９巻：１０６７頁、１９９２頁およびその中の引用文献）。他の多くの細胞外マトリックス蛋白がＴＧＦ−βに結合することが示されており、デコリン、ビグリカン、スロンボスポンジンおよび血清糖蛋白α２−マクログロブリンを包含する（ワイ・ヤマグチ（Y.Yamaguchi）、ディー・エム・マン（D.M.Mann）、イー・ルオスラーチ（E.Ruoslahti）、ネイチャー第３４６巻、２８１頁（１９９０年）；エス・ショルツ−シェリー（S.Scholtz-Cherry）、ジェイ・イー・マーフィー−ウルリッヒ（J.E.Murphy-Ullrich）、ジャーナル・セル・バイオロ（J.Cell Biol.）第１２２巻、９２３頁（１９９３年）；オコーナー−マクコート,エム（O'Conner-McCourt）、エム・ウェイクフィールド（M.Wak efield）、ジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６２巻、１４０９０頁（１９８７年）；およびジェイ・マッサーグ（J.Massague）、カレ・バイオロ（Curr.Biol.）第１巻、１１７頁（１９９１年））。スロンボスポンジンは、潜在的なＴＧＦ−βに結合し活性化することが示されているが、サイトカイン活性を中和しない。対照的に、デコリンは、ＴＧＦ−βの抗増殖活性を中和することが示されている（ヤマグチ（Yamaguchi）ら、ネイチャー第３４６巻：２８１頁、１９９０年）。また、実験的な糸球体腎炎モデルを用いて、デコリンがインビボにおいてＴＧＦ−βの作用に拮抗することが見いだされている（ボーター（Border）ら、ネイチャー第３６０巻、１９９２年）。ウシ・フェツインはウシ胎児血清（ＦＣＳ）から精製された最初の糖蛋白の１つである。フェツインは、肝臓により産生されると考えられているヒト・α−２ＨＳ−糖蛋白（α２−ＨＳ）と類似である（ケラーマン（Kellerman）ら、ジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６４巻：１４１２１頁、１９８９年）。フェツインは、既知細胞表面受容体を用いなくても、インビトロにおいて細胞増殖を促進することが示されており（ビー・ティー・パック（B.T.Puck）、シー・エイ・ワルドレン（C.A.Waldren）、シー・ジョーンズ（C.Jones）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第５９巻、１９２頁（１９６８年））、さらにそれは負の急性フェーズの反応物であることが示されている（ジェイ・ピー・レブレトン（J.P.Lebreton）、エフ・ジョイセル（F.Joisel）、ジェイ・ピー・ラウール（J.P.Raoult）、ビー・ラヌゼル（B.Lannuzel）、ジェイ・ピー・ロゲス（J.P.Rogez）ら、ジャーナル・クリニ・インベスティ（J.Clin.Invest.）第６４巻、１１８頁（１９７９年）；エム・ダボー（M.Daveau）、シー・ダブリンシェ（C.Davrinche）、エヌ・ジエラッシ（N.Djelassi）、ジェイ・レメタイヤー（J.Lemetayer）、エヌ・ジュレン（N.Juren）ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ第２７３巻、７９頁（１９９０年））。血清フェツインは骨に蓄積し（アイ・アール・ディクソン（I.R.Dickson ）、エイ・アール・ポーレ（A.R.Poole）、エイ・ヴェイス（A.Veis）、ネイチャー第２５６巻、４３０頁（１９７５年）；ジェイ・ティー・トリフィット（J. A.Triffitt）、ユー・ゲバウアー（U.Gebauer）、ビー・エイ・アシュトン（B.A .Ashton）、エム・イー・オーウェン（M.E.Owen）、ネイチャー第２６２巻、２２６頁（１９７６年）；ジー・ラウス（G.Rauth）、オー・ペシュケ（O. チッパー（S.Tipper）ら、ヨーロ・ジャーナル・バイオケミ（Eur.J.Biochem.）第２０４巻、５２３頁（１９９２年））、骨の増殖期間中に最高濃度となる。また、それはインビトロにおいて培養された骨外移植物中の骨再吸収を促進し（ジー・シー・コルクレイジャ（G.C.Colclasure）、ダブリュ・エス・ロイド（W.S. Lloid）、エム・ラムキン（M.Lamkin）、ダブリュ・ゴナーマン（W.Gonnerman）、アール・エフ・トリキシラー（R.F.Troxler）ら、ジャーナル・クリニ・エンドクリノ・メタボリズム（J.Clin.Endocrin Metabolism）第６６巻、１８７頁（１９８８年））、脂質生成を増加させる（エイ・ジェイ・カヤッテ（A.J.Cayatt e）、エル・クムブラ（L.Kumbla）、エム・ティー・アール・スビアー（M.T.R.S ubbiah）、ジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６５巻、５８８３頁（１９９０年））。炎症は、有意に低下した血清フェツイン濃度に関連している（ジェイ・ピー・レブレトン（J.P.Lebreton）、エフ・ジョイセル(F.Joisel) 、ジェイ・ピー・ラウール（J.P.Raoult）、ビー・ラヌゼル（B.Lannuzel）、ジェイ・ピー・ロゲス（J.P.Rogez）ら、ジャーナル・クリニ・インベスティ第６４巻、１１８頁（１９７９年）；エム・ダボー（M.Daveau）、シー・ダブリンシェ（C.Davrinche）、エヌ・ジエラッシ（N.Djelassi）、ジェイ・レメタイヤー（J.Lemetayer）、エヌ・ジュレン（N.Juren）ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ.第２７３巻、７９頁（１９９０年））。さらに、パジェット病（無秩序かつ厚い骨を誘導する骨のターンオーバーの増加の病気）の患者において血清フェツイン濃度が低下する（ビー・エイ・アシュトン（B.A.Ashton）、アール・スミス（R.Smith）、クリニ・サイ（Clin.Sci）第５８巻、４３５頁（１９８０年））。骨形成不全の患者の一部において、骨の消失は上昇した血清フェツインレベルに関連している。発明の概要本発明者らは、フェツインがＴＧＦ−βに結合し、ＴＧＦ−βの抗増殖活性に拮抗し、さらに、用量依存的様式でＴＧＦ−βの抗増殖活性を阻害しうることを見いだした。また、本発明者らは、組織培養におけるＴＧＦ−βのアンタゴニストとしてのフェツインの作用はそれら２つの蛋白の結合によるものであることを示した。リアルタイムで高分子相互作用の可視化を可能にする表面プラズモン共鳴を用いることにより、フェツインが物理的にＴＧＦ−β１に結合しうることが示された。フェツインは、密接な関連のあるサイトカインＴＧＦ−β２にも同様の親和性で結合することが示された。また、フェツインは、最高の親和性で骨形態形成蛋白に結合し、骨形態形成蛋白は固定化ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−６を包含する。ＢＭＰ−２はフェツインに最高の親和性を示し、フェツインはＢＭＰ−２により媒介されるインビトロでの骨分化を抑制することが見いだされた。さらにそのうえ、本発明者らは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩホモロジー１ドメイン（ＴＲＨ１）と命名されたフェツインおよびＴＧＦ−β受容体タイプＩＩに共通した結合ドメインを意味深く決定した。該ドメインは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインへの結合を媒介する。該ドメインは、図６〜８においてａおよびｂと命名された２個のジスルフィドループによって定義される。ウシ・チログロブリンのごとき他の蛋白は、ＴＲＨ１ドメインを含むことが見いだされた。チログロブリンは、フェツイン以上の親和性で、サイトカインＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＴＧＦ−β１、およびＴＧＦ−β２と結合することが見いだされた。さらに、チログロブリンは、増殖阻害アッセイにおいて、ＴＧＦ−β 活性を中和することが見いだされた。また、本発明者らは、リガンド結合およびリガンド特異性が、ＴＲＨ１ドメイン中のＴＲＨ１ｂ配列によって媒介されることも見いだした（図６および７、ならびに配列表５〜７参照）。フェツインおよびＴＲＨ１中のこのドメインに対応する合成ジスルフィドループのあるペプチドは、同じ特異性でＢＭＰ−２およびＴＧＦ−β１に直接結合し、ネイティブ蛋白のドメインが反映された。ＴＲＨ１ドメインおよびＴＲＨ１ｂサブドメインは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー、例えばデコリンに結合し、その活性を中和することが以前に示されていた化合物中には見いだされなかった。フェツインおよびチログロブリンは、ＴＲＨ１ドメイン中の配列を介してＴＧＦ−βスーパーフェミリーのサイトカインと複合体形成し、さらにこれらのサイイトカインのアンタゴニストであるという知見は、ＴＧＦ−βスーパーフェミリーのサイトカインを変調させる物質、よってＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの変調を必要とする症状の治療に有用である物質の同定を可能にする。それゆえ、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる物質の存在のアッセイ方法であって、（ａ）ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、およびサイトカインが複合体を形成でき、ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインが既知濃度で存在している条件下にて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる可能性のある物質を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含むＴＧＦ−β結合化合物、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインと反応させ、（ｂ）複合体、遊離ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインをアッセイし、次いで、（ｃ）対照と比較することからなる方法に関する。さらに本発明は、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインを含むＴＧＦ−β結合化合物の、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させるための使用に関する。詳細には、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状の治療のためのこれらの化合物の使用に関する。化合物を直接個体に導入してもよく、あるいは化合物を、ＴＧＦ−β結合化合物をコードする遺伝子の発現によって直接的に製造してもよい。それゆえ、本発明は、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物、および医薬上許容される担体、助剤または賦形剤からなる医薬組成物に関する。該組成物をＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインのアンタゴニストとして用いてもよく、それゆえ、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの変調を必要とする症状の治療に有用であろう。また、本発明は、ＴＧＦ−β受容体でなく、ＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物をコードする遺伝子を含む組み換え分子からなる医薬組成物に関する。また、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状に苦しむ対象の治療方法であって、ＴＧＦ−β受容体でなく、ＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む有効量のＴＧＦ−β結合化合物、または本発明方法により同定される物質を投与することからなる方法を企図する。また、本発明は、個体において効果がＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインによって抑制されている増殖因子の活性の増強方法であって、本発明組成物、または本発明方法により同定されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアンタゴニストである物質を個体に投与することからなる方法を企図する。さらに本発明は、試料中のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアッセイ方法であって、（ａ）化合物およびサイトカインが複合体を形成でき、化合物および／またはサイトカインが既知能度で存在している条件下にて、サイトカインを含有する可能性のある試料を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む一定量のＴＧＦ−β結合化合物、および一定量のサイトカインと反応させ、（ｂ）複合体、遊離化合物および／またはサイトカインをアッセイし、次いで、（ｃ）対照と比較することからなる方法を企図する。本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかであろう。しかしながら、詳細な説明および特別な実施例は特定の具体例を示すが、それらは説明のためだけに示され、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾はこの詳細な説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図面と関連づけて本発明を説明する。図１は、ＭｖＩＬｕ細胞の培養においてウシ・フェツインおよびウシ・チログロブリンがＴＧＦ−βの抗増殖活性を中和することを示すグラフである。図２は、ユニット数（Ｒ.Ｕ.）に対応して固定化ＴＧＦ−β１に結合するウシ・フェツインを示すセンサグラムオーバーレイプロット（sensogram overlay plot ）である。図３は、非結合対照ヒト・トランスフェリンのセンサグラムオーバーレイプロットである。図４は、ユニット数（Ｒ.Ｕ.）に対応して固定化ＢＭＰ−２に結合するウシ・フェツインを示すセンサグラムオーバーレイプロット（sensogram overlay plot ）である。図５は、非結合対照ＢＳＡのセンサグラムオーバーレイプロットである。図６は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびヒト由来のフェツイン配列を並べたものである。図７は、フェツインのジスルフィドループのスキーム図である。図８は、フェツインおよびＴβＲＩＩ配列を並べたものである。図９は、ジスルフィドループ化したＴＲＨ１ｂフェツインペプチドの固定化ＢＭＰ−２への結合を示すセンサグラムプロットである。図１０は、還元されアルキル化されたＴＲＨ１ｂペプチドの結合の欠失を示すセンサグラムプロットである。図１１は、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体の配列を示す。図１２は、ＭｖＩＬｕ細胞の培養においてウシ・フェツインおよびウシ・チログロブリンがＴＧＦ−βサイトカインの抗増殖活性を中和することを示すグラフである。図１３は、１８個のアミノ酸が環化したＴＲＨ１ペプチドの低紫外線ＣＤスペクトルである。図１４は、フェツインおよびＴＲＨ１由来のループ化したＴＲＨ１ｂペプチドを用いる、固定化ＴＲＨ１へのＴＧＦ−β１結合の競争を示す棒グラフである。図１５は、フェツインが、デキサメタソンで６日間処理したラット・骨髄細胞の増殖を刺激することを示すグラフである。図１６は、フェツインが１ないし３週間存在した場合に、デキサメタソン処理培養物において引き続き起こる無機質化を阻害し、骨形成活性のみを欠くことを示すグラフである。図１７は、デキサメタソン処理および未処理培養物において測定された活性ＴＧＦ−βおよび全ＴＧＦ−βを示すグラフである。図１８は、中和的抗ＴＧＦ−β抗体が無機質化を抑制し、１〜３週間の培養期間においてフェツインとともに添加物であったことを示すグラフである。発明の詳細な説明上で述べたように、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる物質の存在についてのアッセイ方法に関する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる可能性のある物質を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１またはその一部もしくは模倣物を含むＴＧＦ−β結合化合物、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインと反応させる。適当な反応条件を用いて、化合物とサイトカインとの間に複合体を形成させる。複合体、遊離化合物および／またはサイトカインをアッセイし、結果を対照と比較する。本明細書において、「ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン」、「ＴＧＦ−βのスーパーフェミリーのサイトカイン」、または「ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカイン」は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの構造的特徴を有するサイトカインを包含する。遺伝子スーパーファミリーについての構造上のプロトタイプはＴＧＦ−βである。ＴＧＦ−βは、小胞体を越えた転位のためのＮ末端疎水性シグナル配列、プロ領域、およびＣ末端生物活性ドメインを有することにより特徴づけられる前駆体として生成される。細胞からの放出の前に、プロ領域は、生物活性ドメイン直前の４個の塩基性アミノ酸を含む領域で開裂される（マッサーグ、１９９０年）。ＴＧＦ−β１の前駆体の構造は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインのメンバーによって共有されているが、明確なシグナル配列を欠くＴＧＦ−β４前駆体は例外である。Ｃ末端生物活性ドメインにおけるファミリーのメンバー間の同一性の程度は２５ないし９０％である（バスラー（Basler）ら、セル、第７３巻：６８７頁、１９９３年の図２参照）。スーパーフェミリーのすべてのメンバーにおいて、生物活性ドメイン中の少なくとも７個のシステインが保存されており、９個すべてのシステインがＴＧＦ−βファミリーおよびインヒビンβ 鎖において保存されている。ミュラーの阻害物質（ＭＩＳ）は例外であるが（ケイト（Cate）ら、１９８６年）、生物活性ドメインは開裂されて成熟モノマーを生じる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの例は、ＴＧＦ−βファミリー、インヒビンファミリー、ＤＰＰ／ＶＧ１ファミリーおよびミュラーの阻害物質ファミリーのサイトカインを包含する。ＴＧＦ−βファミリーは、ＴＧＦ−β１からＴＧＦ−β５と呼ばれる５種のメンバーを包含し、それらはすべて約２５ｋｄのホモダイマーを形成する（マッサーグ、１９９０年のレビュー）。さらに該ファミリーはＴＧＦ−β１.２を包含し、それはジスルフィド結合により結合したβ１およびβ２サブユニットを含むヘテロダイマーである。５種のＴＧＦ−β遺伝子は、長い進化距離にわたり非常に保存されている。該遺伝子ファミリーのメンバーから生成される成熟しプロセッシングされたサイトカインは、種間においてほぼ１００％のアミノ酸同一性を示し、該５種のペプチドは一群として約６０〜８０％の同一性を示す。ＤＰＰ／ＶＧ１ファミリーは、ＢＭＰ−２ないしＢＭＰ−７命名された６種のＢＭＰ、Ｖｇ１、およびＤＰＰを包含する。ＢＭＰは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーに対して３０〜４０％の相同性がある。ＢＭＰ−２〜７は、インヒビン／アクチビンを包含するインヒビンファミリーのメンバーとかなりの相同性を共有している。インヒビンは、αサブユニット、βＡサブユニット(インヒビンＡ) 、またはβＢサブユニット（インヒビンＢ）からなる。２種のβ−サブユニットのアミノ酸同一性は約６０％であるが、αサブユニット配列は非常に多様である（同一性約２５％）。該ファミリーは、インヒビンＡ（α・βＡダイマー）、インヒビンＢ（α・βＢダイマー）、アクチビンＡ（βＡホモダイマー）、およびアクチビンＡＢ（βＡ・βＢダイマー）を包含する（ＤＰＰ／ＶＧ１ファミリーおよび特にＢＭＰについてのレビューのためには、マッサーグ、１９９０年、およびローズ,ブイ（Rose,V.）およびアール・エス・チース（R.S.Thies）、１９９２年参照）。ミュラーの阻害物質ファミリーは、ミュラーの阻害物質（ＭＩＳ）ホモダイマーを包含する。ＭＩＳのＣ末端ドメインの推定配列は、スパーファミリーの他のメンバーのＣ末端ドメインと約２５％の同一性がある。ＭＩＳは、７０〜７４ｋｄの糖鎖付加された鎖のジスルフィド結合したホモダイマーであり、Ｃ末端ドメインから開裂されない糖鎖付加されたＮ末端伸長部を含む（レビューのために、マッサーグ、１９９０年およびその中の引用文献参照）。好ましくは、本明細書記載の方法および組成物は、ＴＧＦ−βファミリーおよびＤＰＰ／ＶＧ１ファミリーを含み、最も好ましくは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ− β２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−６を含む。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを天然または組み換えソースから単離することができる。例えば、培養中の種々の正常または形質転換細胞によってＴＧＦ−βを合成してもよく（ロバーツ（Roberts）ら、１９８１年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７８巻：５３３９〜５３４３頁）、また、胎盤（フロリク（Frolik）ら、１９８３年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８０巻：３６７６〜３６８０頁）、腎臓（ロバーツ（Roberts）ら、１９８３年、バイオケミストリー（Biochemistry）第２２巻：５６９２〜５６９８ペ頁）、尿（トワルジク（Twardzik）ら、１９８５年、ジャーナル・セル・バイオケミ（J.Cell Biochem.）第２８巻：２８９〜２９７頁）、および血小板（チャイルズ（Childs）ら、１９８２年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７９巻：５３１２〜５３１６頁）から精製されている。ＢＭＰ−２、−３、６および７をヒト・および／またはウシ・骨から単離してもよい。サイトカインのコーディング配列を含む組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を用いる組み換え法を用いることにより、大量のサイトカインを得てもよい。また、サイトカインは市販されている（例えば、コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード,ＭａからＴＧＦ−β１を得てもよい）。本明細書記載の方法および組成物に用いるＴＧＦ−β結合化合物は糖蛋白またはポリペプチドであってもよい。化合物は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン、好ましくはＴＧＦ−β１に、１０^-5よりも大きいＫ_Dで結合し、そして／または本明細書記載の増殖阻害アッセイにおいてＴＧＦ−β１またはＢＭＰ−２のごときＴＧＦ−βサイトカインの活性を中和する。ＴＧＦ−β結合化合物は、本来の標的ＴＧＦ−β受容体でなく、すなわち細胞質ゾルにあるセリン／スレオニン蛋白キナーゼドメインを含むＴＧＦ−βまたはアクチビンのタイプＩまたはタイプＩＩ受容体ではない。ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体の配列を図１１および配列表１に示す。ＴＧＦ−β結合化合物の蛋白部分は、少なくとも１個のＴＲＨ１ドメインのアミノ酸配列、またはその一部もしくは模倣物を含む。ＴＲＨ１ドメインは、図７および８においてａおよびｂと命名された２個のジスルフィドループを含む長さ約４３個のアミノ酸の領域からなる。ＧＣＧルーチン「findPatterns」および下記パターンを用いてＴＲＨ１ドメインを同定してもよい：ＣＸ｛８,１４｝（Ｎ, Ｑ）Ｘ｛１２,１６｝ＣＸ｛４,５｝（Ｋ,Ｒ）Ｘ｛２,６｝（Ｓ,Ｔ）Ｘ｛４,９｝ＣＸ｛０,２｝ＤＸ｛５,６｝（Ｄ,Ｅ）（本明細書実施例３参照）。フェツイン由来のＴＲＨ１ドメインを配列番号：２および図８に示す。ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体由来のＴＲＨ１ドメインを配列番号：３および図８に示す。チログロブリン由来のＴＲＨ１ドメイン配列番号：４および図８に示す。好ましくは、化合物は、約１８〜２０個のアミノ酸を含むＴＲＨ１ｂサブドメインのアミノ酸配列を有するＴＲＨ１ドメインの一部を含む。ＧＣＧルーチン「findpatterns」および以下のパターンを用いてＴＲＨ１ｂサブドメインを同定してもよい：ＣＸ｛４ ,５｝（Ｋ,Ｒ）Ｘ｛２,６｝（Ｓ,Ｔ）Ｘ｛４,９｝ＣＸ｛０,２｝ＤＸ｛５,６｝（Ｄ,Ｅ）、またはＣＸ｛０,１｝（Ｖ,Ｉ,Ｆ,Ｙ）Ｘ｛１,３｝（Ｖ,Ｗ,Ｌ）Ｘ｛０,１｝（Ｋ,Ｒ）Ｘ｛４,５｝（Ｖ,Ｉ,Ｆ）Ｘ｛１,２｝（Ｌ,Ｉ）Ｘ｛２,４｝ＣＸ｛０,２｝Ｄ。フェツイン、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体、およびチログロブリン由来のＴＲＨ１ｂサブドメインをそれぞれ配列番号：５、６、および７、および図７に示す。配列番号：５、６および７に示す末端アミノ酸を除去して１８〜１９ＴＲＨ１ｂペプチドを得てもよいことが理解されるてあろう。本発明方法および組成物に用いてもよいＴＧＦ−β結合化合物の例は、α−２ −ＨＳ糖蛋白としても知られるヒト・フェツインを包含するフェツイン、チログロブリン、キニノジェン（ケラーマン（Kellerman）ら、バイオケミ・ジャーナル（Biochem.J.）第２４７巻：１５頁、１９８７年）、およびＴＲＨ１ｂペプチドである。ＴＧＦ−β結合化合物の蛋白部分は、ＴＲＨ１ドメイン、またはＴＲＨ１ｂサブドメインのごときその一部のアミノ酸配列と相同的な配列を包含する。ＴＲＨ１ドメイン、またはＴＲＨ１ｂサブドメインのごときその一部のアミノ酸配列と相同的な配列を、少なくとも、それぞれ約４０％および７０％同一性を有する配列と定義する。相同的配列を有するＴＧＦ−β結合化合物は、１０^-5よりも大きいＫ_DでＴＧＦ−βサイトカインに、好ましくはＴＧＦ−β１に結合でき、そして／または本明細書記載の増殖阻害アッセイにおいてＴＧＦ−β１もしくはＢＭＰ−２のごときＴＧＦ−βサイトカインの活性を中和しうるはずである。アミノ酸を同様のアミノ酸に置換することによりＴＧＦ−β結合化合物を修飾してもよいことが理解されよう。例えば、ＴＲＨ１ドメインまたはＴＲＨ１ｂサブドメインにおいて、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換してもよく、あるいは疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換してもよい。本発明方法および組成物にＴＧＦ−β結合化合物の模倣物を用いてもよい。用語「模倣物」は、関連３次元構造を有する化合物、すなわち、図７に図式的に示す特徴的なジスルフィドループ構造の一方または双方、好ましくは、「ｂ」と命名されたループ構造を有する化合物をいう。例えば、ピー・エス・ファーマー（ P.S.Farmer）、「ドラッグ・デザイン」第１０巻、１１９〜１４３頁（イージェイ・アリエンス（EJ Ariens）編、ニューヨークのアカデミックプレス）；ボール,ジェイビー（Ball JB）、ピーエフ・アレウッド（PF Alewood）、ジャーナル・モレ・レコグニション（J.Mol.Recognition）第３巻、５５頁、１９９０年；ビーエイ・モーガン（BA Morgan）およびジェイエイ・ゲイナー（JA Gainer）、アニュ・レポ・メディ・ケミ（Annu.Rep.Med.Chem.）第２４巻、２４３頁、１９８９年；およびアールエム・フリーディンガー（RM Friedinger）、トレンズ・ファーマコロ・サイ（Trends Pharmacol.Sci.）第１０巻、２７０頁、１９８９年記載のような方法を用いて模倣物の選択を行ってもよい。ＴＧＦ−β結合化合物はキメラ分子であってもよい。例えば、フェツインのＴＲＨ１ｂ領域（配列番号：５および配列番号：２のＣｙｓ２６からＣｙｓ４４まで）を、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体の対応ループ（配列番号：６および配列番号：３のＣｙｓ２４からＣｙｓ４１まで）によって置換するこができる。慣用的な単離精製法を用いてフェツインおよびチログロブリンのごときＴＧＦ −β結合化合物を得てもよい。例えば、ウシ胎児血清の硫酸アンモニウム分別沈殿、次いで、ゲル濾過クロマトグラフィーによって化合物を得てもよい。それらを市販ソースから得てもよい（例えば、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ（ Sigma））。固相合成（メリフィールド（Merrifield）、１９６４年、ジャーナル・アメ・ケミ・アソシ（J.Am.Chem.Assoc.）第８５巻：２１４９〜２１５４頁）または均一溶液中での合成（ハウベンウェイル（Houbenweyl）、１９８７年、メソッズ・オブ・オーガニック・ケミストリー（Methods of Organic Chemistry ）（イー・ワンシュ（E.Wansch）編）第１５巻ＩおよびＩＩ（シュトゥットガルトのティーメ）のごとき蛋白化学においてよく知られた方法を用いる化学合成のごとき慣用的方法を用いてＴＧＦ−β結合化合物を合成的に構築してもよい。ＴＧＦ−β結合化合物、およびＴＲＨ１ドメインならびにＴＲＨ１ｂサブドメインを包含するその一部を、細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞、動物を包含する宿主細胞において、当該分野においてよく知られた方法（例えば、イタクラ（Itakura）ら、米国特許第４,７０４,３６２号；ヒンネン（Hinnen）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ第７５巻：１９２９〜１９３３頁、１９７８年；マレイ（Murray ）ら、米国特許第４,８０１,５４２号；アプショール（Upshall）ら、米国特許第４,９３５,３４９号；ハーゲン（Hagen）ら、米国特許第４,７８４,９５０号；アクセル（Axel）ら、米国特許第４,３９９,２１６号；ゲデル（Goeddel）ら、米国特許第４,７６６,０７５号；およびサムブルック（Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９８９年参照）を用いて発現させてもよい。好ましくは、発現系は哺乳動物発現系である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて、正しく折り畳まれ糖鎖付加されたフェツインまたはキメラフェツインを製造でき、無血清培養上清から蛋白を回収することができる。一時的（transient）および安定（stable）なアプローチの両方を用いることができる。前者のアプローチは、比較的大量の組み換え蛋白を迅速に生産するために用いることにできるＳＦＵウイルスレプリコンに基づいていてもよい。安定なアプローチには、より恒久的かつ不変の蛋白源を得ることのできる、十分に特徴づけられたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用してもよい。蛋白をコードしているｃＤＮＡのコーディング領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法（ムリス（Mullis）ら、米国特許第４,８６３,１９５号およびムリス、米国特許第４,６８３,２０２号）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定によって確認することができる。ＰＣＲによるクローニング法は、発現ベクター中へのサブクローニングのための便利な制限部位の導入を可能にする。ＴＧＦ−β結合化合物およびＴＲＨ１ドメインならびにＴＲＨ１ｂサブドメインを包含するその一部を、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジおよびブタのごとき非ヒト・トランスジェニック動物において発現させてもよい（ハンマー（Hammer ）ら、ネイチャー第３１５巻：６８０〜６８３頁、１９８５年；パルミテル（Pa lmiter）ら、サイエンス第２２２巻：８０９〜８１４頁、１９８３年；ブリンスター（Brinster）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８２巻：４４３８〜４４４２頁、１９８５年、パルミテルおよびブリンスター、セル第４１巻：３４３〜３４５頁；および米国特許第４,７３６,８６６号参照）。本発明方法におけるＴＧＦ−β結合化合物およびＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの選択はアッセイすべき物質の性質によることが理解されるであろう。さらに、本発明方法における化合物およびＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの選択は、特異的相互作用に影響する特異的な化合物の同定を可能にするであろうということも理解されるであろう。かくして、本発明によるＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインに対するＴＲＨ１ドメインの特異的結合部位の同定は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインを変調させる特異的な物質の同定を可能にする。サイトカイン−ＴＧＦ−β結合化合物複合体の生成を可能にする条件を、サイトカインおよびＴＧＦ−β結合蛋白の性質および量のごとき因子に関連して選択することができる。本発明方法における複合体、および遊離の化合物ならびにサイトカインを、慣用的方法、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、フラクショネーション、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはそれらの組み合わせによって単離することができる。知られた方法を用いて複合体または遊離化合物またはサイトカインをアッセイすることができる。成分のアッセイを容易にするために、標識されていてもよい化合物またはサイトカインに対する抗体、あるいは標識化合物またはサイトカインを用いてもよい。本明細書記載の増殖阻害アッセイにおいて、ＴＧＦ−β１またはＢＭＰ−２のごときＴＧＦ−βサイトカインの活性を中和する能力を調べることにより、成分をアッセイしてもよい。対照として、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる可能性のある物質の不存在下で、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させることが知られている物質の存在下で本発明方法を行ってもよい。ＴＧＦ−β結合化合物およびＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインを用いて抗体を調製してもよく、該抗体を用いて複合体および遊離化合物の単離および分離を容易にしてもよい。下記のごとく、ＴＲＨ１ドメインおよびその一部に対する抗体を用いて、ネイティブな受容体への結合をブロックすることにより、ＴＧＦ−βサイトカインの活性を中和してもよく、したがって、線維症のように過剰なＴＧＦ−βサイトカイン活性が存在する場合、あるいはＴＧＦ−βがオートクリン腫瘍増殖因子として作用する場合、抗体は治療的介在を可能にしうる。それらを、診断への応用として生物学的試料中のＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの存在のアッセイに用いてもよい。本発明の文脈において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ(ａｂ')₂）および組み換え生産された結合パートナーを包含するものと理解される。当業者は、ウマ、ウシ、種々のトリ、ウサギ、マウス、またはラットのごとき温血動物からポリクローナル抗体を容易に得ることができる。本発明者らは、ウサギをＴＲＨ１ｂペプチドで免疫し、自己免疫状態において見られるのと同様な臨床的徴候を示す動物を得た。詳細には、ウサギは、足の甲の線維症を示し、肝臓において炎症応答の証拠が存在した。また、慣用的方法（米国特許ＲＥ３２,０１１、第４、９０２、６１４、４,５４３,４３９、および４,４１１,９９３号（参照によりそれらを本明細書に記載されているものとみなす）；さらに、ア・ニュー・ディメンジョン・イン・バイオロジカル・アナリシス（A New Dimension in Biological Analyses）、プレナム・プレス、ケネット（Kennet）、マクキーン（McKearn）およびベクトル（Bec htol）編、１９８０年、およびアンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）、ハーロウ（Harlow）およびレーン（La ne）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８８年（参照によりそれらを本明細書に記載されているとみなす）を参照）を用いてモノクローナル抗体を容易に得ることができる。組み換えＤＮＡ法を用いて、特異的結合抗体をコードする種々の遺伝子領域を取り込むことによって結合パートナーを構築してもよい（バード（Bird）ら、サイエンス第２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年参照）。いくつかのサイトカインに特異的な抗体を、市販ソースから得てもよい。例えば、ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインに対する抗体を、米国コネチカット州のアメリカン・ダイアグノスティクス・インコーポレイテッド（American Diagn ostics Inc）、米国ニューヨーク州のオンコジーン・サイエンス（Oncogene Sci ence）、およびカナダのミシソーガのディメンジョン・ラボラトリーズ（Dimens ion Laboratories）から得てもよい。種々の酵素、蛍光物質、化学発光物質および放射活性物質を用いる慣用的方法を用いて化合物またはサイトカインに対する抗体を標識してもよい。適当な酵素の例は、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを包含する。適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリスリンを包含し、化学発光物質の例はルミノールを包含し、適当な放射活性物質の例は、放射活性リン³²Ｐ、ヨウ素Ｉ¹²⁵ 、Ｉ¹³¹またはトリチウムを包含する。化合物またはサイトカインに特異的な抗体を、電子顕微鏡により容易に可視化できるフェリチンまたはコロイド状の金のごとき電子密度の高い物質に結合させてもよい。本発明方法に用いるＴＧＦ−β結合化合物またはサイトカインを不溶化してもよい。例えば、それらを適当な担体に結合させてもよい。適当な担体の例は、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹等である。担体は、例えば、管状、テストプレート（te st plate）状、ビーズ状、ディスク状、球状等であってよい。知られた化学的または物理的方法を用いて、例えば、臭化シアンカップリングを用いて、適当な不溶性担体と物質を反応させることにより、不溶化された化合物またはサイトカインを調製することができる。本発明方法を用いて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインを変調させる物質、好ましくはアゴニストまたはアンタゴニストである可能性のある物質をアッセイすることができる。一般的には、アンタゴニストは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインと同様の結合活性を有するが、通常はサイトカインによって誘導される生物学的応答を伝達することができない分子を構成要素としうる。さらに、アンタゴニストはサイトカインに対する受容体上の結合部位を模倣する分子であってもよい。例えば、アンタゴニストは、ＴＲＨ１ドメイン、詳細にはＴＲＨ１ｂサブドメインを含む分子を構成要素とする。本明細書に詳細に説明するように、ＴＲＨ１ドメイン（およびＴＲＨ１ｂサブドメイン）を含むフェツインおよびチログロブリンのごとき化合物はＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアンタゴニストである。一方、アゴニストは、サイトカインに対する受容体上の特異的結合部位、すなわち、ＴＲＨ１ドメインまたはＴＲＨ１ｂサブドメインに、本来のサイトカインと比較していくぶん有利な様式で結合する分子を構成要素とする。アゴニストまたはアンタゴニストは内在性の生理学的物質であってもよく、また、天然または合成薬品であってもよい。さらに、本発明は、少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物からなる医薬組成物に関する。また、本発明は、本発明方法を用いて同定される物質を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物を、ＴＧＦ−βサイトカインおよびＴβＲＩＩの相互作用についてのアゴニストまたはアンタゴニストとして用いてもよい。好ましくは、組成物はフェツイン、より好ましくはα−２ＨＳ−糖蛋白としても知られるヒト・フェツイン、または本明細書記載のキメラフェツインを含有する。フェツインは非免疫性の天然のヒトの化合物であり、本明細書記載のごとく組み換え分子として製造されうるので、フェツインは医薬上の薬剤として特に適している。本発明医薬組成物は、少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物または本発明方法を用いて同定される物質を、それのみ、あるいは他の活性物質と混合された状態で含有する。かかる医薬組成物を、経口的に、局所的に、直腸から、非経口的に、局部的に、吸入により、または脳内に使用することができる。それゆえ、それらは、固体または半固体、例えばピル、錠剤、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐薬、軟ゼラチンカプセル、ゲル、膜、チューブレット（tubelet）である。本発明組成物をトランスフェリンのごとき輸送分子と結合させて脳関門を越えた組成物の輸送を容易にしてもよい。本発明医薬組成物はさらなる治療化合物を含有していてもよい。例えば、リューマチ性関節炎、慢性活動性肝炎、および喘息を包含する多くの症状に治療に広く用いられているグルココルチコイドを本発明医薬組成物に含ませてもよい。本発明医薬組成物はヒトまたは動物への投与用を意図されている。投与量は個々の必要性、所望の効果および選択された投与経路による。医薬組成物を、患者に投与できる医薬上許容される組成物の製造に関する自体公知の方法により製造することができ、有効量の活性物質を医薬上許容される担体と混合する。例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、Pa、USA,１９８５年）に適当な担体が記載されている。これによると、医薬組成物は、１種またはそれ以上の医薬上許容される担体または希釈剤と混合された活性化合物または物質を含むが、それ以外のものを含んでいてもよく、適当なｐＨであって生理学的液体と等張な緩衝溶液中に含まれていてもよい。また、本発明は、ＴＧＦ−β受容体でなく、ＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物をコードしている遺伝子を含む組み換え分子からなる。さらに組み換え分子は適当な転写または翻訳調節エレメントを含む。適当な調節エレメントは種々のソース由来であってよく、当業者によってそれらは容易に選択されうる。調節エレメントの例は、転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボゾーム結合配列、転写開始シグナルを包含する。さらに、使用ベクターによっては、選択可能マーカーのごとき他の遺伝学的エレメントを組み換え分子中に組み込んでもよい。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターのごときインビトロ送達担体を用いて組み換え分子を対象細胞に導入することができる。マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションのごとき物理的方法または共沈およびリポソーム中へのＤＮＡ取り込みのごとき化学的方法を用いて、それらをかかる細胞中にインビボで導入してもよい。組成物をエアロゾル形態または洗浄法によって送達してもよい。さらに本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状に苦しむ患者を有効量のＴＧＦ−β結合化合物で治療する方法を提供する。本発明方法で同定されるアゴニストまたはアンタゴニストを投与することからなる治療方法もまた、本発明の範囲内である。ＴＧＦ−β結合化合物、本発明方法を用いて同定される物質、抗体、およびそれらを含有する組成物を種々の適用例に用いることができる。ＴＧＦ−βサイトカインは多くの生物学的プロセスに関与しているため、化合物、物質、抗体および組成物をこれらのプロセスを変調させるために用いることができる。本発明方法を用いて同定されたＴＧＦ−βファミリーのサイトカインのアゴニストを用いて、例えば、傷の治癒の刺激、ＴＧＦ−β感受性腫瘍の増殖抑制、免疫応答の抑制、および血管形成の刺激に用いてもよい。移植器官の拒絶反応を停止させるためにトランスプラントにおいて免疫応答を抑制してもよい。ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインのアンタゴニストを用いて本来の標的受容体に対する内在性ＴＧＦ−βの結合をブロックすることができ、そのことによりリガンド−受容体結合イベントにより発生する細胞の増殖または阻害シグナルをブロックすることができる。よって、ＴＧＦ−β結合化合物および抗体のごときアンタゴニストは免疫応答を刺激し、細胞外マトリックスの沈着を減少させるであろう。したがって、アンタゴニストは、肺の線維症を包含する線維症、慢性肝臓疾患に関連した線維症、肝臓静脈閉塞ならびに突発性間質性肺炎、腎臓疾患、および放射線療法もしくは放射線事故；増殖性ガラス体網膜症；全身性硬化症；リューマチ性関節炎のごとき自己免疫疾患、グレイブス病、全身性エリテマトーデス、ワグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、多発性関節炎、天疱そう、類天疱そう、多型性紅斑、ショーグレン症候群、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、角膜炎、強膜炎、Ｉ型糖尿病、インスリン依存性糖尿病、狼そう、腎炎、およびアレルギー性脳髄膜炎；白血病、リンパ種（ホジキンおよび非ホジキン）、肉腫、メラノーマ、アデノーマ、固体組織の癌腫、低酸素性腫瘍、口、喉、咽頭、ならびに肺の鱗状細胞癌腫、頸部および膀胱癌のごとき生殖尿道系の癌、造血系の癌、頭部および首の癌、および神経系の癌のごとき種々の形態の癌を包含する増殖性疾患、乳頭腫のごとき良性の傷害、アテローム性動脈硬化、血管形成、およびウイルス感染、詳細にはＨＩＶ感染のごとき症状の治療に特に適するであろう。ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインのアンタゴニストを用いて、ＴＧＦ−β により誘導される低血圧の阻害を通して血圧を上昇させてもよい。対象中の循環ＴＧＦ−βレベルを低下および／または維持する方法は同様の昇圧効果を生じ、過大な降圧シグナルおよび結果生じる低血圧の発生を防止しうる。アクチビンによるＦＳＨ放出の刺激を、特異的ＴＧＦ−β 結合化合物の投与によって促進することができる。その化合物は、アクチビンとその本来の受容体との間の複合体形成を防止し、次いで、ＦＳＨ放出刺激作用をするであろう。それゆえ、ＴＧＦ−β結合化合物は、アクチブンとアクチビン受容体との間の正常な相互作用をブロックすることにより、アクチビンの効果を減じるであろう。したがって、ＴＧＦ−β結合化合物を適用してヒト、家畜、および商業的に興味がもたれる動物の受精をコントロールすることができる。赤血球生成に対するアクチビンの作用を、変調に有効な量のＴＧＦ−β結合化合物を投与することにより変調させることもできる。本発明化合物、物質、抗体および組成物を、アクチビン依存性腫瘍の診断および／または治療、または脳ニューロンの生存促進に用いることもできる。本発明者らの仕事は、骨細胞分化におけるフェツインとＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトラインとの相互作用に関する役割を支持する。本発明者らは、フェツインがＢＭＰに対して高い親和性を有していることを見いたしており、しかもフェツインとＢＭＰは発生中の骨に一緒に局在化していることが知られている。さらに、本発明者らは、フェツインがインビトロにおけるＢＭＰ−２依存性の骨の分化を抑制することを示している。それゆえ、ＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカイン、詳細にはＢＭＰ−２からＢＭＰ−７までを変調させる物質であって、本明細書において確認されたものおよび本発明方法を用いて同定されたものを用いて骨形成を誘導してもよく、例えば、それらを用いて骨折を修復もしくは治癒し、骨粗鬆症を治療し、歯科的問題を取り扱うことができ、さらにそれらをインプラントとともに用いて骨の増殖を促進してもよい。ＴＧＦ−βは、間葉前駆体細胞、軟骨細胞、骨芽細胞および破骨細胞を包含するいくつかの細胞タイプの増殖および分化をコントロールすることが見いだされている。ＴＧＦ−βは、正常ラットの２倍体胎児骨芽細胞の分化をインビトロでブロックすることが示されている（イー・シー・ブリーン（E.C.Breen）ら、ジャーナル・セル・フィジオロ（J.Cell.Physiol.）第１６０巻：３２３〜３３５頁、１９９４年）。細胞が成熟骨芽細胞表現型を発現するまでは、その効果は培養の増殖フェーズに限定される。本発明者らは、増殖フェーズの間にフェツインが細胞増殖を刺激し、増殖フェーズ後はカルシウム含有マトリックス、すなわち、骨組織の沈着を阻害したことを示した。それゆえ、ＴＧＦ−β結合化合物を投与することによりＴＧＦ−βサイトカインの初期の効果を変調させることによって、および／または本発明方法を用いて同定されたＴＧＦ−βのアゴニストを投与することによりＴＧＦ−βサイトカインの後期の効果を変調させることによって、骨形成（詳細には、上記適用例に関する）を刺激することができる。ＴＧＦ −β結合化合物、および本発明方法を用いて同定された物質を用いてＴＧＦ−β サイトカインを変調させることによって骨形成過剰疾患（例えば、軟骨発育不全、パジェット病、および骨粗鬆症）を治療してもよい。ＴＧＦ−β結合化合物および本発明方法を用いて同定された物質を、リューマチ性関節炎、慢性活動性肝炎、喘息、および移植後の組織拒絶反応を包含する多くの疾病の治療に用いられるグルココルチコイドと混合して用いてもよい。長期にわたるグルココルチコイド療法は、骨の損失の最大のリスクである骨粗鬆症の誘導に関連している。ＴＧＦ−βは、骨細胞機能に対するグルココルチコイド調節において役割を果たしていることが見いだされている（オースラー,エム・ジェイ（Oursler,M.J.）ら、エンドクリノロジー(Endocrinology)、第１３３巻(５ )、２１８７頁、１９９３年）。本発明化合物、抗体、および組成物の有用性を動物実験モデルにおいて確認してもよい。例えば、硫酸ブレオムチンによる肺の線維症の誘導に対するマウスの感受性を試験することにより、線維症における治療上の有用性を試験してもよい（ベヒャー−アラン（Baecher-Allan）、レジオナル・イミュノロジー（Regiona l Immunology）第５巻（３〜４）：２０７頁、１９９３年）。マーチン（Martin ）ら、ラジエイション・リサーチ（Radiation Research）第１３４巻（１）、６３頁、１９９３年に記載された、十分に特徴づけられた放射線照射により誘導される線維症のブタのモデル、およびボーダー（Border）ら、ネイチャー第３６０巻：３６１頁、１９９２年に記載された実験的糸球体腎炎モデルを用いてもよい。本発明化合物、物質および組成物の有用性の確認に用いることのできる他のモデルは、傷の治癒（例えば、ブリーチャー（Bleacher）ら、ダーマトロジック・クリニクス（Dermatologic Clinics）第１１巻（４）：６７７頁、１９９３年に記載された胎児の骨の修復モデル）、骨の修復（例えば、ラットにおける骨誘導モデル）−ヤスコ,エイダブリュ（Yasko,AW）ら、オーソプ・トランス（Orthop. Trans.）第１５巻：５０１頁、１９９１年；ヒツジの大腿骨−ゲルハルト,ティーエヌ（Gerhart,TN）ら、トランス３７アニュアル・ミーティング・オーソプ・リサ・ソサ・アナヘイムＣＡ（Trans 37 Annual Meeting Orthop.Res.Soc.Ana heim CA）、カサーソン,ビー（Catherson,B.）編第１６巻（１）、１７２頁、１９９１年；およびイヌ・下顎骨−トリウミ,ディーエム（Toriumi,DM）ら、アーチーブ・オトラリノボロ・ヘッド・ネック・サージ（Archiv.Otolarynogol.Head Neck Surg.）第１１７巻：１１０１〜１１１２頁、１９９１年）、および自己免疫疾患（例えば、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｉｐｒマウス（全身性エリテマトーデスに関するモデル）；ＮＺＢｘＮＺＷｆ１マウス（ヒトの自己免疫疾患について見られる臨床的徴候に匹敵する臨床的徴候を示す）−テオフィロプーロス（Theofilo poulos）およびディクソン（Dixon）、アドバ・イムイノロ（Adv.Immunol.）第３７巻、１９８５年）に関するモデルを包含する。上記方法、化合物、物質、抗体および組成物を用いてＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを研究してもよく、したがって、増殖、分化および形態形成におけるサイトカインの役割に対するさらなる洞察が得られるであろうということが、さらに当業者に理解されるであろう。ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインは細胞の増殖を停止させ、それにより、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉｎｔ−２、ケラチノサイト増殖因子、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ヒト・成長ホルモン、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ボンビキシン、グリア増殖因子、ＴＮＦ、およびＣＤ４０リガンド（エウェン（ Ewen）ら、セル第７４巻：１００９頁、１９９３年）のごとき他の増殖因子の作用を抑制する。臨床的状況における増殖因子の効果的な利用のためには、ＴＧＦ −βサイトカインの活性を同時に低下させることが望ましい。したがって、さらに本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインによって効果が抑制される増殖因子と混合されたＴＧＦ−β結合化合物からなる組成物に関する。さらに本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインによって効果が抑制される増殖因子を用いて個体の治療を促進する方法であって、ＴＧＦ−βサイトカインの受容体でなく、ＴＲＨ１ドメインを含むＴＧＦ− β結合化合物を増殖因子と同時に投与することからなる方法に関する。本発明方法を用いて同定される、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインに結合に対する他のアンタゴニストを、これらの組成物および方法に用いて増殖因子の活性を促進してもよい。本発明のもう１つの適用例は、サイトカインのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの存在または不存在に関する試料のアッセイである。例えば、ＴＧＦ −βサイトカインのスーパーファミリーのメンバーにより媒介される経路に関連した徴候を示す患者由来の血清をアッセイして、観察される徴候がかかるサイトカインの過剰または過小産生により引き起こされた可能性があるかどうかを調べることができる。アッセイを種々のやり方で行うことができ、当業者によって容易に確認されうる。例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＲＭＡ等のごとき、本発明抗体を用いる免疫学的アッセイのみならず、競争的アッセイを用いることができる。本発明の具体例において、試料中のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインをアッセイするために競争的結合アッセイが示され、該競争的アッセイは、（ａ）化合物およびサイトカインが複合体を形成でき、化合物および／またはサイトカインが既知能度で存在している条件下にて、サイトカインを含有する可能性のある試料を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む一定量のＴＧＦ−β結合化合物、および一定量のサイトカインと反応させ、（ｂ）複合体、遊離化合物および／またはサイトカインをアッセイし、次いで、（ｃ）対照と比較することからなる。本発明方法を用いて組織および生物学的試料、例えば、サイトカインを含有または含有する可能性のある血液、血液産物、血清、体液、分泌物、便、咽頭洗浄物のごとき洗浄物、組織ホモジネートおよび細胞培養液中のＴＧＦ−βサイトカインをアッセイしてもよい。上の記載において、本発明方法に使用できるサイトカインおよびＴＧＦ−β結合化合物を、ＴＧＦ−βサイトカインに影響する物質のアッセイ方法を参照して詳細に説明する。サイトカインおよびＴＧＦ−β結合化蛋白の性質および量のごとき因子を考慮して、サイトカイン−ＴＧＦ−β結合化合物複合体の形成を可能にする条件を選択することができる。下記の非限定的な実施例は本発明の説明である。実施例：実施例１フェツインおよびチログロブリンがＴＧＦ−βサイトカインに結合し、ＴＧＦ −βサイトカインに拮抗する能力を試験した。ミンクの肺上皮細胞系であるＭｖＩＬｕ細胞における³Ｈ−チミジン取り込みを、ＴＧＦ−β１（１２ｐＭ）のみ存在下、およびＴＧＦ−β（１２ｐＭ）とともにウシ・フェツイン濃度（図１の黒丸）；ウシ・チログロブリン（図１の白丸）；または血清アルブミン（図１の黒三角）を増加させていって評価を行った。サイトカインの不存在下（白丸）または存在下において、すなわち、１８ｐＭヒト・ＴＧＦ−β１（白四角）、もしくは３３ｎＭヒト・ＢＭＰ−２（白三角）存在下でフェツインを滴定した（図１２）。ＭｖＩＬｕ細胞を２０００個／ウェルとしてα−ＭＥＭ中０.２％ＦＣＳを含む９６ウェルプレートに撒き、示された濃度の蛋白とともに１８時間インキュベーションした。次いで、細胞を８μＣｉ／ｍｌのメチル−³Ｈ−チミジン（ＮＥＮ、マサーセッツ州ボストン）で６時間パルスした。細胞をトリプシン処理し、フィルターマット上に取り、β−カウンターで計数した。中和パーセント値を、１２ｐＭのＴＧＦ−β１のみ存在下での取り込みを０％とすると定義し、添加物なしの場合の取り込みを１００％と定義した。０％と１００％との間の³Ｈ−チミジン取り込みの相違は７.５倍であった。図１および図１２の各点は最小二乗平均値を示し、結果は３つの実験のものを示す。ウシ・チログロブリンおよびウシ・フェツイン（ＦＣＳを硫酸アンモニウム沈殿し、次いで、ゲル濾過クロマトグラフィーにより得た）をシグマ（Sigma）（ミズーリ州セントルイス）から購入し、ＢＳＡ（フラクションＶ）をベーリンガー・マンハイム（Boehringer Man nheim）（ケベック州ラバル（Laval））から購入し、ＴＧＦ−β１（ヒトから精製したもの）をコラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）（マサチューセッツ州ベドフォード（Bedford））から購入した。使用前に、ウシ・チログロブリンをセントリコン（分子量カットオフ１００００Ｄａ）（アミコン（ Amicon）、マサチューセッツ州ビバリー（Beverly））にて２回遠心分離して過剰のヨウ素およびＴ３／Ｔ４甲状腺ホルモンを除去した。図１は、ウシ・フェツインおよびウシ・チログロブリンがＭｖＩＬｕ細胞の培養に対するＴＧＦ−β１の抗増殖活性を中和することを示す。ＭｖＩＬｕ細胞はミンクの肺上皮細胞系であり、ＴＧＦ−β１の抗増殖作用に感受性がある。フェツインおよびチログロブリン双方に関する最大の効果は約１５０％の中和であり、培養物中の内在性ＴＧＦ−βも阻害され、対照と比較すると正味の細胞増殖刺激を生じたことが示唆された。ＴＧＦ−βアンタゴニストであるデコリンについても同様の観察結果が報告されている（ワイ・ヤマグチ（Y.Yamaguchi）、ディー・エム・マン（D.M.Mann）、イー・ルオスラーティ（E.Ruoslahti）、ネイチャー第３４６巻、２８１頁（１９９０頁）；エス・ショルツ−チェリー（S.Scho ltz-Cherry）、ジェイ・イー・マーフィー−ウルリヒ（J.E.Murphy-Ullrich）、ジャーナル・セル・バイオロ（J.Cell Biol.）第１２２巻、９２３頁(１９３３年)；オコナー−マクコート（O'Conner-McCourt）、エル・エム・ウェイクフィールド（L.M.Wakefield）、ジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６２巻、１４０９０頁（１９８７年）；およびジェイ・マッサーグ（J.Massague）、カレ・バイオロ（Curr.Biol.）第１巻、１１７頁（１９９１年））。フェツインは、用量依存的な様式でＭｖＩＬｕ細胞に対するＴＧＦ−β１の抗増殖活性を阻害することができ、４.２ｘ１０^-6Ｍにおいて最大値の半分の阻害（ＩＣ₅₀）がみられた。トリグロブリンは、ＭｖＩＬｕ増殖阻害においてもＴＧＦ−β１活性を中和し、ＩＣ₅₀＝２.２ｘ１０^-7（図１）であった（図１）。チログロブリンによるＴＧＦ−β１活性の阻害についてのＩＣ₅₀はフェツインに関するものよりも２０倍低く、これらの糖蛋白とのＴＧＦ−βの関連についてのＫ_D 値においても相違が反映されていた（表１）。図１２に示すように、フェツインはＭｖＩＬｕ細胞の増殖を刺激した（ＩＣ₅₀ ＝８ｐＭ）。ＴＧＦ−βに対する中和抗体も細胞増殖を刺激し、ＭｖＩＬｕ細胞が活性のあるＴＧＦ−βを産生し、サイトカインアンタゴニストはフェツインと同じ様式で細胞増殖を刺激しうることが示唆された。さらにそのうえ、フェツインは、外から添加したＴＧＦ−β１の抗増殖活性をブロックし、ＩＣ₅₀は約３ｘ１０^-6Ｍであった。ＢＭＰ−２もＭｖＩＬｕ細胞の増殖を阻害（ＩＣ₅₀＝２０ｎＭ）したが、ＴＧＦ−β１よりもずっと高濃度においてであった。フェツインはＢＭＰ−２の効果を逆転させ、ＩＣ₅₀は２〜５ｘ１０^-6Ｍであった（図１２）。実施例２組織培養におけるＴＧＦ−β１のアンタゴニストとしてのフェツインの作用が２つの蛋白の直接結合によるものであるのかどうかを決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（ファルマシア・バイオセンサー（Pharmacia Biosensor）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway））を用いて、表面プラズモン共鳴によるそれらの相互作用を調べた（エム・マルムクビスト（M.Malmqvist）、ネイチャー第３６１巻、１８６頁（１９９３年）およびエス・シー・シュスター（S.C.Sc huster）、アール・ブイ・スワンソン（R.V.Swanson）、エル・エイ・アレックス（L.A.Alex）、アール・ビー・ブレット（R.B.Bourret）、エム・アイ・サイモン（M.I.Simon）、ネイチャー第３６５巻、３４３頁（１９９３年）。この系において、リガンドとして役立つ精製蛋白はカルボキシメチル化デキストラン表面に結合され、結合分子（すなわち、分析物）は表面を通って液相中を通過する。リガンドへの分析物の結合は反射光の変化を生じ、該変化は結合質量に直接比例し、任意応答ユニット（Ｒ.Ｕ.）として測定される。分析物−リガンド結合は、分析物を注入している間の経時的応答増加および注入前後のベースライン位置の相違の両方として観察される。より詳細には、エム・マルムクビスト（M.Malmqvist）、ネイチャー第３６１巻、１８６頁（１９９３年）およびエス・シー・シュスター（S.C.Schuster）、アール・ブイ・スワンソン（R.V.Swanson）、エル・エイ・アレックス（L.A.Ale x）、アール・ビー・ブレット（R.B.Bourret）、エム・アイ・サイモン（M.I.Si mon）、ネイチャー第３６５巻、３４３頁（１９９３年）に記載されたようにして、精製ヒト・ＴＧＦ−β１（コラボレイティブ・リサーチ、マサチューセッツ州ベドフォード）および組み換えヒト・ＢＭＰ−２（マサチューセッツ州ケンブリッジのジェネティクス・インスティチュート（Genetics Institute）から得た）をＣＭ５センサーチップのカルボキシメチル化デキストラン表面に固定化した。１０００Ｒ.Ｕ.は約１ｎｇ／ｍｍ²に等しい。使用バッファーは２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）、１５０ｍＭＮａＣｌであり、すべてのセンサグラムにつき流速は３μｌ／分であった。ウシ胎児フェツイン（ミズーリ州のシグマ製）および成人フェツイン／α２− ＨＳ糖蛋白（カリフォルニア州のカルバイオケム（Calbiochem）製）は、製造者により異なるプロトコールを用いて精製されていた。１０μｌの２０ｍＭＮａＯＨを注入することにより結合分析物を除去するための表面の再生を行った。ＴＲＨ１ペプチドを環化するために、５ｍＭＤＴＴで材料を還元し、次いで、２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８.５）中６０μＭの最終濃度とした。３０ｍＭフェリシアニドカリウムとともに暗所で２０℃、３０分撹拌した後、ペプチドをＡＧ３−Ｘ４Ａ樹脂（BioRad）と混合し、濾過し、凍結乾燥し、水で展開するバイオゲルＰ２（ファルマシア）の５０ｘ２.５ｃｍカラムで脱塩し、さらに逆相ＨＰＬＣにより精製した。イオンスプレー質量スペクトル法により環化およびペプチド架橋不存在を確認した。注入体積は、図２、４および５については３６μｌであり、図３については４５μｌであった。結合分析物を除去するためのに、１０μｌの１Ｍグルコース− ６−リン酸、またはＴＧＦ−β１およびＢＭＰ−２被覆表面については１μｌの２０ｍＭＮａＯＨで、それぞれ、再生を行った。各実験における蛋白濃度は２、５、１０、２０、３０、４０μＭ（図２および３）であり；図４では０.２１、０.３１、０.４１、０.６２、０.８２、１.２４μＭであり、図５については０.２２、０.２９、０.４４、０.５９、０.８８μＭであった。各実験における固定化サイトカインについてのＲ.Ｕ.は、それぞれ、図２および３については２８５０Ｒ.Ｕ.、図４については７４５０Ｒ.Ｕ.、図５については５３００Ｒ.Ｕ. であった。図２ないし５におけるセンサグラムオーバーレイプロット（sensogram overla y plots）は、固定化ＴＧＦ−β１へのウシ・フェツインの結合（図２）を応答ユニット（Ｒ.Ｕ.）で示し；さらに固定化ＢＭＰ−２への結合（図４）を示す。下から上へのそれぞれの線は、後で詳述する注入分析物の濃度増加を示す。図３および図５は、固定化ＴＧＦ−β１を通過した非結合対照ヒト・トランスフェリンおよび固定化ＢＭＰ−２を通過したＢＳＡをそれぞれ示す。注入の始めと終わりにおける応答の大きな変化は注入されたバッファー中の蛋白により引き起こされた屈折率の変化によるものであり、結合を示すものではない。ＴＧＦ−β１およびＢＭＰ−２へのフェツイン結合は、ｉ）注入の間の経時的応答増加、およびｉｉ）フェツイン濃度を増加させて注入すると各注入終了後の応答が段階的に増加することにより示される。図４に示すフェツイン−ＢＭＰ−２相互作用は平衡に達していないが、図２においては、より低いフェツイン−ＴＧＦ−β１親和性が平衡に達している。パネル（Ａ）に示されるように、ＴＧＦ−β１へのフェツイン結合約２００秒後、経時的応答の変化がゼロとなった場合に平衡が達成される。別の対照実験は、特別な蛋白を固定化した場合にはフェツインが結合しなかったことを示した（データ示さず）。フェツイン、チログロブリン、およびＴＲＨ１ペプチドと、ＴＧＦ−β１およびＢＭＰについての結合定数を決定した。ＢＩＡ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ファルマシア・バイオセンサー）を用いてデータを分析した。まず、応答に対する経時的応答の変化（すなわち、Ｒに対してｄＲ／ｄＴ）をプロットすることにより結合速度定数ｋ_assを計算した。このグラフの直線の傾きを分析物濃度に対してプロットした場合(すなわち、Ｃに対してｄ（ｄＲ／ｄＴ）／ｄＲ) 、直線の傾きからｋ_assが得られる。分析物の注入を止めた後、経時的応答が減少している間に解離速度定数ｋ_dissを得る。詳細には、時間に対するｌｎ（Ｒ_t1 ／Ｒ_t0）のプロットにおける直線の傾きからｋ_dissを得た。Ｋ_D＝ｋ_diss／ｋ_assから親和性定数を計算した。ｋ_assの変動は直線的回帰プロットの標準偏差であり、ｋ_diss値の変動については、平均値±３回またはそれ以上の独立した注入の範囲である。フェツイン結合については定常状態が観察され、スキャッチャードプロット（Scatchered plot）によるこれらのデータの分析により同様のＫ_D値４.６ｘ１０^-6Ｍが得られた。表１は、フェツイン、チログロブリン、ＴＲＨ１ｂ等のサイトカインとの相互作用に関する結合定数を示す。ＴＧＦ−βサイトカインに対するフェツインおよびＴＲＨ１の結合について計算を繰り返し、計算値を表２に示す。表１および１の括弧内の数はＢＭＰ−２に対するサイトカインの相同性のパーセント値を示す。非平衡結合データの分析により、フェツイン−ＴＧＦ−β１の結合速度（ｋ_as _s ）（６７０Ｍ^-1ｓ^-1）および解離速度（ｋ_diss）（１.６ｘ１０^-3ｓ^-1（表１）および１.９ｘ１０^-3（表２））が明らかとなった。図２のデータを用いて、定常状態のフェツイン−ＴＧＦ−β１結合についてのスキャッチャードタイプの分析により４.６ｘ１０^-6ＭのＫ_D値が得られ、Ｋ_D＝ｋ_diss／ｋ_assから、２.２および２.４ｘ１０^-6Ｍの値（それぞれ表１および表２）が得られた。このフェツイン−ＴＧＦ−β１親和性の測定値は、ＴＧＦ−β１活性のフェツインによる中和についてのＩＣ₅₀と同様であり（図１および図１２）、フェツインがサイトカインに直接結合することによってＴＧＦ−β１活性を中和するという知見と矛盾しない。フェツインは密接に関連したサイトカインＴＧＦ−β２にも結合し、同様の親和性を有していた（表１および表２）。また、フェツインは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであってＴＧＦ−β１とは３８％のアミノ酸同一性（ジェイ・エム・ウォズニー（J.M.Wozney ）、ブイ・ローゼン（V.Rosen）、エイ・ジェイ・セレステ(A.J.Celeste)、エル・エム・ミトソック（L.M.Mitsock）、エム・ジェイ・（ホイターズ（M.J.Whitt ers）ら、サイエンス第２４２巻、１５２８頁およびブイ・ローゼン（V.Rosen）、アール・エス・シース（R.S.Thies）、ＴＩＧ第８巻、９７頁（１９９２年））を有する固定化ＢＭＰ−２（図４）に結合した。ＢＭＰ−２に対するフェツイン結合親和性は、ＴＧＦ−β１へのフェツイン結合よりも約１００倍高かった（Ｋ_D＝３.６ｘ１０^-8Ｍ、およびＫ_D＝２.７ｘ１０^-8Ｍ、それぞれ表１および表２）。両方の相互作用は同様のオンーレイト（on-rate）（ｋ_ass＝１.７ｘ１０³Ｍ^-1 ｓ^-1）を示したが、フェツイン−ＢＭＰ−２はずっと低いオフ−レイト（off- rate）（ｋ_diss＝６.２ｘ１０^-5ｓ^-1（表１）およびｋ_diss＝６.５ｘ１０^-5（表２））を有しており、大部分の親和性の相違の根拠となった。また、フェツインは固定化ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−６と結合し、オフ−レイトにおける変化のため大きく異なる特徴的な親和性を有していた（表１および表２）。５種のサイトカインに対するフェツインの結合親和性はＢＭＰ−２に対するアミノ酸相同性との直接的関連を示し、ＢＭＰ−２がフェツインに対して最高の親和性を有することは注目すべきである（表１および表２）。フェツイン−サイトカイン結合に関するＫ_D測定値のランク順位は、ＢＭＰ−２＜ＢＭＰ−４＜ＢＭＰ−６＜ＴＧＦ −β１＜ＴＧＦ−β２であり、ＢＭＰ−２に対するそれらの１次配列の相同性に関連していた（表１および表２）。さらに、上記ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、チログロブリンをＢＭＰおよびＴＧＦ−βに対する結合に関して試験した。驚くべきことに、チログロブリンは、サイトカインに対してフェツインよりも高い親和性で結合し、ＢＭＰ−２とは最強の相互作用（Ｋ_D＝３.１ｘ１０^-9Ｍ）を示した。チログロブリンは、ＢＭＰ−２＞ＢＭＰ−４＞ＴＧＦ−β１＞ＴＧＦ−β２の順に強く結合し、これらのサイトカインに対するフェツインの結合に関して観察された順序と同様であった（表１および表２）。チログロブリンは血清中に低レベルで見いだされ、甲状腺の濾胞においてずっと高濃度で存在し、そこではチロキシンの前駆体となっている。ＴＧＦ−βは、チログロブリン生合成およびインビトロでの甲状腺細胞の増殖を阻害することが見いだされている（コレッタ（Colletta）ら、キャンサー・リサ（Cancer Res.）第４９巻、３４５７頁、１９８９年）。この意味において、本研究の結果は、チログロブリンは甲状腺においてＴＧＦ−βに結合し、このタイプのＴＧＦ−βの作用に拮抗しうることを示唆する。実施例３フェツインおよびＴＧＦ−β受容体タイプＩまたはタイプＩＩアミノ酸配列を比較してサイトカイン結合ドメインを同定した。フェツインおよびＴβＲＩＩ配列を、まず、ンシステイン残基の位置によって併置した。ヘイチ・ワイ・リン（ H.Y.Lin）、エックス・−エフ・ワン（X.-F.Wnag）、イー・Ｎｇ−イートン（E. Ng-Eaton）、アール・エイ・ワインバーグ（R.A.Weinberg）、エイチ・エフ・ロディッシュ（H.F.Lodish）、セル第６８巻、７７５頁（１９９２年）のごとく、図８に示すＴＧＦ−βタイプＩ（Ｔｓｋ７Ｌ）受容体をＴβＲＩＩと併置した。エブナー（Ebner）ら、サイエンス第２６０巻、１３４４〜１３４８頁、１９９３年のごとく、図８に示すＴＧＦ−βタイプＩ（Ｔｓｋ７Ｌ）受容体をＴβ ＲＩＩと併置した。併置配列を目で見て調べることにより、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ相同的１ドメイン（ＴＲＨ１）と命名された４３個のアミノ酸の相同的ドメインが明らかとなった（図８）。ＴＲＨ１ドメインは、ＴβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩおよびＡｃｔＲＩＩｂに存在するが、タイプＩの受容体には存在せず（リン（Li n）ら、セル第６８巻、７７５〜７８５頁、１９９２年；エブナー（Ebner）ら、サイエンス第２６０巻、１３４４〜１３４８頁、１９９３年；アッチサノ（Atti sano）ら、セル第７５巻、６７１〜６８０頁、１９９３年；フランゼン（Franze n）ら、セル第７５巻、６８１〜６９２頁、１９９３年；バッシング（Bassing）ら、サイエンス第２６３巻、８７〜８９頁、１９９４年）、タイプＩ受容体はタイプＩＩ受容体の不存在下ではサイトカインに結合しない（ウラナ（Wrana）ら、セル第７１巻、１００３〜１０１４頁、１９９２年；ウラナら、ネイチャー第３７０巻、３４１〜３４７頁、１９９４年）。ヒト・フェツインの分子内ジスルフィド結合が以前決定されている（ジェイ・ケラーマン（J.Kell ermann）、エイチ・ハウプト（H.Haupt）、イー・−エイ・アウアースワルジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６４巻、１４１２１頁（１９８９年））。フェツイン中のＴＲＨ１ドメインはアミノ末端構造重複（structur al duplication）におけるペプチドループを形成する。構造重複は、図７において大きいほうの半円として示され、ａおよびｂと命名される（図７および８）。図７に示すように、フェツイン中の各構造重複は２個のジスルフィドループを含んでおり、それはＴＲＨ１ドメイン（位置１１４〜１３２）および不活性なループ２（すなわち、位置２３０〜２４８）を含んでいる。ＴＭおよびキナーゼは、それぞれ、ＴβＲＩＩのトランスメンブランドメインおよび蛋白キナーゼドメインを示す。２次構造を予測するためのチョウ−ファスマン（チョウ（Chou）およびファスマン（Fasman）、１９７８年）およびガルニエ（Garnier）、オスグテョペ（Osguthorpe）ならびにロブソン（Robson）（ガルニエら、１９７８年）の方法により、図７の下部に示すように、フェツインおよびＴβＲＩＩのＴＲＨ１ドメインについて同様な結果が得られた。２次構造に関するアルゴリズムにより、フェツイン、ＴβＲＩＩおよびタイプＩＩアクチビン受容体のＴＲＨ１ペプチドについてβ−シート−ターン−β−シート配列が予測されるが、この構造は、フェツインのカルボキシ末端における類似位置にあるループであるループ２（図７）については予測されなかった。前以て形成された環化ＴＲＨ１ペプチトの低紫外線ＣＤスペクトルにより、予想アルゴリズムと矛盾しない５８％β−シート、４１％ランダムコイルが示される（図１３）。フェツイン中のＴＲＨ１ドメインおよび隣接配列は、分子のカルボキシ側半分に関して、種間において非常に保存されている（すなわち、ヒト・ウシ・ヒツジ、ラット、マウス）（ジエギエレフスカ（Dzigielewska）ら、ジャーナル・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）第２６５巻、４３５４〜４３５７頁、１９９０年；ラウス（Rauth）ら、ジャーナル・バイオケミ（J.Biochem.）第２０４巻）５２３〜５２９頁、１９９２年；ブラウン（Brown）ら、ヨーロ・ジャーナル・バイオケミ（Eur.J.Biochem.）、３２１〜３３１頁、１９９２年）（図６参照）。実際に、ヒト・フェツイン（α２−ＨＳ糖蛋白）は、ウシ・フェツインと同様の親和性でＢＭＰ−２に結合した。ＴＲＨ１ドメインを含む他の蛋白を探すためのＰＩＲ蛋白配列データバンクの検索を、ＧＣＧルーチン「findpatterns」および下記パターンを用いて行った：ＣＸ｛８,１４｝（Ｎ,Ｑ）Ｘ｛１２,１６｝ＣＸ｛４,５｝（Ｋ,Ｒ）Ｘ｛２,６｝（Ｓ,Ｔ）Ｘ｛４,９｝ＣＸ｛０,２｝ＤＸ｛５,６｝（Ｄ,Ｅ）。該パターンは、フェツイン、ＴβＲＩＩ、ｄａｆ−１、およびアクチビン受容体タイプＩＩ間の保存アミノ酸配列に基づいていた。検索により４６個のマッチ（match）が得られ、それらの大部分は、受容体の細胞外ドメインまたは分泌糖蛋白であり、フェツイン（ｎ＝５）、フェツインの遠いファミリーであるキノジェン（ジェイ・ケラーマン（J.Kellermann）、エイチ・ハウプト（H.Haupt）、イー・−エイ・アウアースワルド（E.-A.Auerswald）、ダブリュ・ミュラー−アステール（W. １４１２１頁（１９８９年））（ｎ＝５）、ｄａｆ−１（ｎ＝１）、アクチビン受容体タイプＩＩ（ｎ＝５）、ウシ・チログロブリン（エル・メルケン（L.Merc ken）、エム・−ジェイ・シモンズ（M.-J.Simons）、エス・スィロンズ（S.Swil lons）、エム・マサー（M.Massaer）、ジー・バサート（G.Vassart）、ネイチャー第３１６巻、６４７頁（１９８５年））（ｎ＝１）、ＥＧＦ受容体（ｎ＝２）、ＬＤＬ受容体（ｎ＝１）、ＩＬ−１受容体（ｎ＝１）およびショウジョウバエ・ｃｒｕｍｂｓ（ｎ＝１）を包含していた。括弧内の数はマッチの数を示し、例えば、フェツインは５つの種に由来する。フェツインおよびＴＧＦ−βならびにアクチビンに対するタイプＩＩ受容体のＴＲＨ１ドメインにおける保存残基を用いてＰＩＲ蛋白データバンクの低厳密性検索も行った。ＧＣＧルーチン「findpatterns」および下記パターンを用いた：ＣＸ｛０,１｝（Ｖ,Ｉ,Ｆ,Ｙ）Ｘ｛１,３｝（Ｖ,Ｗ,Ｌ）Ｘ｛０,１｝（Ｋ,Ｒ）Ｘ｛４,５｝（Ｖ,Ｉ,Ｆ）Ｘ｛１,２｝（Ｌ,Ｉ）Ｘ｛２,４｝ＣＸ｛０,２｝Ｄ。検索により３２個のマッチが得られ、そのうち２５個が、種々の種由来のフェツイン（ｎ＝５）、ＴβＲＩＩ（ｎ＝２）、およびタイプＩＩアクチビン受容体（ｎ＝１８）を表した。ＴβＲＩＩ、フェツインおよびチログロブリンのＴＲＨ１ｂサブドメイン間の配列の類似性は衝撃的であり、６３％から７１％に及ぶ（図８）。それゆえ、実施例１および２に説明したＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βへの結合に関してチログロブリンを試験した。実施例４ＴＧＦ−βおよびアクチビンのタイプＩ受容体はＴＲＨ１ｂ配列を欠き（図８）、タイプＩＩ受容体不存在下ではリガンドに結合しない（アール・エブナー（ R.Ebner）、アール・エイチ・チェン（R.H.Chen）、エル・シャム（L.Shum）、エス・ローラー（S.Lawler）、ティー・エフ・ジノチェク（Zinocheck）ら、サイエンス第２６０巻、１３４４頁（１９９３年）；ジェイ・マッサーグら、セル第７５巻、６７１頁（１９９３年）；ピー・フランゼン（P.Franzen）、ピー・テンディーケ（P.tenDijke）、エイチ・イチジョー（H.Ichijo）、エイチ・ヤマシタ（H.Yamashita）、ピー・シュルツ（P.Schultz）ら、セル第７５巻、６８１頁（１９９３年）；シー・エイチ・バッシング（C.H.Bassing）、ジェイ・エム・イングリング（J.M.Yingling）、ディー・ジェイ・ハウ（D.J.Howe）、ティー・ワン（T.Wang）、ダブリュ・ダブリュ・ヘ（W.W.He）ら、サイエンス第２６３巻、８７頁（１９９４年）；およびジェイ・エル・ウラナ（J.L.Wrana）、エル・アッチサノ（L.Attisano）、ジェイ・カルカモ（J.Carcamo）、エイ・ゼンテラ（A.Zentella）、ジェイ・ドーディ（J.Doody）ら、セル第７１巻、１００３頁（１９９２年））。これは、タイプＩＩ受容体のＴＲＨ１ｂサブドメインがサイトカイン結合に直接関与している可能性を示唆する。この可能性を試験するために、フェツインおよびＴβ−ＲＩＩ双方由来のＴＲＨ１ｂペプチドを合成し、環化ＴＲＨ１ｂペプチドを調製した。ＴＲＨ１ｂペプチドおよび環化ペプチドを、ＴＧＦ−β１およびＢＭＰ−２への結合について試験した。まず、ペプチドをＤＴＴで還元してダイマー、トリマー等を除去することにより環化ＴＲＨ１ｂペプチドを調製し、次いで、２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８.５）中６０μＭの最終濃度とした。３０ｍＭフェリシアニドカリウムとともに暗所で２０℃において３０分撹拌後、ペプチドをＡＧ３−Ｘ４Ａ樹脂（BioRad ）と混合し、濾過した。凍結乾燥後、水で展開するＢｉｏｇｅｌＰ２（BioRad ）の５０ｘ２.５ｃｍカラムで試料を脱塩した。イオンスプレー質量スペクトル法により環化が確認され、多量体は検出されなかった。０.１５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）、０.１５ＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ中のペプチドを、まず、９０倍過剰のＤＴＴ中で１０分間煮沸し、次いで、４５倍過剰のヨードアセトアミド（ピアス（Pierce））とともに暗所で撹拌しながらインキュベーションすることにより還元し、アルキル化した。試料をＰ２カラムで脱塩した。イオンスプレー質量スペクトル法によりペプチドの還元およびアルキル化が確認された。図９は、６種の濃度（８７、１３０、１７４、２１７、２８３および３４８μ Ｍ）のジスルフィドループ形成したＴＲＨ１ｂフェツインペプチドの固定化ＢＭＰ−２（５３００Ｒ.Ｕ. 固定化）への結合を示すセンサグラムオーバーレイプロットである。図１０は、同じ濃度の還元されアルキル化されたＴＨＲ１ｂペプチドの固定化ＢＭＰ−２への結合の消失を示すセンサグラムプロットである。ＢＩＡｃｏｒｅシグナル測定質量として、低分子量のＴＲＨ１ｂペプチドは、シグナルを観察するためには飽和付近の結合条件を用いる必要があった。飽和は約５５０Ｒ.Ｕ.であると決定された。環化ＴＲＨ１ｂペプチドによるフェツイン−ＢＭＰ−２結合に対する競争が観察されたが、還元されアルキル化されたペプチドによってはその程度がずっと小さかった（データ示さず）。ＴＲＨ１ｂペプチドはフェツインの１／２０の質量であり、それゆえ、それに比例して結合分子あたりのシグナルが小さいので、フェツインのみ注入した場合と比較して低濃度のＴＲＨ１ｂがフェツインとともに注入された場合に、対応した減少が観察された。しかしながら、これらの実験において行われた平衡でない条件で観察されたフェツインおよびＴＲＨ１ｂペプチドのＢＩＡｃｏｒｅシグナルを定量的方法で分離することは不可能であった。結果は、フェツインＴＲＨ１ｂペプチドの分子内ジスルフィドループ形態は固定化ＢＭＰ−２に直接結合し、Ｋ_D＝３.２ｘ１０⁶Ｍ（図９、表１）、Ｋ_D＝２. ４ｘ１０⁶Ｍ（表２）であり、さらに用量依存的な様式でフェツイン−ＢＭＰ− ２結合に関して競争したことを示す。しかしながら、このペプチドを還元しアルキル化した場合にはＢＭＰ−２への有意な結合は観察されなかった（図９）。このことは、還元されアルキル化されたフェツインは、ネイティブなフェツインと比較して、ＢＭＰ−２およびＴＧＦ−β１への結合を減じていたという観察結果と矛盾しない（データ示さず）。このことは、ジスルフィドループ形成は、サイトカイン結合にとり好ましいＴＨＲ１ペプチド構造を安定化することを示唆する。ＢＭＰ−２へのジスルフィドループ形成ＴＲＨ１ｂペプチド結合についてのオン−レイト（on-rate）は、無傷のフェツインのそれと同様であるが、ＴＲＨ１ｂのオフ−レイト（Off-rate）は１００倍も早い（表１および表２）。このことは、フェツインのＴＲＨ１ｂドメインはサイトカインの最初の認識およびおよび結合に必要な主要ペプチドモチーフであることを示唆する。フェツイン蛋白の他の部分は、ＴＲＨ１ｂペプチドループの結合および／またはコンホーメーションを安定化し、そのことにより、ペプチドと比較した場合フェツインのオフ−レイトを遅くする。Ｔβ−ＲＩＩへのサイトカイン結合がＴＲＨ１ｂ配列により媒介される場合、受容体の知られたサイトカイン特異性（ジェイ・エル・ウラナ、エル・アッチサノ、ジェイ・カルカモ、エイ・ゼンテラ、ジェイ・ドーディら、セル第７１巻、１００３頁（１９９２年））により、ＴβＲＩＩ由来のペプチト配列はＢＭＰ− ２に対するよりも高親和性をもってＴＧＦ−β１に結合するはずであると予測される。ＢＩＡｃｏｒｅ結合データによりこの予測が確認された（実施例５および表１、表２参照）。環化Ｔβ−ＲＩＩペプチドは、ＢＭＰ−２に対するよりも高親和性で（すなわち、それぞれ、Ｋ_D＝５.２ｘ１０^-7Ｍおよび＞１０^-5）ＴＧＦ −β１に結合し、フェツイン由来のＴＲＨ１ｂペプチドによって結合選択性の逆転が示された（表１および表２）。このことは、ＴＲＨ１ｂ配列はリガンド結合親和性を決定し、それゆえ、リガンド特異性を決定しうることを示す。実施例５フェツインおよびＴβＲＩＩ由来のループ化ＴＲＨ１ペプチドを用いる、固定化ＴβＲＩＩへのＴＧＦ−β１結合に対する競争ＴβＲＩＩへのＴＧＦ−β１結合の阻害を、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））を用いて行った。詳細には、９６ウェルのプレートをＴβＲＩＩの細胞外ドメインでプレコートした。ＴＧＦ− β１結合に対する競争を研究するために、キット添付の希釈剤にてサイトカインを最終濃度４０ｐＭとし、それのみ、またはアンタゴニストフェツイン（４０μ Ｍ）、ＴβＲＩＩ由来のＴＲＨ１ペプチド（２０μＭ）またはＢＳＡ（４０μＭ）とともに２０℃で１.５時間シリコン処理したエッペンドルフチューブ中で振盪しながらインキュベーションした。次いで、ＴβＲＩＩ被覆したＥＬＩＳＡウェルで振盪しながら５分間インキュベーションし、推奨されたように洗浄し、さらに、ポリクローナル抗ＴＧＦ−β１抗体とともに１時間インキュベーションした。プレートを説明書どおりに展開し、３系で測定を行った。図１４は、ＴＲＨ１ｂペプチドおよびフェツインが、固定化組み換えＴβＲＩＩへのＴＧＦ−β１の結合の競争的阻害剤として役立つことを示す。それゆえ、ＴＲＨ１ｂは、Ｔβ ＲＩＩ中の主要認識部位であると考えられ、タイプＩＩ受容体およびフェツインのＴＲＨ１ｂドメイン間の配列の相違は主としてサイトカイン特異性を決定している可能性がある。上記実施例に記載された実験は、Ｔβ−ＲＩＩ、フェツインおよびチログロブリンに共通したジスルフィドループを形成したモチーフを特定するものであり、該モチーフはＴＧＦ−βスーパーファミリーの２つの異なるメンバーへの結合を媒介する。ＴＲＨ１モチーフは、アクチビンタイプＩＩ¹⁸およびｄａｆ−１受容体を包含するリガンド結合ＴβＲＩＩファミリーのメンバーにおいて保存されているが、ＴＧＦ−β／アクチビンタイプＩ受容体には存在しない。後者は、タイプＩＩ受容体不存在下ではサイトカインに結合することができない。フェツインおよびチログロブリンは、ＴＧＦ−βに対するよりもＢＭＰ−２に対して有意に高い親和性を有しており、ＴＧＦ−βおよびＴＲＨ１配列の両方におけるバリエーションは、結合親和性の変化によってリガンド−受容体／アンタゴニスト特異性を決定することが示唆される。さらに、結果は、インビトロにおけるＴＧＦ− βスーパーファミリーのアンタゴニストとしてのフェツインおよびチログロブリンの今まで未知であった機能を示唆し、フェツインに帰属される広範な生物学的性についての機構を説明しうるものである。実施例６この実施例に記載、図１６および１７に示される研究に用いる方法は以下のごとし。大腿骨を無菌条件下で成体オスのウィスターラット（１２０ｇ）から取り、付着軟組織を除去し、抗生物質中で徹底的に洗浄した。遠位末端を除去し、骨髄内容物を１０ｍｌの培地とともに洗い出す。２０ゲージの注射針中を繰り返し通すことにより細胞を分散させ、１５％ウシ胎児血清、アスコルビン酸（５０μ ｇ／ｍｌ）抗生物質（ペニシリンＧ１００μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０ μｇ／ｍｌ、フンジゾン０.３μｇ／ｍｌ）および１０ｍＭ β−グリセロリン酸を補足したアルファーＭＥＭ中でインキュベーションした。さらに培地にデキサメタソンのみ（１０^-8Ｍ）、または種々の濃度のフェツインを補足した。空気中５％ＣＯ₂を含有する湿雰囲気下で３７℃で６日培養後、細胞を１ｘ１０²個／ｍｍ²の密度で９６ウェルプレート（ファルコン（Falcon）３０４７）に再プレーティングし、さらに１２〜１４日増殖させた。培養の終わりに、細胞を固定し、骨小結節部位（無機質化部位として報告（ｍｍ²）／ウェル）の定量のためにアリザリンレッドｓでカルシウムに関して染色した。培養物中の無機質化組織形成を評価するために、ライツ・Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ顕微鏡を用い、ＢｉｏｑｕａｎｔＩＶシステム（バイオクアント（Bioquant）、米国、ＴＮ、ナッシュビル）の助けを借りて生物形態計測的測定を行った。図１２に記載するインジケーター細胞系としてミンクの細胞を用いて、無機質化の評価の４日前に取った培養上清中のＴＧＦ−βを、熱活性化（８０℃１０分）の有無につき測定した。Ｒ＆Ｄシステムズにより提供された中和性抗ＴＧＦ−β抗体はＴＧＦ−β １に特異的であり、ＴＧＦ−β２およびβ３に対して１００倍低い反応性を有していた。ＢＭＰに対するフェツインの高い親和性、ならびに発生中の骨におけるフェツインのＢＭＰとの共局在化（ローゼンおよびシース、トレンズ・ジェネテイ（Tr ends Genet.）第８巻、９７〜１０２頁、１９９２年；ウォィズニーら、サイエンス第２４２巻、１５２８〜１５３４頁、１９８８年）により、フェツイン−サイトカイン相互作用は骨細胞分化において役割を果たしている可能性がある。この可能性を調べるために、ラット骨髄基質細胞をデキサメタソン存在下で培養した（デキサメタソンは、培養３週間後にはカルシウム含有マトリックスの沈着を伴う骨形成分化を誘導する）（図１５ないし１８）。培養初期段階での外来性ＴＧＦ−βの添加は細胞増殖を阻害する（オールスラーら、エンドクリノロジー第１３３巻、２１８７〜２１９６頁、１９９３年）が、骨形成分化の後期フェーズにおいては、該サイトカインはマトリックスの沈着に必要である（ブラセリアー（Vlasselaer）ら、ジャーナル・セル・バイオロ（J.Cell Biol.）第４巻、５６９〜５７７頁、１９９４年）。増殖フェースである培養第１週目におけるフェツインの添加は細胞数の増加を刺激し、ＴＧＦ−βアンタゴニストとしてのその役割と矛盾しなかった（図１５）。培養の最後の２週間に添加した場合、フェツインは、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして期待されたとおり、カルシウム含有マトリックスの沈着を阻害した（図１６）。カルシウム沈着の阻害に関するＩＣ₅₀は約１０^-5Ｍであり、フェツイン−ＴＧＦ−β結合についてのＫＤのＢＩＡｃｏｒｅ測定値よりの５倍高濃度であった。フェツインは培地の１５％ＦＣＳとともに存在しており、２〜３ｘ１０⁵の濃度であるため、これによりフェツイン濃度の３０〜５０％の増加が示されただけである。デキサメタソンは、潜在的なサイトカインの活性化を誘導することによってラット・骨髄培養物中のＴＧＦ− βレベルを上昇させた（図１７）。全サイトカインレベルが同様であるにもかかわらず、デキサメタソン処理培養物において活性ＴＧＦ−βのフラクションは３倍に増加した。図１８のデータは、中和的抗ＴＧＦ−β抗体は、それのみ、またはフェツインと混合された場合に、デキサメタソン処理骨髄培養物におけるカルシウム含有マトリックスの沈着を完全にブロックすることを示す。このことは、分化の最終段階の完結にはＴＧＦ−βが必要であることを確認するが、他のＴＧＦ−βファミリーのメンバーの関与を排除するものではない。骨髄細胞の増殖は培養の最初の１週間においてフェツインによって刺激されるので、カルシウム含有マトリックスの沈着に対するフェツインの抑制的効果は細胞毒性によるものである可能性はない（図１６）。ＢＭＰ−２もこれらの培養において骨形成を誘導し、それはフェツインの添加によりブロックすることができた（データ示さず）。要約すると、上記実験は、ＴβＲＩＩおよびフェツインに存在するジスルフィドループモチーフを画定するものであり、該モチーフはＴＧＦ−βスーパーファミリーの多数のメンバーへの結合を媒介する。さらに、ＴＲＨ１モチーフがアクチビンタイプＩＩ受容体において見いだされているが（マシューズ（Mathews）およびベイル（Vale）、１９９１年）、タイプＩサイトカイン受容体には存在しない（エブナーら、１９９３年；アッチサノら、１９９３年；フランゼンら、１９９３年；ブラナら、１９９２年）。また、結果は、これまで知られていなかったインビボにおけるＴＧＦ−βスーパーファミリーのアンタゴニストとしてのフェツインに関する機能を示し、以前フェツインに帰属されていた種々の生物学的活性（ニー（Nie）、アメ・ジャーナル・メディ（Am.J.Med.）、１９９４年）についての機構を説明しうるものである。最も注目すべきことには、フェツインは循環系を経て骨に蓄積し（ディクソン（Dickson）ら、ネイチャー第２５６巻、４３０〜４３２頁、１９７５年；トリフィット（Triffitt）ら、ネイチャー第２６２巻、２２６〜２２７頁、１９７６年）、骨の成長部位において最高濃度であり、そこではＢＭＰ（ウォズニー（Wozney）ら、サイエンス第２４２巻、１５２８〜１５３４頁、１９８８年；ローゼン（Rosen）およびシース（Thies）、１９９２年）およびＴＧＦ−β（マッサーグ、１９９０年）の骨促進活性を調節している可能性がある。無秩序かつ厚い骨を伴って骨ターンオーバーが増加する病気であるパジェット病（Paget's disease）においては、血清フェツインレベルが抑制され、一方、フェツインは骨形態形成不全患者の一部において上昇する。結局、ＴＲＨ１ｂペプチドに基づいてサイトカインアンタゴニストは癌患者における免疫抑制の治療および上昇したサイトカイン活性が役割を果たしていること（ボーダー（Border）およびルオスラーティ（Ruoslahti）、ジャーナル・クリニ・インベスティ（J.Clin.Invest.）第９０巻、１〜７頁、１９９２年）が知られている糸球体腎炎（ボーダー（Border）ら、ネイチャー第３６０巻、３６１〜３６４頁、１９９２年）ならびにアテローム性動脈硬化症（ロス（Ross）ら、ネイチャー第３６２巻、８０１〜８０９頁、１９９３年）のごとき線維症（マッサーグ、１９９０年）の治療において有用であるだろう。本発明は、特別な好ましい具体例について詳述されたが、本発明の精神および範囲から離れずに変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許および特許公報を、参照により各刊行物、特許または特許公報が個々に示され参照によりその全体を取り込まれるのと同程度に、参照によりそれらの全体を本明細書に取り込む。添付した配列表は本発明開示の一部を形成する。フェツイン、チログロブリンおよびＴＲＨ１ｂペプチドの、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰとの結合定数。ＢＩＡ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ファルマシア・バイオセンサー）を用いてデータを分析した。まず、応答に対する経時的応答の変化（すなわち、Ｒに対してｄＲ／ｄＴ）をプロットすることにより結合速度定数ｋ_assを計算した。このグラフの直線の傾きを分析物濃度に対してプロットした場合（すなわち、Ｃに対してｄ(ｄＲ／ｄＴ)／ｄＲ）、直線の傾きからｋ_as _s が得られる。分析物の注入を止めた後、経時的応答が減少している間に解離速度定数ｋ_dissを得る。詳細には、時間に対するｌｎ(Ｒ_t1／Ｒ_t0)のプロットにおける直線の傾きからｋ_dissを得た。Ｋ_D＝ｋ_diss／ｋ_assから親和性定数を計算した。ｋ_assの変動は直線的回帰プロットの標準偏差であり、ｋ_diss値の変動については、平均値±３回またはそれ以上の独立した注入の範囲である。表１および１の括弧内の数はＢＭＰ−２に対するサイトカインの相同性のパーセント値を示す。ＢＩＡｃｏｒｅおよびＢＩＡ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ファルマシア・バイセンサー）を用いて測定された、フェツインおよびＴＲＨ１ペプチドのＴＧＦ−βおよびＢＭＰとの相互作用に関する結合定数。経時的変化を各分析物濃度に対してプロットし（すなわち、Ｒに対してｄＲ／ｄＴ）、次いで、これらの直線の傾きを分析物濃度の関数としてプロットした（すなわち、Ｃに対してｄ (ｄＲ／ｄＴ)／ｄＲ）。ここに傾きはｋ_assを生じる。分析物注入を中止した後、時間に対するｌｎ(Ｒ_t1／Ｒ_t0)の傾きとして解離速度定数ｋ_dissが得られる。Ｋ_Dはｋ_diss／ｋ_assである。ｋａｓｓの変動は直線的回帰プロットの標準偏差であり、ｋ_diss値の変動については、平均値±３回またはそれ以上の独立した注入の範囲である。フェツイン−ＴＧＦ−β１結合については定常状態が観察され、スキャッチャードプロット（Scatchered plot）によるこれらのデータの分析により同様のＫ_D値４.６ｘ１０^-6Ｍが得られた。括弧内の数はＢＭＰ−２に対するサイトカインの相同性のパーセント値を示す。方法ＴＧＦ−βおよびＢＭＰをＣＭ５バイオセンサーチップのカルボキシメチル化デキストラン表面に固定化した。１０００Ｒ.Ｕ.は約１ｎｇ／ｍｍ²に等しい。使用バッファーは２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.２）、１５０ｍＭＮａＣｌであり、すべてのセンサグラムにつき流速は３μｌ／分であった。ウシ胎児フェツイン（ミズーリ州のシグマ製）および成人フェツイン／α２−ＨＳ糖蛋白（カリフォルニア州のカルバイオケム（Calbiochem）製）は、製造者により異なるプロトコールを用いて精製されていた。１０μｌの２０ｍＭＮａＯＨを注入することにより結合分析物を除去するための表面の再生を行った。ＴＲＨ１ペプチドを環化するために、５ｍＭＤＴＴで材料を還元し、次いで、２５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８.５）中６０μＭの最終濃度とした。３０ｍＭフェリシアニドカリウムとともに暗所で２０ ℃、３０分撹拌した後、ペプチドをＡＧ３−Ｘ４Ａ樹脂（BioRad）と混合し、濾過し、凍結乾燥し、水で展開するバイオゲルＰ２（ファルマシア）の５０ｘ２ .５ｃｍカラムで脱塩し、さらに逆相ＨＰＬＣにより精製した。イオンスプレー質量スペクトル法により環化およびペプチド架橋不存在を確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＣＤＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳＡＣＳＡＣＶＡＣＶＡＤＰＡＤＰＡＢＡＡＤＳＡＡＢＡＤＵＡＤＶＡＤＶＡＢＬ 38/22 ＡＢＥＡＤＵＧ０１Ｎ 33/566 ＡＢＸ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デメトリオウ，マイケルカナダ、エム４ワイ・１アール５、オンタリオ、トロント、チャールズ・ストリート・ウエスト 30番アパートメント315

Claims

【特許請求の範囲】１．ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる物質の存在のアッセイ方法であって、（ａ）ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、およびサイトカインが複合体を形成でき、ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインが既知濃度で存在している条件下にて、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインを変調させる可能性のある物質を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含むＴＧＦ−β結合化合物、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインと反応させ、（ｂ）複合体、遊離ＴＧＦ−β結合化合物、その一部もしくは模倣物、および／またはサイトカインをアッセイし、次いで、（ｃ）対照と比較することからなる方法。２．ＴＧＦ−β結合蛋白が、配列番号：２および図８に示すフェツインのＴＲＨ１ドメイン、配列番号：３および図８に示すＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体由来のＴＲＨ１ドメイン、または配列番号：４および図８に示すチログロブリン由来のＴＲＨ１ドメインを含む請求項１記載の方法。３．ＴＧＦ−β結合化合物が、配列番号：５、６、および７にそれぞれ示すフェツイン、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体、またはチログロブリン由来のＴＲＨ１ｂサブドメインを含む請求項１記載の方法。４．ＴＧＦ−β結合化合物が、配列番号：５、６、および７にそれぞれ示すフェツイン、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体、またはチログロブリン由来のＴＲＨ１ｂサブドメインの配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む請求項３記載の方法。５．ＴＧＦ−β結合化合物が、ＴＲＨ１ドメインまたはＴＲＨ１ｂサブドメインの模倣物を含む請求項１記載の方法。６．サイトカインがＴＧＦ−βファミリーまたはＤＲＲ／ＶＧ１ファミリーのメンバーである請求項１記載の方法。７．サイトカインがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ− ６である請求項１記載の方法。８．ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物、および医薬上許容される担体、助剤または賦形剤からなる医薬組成物。９．ＴＧＦ−β結合化合物が、配列番号：２および図８に示すフェツインのＴＲＨ１ドメイン、配列番号：３および図８に示すＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体由来のＴＲＨ１ドメイン、または配列番号：４および図８に示すチログロブリン由来のＴＲＨ１ドメインを含む請求項８記載の医薬組成物。１０．ＴＧＦ−β結合化合物が、配列番号：５、６、および７にそれぞれ示すフェツイン、ＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体、またはチログロブリン由来のＴＲＨ１ｂサブドメインを含む請求項８記載の医薬組成物。１１．ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状に苦しむ個体の治療方法であって、有効量の請求項８記載の組成物または請求項１の方法により同定される物質を投与することからなる方法。１２．個体において効果がＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインによって抑制されている増殖因子の活性の増強方法であって、請求項８記載の組成物、または請求項１の方法により同定されるＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアンタゴニストである物質を個体に投与することからなる方法。１３．試料中のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアッセイ方法であって、（ａ）化合物およびサイトカインが複合体を形成でき、化合物および／またはサイトカインが既知能度で存在している条件下にて、サイトカインを含有する可能性のある試料を、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む一定量のＴＧＦ−β結合化合物、および一定量のサイトカインと反応させ、（ｂ）複合体、遊離化合物および／またはサイトカインをアッセイし、次いで、（ｃ）対照と比較することからなる方法。１４．有効量の請求項８記載の組成物または請求項１の方法により同定される物質を投与することからなる、個体における骨形成を変調させる方法。１５．ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状に苦しむ個体を治療するための、有効量の請求項８記載の組成物、または請求項１の方法により同定される物質の使用。１６．効果がＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインによって抑制されている増殖因子の活性を増強するための、請求項８記載の組成物、または請求項１の方法により同定されるＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアンタゴニストである物質の使用。１７．ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの変調を必要とする症状に苦しむ個体を治療するための医薬の製造における、ＴＧＦ−β受容体でなく、かつＴＲＨ１ドメインまたはその一部もしくは模倣物を含む少なくとも１種のＴＧＦ−β結合化合物の使用。