MX2012000214A - Aumento de retencion de bmp. - Google Patents

Abstract

El uso de un injerto óseo autógeno es el patrón de oro actual en 1.500.000 cirugías de injerto óseo que se realizan anualmente en Estados Unidos. Aunque esta práctica ha derivado en altos índices de éxito de fusión, está asociada a un tiempo de operación y una pérdida de sangre aumentada, junto con un importante nivel de morbidez en el sitio del donante. Además, en ciertas situaciones tales como casos de revisión, constructos multinivel, o en pacientes con co-morbideces médicas, el injerto óseo autógeno puede existir en una cantidad y calidad limitada. Esta importante necesidad de una alternativa adecuada para el injerto óseo autógeno ha estimulado un gran interés en la exploración de sustitutos y extensores de injertos óseos.

Description

AUMENTO DE RETENCIÓN DE BMP Este trabajo tuvo el respaldo del Departamento de Asuntos de Veteranos de Estados Unidos y el Gobierno Federal tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención La invención se relaciona con la unión y la retención de las proteínas morfogenét cas óseas ("BMP") por factores de crecimiento (que incluyen el Péptido de Unión a BMP ("BBP")) que deriva en la exposición prolongada de BMP al sitio de acción deseado y en la proliferación mayor y más temprana de células madre mesodérmicas , en la condrogénesis , osteogénesis y/o calcificación, que incluye en un sitio de fusión o de reparación.

Antecedentes de la Invención El uso del injerto óseo autógeno es el patrón de oro actual en 1.500.000 de cirugías de injerto óseo que se realizan anualmente en Estados Unidos. Aunque esta práctica ha derivado en altos índices de éxito de fusión, está asociada a la duración de la operación aumentada y a la pérdida de sangre, junto con un nivel importante de morbidez del sitio del donante. Además, en ciertas situaciones, tales como los casos de revisión, los constructos multinivel, o en pacientes con co-morbideces médicas, el injerto óseo autógeno puede existir en una cantidad y calidad limitada. Esta necesidad importante de una alternativa adecuada para el injerto óseo autógeno ha estimulado un mayor interés en la exploración de los sustitutos y los extensores del injerto óseo.

Una de las líneas de investigación amplia consiste en el uso de proteínas morfogenéticas óseas (BMP) . Las BMP son proteínas osteoinductivas de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) . Desde su descubrimiento, se han identificado varias BMP y se las está produciendo actualmente en cantidades masivas usando tecnologías recombinantes . La proteína osteogénica humana recombinante 1 (rhOP-1) , también denominada rhBMP-7, y rhBMP-2, son las únicas dos BMP que están aprobadas actualmente para procedimientos ortopédicos. Ambas han demostrado ser proteínas osteoinductivas eficaces en los ensayos preclínicos y clínicos. Estos factores de crecimiento proporcionan una alternativa potencial para el injerto óseo autógeno y son capaces de superar al medio biológico subóptimo para la formación ósea observada en las cirugías de revisión y en pacientes con factores de riesgo para pseudoartrosis . Lamentablemente, la utilidad de estas alternativas está limitada por su costo, y los riesgos asociados, tales como reacciones inflamatorias, formación ósea ectópica y riesgos teóricos de carcinogenicidad y teratogenicidad . El riesgo para estos factores adversos aumenta en una forma que depende de la dosis y están presentes a las dosis usadas actualmente para procedimientos ortopédicos.

Los factores de crecimiento son sustancias, que incluyen péptidos, que afectan el crecimiento y la diferenciación de las poblaciones de células definidas in vivo o in Vitro. La formación ósea normal ocurre durante el desarrollo, la remodelación ósea ocurre en la vida adulta, y la reparación ósea ocurre para preservar la integridad del esqueleto. La formación, remodelación y reparación ósea consisten en la resorción ósea por osteoclastos y la formación ósea por osteoblastos . La diferenciación celular y la actividad de los osteoclastos y los osteoblastos están reguladas por los factores de crecimiento. Por lo tanto, cualquier interferencia entre el equilibrio en la diferenciación celular y la resorción puede afectar la homeostasis ósea, la formación y la reparación ósea.

Se ha descrito la inducción de la formación ósea ectópica por la matriz ósea desmineralizada (DBM) . Además, se han descrito las propiedades de la fracción de proteína parcialmente purificada, que incluye BBP . BBP es un péptido de 19 aminoácidos, sintético, cíclico. La secuencia para este péptido está basada en aquella de una parte de una proteína de 18,5 kD denominada "proteína morfogenéticas ósea/proteína no colagenosa" (BMP/NCP) que no tenía ninguna actividad osteogénica independiente. Se descubrió que la proteína era idéntica a un fragmento de una proteína aislada previamente, spp24 ( fosfoproteína segregada de 24 kD) . La spp24 comparte con otras proteínas de unión a BMP, tales como la fetuina, un dominio de cistatina que a su vez contiene un motivo más pequeño, el dominio del TRH-1 (homología 1 del receptor II de TGF-ß) . Spp24 se une al BMP-2 y se ha demostrado que inhibe la actividad osteogénica en un modelo de formación ósea ectópica y en un modelo transgénico de la formación ósea.

Se desean composiciones, dispositivos y métodos seguros, eficaces y asequibles para aumentar la formación y la reparación ósea, que incluyen el tratamiento de los trastornos óseos (tales como la osteoporosis) , de la lesión ósea (tal como la curación de fracturas de huesos planos (por ejemplo, membranosos) y largos (por ejemplo, endocondrales) , de fracturas que no se unieron y de cirugía reconstructiva) , sitios de reparación de rodilla/cadera/articulación o cirugía de reemplazo para tratar la periodontitis , regeneración periodontal, aumento de la cresta alveolar para la reconstrucción de implantes dentales, por ej emplo .

Extracto de la invención Las invenciones se relacionan con la unión y la retención del miembro de la superfamilia de TGF-ß, tal como las BMP, por los factores de crecimiento (que incluyen BBP) que derivan en la exposición prolongada del miembro (s) de la superfamilia de TGF-ß al sitio de acción deseado. En una realización, esto deriva en índices de proliferación mayor y más temprana de células madre mesodérmicas , de condrogénesis , de osteogénesis y/o de calcificación, que incluyen fusión o reparación ósea. Por ejemplo, se ha revelado que BBP aumenta la osificación provocada por la BMP recombinante . Además, BBP cuando se usa como BMP in vivo provoca que la osteogénesis ocurra más rápidamente, en una magnitud mayor y con cantidades más pequeñas de rhBMP-2.

Las invenciones se relacionan con la retención de los factores de crecimiento en el sitio de acción deseado. En una realización, la invención se relaciona con el uso de BBP para unir y retener miembros del miembro de la superfamilia de TGF-ß, que incluye las BMP y los factores de crecimiento relacionados. En una realización de la invención, BBP se puede usar para retener rhBMP-2.

Las invenciones se relacionan con el aumento de la velocidad y/o el nivel de osteogénesis y/o de calcificación por factores de crecimiento debido a la retención del factor de crecimiento en el sitio de acción. En una realización, la invención se relaciona con el uso de BBP para aumentar la velocidad y/o el nivel de la condrogénesis , la osteogénesis y/o la calcificación por miembros de la familia de BMP y factores de crecimiento relacionados. En una realización de la invención, BBP se puede usar para aumentar la velocidad y/o el nivel de la osteogénesis y/o la calcificación por rhBMP-2.

Las invenciones están relacionadas con la retención de factores de crecimiento en el sitio que deriva de la asociación de la BMP con BBP. Las constantes de equilibrio y/o las constantes de disociación pueden derivar en la unión y retención deseadas de factores de crecimiento por BBP.

Las composiciones y los sustratos que incluyen factores que se unen a factores de crecimiento, tales como BBP y métodos de uso de estas sustancias que se asocian a factores de crecimiento son útiles. Las aplicaciones incluyen prevenir la difusión o mantener la concentración de los factores de crecimiento en el sitio de acción, tal como el sitio de reparación ósea.

La invención puede incluir un método de tratamiento con agentes para la asociación con factores de crecimiento para mantener concentraciones deseables de factores de crecimiento en el sitio de acción.

En una de las aplicaciones de la invención, el método se puede aplicar para incluir la formación o reparación ósea.

La invención también puede incluir implantes que tienen agentes para la asociación a factores de crecimiento y/o sembrados con células pluripotenciales o diferenciadas. En una de las aplicaciones BBP, el miembro (s) de la superfamilia de TGF-ß y las células se pueden seleccionar para inducir la formación o la reparación ósea. La invención también puede incluir también la aplicación de agentes para la asociación a factores de crecimiento en un sitio de acción deseado. Los implantes pueden incluir, en forma no taxativa, clavos, tornillos y placas que se usan para inmovilizar fracturas, aumentar la formación ósea o estabilizar un implante protésico estimulando la formación o reparación ósea.

Esta invención es ventajosa por lo menos en que BBP mejora el índice y/o el nivel de actividad por el factor de crecimiento seleccionado, tal como las BMP. Además, esta invención es ventajosa por lo menos en que BBP actúa en forma sinérgica con miembros de la familia de TGF-ß, tales como la cantidad más baja del miembro de la familia de TGF-ß es eficaz para lograr el mismo o un mayor índice o nivel de crecimiento que el esperado con el miembro de la familia de TGF-ß solo. Por lo tanto, la combinación puede mejorar el tiempo al beneficio clínico, mejorar el resultado clínico, reducir los efectos colaterales no deseados y reducir la dosis del factor de crecimiento usado (y el costo de tratamiento concomitante) .

En una realización, un sistema de suministro proporcionaría una concentración local sostenida de BMP suficiente para inducir la formación o la reparación ósea, mientras que minimiza la concentración de la BMP usada, y cualquier efecto colateral local o sistémico.

En una realización se puede usar una combinación de BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß (tal como OP-1) para reducir el costo asociado al uso de los factores de crecimiento en aplicaciones relacionadas con los huesos, reducir los efectos colaterales afectados con altas dosis de factores de crecimiento (tales como para las BMP, la hinchazón y la formación ósea ectópica) y mejorar los resultados clínicos utilizando una combinación de BBP con OP-1. Por lo tanto, en uno de los aspectos de la invención, el BBP se puede usar para unir BMP y otros miembros de la familia de TGF-ß y liberar lentamente los factores de crecimiento en el sitio de acción deseado. Por ejemplo, el uso de BBP en conjunto con rhOP-1 se puede usar para generar la fusión espinal mucho más temprana y mayor. Éstos, así como otros objetos, características y beneficios se aclaran ahora a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas y los dibujos que la acompañan.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1A son secuencias de (1) aminoácido y (2) ácido nucleico bovino de BBP, respectivamente; Figura IB es una secuencia de aminoácido parcial de la proteína de unión a BMP bovina ("BBP") que muestra el dominio de la región de homología de cistatina, la región de homología de BMP-2 y de homología de receptor II de TGF-ß.

La Figura 2 es una alineación de la secuencia de aminoácidos de la BMP-2 humano y la región de homología de la BMP-2 en SPP-24; (i, idéntica; c, sustitución conservadora; se, sustitución semiconservadora) .

La Figura 3 es una alineación de secuencia de aminoácidos de la fetuina bovina y del receptor II de TGF-ß humano (arriba) y del receptor II de TGF-ß humano y el dominio de homología del receptor II de TGF-ß de SPP-24 bobina (que corresponde a BPP) (abajo); (i, idéntica; c, sustitución conservadora; se, sustitución semiconservadora) .

La Figura 4 es un radiograma de los cuartos traseros de ratón 21 días después de la implantación de 500 µg de BPP en atelocolageno (arriba) o atelocolageno solo (abajo) .

La Figura 5 es un corte biológico de músculo de ratón 21 días después de la implantación de 500 de BBP atelocolágeno .

(Mancha de H & E. Aumento original: 100 X) .

La Figura 6 son radiogramas de cuartos traseros de ratón 21 días después de la implantación de 5 de rhBMP-2 (izquierda) o 5 pg de rhBMP-2 más 500 mg de BPP (derecha) .

La Figura 7 son radiogramas de cuartos traseros de ratón 9 (arriba) y 12 (abajo) días después de la implantación de 5 pg de rhBMP-2 (izquierda) o 5 yg de rhBMP-2 más 500 mg de BBP (derecha) .

La Figura 8 son cortes histológicos de cuartos traseros de ratón 9 días después de la implantación de 5 g de rhBMP-2 solo (A) o 5 yg de rhBMP-2 más 500 mg de BBP (B) .

La Figura 9 es un sensograma de resonancia de plasmón de superficie para la interacción de rhBMP-2 (fijado al chip) y BBP ciclizado a concentraciones en la gama de 1 x 10"5 M 1 x 10"4 M.

La Figura 10 es un gráfico de barras que ilustra el porcentaje de la retención de rhBMP-2 durante 1, 3 y 7 días en la presencia o ausencia de BBP.

La Figura 11 incluye secuencias de aminoácidos contra las cuales se han generado anticuerpos de SSP-24/BBP específicos.

Las Figuras 12A y B ilustran diagramas de flujo de ejemplos de métodos de la invención.

Las Figuras 13A y B son esquemas dedos realizaciones de la invención .

La Figura 14A es un gráfico que muestra la secuencia de aminoácidos para BPP en diferentes especies. La Figura 14B es un listado de las secuencias de ácido nucleico para BPP en diferentes especies.

La Figura 15 es una radiografía anteroposterior de una espina de rata fusionada a L4-L5 con la aplicación de una dosis alta de BBP (1000 µq) + dosis baja de rhBMP-2 (1 g) 8 semanas después del tratamiento .

La Figura 16 es una radiografía anteroposterior de una espina de rata que muestra pseudoartitis en la anno fusión derecha en L4-L5 izquierdo con la aplicación del tratamiento con rhBMP-2 (1 pg) .

La Figura 17 es un corte histológico de la región espinal de rata 8 semanas después del tratamiento de una combinación de BBP y rhBMP-2. (Mancha de H & E. Aumento original 8,4 X).

La Figura 18 es un corte histológico de región espinal de rata 8 semanas después del tratamiento con dosis baja de rhBMP-2 (1 q) . (Mancha de H & E . Aumento original: 8,4 X) .

La Figura 19 son radiografías posteroanteriores de espinas de rata explantadas obtenidas después de ocho semanas de tratamiento con (A) 3 yg de rhOP-1 + BBP y (B) 3 µ? de rhOP-1; (A) demuestra una artrodesis exitosa con una fusión ósea intertransversal en L4-L5 mientras que (B) muestra una no unión en L4-L5.

La Figura 20 son reconstrucciones tridimensionales de imágenes de tomografía microcomputarizada de espinas de rata (imágenes de planos de corte) . Espinas fusionadas desde (A) el Grupo IV (10 µg rhOP-1) , (B) el Grupo V (3 µg rhOP-1) , (C) el Grupo VI (3 µ<3 rhOP-1 + BBP), (D) el Grupo VII (1 µg rhOP-1) , (E) el Grupo VIII (1 µg rhOP-1 + BBP) . (F) Ejemplo de la falta de unión observada en el Grupo VI I I .

La Figura 21 es un corte biológico de una fusión exitosa del Grupo VI (3 µg de rhOP-1 + BBP) que muestra una masa de fusión importante (FM) con remodelación ósea muy madura y amplia del proceso transversal (TP) . Aumento original 25 X.

Descripción Detallada de la Invención Una de las realizaciones de la invención comprende un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO la. La SEQ ID NO la de aminoácidos derivados de bovinos se ha designado BBP y la SEQ ID No Ib corresponde a la secuencia de ácido nucleico bovina que codifica BBP.

Una de las realizaciones de la invención comprende un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 12a que es la secuencia de BBP humano. La SEQ ID NO 12b corresponde a la secuencia de ácido nucleico humano que codifica BBP humano.

BBP es un péptido de 2,1 kD, de 19 aminoácidos, derivado de un fragmento de 18,5 kD de una fosfoproteína segregada de 24 kD conocida ("SPP-24"). SPP-24 está ilustrada por la SEQ ID NO 2. BBP contiene el dominio similar a la cistatina de SPP-24.

La secuencia de aminoácidos de BPP es similar a región de la unión a TGF-ß/??? de fetuina, un miembro de la familia de las cistatinas de los inhibidores de proteasas. BPP se une a rhB P-2 (BMP-2 humana recombinante) y también se une a otras moléculas que tienen dominios de unión similares a BMP-2 tales como otros miembros de la superfamilia de TGF-ß (que incluyen en forma no taxativa a BMP-4, BMP-7, TGF-ß y GDF-5) y afecta sus índices de retención y/o su actividad. Sin embargo, cualquier factor de crecimiento puede ser útil en esta invención en la medida en que se une a BBP con una constante de equilibrio y/o de disociación para ser unida y retenida por BBP durante un período de tiempo mayor que sin la presencia de BBP.

BBP solo induce la calcificación de las células de precursores condrogénicos y osteogénicos . BBP aumenta el índice y el nivel al cual rhBMP-2 induce la formación ósea. Sorpresivamente, BBP actúa en forma sinérgica con BMP-2 in vivo provoca que la proliferación de células madre, la condrogénesis, la osteogénesis y/o la calcificación ocurran más rápidamente y en una mayor magnitud y con cantidades más pequeñas de rhBMP-2.

Por ejemplo, cuando se implanta solo en el músculo de ratón, el BBP induce la calcificación distrófica. El proceso de la formación ósea en la reparación o la formación ósea ectópica el modelo de "cuarto trasero de ratón" o de "bolsa muscular" recapitula la formación ósea endocondral. El primer paso consiste en la producción del cartílago, que se reemplaza por el hueso. El mismo proceso que ocurre durante la formación ósea endocontral en desarrollo, mientras que alguna formación ósea membranosa ocurre directamente sin un cartílago intermediario.

En una de las realizaciones de la invención, un péptido que comprende un fragmento de BBP puede ser útil, si el fragmento aumenta en forma similar el nivel o el índice de proliferación de células madre mesodérmica, de condrogénesis , osteogénesis y/o calcificación por BMP-2 en las células de mamíferos, o aumenta el nivel o el índice de calcificación en células de vertebrados, o específicamente células progenitoras condrogénicas u osteogénicas .

Las formas de BBP que tienen modificaciones de las secuencias de aminoácidos reveladas en la presente también pueden ser útiles en esta invención, siempre que la región de unión a TGF-ß mantenga una secuencia y estructura suficiente para unirse a miembros de la superfamilia de TGF-ß con una constante de equilibrio y/o de disociación adecuada que sea eficaz para retenerlos en el sitio de acción durante una cantidad de tiempo mayor que si BBP no estuviera presente.

Por ejemplo, se desea que las secuencias de aminoácidos conservadas de BBP entre especies, las modificaciones de eliminación o inserción, las modificaciones de sustitución conservadora o semiconservadora estén comprendidas en el BBP reivindicado, en la medida en que las secuencias de aminoácidos modificadas aumenten el tiempo de residencia o la actividad de BMP-2 u otras moléculas homologas de TGF-ß. BBP es un motivo molecular de hoja plegada de golpe de vuelta de hoja plegada ß ("B-T-B") . Actualmente se cree que los aminoácidos de unión al factor de crecimiento residen en la sección T. En consecuencia, las sustituciones de aminoácidos de la sección T pueden afectar la actividad de BBP en una mayor medida que en las regiones B.

Una de las realizaciones de la invención comprende un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO 11: C-R-S-T-V-X-Y-S-X-X-X-V-X-X-V X-Y-Y-C, que es la secuencia de consenso de mamífero para BBP. La Figura 14A muestra la homología en BBP bovino (SEQ ID NO 1 ; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 2) , humano (SEQ ID NO 12; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 14 (la posición 9 es A o V) , porcino (SEQ ID NO 15; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 16), ovino (SEQ ID NO 17; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 18) , de rata (SEQ ID NO 19; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 20) y de ratón (SEQ ID NO 21; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 12) . La Figura 14A también muestra regiones muy conservadas en pollo (SEQ ID NO 23; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 24) , salmón (SEQ ID NO 25; secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 27; secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO 28) .

En la Figura 14A, "X" e "Y" se usan para indicar sustituciones de aminoácidos que se entiende que son semiconservadoras o conservadoras, respectivamente. Las sustituciones conservadoras incluyen aminoácidos seleccionados del mismo grupo, y las sustituciones semiconservadoras incluyen sustituciones que no se cree que afecten el dominio de unión a BMP-2 o la función del BBP. Por ejemplo, la sustitución en la posición 6 se conservadora entre humano, rata y ovino, pero es semiconservadora con algunas otras especies porque los aminoácidos informados en esa posición en diferentes especies son Q y E (Q en BBP porcino, de rata y de ratón, y E en pollo) . Aunque K y R están clasificados como aminoácidos básicos. Q está clasificado como un aminoácido polar sin carga, en consecuencia la sustitución es no conservadora. La sustitución es semiconservadora, sin embargo, porque se cree que la función de BBP no se ve afectada. También se encuentran sustituciones semiconservadoras en las posiciones 9, 10, 11 y 16. En la posición 9, el aminoácido A se encuentra en BPP bovino, humano, porcino y ovino, comparado con K que se encuentra en BBP de rata y de ratón. En la posición 10, el aminoácido B se informa para BBP bovino, porcino y ovino, BBP humano contiene Q en esa posición y BBP de rata y de ratón contienen el aminoácido G. En la posición 11, el aminoácido Q se halla en bovinos, humanos, ratas y ratones, mientras que K se informa para BBP porcino y R para BBP ovino. En la posición 16, se halla en BBP bovino, porcino, ovino, de rata y de ratón, mientras el BBP humano contiene un H. También hay-sustituciones semiconservadoras en las posiciones 13 y 14 entre rata/humano, a diferencia de otras especies.

Un ejemplo de una sustitución conservadora se halla en la posición 7. En esta posición, se observan diferentes aminoácidos hidrófobos en diferentes especies, a saber, M en BBP bovino, ovino, de rata y de ratón, comparado con V en BBP humano e I en BBP porcino. Esta sustitución se considera conservadora porque M, V e I son todos aminoácidos hidrófobos. Otras sustituciones conservadoras ocurren en las posiciones 17 y 18. Dos aminoácidos hidrófobos, A y V, se hallan en la posición 17. En la posición 18, se hallan dos aminoácidos básicos, R y H.

Una de las realizaciones de la invención pueden ser una composición que incluyen BBP cuando aumenta el nivel o el índice de calcificación en células de vertebrados, o más específicamente, células de precursor condrogénico u osteogénico de mamíferos. Además, la invención puede incluir BBP que aumenta el nivel o el índice de la osteogenesis por BMP-2 y una de BMP-2 o la matriz ósea desmineralizada. Además, la composición además o alternativamente puede incluir otros miembros de la familia de TGF-ß, que incluyen en forma no taxativa BMP-4, BMP- 7, TGF-Py GDF-5. Además se indica que otros miembros de la familia de TGF-ß están involucrados en la función del sistema inmune y BBP se puede unir con un efecto sobre el tiempo de residencia o la actividad de esas moléculas, así como que puede afectar la función inmune, la inflamación o el crecimiento de tumores.

En una de las realizaciones, esta invención puede incluir un medicamento para el uso en la inducción del índice o el nivel de osteogénesis en un vertebrado que incluye una dosificación terapéuticamente eficaz de BBP y BMP o DBM. La invención puede incluir también un medicamento para su uso en la inducción del índice o el nivel de calcificación en un vertebrado que incluye un péptido que comprende BBP.

Aplicaciones para BBP. Se sugieren numerosas aplicaciones para BBP desde sus propiedades farmacológicas (actividad biológica) . Por ejemplo, BBP solo o en combinación con otros miembros de la familia de TGF tales como BMP-2, BMP-4, BMP-7, GDF-5, o la matriz ósea desmineralizada se pueden usar en métodos clínicos o de investigación para inducir la formación ósea, manteniendo la homeostasis ósea y/o aumentando la reparación ósea. BBP se puede usar solo o en combinación para tratar trastornos homeostáticos o de desarrollo óseo (tales como osteoporosis) , lesión ósea (tal como curación de fracturas de huesos planos (por ejemplo, membranosos) y largos (por ejemplo, endocondrales) , fracturas sin unión y cirugía de reconstrucción. La invención también se puede usar en el tratamiento de periodontitis , regeneración periodontal, aumento de la cresta alveolar para la reconstrucción de implantes dentales, el tratamiento de fracturas sin unión, sitios de reparación de rodilla/cadera/articulaciones o cirugía de reemplazo .

Los índices clínicos de un método o la capacidad de los compuestos de mantener la homeostasis ósea están evidenciados por mejora en la densidad ósea en diferentes sitios en todo el cuerpo que se evalúa, por lo menos mediante exploración DEXA (densitometría ósea) . La formación ósea aumentada en una curación de fractura se evalúa en forma rutinaria mediante rayos X normal del sitio de fractura a intervalos de tiempo seleccionados. Se pueden usar técnicas más avanzadas para determinar los índices precedentes, tales como la exploración de CT (tomografía computada) o métodos histológicos cuantitativos (por ejemplo, el tejido se procesa, se tiñe y se examina en forma microscópica y el hueso definió y se definió con análisis de imágenes) . Además, se pueden usar medidas de la densidad ósea, la superficie ósea, el contenido de minerales óseos, la formación de hueso ectópico, y aumentos en la capacidad del tejido después del examen de rayos X, la expresión de la actividad de la fosfatasa alcalina, la incorporación de calcio, la mineralización o la expresión del mARN de osteocalcina para observar los efectos de la calcificación de BBP y/o de la osteogénesis .

La invención también puede incluir el uso de agentes que inhiben la resorción ósea osteoclástica . Los agentes que pueden ser útiles en esta invención incluyen, en forma no taxativa, los biofosfonatos , los moduladores de receptores de estrógenos selectivos, calcitonina, y suplemento de vitamina D y calcio. La invención también puede incluir el uso de agentes que inducen la formación ósea osteoclástica. Los agentes que pueden ser útiles en esta invención incluyen, en forma no taxativa, PTH, fluoruro de sodio y factores de crecimiento, tales como los factores de crecimiento similares a la insulina I y II.

Los modelos in vivo usados para mostrar los efectos de calcificación de BBP solo o los efectos osteogénicos en combinación con BMP se han usado previamente en la demostración de comportamientos similares de otros compuestos. En particular, los modelos in vivo también han podido predecir exitosamente los efectos osteogénicos in vivo de compuestos tales como BMP y factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) . Específicamente, se ha demostrado que los efectos osteogénicos de BBP en un modelo animal usando un modelo de formación ósea ectópica de fémur de rata. En consecuencia, se anticipa que basado en estos hallazgos similares, BBP tiene efecto osteogénicos in vivo en humanos .

Dosis terapéutica eficaz. Una dosis terapéuticamente eficaz de BBP o un miembro de la familia de TGF-ß útil en esta invención es aquella que tiene un efecto clínico positivo sobre un paciente o un efecto deseado en células medidas por la capacidad del agente de aumentar la proliferación de células madre mesodérmicas , la condrogénesis , la osteogénesis y/o la calcificación, como se describió anteriormente. La dosis terapéuticamente eficaz de cada agente se puede modular para lograr el efecto clínico deseado, mientras que minimiza los efectos colaterales negativos. La dosificación del agente se puede seleccionar para un paciente individual según la vía de administración, la severidad de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, otras medicaciones que está tomando el paciente y otros factores normalmente considerados por el médico que lo atiende, cuando se determina un régimen individual y un nivel de la dosis apropiado para un paciente particular.

Esta invención es ventajosa en que por lo menos la dosificación de BMP-2 necesaria para inducir una velocidad o nivel dado de osteogénesis se puede reducir cuando BMP- 2 se optimiza con BBP. Por lo tanto, BBP y los miembros de la familia de TGF-ß actúan en forma sinérgica.

Forma de Dosificación. La dosis terapéuticamente eficaz de un agente incluido en la forma de dosificación se puede seleccionar considerando el tipo de agente seleccionado y la vía de administración. La forma de dosificación puede incluir un agente en combinación con otros ingredientes inertes, que incluyen coadyuvantes y portadores farmacéuticamente aceptables para la facilitación de la dosificación al paciente, como lo saben los expertos en el arte farmacéutico.

Las formulaciones terapéuticas de BBP (cuando se desea que lo reivindicado incluya modificaciones o fragmentos de ello) se pueden preparar para el almacenamiento mezclando el BBP que tiene el nivel de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales, en la forma de torta liofilizada o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los excipientes a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina del suero, gelatina o inmunoglobulinas . Otros componentes pueden incluir glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG) .

La forma de dosificación se puede proporcionar en preparaciones para la aplicación subcutánea (tal como en un cápsula de liberación lenta), intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, periesquelética o intraesquelética . Una cualquiera o una combinación de agentes pueden estar incluidas en la forma de dosificación. Alternativamente, se puede administrar una combinación de agentes a un paciente en formas de dosificación por separado. Se puede administrar una combinación de agentes en forma simultánea en el tiempo de manera tal que el paciente se exponga a por lo menos dos agentes para el tratamiento.

Agentes Adicionales. La invención puede incluir el tratamiento con un agente adicional que actúa en forma independiente o sinérgica con BBP para aumentar la osteogénesis de calcificación.

Por ejemplo, BBP se puede combinar con BMP, bisfosfonatos , tratamientos de terapia de hormonas, tales como moduladores de receptores de estrógenos, calcitonina y complemento de vitamina D y calcio, PTH (tal como Forteo o teriparatida , Eli Lilly, fluoruro de sodio y factores de crecimiento que tienen un efecto positivo sobre el hueso, tal como factores de crecimiento similares a la insulina I y II y TGF-ß . Los expertos en el arte podrían determinar las dosificaciones aceptadas para cada una de las terapias usando parámetros de dosificación terapéuticas estándar, o dosificaciones reducidas donde los efectos de BBP son sinérgicas con el agente secundario, tal como las BMP.

Actualmente se piensa que BBP actúa sobre BMP-2 por lo menos aumentando su tiempo de residencia con un sustrato. Una de las realizaciones de la invención es un método para detectar la capacidad de BBP de aumentar el tiempo de residencia de una molécula homologa de TGF-ß que incluye aplicar una cantidad de la molécula homologa de TGF-ß en un primer y segundo lugar seleccionado. Además, aplicando una cantidad seleccionada de BBP en el primer lugar seleccionado y finalmente detectando la cantidad de la molécula homologa de TGF-ß en el primer y segundo lugar después un período de tiempo seleccionado y calculando la diferencia entre la cantidad de la molécula homologa de TGF-ß en el primer y segundo lugar.

En una realización, la invención puede incluir un método para aumentar el índice o el nivel de proliferación de células madre mesodérmicas, la condrogénesis , la osteogénesis y/o la calcificación en el tejido de vertebrados que incluye la aplicación de BBP que aumenta el nivel o el índice de la osteogénesis por BMP-2 en células de mamíferos y uno de los miembros de la familia de TGF-ß, tal como BMP-2 o la matriz ósea desmineralizada .

En una realización, la invención puede incluir un método para aumentar el índice o el nivel de la proliferación de células madre mesodérmicas, de condrogénesis, osteogénesis y/o calcificación en el tejido de vertebrados que incluyen administrar células de precursores condrogénicos u osteogénicos al paciente en un lugar próximo al lugar deseado de osteogénesis, además administrar BBP, y administrar uno de los miembros de la familia de TGF-ß, tal como BMP-2 o la matriz ósea desmineralizada .

En una realización, la invención puede incluir un método para aumentar el índice o el nivel de la osteogénesis en un vertebrado que incluye tratar células madre mesinquimales de vertebrados con uno de un miembro de la familia de TGF-ß, tal como BMP-2 o la matriz ósea desmineralizada para reducir la osteogenesis de las células. Además, el tratamiento de las células madre mesenquimales de vertebrados con BBP y la administración de células madre mesenquimales de vertebrados al paciente en un lugar próximo al sitio de acción deseado.

Por ejemplo, las células de mamíferos, tales como las células madre mesenquimales, desde el paciente o un donante de células. Las células se pueden inyectar en un lugar donde se desea la formación o la reparación ósea (tal como el sitio de la fractura o el sitio del implante), o se tratan primero con BBP y/o BMP. Las células luego se pueden administrar al paciente, en forma sistémica o en un sitio seleccionado. Además, se puede tratar al paciente en forma local o sistémica con por lo menos un agente adicional que afecta la proliferación de células madre mesodérmicas , la condrogénesis , la osteogénesis y/o la calcificación.

Las Figuras 12A y B ilustran diagramas de flujo de ejemplos de métodos de la invención, cuyos pasos se pueden realizar en cualquier orden.

Una de las realizaciones de la invención puede incluir un artículo de fabricación que comprende BBP inmovilizado sobre un soporte sólido. El soporte sólido además puede incluir un miembro de la familia de TGF-ß, tal como un miembro de la familia de BMP, que incluye BMP-2, o la matriz ósea desmineralizada.

Una de las realizaciones de la invención puede incluir un implante para su uso in vivo que incluye un sustrato donde por lo menos la superficie del implante incluye BBP. El implante puede incluir además MSC, células progenitoras condrocíticas u osteoblásticas . Además, el implante se puede formar en la forma de un clavo, tornillo, placa o articulación protésica, por ej emplo .

Por ejemplo, las Figuras 13A y B ilustran dos realizaciones de la presente invención. En la Figura 13A, la invención puede incluir implantes o injertos (200) para el uso en el cuerpo que comprende un sustrato que tiene una superficie (201) , en donde por lo menos la superficie del implante incluye BBP (203) en una cantidad suficiente para inducir la calcificación o la osteogénesis en el tejido circundante. El implante puede incluir células madre mesenquimales , células condrogénicas u osteogénicas que expresan BBP y/o BMP-2, matriz ósea desmineralizada, o cultivos de colágeno. El implante puede estar, en forma no taxativa, en la forma de clavos, tornillos, placas o articulaciones protésicas que se pueden colocar en la proximidad o en contacto con un hueso (202) , que se usan para inmovilizar una fractura, aumentar la formación ósea, o estabilizar un implante protésico estimulando la formación o la reparación de un sitio de extirpación ósea, fractura u otra lesión ósea (204).

Como se muestra en la Figura 13B, la invención también puede incluir la aplicación in Vitro (tal como cultivos de colágeno o condrocitos) o in vivo de por lo menos una composición que contiene BBP o células que expresan BBP (206) en la proximidad y en contacto con un hueso (202) , un implante (200) en un sitio de extirpación ósea, fractura u otra lesión ósea (204) donde se desea la osteogénesis y/o la calcificación. La composición de BBP se puede aplicar en combinación con otros agentes tales como BMP-2, la matriz ósea desmineralizada o cultivos de colágeno.

Por ejemplo, también se ha examinado el uso de las células madre para tratar trastornos relacionados con los huesos en humanos . Se ha mostrado que la infusión de células madre progenitoras osteoblásticas de un individuo sano a un individuo enfermo mejora la densidad ósea en estos pacientes (01) . Las células se pueden pretratar con BMP y BPP o aplicar simultáneamente con ellos .

En una de las realizaciones, la invención puede incluir un anticuerpo monoclonal o policlonal que tiene una unión selectiva a cualquier parte del BBP, o a la parte del BBP de este precursor de BBP, SSP-24.

BBP o los fragmentos de él se pueden fusionar (por ejemplo mediante la expresión recombinante o los métodos covalentes in Vitro) a un polipéptido inmunogénico y esto, a su vez, se puede usar para inmunizar a un animal para crear anticuerpos contra BBP. Los anticuerpos son recuperables desde el suero de los animales inmunizados. Alternativamente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales desde células del animal inmunizado en forma convencional. Los anticuerpos inmovilizados pueden ser útiles particularmente en la eliminación o purificación de BBP.

Dos ejemplos de secuencias de péptidos específicas contra las cuales se han generado anticuerpos policlonales de conejo incluyen: (1) Un anticuerpo contra la secuencia de péptidos " IQETTCRRESEADPATCDFQRGYHVPVAVCRSTVRMSAEQV" (Figuras 11-SEQ. ID No. 3) que reacciona con SSP-24 de bovino y humano, el precursor de BBP. Este anticuerpo se generó en conejos inmunizados con el péptido sintético indicado anteriormente. Además, (2) Un anticuerpo dirigido contra la secuencia "CGEPLYEPSREMRRN" (Figura 11-SEQ. ID No. 4) que también se produjo en conejos inmunizados con un péptido sintético que corresponde a la secuencia indicada. Este segundo anticuerpo reacciona con SSP-24 de bovino. La cistatina del extremo de N no forma parte de la secuencia de' SSP-24 nativo, pero preferentemente está incluida para permitir el péptido que se debe conjugar a resinas cromatográficas para la cromatografía de afinidad. Otras secuencias adicionales se pueden identificar para la unión específica a BBP y las secuencias ase pueden seleccionar de manera tal que creen un anticuerpo que tiene una unión selectiva con BBP, pero de manera tal que no interfieran con la unión a BBP tal como la región de BBP que se une a BMP-2 u otros miembros de la familia de TGF-ß.

Los anticuerpos contra las secuencias precedentes, que corresponden a secuencias en el genoma de ratón, humano y de rata, o cualquier derivado de las secuencias inmunogénicas también son útiles en esta invención. Estos anticuerpos son útiles por lo menos en la medida en que reconozcan la secuencia de aminoácidos de BBP con alta especificidad. Dichos anticuerpos también pueden ser útiles en la inhibición de interacciones específicas de proteínas de BBP con otras moléculas donde el anticuerpo se une a un lugar sobre el péptido que interactúa con otras moléculas. La inhibición de la actividad de BBP en situaciones donde el índice o nivel de condrogénesis o de osteogénesis se puede modificar.

En una de las realizaciones de la invención, los anticuerpos específicos para BBP pueden ser útiles en la reducción del nivel o el índice de osteogénesis por BMP-2 en células de vertebrados o la reducción del nivel o el índice de calcificación en células de vertebrados, o más específicamente en células de precursores condrogénicas u osteoblásticas de mamíferos.

Una de las realizaciones de la invención también puede incluir un método para usar anticuerpos selectivos de BBP para seleccionar la presencia de SSP-24/BBP en una muestra (que incluye en forma no taxativa un cultivo de células, una muestra de tejido, una fracción de péptidos, Western blot) que incluye exponer la muestra al anticuerpo selectivo de BBP y visualizar el complejo de SSP-24/BBP y el anticuerpo de BBP.

En una de las realizaciones de la invención, los anticuerpos de BBP se pueden usar para la purificación de afinidad del BBP del cultivo de células recombinante o fuentes naturales. Se pueden usar anticuerpos de BBP que no reaccionan en forma detectable con otros factores de crecimiento para purificar BBP desde estos otros miembros de la familia.

En una realización, la invención puede incluir un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de ADN o ARN que codifica BBP, o secuencias modificadas que corresponden a las secuencias de amino modificadas descritas anteriormente .

La invención también puede incluir un vector de expresión unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica BBP, o SSP-24 precursora. Además, se puede obtener un transformante introduciendo el constructo de ácido nucleico que codifica para BBP, o su SSP-24 precursora en una célula huésped.

La práctica de esta invención puede incluir el uso de un constructo de oligonucleótido que comprende una secuencia que codifica para BBP y para una secuencia de promotor unida en forma operativa en un vector de expresión de mamífero o viral. Los vectores de expresión y de codificación contienen una secuencia de nucleotidos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación esta secuencia es aquella que permite que el vector se replique independientemente de los cromosomas huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichos vectores de clonación son conocidos para los expertos en el arte. Los vectores de expresión, a diferencia de los vectores de clonación, pueden contener un promotor inducible o constitutivo que es reconocido por el organismo huésped y está unido en forma operativa al ácido nucleico de BBP . El ácido nucleico puede estar unido en forma operativa cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o secuencia líder secretora unida al ADN para un polinucleótido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido.

Una de las realizaciones de la invención también puede incluir un método para usar secuencias del ácido nucleico de ADN o el ARN complementarias y que tienen una unión específica para las secuencias de ADN o de ARN que codifican BBP para detectar la presencia del ADN o del ARN de BBP en una muestra, respectivamente (que incluye en forma no taxativa un cultivo de células, una muestra de tejido, una fracción del ácido nucleico, o Southern o Northern blot) que incluye exponer la muestra a las secuencias de ADN o ARN de BBP complementarias y visualizar el complejo de híbridos.

Ejemplo 1. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS ÓSEAS NO COLAGENOSAS (NCP) Métodos: Se extrajeron NCP de polvo de hueso cortical humano desgrasado, desmineralizado con 4 M GuHCI, 0,5 M CaCI2, 2 mM N-etilmalemida, 0,1 mM HCl de benzamidina y 2 mM NaN3 durante 18 horas a 6°C. Se extrajeron NCP solubles en colágeno y citrato residual mediante diálisis contra 250 mM citrato, a pH 3,1 durante 24 horas a 6°C. Se formaron pelotillas del residuo (10.000 x g a 6°C durante 30 minutos), se desgrasaron con 1:1 (v/v) cloroformo: metanol durante 24 horas a 23°C, se recogieron mediante filtración y se secaron a 22 °C. El material se resuspendio en 4 M GuHCI, se sometió a diálisis contra 4 M GuHCI, 0,2% (v/v) de Tritón X-100, 100 mM Tris-HCI, a pH 7,2 durante 24 horas a 6°C, luego se sometieron a diálisis contra agua y se centrifugaron a 10.000 x g durante 30 minutos a 6°C. La pelotilla se liofilizó y posteriormente se separó mediante cromatografía con hidroxiapatita .

Se realizó la cromatografía usando una estación de trabajo de cromatografía BioLogic con una columna de hidroxiapatita cerámica CHT-10 (BioRad, Hercules, CA) . BMP/NCP bobina se solubilizó en 6 M urea, 10 mM fosfato de sodio, pH 7,4. La muestra se cargó en una columna de hidroxiapatita y se recogió la fracción no unida. Las proteínas unidas se eluyeron con una concentración creciente de fosfato de sodio hasta 300 mM sobre un gradiente lineal de cinco volúmenes de columna. Se recogieron fracciones de 5 mi durante el transcurso de la corrida. La fracción que se separó en 180 mM fosfato se separó adicionalmente mediante electroforesis de SDS-PAGE. Una banda que corresponde a una Mr de 18,5 se extirpó y se sometió al análisis de secuencia mediante espectroscopia de masa con análisis de tiempo de vuelo y ionización por deserción mediante láser asistida por una matriz (MALDI/TOF MS) .

Resultados: Identificación y Análisis de Secuencia. La fracción de bBMP/NCP que eluyó desde la hidroxiapatita en 180 mM fosfato se separó mediante electroforesis de SDS-PAGE y el material con una Mr de 18,5 kD se sometió al análisis de MALDI/TOF MS . Se determinó que el componente de proteína principal de este material era un fragmento de SPP-24 sobre la base de seis péptidos con secuencias idénticas a regiones de esa proteína (Hu, et al, Aislamiento y clonación molecular de una fosfoproteína ósea novedosa en su secuencia con la familia de las cistatinas de los inhibidores de tiol proteasa . J. Biol . Chem. 270:431-436, 1995) . Las secuencias de estos péptidos se muestran en la Tabla Tabla 1 . Identificación de la proteína de 18,5 kD mediante espectroscopia de masa de MALDI/TOF y toma de huellas dactilares de péptidos Masa Masa Secuencia de Péptido Esperada3 Observada*1 1526, 574 1526, 53 ESEADPATCDFQR* (SEQ ID NO: 291 1411, 600 1411, 71 VNSQSLSPYLFR ÍSEQ ID NO: 30) 1291,406 1291,41 SRGEPLYEPSR ÍSEQ ID NO: 31) 1249,409 1249,48 NSYLLGLTPDR (SEQ ID NO: 32) 1158 , 363 1158 ,27 GYHVPVAVCR *ÍSEQ ID NO: 33) * cistatina modificada; a = las masas de los péptidos se expresan como [M + H+] El análisis de esta secuencia con la base de datos de MALDI/TOF reveló el dominio similar a cistatina que se había descrito previamente, pero ninguna otra similitud de secuencia de importancia para el metabolismo óseo. (Hu et al). Sin embargo, se sabe a partir de otro trabajo que otras proteínas similares a cistatinas interactúan con proteínas que cumplen una función en el metabolismo óseo. Especialmente, los miembros de la familia de las cistatinas tienen propiedades de unión a TGF-ß y a BMP-2 basadas en las similitudes en el receptor de TGF-ß. (Brown et al, Amigos y relaciones de la superfamilia del ADN de cys, nuevos miembros y su evolución; Protein Sci. 6:5-12, 1997; Demetriou, et al., Fetuina/oí2-HS glicoproteína es un imitador del receptor tipo II del factor de crecimiento transformante ß y un antagonista de citoquina. J. Biol . Chem. 271:12755-12761, 1996.) Sin embargo, la fetuina antagoniza la actividad de BMP. (Hu, et al.) En consecuencia, se hizo una comparación manual de la región similar a citoquina de SSP-24 y el dominio similar a cistatina de fetuina .

La Figura IB es una secuencia de aminoácidos parcial de SPP-24 bovino, la región de homología de BMP-2 y el dominio de homología del receptor II de TGF-ß. Se ha confirmado la presencia de los aminoácidos subrayados mediante espectroscopia de masa (GenBank Acceso Número U08018; Hu et al) .

Se identificaron dos regiones de interés en la región similar a cistatina de SPP-24. Una de las regiones tenía alguna similitud de secuencia con BMP-2, mientras que la otra región tenía similitud de secuencia con el dominio de homología del receptor II de TGF-ß de fetuina. Esa parte de la secuencia de SPP-24 que contiene estas dos regiones se muestra en la Figura IB.

Las comparaciones de las dos regiones de interés con BMP-2 humana y receptor II de TGF-ß humano se muestran en las Figuras 2 y 3. La Figura 2 es una alineación de secuencia de aminoácidos de BMP-2 humana y la región de homología de BMP-2 en SPP-24 bovino. La Figura 3 es una alineación de secuencia de aminoácidos de fetuina bovina y el receptor II de TGF-ß humano (arriba) y del receptor II de TGF-ß humano y del dominio de homología del receptor II de TGF-ß humano de SPP-24 bovino (que corresponde a BBP (abajo) . La alineación de las secuencias de SPP-24, fetuina, BMP-2 humana y receptor II de TGF-ß humano se realizó usando el programa T-Coffee. (Notredame et al, T-Coffee: Un método novedoso para varias alineaciones de secuencias. J. Molecular Biol. 302:205-217, 2000) . Los péptidos sintéticos que corresponden a estas dos regiones se obtuvieron y se sometieron a los análisis químicos e in vivo que se describen a continuación.

Ejemplo 2. ACTIVIDAD IN VIVO DE BBP Métodos. La actividad osteogénica del material se ensayó usando ratones Swiss-Weber machos de 8 a 10 semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, NY) . Antes del ensayo, el BBP se solubilizó y se liofilizó en 2 mg de atelocolágeno. El material seco se colocó dentro de una cápsula de gelatina N°5 y se esterilizó mediante la exposición a vapor de cloroformo. Para realizar el ensayo, se anestesió a los ratones usando 1% de isoflurano suministrado en oxígeno a 2 1/minuto a través de una máquina de anestesia para animales pequeños (VetEquip, Pleasanton, CA) . Los animales se fijaron a un panel de cirugía y la piel que está sobre los cuartos traseros se rasuró. La piel se limpió con 70% de etanol y se hizo una incisión de la línea media sobre la espina adyacente a los cuartos traseros. Se usó la disección con un elemento contundente con tijeras para exponer los músculos cuádriceps de un costado. Se hizo una bolsa pequeña en el músculo usando la punta de las tijeras y la cápsula N°5 que contiene el material de ensayo se insertó dentro de la bolsa. La piel luego se cerró con tres broches quirúrgicos de Michel de 11 mm y se devolvió al animal a la jaula para el monitoreo.

Después de 21 días se sacrificó a los animales y se extirparon los cuartos traseros. El examen radiológico de los especímenes se realizó usando un gabinete de rayos X de las partes pequeñas (Faxitron, heeling, IL) . Para la cuantificación de la formación ósea, la superficie ósea y el contenido mineral óseo (BMC) de una superficie de interés que abarca el sitio de formación ósea ectópica se determinó usando un densitómetro de animal pequeño PIXImus2 (GE Lunar, Madison, WI) . Luego los especímenes se colocaron en formalina con tampón y se sometieron al procesamiento para exámenes histológicos de rutina.

Diferentes cantidades de rhBMP-2 y BBP se combinaron y se prepararon para la implantación. Todas las combinaciones posibles de las siguientes cantidades se usaron en estudios piloto, rhBMP-2: 0 µg, 50 µ?, y µg 500 mg. Se usaron 5 de rhBMP-2 estudios posteriores más amplios porque esa cantidad produjo consistentemente una cantidad de hueso ectópico que no fue ni demasiado grande ni demasiado pequeña para un análisis confiable.

Resultados: El BBP se ensayó solo y en combinación con rhBMP-2 La Figura 4 es una radiografía de cuartos traseros de ratón 21 días después de la implantación de 500 µg de BBP en atelocolágeno (arriba) o atelocolágeno solo (abajo) . Cuando se implantó solo con un portador, BBP indujo la calcificación.

La Figura 5 es un corte histológico de músculo de ratón 21 días después de la implantación de 500 µg de BBP en atelocolágeno. Obsérvese la calcificación distrófica asociada principalmente al tejido adiposo intramuscular. (Mancha H & E. Aumento Original 100 X) .

Cuando se implantaron 500 µg de BBP con una similitud de secuencia con el receptor II de TGF-ß con 5 µ9 de rhBMP-2 la cantidad de hueso ectópico formada, medida mediante densitometría, fue consistentemente mayor que la cantidad de hueso formada en animales en los cuales se implantaron cantidades idénticas de rhBMP-2 sola.

La Figura 6 son radiografías de los cuartos traseros de ratón 21 días después de la implantación de 5 µ<3 de rhBMP-2 (izquierda) o 5 µg de rhBMP-2 más 500 mg de BBP (derecha) . Obsérvese la opacidad aumentada asociada a las muestras que contienen tanto rhBMP-2 como BBP.

Además, los implantes que contenían tanto el péptido como rhBMP-2 produjeron un cartílago y hueso detectables antes que los implantes de BMP-2 sola.

La Figura 7 son radiografías de los cuartos traseros de ratón 9 (arriba) y 12 (abajo) días después de la implantación de 5 µg de rhBMP-2 más 500 mg de BBP (derecha) . Obsérvese la aparición de calcificación en la muestra del día 9 que contiene tanto rhBMP-2 como BBP pero no la muestra que contiene BMP-2 sola.

La Figura 8 son cortes histológicos de los cuartos traseros de ratón 9 días después de la implantación de 5 µg de rhB P-2 sola (A) o 5 µ9 de rhBMP-2 más 500 de BBP (B) . Obsérvese el cartílago abundante en el espécimen de BMP + BBP mientras que el espécimen de BMP sola muestra las primeras etapas de inflamación y proliferación de células mesodérmicas .

Tabla 2. Cuantificación Densitométrica de la formación ósea ectópica con diferentes cantidades de BBP implantadas con 5 µ< de rhBMP-2. Promedio, SE (n) BBP (µ<3) 0 50 500 Superficie 0,089 ± 0,0336 0,159 ± 0,0606 0,226 ± 0,0270 ósea (cm2) (12) * (8) Contenido 0,00189 ± 0,00388 ± 0,00528 ± mineral óseo 0,00084 (12)** 0,0017 (8) 0,00068 (12)** (g) 0,0044; **p = 0,0049 Ejemplo 3. RESONANCIA DE PLASMON DE SUPERFICIE PARA DETERMINAR LA INTERACCIÓN DE BMP-2 Y EL PÉPTIDO SINTÉTICO Métodos. La interacción de unión entre rhBMP-2 y BBP se caracterizó usando la resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento Biacom X (Biacore, Piscataway, NJ) . Se obtuvieron tampones y chips para el procedimiento de Biacore. rhBMP-2 se sometió a diálisis en 10 mM acetato de sodio, pH 5,5, a una concentración de 1 mg/ml. Este material luego se adhirió a un chip de sensor CM-5 usando reactivos y procedimientos provistos por el fabricante. El tampón corriente fue 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactante P20. El péptido se disolvió en tampón corriente a concentraciones en la gama de 1 x 10"5 a 1 x 10~4. Se emplearon velocidades de flujo de 5 a 50 µ?/minuto y volúmenes de inyección de 20 a 100 µ?. La solución de regeneración fue 10 µ? glicina-HCl, pH 2,0.

Resultados: Los resultados de los estudios de resonancia de plasmón de superficie para determinar la interacción entre rhBMP- 2 y BBP se muestran en la Figura 9.

La Figura 9 es un sensograma de resonancia de plasmón de superficie para la interacción de rhBMP-2 (fijada al chip) y BBP ciclizado a concentraciones en la gama de 1 x 105 M a 1 x 10~4 M. La constante de disociación estimada (KD) para la interacción fue 3 x 10"5 M. Cuando el BBP se desciclizó mediante la reducción previa con ß-mercaptoetanol , no ocurrió ninguna unión importante.

Ejemplo 4. ESTUDIO DE TIEMPO DE RESIDENCIA: BBP y rhBMP-2 Métodos: Se mezcló rhBMP-2 marcada con BBP o un excipiente y se aplicó a esponjas de colágeno. Las esponjas se implantaron en bolsas de músculo en roedores. En los tiempos especificados (1, 3, y 7 días), los implantes se retiraron y se determinó la cantidad de BMP remanente. Se usaron cuatro animales en cada grupo .

Resultados: BBP aumentó la retención de rhBMP-2 en un factor de dos. La Figura 10 es un gráfico de barras que ilustra el porcentaje de retención de rhBMP-2 después de 1, 3 y 7 días en la presencia o ausencia de BBP.

Discusión: El aumento de la retención de BMP en un sitio de implante puede mejorar la eficacia de la BMP y también reducir la cantidad necesaria para el mismo resultado terapéutico.

Ejemplo 5. ACTIVIDAD IN VIVO DE BBP HUMANO Métodos: Los métodos del Ejemplo 5 se utilizaron para ensayar la actividad de hBBP en ocho ratones en el método del ensayo de formación ósea ectópica de los cuartos traseros usando 5 µg de rhBMP-2 sola (control) o 5 µg de rhBMP-2 más 0,05 mg de BBP humano (hBBP) . Después de 4 semanas, se sacrificó a los animales y se extirparon les los cuartos traseros. Se realizaron análisis de rayos X y de DEXA.

Resultados: hBBP se ensayó en combinación con rhBMP-2 Cuando se implantó, hBBP con BMP derivó en una mayor cantidad de inducción de la calcificación que BMP sola.

Tabla 3. Cuantificación densitométrica de la formación ósea ectópica con diferentes cantidades de BBP implantado con 5 µg de rhBMP-2. Promedio, SE (n) .

Grupo Contenido de BMC Promedio (g) rhBMP-2 (5 0, 00775 hBBP (0,05 mg) + rhBMP-2 (5 0, 01125 Además, la unión a BBP con cuatro factores de crecimiento de la familia de TGF-ß se evaluó usando a la resonancia de plasmón de superficie. La retención in vivo de rhBMP-2 se cuantificó comparando el porcentaje de rhBMP-2 marcada con [125I] retenida en implantes de esponja de colágeno absorbible (ACS) con o sin BBP a 1, 3 y 7 días después de la implantación en musculatura abdominal de rata. El efecto complementario de BBP con crecimiento óseo inducido por rhOP-1 se evaluó comparando el tiempo a la fusión y las velocidades de fusión en un modelo de fusión posterolateral de roedor bien aceptado con dos dosis diferentes de rhOP-1 con y sin BBP. El tiempo a la fusión se evaluó usando radiografías simples. La velocidad de fusión se determinó mediante radiografías simples, palpación manual, y tomografía microcomputarizada (micro-CT) . Se usó la histología para evaluar las características óseas de la masa de fusión.

Como se describió anteriormente, BBP se unió a los cuatro factores de crecimiento de la familia de TGF-ß con una afinidad intermedia. La retención in vivo de BMP-2 sola estuvo en la gama del 40% el día 1 al 30% el día 7, mientras que, la retención de BMP-2 en la presencia de BBP fue del 85% el día 1 y del 55% el día 7. Se retuvo un porcentaje mucho mayor de rhBMP-2 en la presencia de BMP en todos los puntos de tiempo. El agregado de BBP a rhOP-1 derivó en velocidades de fusión muy anteriores y mayores que las logradas con rhOP-1 sola.

Se determinó que BBP aumentó las propiedades osteoinductivas de BMP que involucra la unión y la retención del factor de crecimiento, que deriva en la exposición prolongada de BMP al sitio de fusión deseado. El agregado de BBP a rhOP-1 derivó en velocidades de fusión muy anteriores y mayores que aquellas logradas con rhOP-1 sola. Estos estudios respaldan el uso de BBP con BMP para proveer resultados de fusión satisfactorios, mientras que reducen los costos y los efectos colaterales asociados al uso de BMP.

Ejemplo 6. Caracterización de la unión a BBP con Resonancia de Plasmón de Superficie Métodos: La unión dinámica y de equilibrio de BBP y la proteína parental, spp24 (fosfoproteína segregada, 24 kD) , con varios factores de crecimiento de la superfamilia de TGF-ß se determinaron usando la resonancia de plasmón de superficie (SPR) con un instrumento Biacore X (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . SPR es una técnica óptica en la cual la unión de un analito (por ejemplo, BBP) a un ligando inmovilizado en forma covalente (por ejemplo, rhBMP-2) sobre un chip de vidrio se mide como una señal eléctrica proporcional a la masa del analito que se une al chip cuando el tampón corriente que contiene el analito fluye sobre la superficie. rhBMP-2, rhOP-1 (rhBMP-7) , rhTGF-ß y GDF-5 de ratón recombinante (0,5 µg cada uno; R&D Systems, Minneapolis, MN) se sometieron a diálisis en 10 mM tampón de acetato (pH 5,0) y amina acoplada a un chip de sensor CM-5 usando el estuche de reactivo provisto por el fabricante (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ) . BBP (GenScript, Piscataway, NJ y CS Bio, Menlo Park, CA) la proteína relacionada se disolvieron en tampón corriente de HEPES-EP (10 m HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl ; 3 mM EDTA; y 0,005% de surfactante P-20) a 1 x 10"5 M a 1 x 10"4 M. Para asegurar la cuantificación precisa de las concentraciones de proteínas, que son esenciales para cálculos cinéticos, se centrifugaron muestras a 12.000 rpm en una microfuga durante un minuto antes del uso. El sobrenadante se decantó y se usó para análisis. Las concentraciones de las proteínas se determinaron usando el espectroscopio de radiación ultravioleta a una absorbencia de 280 nm. Los coeficientes de extinción se calcularon usando la herramienta ProtParam (www. expasv. ch/tools/protparam. html ) . Las velocidades de flujo estuvieron en la gama de 5 a 50 µ?/minuto y los volúmenes de inyección fueron de 20 a 200 µ? . Para asegurar la uniformidad, se hizo un esfuerzo de hacer reaccionar suficiente ligando al chip para dar un valor de línea base de 2500 U (unidades de respuesta). Las constantes cinéticas ka (en el índice, constante, "reconocimiento") y kd fuera de índice, constante de disociación, "estabilidad") así como la constante de equilibrio KD (constante de equilibrio, "afinidad") se determinaron mediante un análisis de Langmuir usando el software BIAevaluation (versión 3.2) instalado en instrumento por el fabricante.

Resultados: Los resultados de los análisis cinéticos de las interacciones entre BBP o spp24 y los diferentes factores de crecimiento se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Análisis Cinéticos de la Unión de BBP y spp24 a Cuatro Factores de Crecimiento de la Familia de TGF-ß Analito Ligando KD(kd/ka) Ka kd "afinidad" "reconocimiento" "estabilidad" M N"1 s"1 s'1 BBP rhBMP-2 5, 33 X 10" -8 3 , 17X104 1,69 x 10"3 BBP rhOP-1 1, 16 X 10' -6 3, 18 x 103 3,69 x 10-3 (rhBMP-7) BBP rhTGF-ß 6, 8 X 10" 8 2 , 77 x 104 1,75 x 10"3 BBP rmGDF-5 7, 77 X 10' -7 4,53 x 103 3,52 x 10"3 spp24 rhBMP-2 1, 77 X 10 -8 3,11 xlO5 5,5 x 10~3 BBP = péptido de unión a la proteína morfogenéticas ósea rhBMP = proteína morfogenétcia ósea humana recom inante rhOP-1 = proteína 1 osteogénica humana recombinante rhTGF-ß = factor de crecimiento transformante beta humano recombinante rmGDF-5 = factor de crecimiento y diferenciación 5 de ratón recombinante spp24 = fosfoproteína segregada 24 BBP se unió a los cuatro factores de crecimiento de la familia de TGF-ß y la proteína parental con una afinidad que no fue muy diferente. rhOP-1 y GDP tuvieron la afinidad más baja (KD más alta) . La diferencia en la KD para la interacción de BBP/rhBMP-2 se debió principalmente a una ka más baja ("reconocimiento" más lento) en el caso de la interacción de BBP/BMP-7.

Las constantes de unión (KD, "afinidad") para la asociación de BBP con varios factores de crecimiento de la familia de TGF-ß y la proteína parental, spp24, son ligeramente mayores (afinidad más baja) que aquellas para las interacciones de receptor y ligando (en el orden de KD = 10"8 a 10"9 M) y mucho mayores que la interacción más ávida en la naturaleza (KD para estreptavidina/biotina = 10"14 M) . Una afinidad de esta magnitud puede ser útil para brindar la función de la "liberación/inmovilización lenta" con respecto a la acción de las BMP en el tejido esquelético.

La KD para la interacción de BBP/rhOP-1 es mayor (menos afinidad) que para la interacción de BBP/rhBMP-2. Sin embargo, la kd (disociación, "estabilidad") para cada una de estas dos interacciones es muy similar y, en consecuencia, puede reflejar una propiedad cinética que tiene importancia aumentada en el diseño de la terapéutica.

Ejemplo 7. Efecto de BBP sobre la retención de BMP n vivo Métodos: El efecto de BBP sobre la retención in vivo de rhBMP-2 se estudió en ratas Sprague-Dawley hembras de 4 a 6 semanas. En resumen, 5 mg de rhBMP-2 fría y 1 x 105 cpm de rhBMP-2 marcada con [125I] en 50 mi se aplicaron a esponjas de colágeno reticuladas absorbibles (ACS ; 14 x 14 x 3 mm; Helistat, Integra Life Sciences, Palinsboro, NJ) en la presencia de un excipiente o 0,5 mg de BBP. Después de aproximadamente 10 minutos de incubación a temperatura ambiente la preparación se implantó insertándola en una bolsa ciega creada mediante la disección con un elemento contundente suave en la musculatura abdominal . Hubo cuatro muestras para cada tratamiento/punto de tiempo (2 muestras por rata y 2 ratas por punto de tiempo) . La retención del trazador se midió 1, 3 y 7 días después de la implantación recuperando los implantes usando un contador gamma. Se contaron alícuotas de los fluidos de aplicación en el momento de la implantación para determinar cpm total a t0. El porcentaje de rhBMP-2 aplicada retenida se calculó en cada punto de tiempo dividiendo cpm asociado al explante por cpm implantado a t0.

Resultados: El efecto de BBP sobre la retención de BMP- 2 in vivo se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Efecto de BBP sobre la Retención de BMP-2 in vivo (Porcentaje de BMP-2 Retenida) Tratamiento Dia 1 Día 3 Dia 7 BMP-2 sola 40,9 ± 1,51 31, 9 ± 2,07 27,9 + 2,48 BMP-2 + BBP 83,3 ± 1,56* 70, 6 ±1,34* 53, 0 ± 1,51 * Los datos se muestran como promedio + S.E. n = 4 para todos los grupos.

* Mucho mayor porcentaje de rhBMP-2 retenida comparada con el grupo sin BBP (p< 0,0001) .

La retención de BMP-2 sola estuvo en la gama del 40% el día 1 al 30% el día 7. Por otra parte, la retención de BMP-2 implantada en la presencia de BBP fue del 85% el día 1 y del 55% el día 7. Se retuvo un porcentaje mucho mayor de rhBMP-2 en la presencia de BBP en todos los puntos de tiempo (p < 0,0001) .

Los resultados del estudio de la retención de BMP respaldan la hipótesis de que BBP aumenta la actividad de BMP aumentando la retención de BMP en el sitio del implante. La teoría de que, si una concentración más alta de BMP está presente durante un período de tiempo más prolongado, se esperaría un efecto biológico mayor. Las BMP inducen una recapitulación de la formación ósea endocondral, lo cual quiere decir que el tejido en el sitio del implante pasa por un progreso definido y reproducible que incluye inflamación, proliferación de células madre mesodérmicas , formación de cartílago e invasión vascular con reemplazo de cartílago por hueso. Este proceso requiere un período de muchos días y cada uno de los primeros pasos depende de la BMP. Por lo tanto, un retardo en la dispersión de BMP deriva en una mayor concentración del morfógeno muchos días después de la implantación y, en consecuencia, un aumento de procesos tales como la diferenciación condrogénica de las células madre mesodérmicas. A partir de estos resultados, uno esperaría una respuesta clínica similar a una dosis más pequeña de BMP cuando se usa en conjunto con BBP.

Ejemplo 8. Diseño del Estudio de la Fusión Posterolateral In Vivo Métodos: Un total de 120 ratas Lewis machos (de 8 semanas, de 200-260 g, Charles River, Wilmingon, MA) se dividieron en 8 grupos. Los grupos se diferenciaron solamente por los materiales agregados a la ACS (5 x 5 x 13 mm) que se aplicaron a los sitios quirúrgicos. La preparación de los implantes se describió previamente en detalle. (Alanay et al, El efecto complementario del péptido de unión sobre la proteína morfogenética aumentó la curación ósea en un modelo de roedor de fusión espinal . Espina 2008;33:1709-13). rhOP-1 implantada se obtuvo de Stryker Biotech, Hopkinton, MA. Los grupos control fueron: I) Decorticación solamente (n = 10); (II) ACS solamente (n = 10); (III) ACS con 1000 BBP (n = 10); y (IV) ACS con 10 iq de rhOP-1 (n = 10). Los grupos experimentales fueron: (V) ACS con 3 µ? de rhOP-1 (n = 20); (VI) ACS con 3 µ? de rhOP-1 más 1000 g de BBP (n = 20); (VII) ACS con 1 ug de rhOP-1 (n = 20); (VIII) ACS con 1 \iq de rhOP-1 más 1000 pg de BBP (n = 20) (véase la Tabla 6) . Se sacrificó a los animales 8 semanas después de la cirugía con C02.

Técnica quirúrgica. Se anestesió a los animales con 2-2,5% de isoflurano administrado en oxígeno (1 L/minuto) y el sitio quirúrgico se rasuró y se desinfectó con betadina alternativa y 70% de alcohol. Se medicó previamente a los animales con 0,15 mg de buprenorfina y en forma postoperatoria recibieron dosis graduales cada 12 horas durante 2 días.

La fusión espinal de proceso intertransversal posterolateral en L4-L5 en la rata es un modelo bien establecido en nuestro laboratorio. La cresta ilíaca se usó como una marca para ubicar el cuerpo de la vértebra L6. Se hizo una incisión de la línea media longitudinal de 4 cm a través de la piel y el tejido subcutáneo sobre L4-L5 hacia abajo hacia la fascia lumbodorsal . Luego se hizo una incisión paramédica longitudinal de 2 cm en los músculos espinales bilateralmente . Se expusieron los procesos transversales de L4-L5, se limpiaron del tejido blando y se decorticaron con una rebaba de alta velocidad. El sitio quirúrgico luego se irrigó con solución salina estéril y se colocaron materiales de tratamiento idénticos bilateralmente, teniendo cuidado de aplicar el implante para cubrir totalmente los procesos transversales. Luego se dejó que los músculos paraespinales cubrieran los implantes y la fascia lumbodorsal y la piel se cerraron con suturas Prolene 4-0 (Ethicon Inc., Somerville, NJ) . Se dejó que los animales deambularan, comieran y bebieran a placer inmediatamente después de la cirugía.

Análisis Radiográfico. Se tomaron radiografías posteroanteriores de cada animal a las 4, 6 y 8 semanas usando un instrumento de rayos X portátil AMX-3 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Las radiografías fueron evaluadas por 3 observadores independientes empleando la siguiente escala estandarizada: 0: ninguna fusión; 1: fusión incompleta con presencia de formación ósea; y 2: fusión completa. Las calificaciones de los observadores se sumaron y una calificación de 5 o 6 se consideró "fusionada" .

Evaluación Manual de la Fusión. Ocho semanas después de la cirugía, se extirparon las espinas y fueron evaluadas por tres observadores independientes a ciegas por el movimiento intersegmental . Todos los movimientos hacia cualquier costado entre las facetas o los procesos transversales, que incluyen el movimiento unilateral, se consideraron una falta de unión. La ausencia bilateral de movimiento se consideró fusión. Las espinas se calificaron como fusionadas o no fusionadas. Fue necesario el acuerdo unánime para considerar que un espina estaba "fusionada" .

Análisis de Tomografía Microcomputarizada . Las espinas explantadas se exploraron posteriormente usando la tomografía microcomputarizada (micro-CT) de alta resolución, usando una tecnología de resolución de 9-20 µ?? (µ??40, SCANCO Medical, Basseerdorf, Suiza) para evaluar nuevamente el índice de fusión y observar la masa de fusión. La fusión se definió como la presencia bilateral de formación de puente óseo entre los procesos transversales de L4 y L5. Los datos de la micro-CT se recogieron a 55 kVp y 72 µ? y se reconstruyeron usando un algoritmo de haz cónico con el explorador de micro-CT. La visualización y la reconstrucción de los datos se realizaron usando el Programa Ray T3.8 y Evaluation v6.0 (SCANCO Medical), respectivamente. Un observador independiente juzgó que las imágenes reconstruidas estaban fusionadas o no fusionadas.

Análisis Histológico. Las espinas se disecaron y se fijaron en 10% de formalina, luego se transfirieron a 70% de etanol desnaturalizado. Cuando se terminó la formación de imágenes, los especímenes se descalcificaron usando un reactivo comercial que contiene 10% de HCl (Cal-Ex, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ) , se lavaron con agua potable corriente y luego se transfirieron a 70% de etanol desnaturalizado. Se cortaron cuidadosamente cortes sagitales seriales al nivel del proceso transversal . Los especímenes luego se incrustaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Cada muestra que presentó cualquier fusión se procesó para el examen histológico para asegurar que la masa de fusión representaba una formación ósea verdadera y no una calcificación distrófica o algún otro proceso clínicamente desventajoso. Las muestras sin ninguna masa de fusión no se. examinaron.

Análisis Estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS, V17, Chicago, IL) . Se comparó la retención de rhBMP-2 usando la prueba t de Student . Los índices de fusión se compararon en comparaciones dedos grupos secuenciales usando la prueba exacta de Fisher. La conflabilidad entre observadores se evaluó computando la estadística de ?. El acuerdo se calificó de la siguiente manera: pobre, ? = 0-0,02; regular, ? 0,21-0,4; moderado, ? = 0,41-0,60; sustancial, ? = 0,61-0,8; y excelente, ? > 0,81. Un valor de 1 indica un acuerdo absoluto, mientras que un valor de 0 indica un acuerdo no mejor que casual.

Resultados: Resultados Quirúrgicos. No se observó ningún comportamiento anormal en las 120 ratas operadas. Ninguna de las ratas murió antes del final del estudio. No hubo ninguna complicación quirúrgica y ninguna rata presentó déficits neurológicos durante el período de seguimiento de 8 semanas .

Análisis Radiográfico. Se obtuvieron radiografías de las espinas de las ratas a las 4, 6 y 8 semanas (Figura 19) . La Tabla 6 muestra la proporción de ratas en cada grupo que tuvo una calificación de fusión total de 5 o 6 y se las juzgó, en consecuencia, como fusionadas en el punto de tiempo especificado.

Tabla 6. Evaluación radiológica de los tratamientos. Porcentajes de sujetos que presentaron una fusión espinal radiológica satisfactoria Grupo Tratamiento 4 semanas 6 semanas 8 semanas (%) (%) (%) I Decorticación solamente 0 0 0 II ACS solamente 0 0 0 III ACS + 1000 µ9 de BBP 0 0 0 IV ACS + 10 µ9 de rhOP-1 50 80 100 V ACS + 3 µ9 de rhOP-1 30 45 55 VI ACS + 3 de rhOP-1 + 40 80* 90* 1000 µ9 de BBP VII ACS + 1 g de rhOP-1 0 10 20 VIII ACS + 1 \xg de rhOP-1 + 0 30 60* 1000 pg de BBP * índice de fusión mucho mayor comparado con el grupo sin BBP (p < 0,05) ACS = esponja de colágeno absorbible BBP = péptido de unión a la proteína morfogenética ósea rhOP-1 = proteína osteogénica humana recombinante 1 El acuerdo entre observadores fue sustancial a excelente en todos los puntos de tiempo (? = 0,783 a 0,895). Ninguno de los animales de los grupos de decorticación solamente, ACS solamente, o ACS con BBP presentó ningún signo de formación ósea durante el período de seguimiento de 8 semanas. El Grupo VI (3 µg de rhOP-1 + BBP) tuvo un índice de fusión más alto que el Grupo V (3 µ9 de rhOP-1) en todos los puntos de tiempo. Esta diferencia en el índice de fusión fue importante a las 6 y 8 semanas (p=0,048 y 0,031, respectivamente). El Grupo VIII (1 µ9 de rhOP-1 + BBP tuvo un índice de fusión más alto que el Grupo VII (1 µ9 de rhOP-1) a las 6 y 8 semanas, sin embargo, esta diferencia fue solamente importante a las 8 semanas (p=0,022). No hubo ninguna diferencia estadísticamente importante entre los índices de fusión de los Grupos IV (10 µg de rhOP-1) y VI (3 µg de rhOP-1 + BBP) .

Palpación Manual. Las proporciones de ratas de cada grupo que se juzgó que se fusionaron mediante tres evaluaciones independientes se muestran en la Tabla 4. El acuerdo entre observadores fue excelente entre estos observadores (? = 0,966 a 0,983) . Las comparaciones críticas fueron entre rhOP-1 con y sin el agregado de BBP. Once espinas del Grupo V (3 g de rhOP-1) se evaluaron como fusionadas (55% de índice de fusión) , mientras que 18 espinas del Grupo VI 3 pg de rhOP-1 + BBP) se consideraron fusionadas (90% de índice de fusión) . Esta diferencia observada fue estadísticamente importante (p=0,031) . Se observó un efecto similar del tratamiento cuando se comparó el Grupo VII (1 pg de rhOP-1) con un 10% (2/20) de índice de fusión con el Grupo VIII (1 g de rhOP-1 + BBP) con un 50% (10/20) de índice de fusión. Esta diferencia observada también fue estadísticamente importante (p= 0,014). No hubo ninguna diferencia importante entre los índices de fusión de los Grupos IV (10 µ? de rhOP-1) y VI (3 de rhOP-1 + BBP) .

Análisis de Micro-CT. La Tabla 7 muestra las proporciones de sujetos de cada grupo que se juzgó que se fusionaron. Los índices de fusión observados fueron consistentes con aquellos determinados con el uso de la palpación manual y los análisis radiográficos. Las espinas de las ratas de los grupos VI y VIII presentaron una formación ósea considerable cuando se las comparó con sus respectivos grupos control sin BBP (V y VIII) . Las masas óseas nuevas se fusionaron en forma maciza y no se detectó ningún espacio entre los procesos transversales. Se reconstruyeron varios cortes para evaluar la presencia de un puente óseo entre los procesos transversales. Se observó la formación de puentes tuberculares entre los procesos transversales en forma consistente en las imágenes de plano de corte de todas las muestras de espinas que se consideró que se fusionaron. El hueso tubercular de formación de puente fue más grueso en los grupos con BBP comparados con sus respectivos grupos control sin BBP. Los Grupos I, II, y III que no incluyeron ningún OP-1 no presentaron ninguna formación de puente ósea entre los procesos transversales. Se observó una hendidura entre los procesos transversales L4 y L5 en todas las espinas que se juzgó que no se fusionaron (Figura 20) .

Tabla 7. índice de Fusión Basado en la Palpación Manual y Micro-CT a las 8 Semanas Tratamiento Manual Micro (%) (%) Decorticación solamente 0 0 ACS solamente 0 0 ACS + 1000 µ9 BBP 0 0 ACS + 10 µ9 rhOP-1 100 100 ACS + 3 rhOP-1 55 55 ACS + 3 µg rhOP-1 + 1000 BBP 90* 90* ACS + 1 g rhOP-1 10 10 ACS + 1 µg rhOP-1 + 1000 BBP 50* 50* * Indice de fusión mucho mayor comparado con el grupo sin BBP (p < 0,05) † Estadísticamente no distinguible del grupo control rhOP-1 de dosis alta 0,54) ACS = esponja de colágeno absorbible BBP = péptido de unión a la proteína morfogenéticas ósea rhOP-1 = proteína osteogénica humana recombinante 1 Análisis Histológico. Un corte histológico representativo de un espécimen con una fusión exitosa se muestra en la Figura 21. Se puede observar un hueso tubercular maduro en la masa de fusión y remodelación amplia de la masa y el proceso transversal. El espesor y la madurez de la masa de fusión tendieron a ser mayores en los grupos con BBP comparados con aquellos con la misma dosis de rhOP-1 sola.

En la parte de la fusión del proceso intertransversal posterolateral de este estudio, los resultados radiográficos demostraron índices de fusión mucho más altos y una fusión anterior cuando se usó rhOP-1 en conjunto con BBP que cuando se usó rhOP-1 sola. Estos hallazgos se confirmaron también después de cosechar las espinas y de someterlas a la palpación manual y al análisis de micro-CT. Aunque la palpación manual es el patrón de oro actual en la evaluación de la fusión espinal de este modelo, los resultados de la palpación manual y la micro-CT fueron idénticos y se correlacionaron bien con los resultados radiográficos al final del estudio. BBP solo no indujo ningún nivel de fusión. Ni se observó calcificación ectópica en los grupos de tratamiento con BBP solamente. Estos resultados son consistentes con informes previos que hallaron que BBP solo no indujo la formación ósea ectópica pero que sí observaron pequeñas cantidades de calcificación distrófica asociada al tejido adiposo intramuscular y otros informes que tampoco hallaron ninguna fusión espinal en animales tratados con BBP solo. Además, la combinación de 3 µ9 de rhOP-1 con 1000 µ9 de BBP logró un índice de fusión estadísticamente no distinguible de aquella lograda por rhOP-1 de dosis alta (10 µg) solamente. Esto ilustra el potencial de BBP combinado con una dosis más baja de rhOP-1 para lograr resultados similares como una dosis alta de rhOP-1 sola.

A modo de ejemplo solamente, BBP se puede hacer adherente al implante de numerosas maneras, que incluyen asperjar BBP sobre una superficie metálica o plástica preparada. BBP también se puede adherir en una suspensión de otro material, tal como colágeno o cerámica. Además, BBP y un factor de crecimiento (tal como un miembro de la familia de TGF-ß, BMP-2, 0P-1/BMP-7, GDF-5 y TGF-ß, por ejemplo) se pueden aplicar a una esponja de colágeno e implantar en un sitio donde se desea el crecimiento, que incluye situaciones ortopédicas (tales como la fusión espinal, la cirugía reconstructiva y la curación de una fractura) , aplicaciones dentales (tales como implantes dentales) y en trastornos óseos metabólicos (tales como osteoporosis , donde se pueden usar implantes en sitios esqueléticos vulnerables) .

Si bien la memoria descriptiva describe realizaciones particulares de la presente invención, los expertos en el arte pueden crear variaciones de la presente invención sin apartarse del concepto de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende aplicar una combinación de BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP mantiene una cantidad de factor de crecimiento en un sitio durante un tiempo más prolongado que la presencia de la cantidad del factor de crecimiento solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende aplicar una combinación de BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP tiene una constante de disociación con el factor de crecimiento suficiente para retener una cantidad del factor de crecimiento en un sitio durante un tiempo más prolongado que la presencia de la cantidad del factor de crecimiento solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende una combinación de BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP tiene una constante de equilibrio con el factor de crecimiento suficiente para retener una cantidad del factor de crecimiento en un sitio durante un tiempo más prolongado que la presencia de la cantidad del factor de crecimiento solo . El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la constante de disociación es de 1,0 x 10"3 a 6,0 x 10"3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la constante de equilibrio es de 5,0 x 10"8 a 1,0 x 10"6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en donde el factor de crecimiento es un miembro de la familia de TGF-ß. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el miembro de la familia de TGF-ß se selecciona del grupo que comprende BMP-2, B P-4, BMP- 7, TGF-ß o GDF-5. Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende aplicar a un sitio deseado una combinación de BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde el BBP retiene una cantidad del miembro de la familia de TGF-ß en el sitio deseado durante un tiempo más prolongado que la cantidad del miembro de la familia de TGF-ß solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende aplicar a un sitio deseado una combinación de BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde el BBP retiene el miembro de la familia de TGF-ß a una concentración más alta en el sitio deseado durante un tiempo más prolongado que la presencia del miembro de la familia de TGF-ß solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de formación de tejido en un vertebrado, que comprende aplicar al sitio deseado una combinación de BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde el BBP aumenta la duración de la exposición de una cantidad del miembro de la familia de TGF-ß en el sitio en relación con la cantidad del miembro de la familia de TGF-ß solo. El método de acuerdo con las reivindicaciones 8-10, en donde el miembro de la familia de TGF-ß se selecciona del grupo que comprende BMP-2, BMP-4, BMP- 7, TGF-ß o GDF-5. Un método para aumentar el índice o el nivel de proliferación de células madre mesodérmicas en el tejido de un vertebrado, que comprende aplicar al tejido BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde BBP retiene la familia de TGF-ß en el tejido durante un tiempo más prolongado que la presencia de un miembro de la familia de TGF-ß solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de condrogénesis en un tejido de un vertebrado, que comprende aplicar al tejido BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde BBP retiene la familia de TGF-ß en el tejido durante un tiempo más prolongado que la presencia del miembro de la familia de TGF-ß solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de la osteogénesis en el tejido de un vertebrado, que comprende aplicar al tejido BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß , en donde BBP retiene la familia de TGF-ß en el tejido durante un tiempo más prolongado que la presencia del miembro de la familia de TGF-ß solo. Un método para aumentar el índice o el nivel de calcificación en un tejido de un vertebrado, que comprende aplicar al tejido BBP y por lo menos un miembro de la familia de TGF-ß, en donde BBP retiene la familia de TGF-ß en el tejido durante un tiempo más prolongado que la presencia del miembro de la familia de TGF-ß solo. El método de acuerdo con las reivindicaciones 12-15, en donde el miembro de la familia de TGF-ß se selecciona del grupo formado por BMP-2, BMP-4, BMP-7, TGF-ß o GDF-5. Un artículo de fabricación que comprende BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP retiene una cantidad del factor de crecimiento en la proximidad del artículo más que la presencia de la cantidad de factor de crecimiento solo. Un artículo de fabricación que comprende BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP tiene una constante de disociación con el factor de crecimiento suficiente para retener una cantidad del factor de crecimiento en la proximidad del artículo más que la presencia de la cantidad del factor de crecimiento solo. Un artículo de fabricación que comprende BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP y por lo menos un factor de crecimiento, en donde el BBP tiene una constante de equilibrio con el factor de crecimiento suficiente para retener una cantidad del factor de crecimiento en un sitio más que la presencia de la cantidad del factor de crecimiento solo. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la constante de disociación es de 1,0 x 10"3 a 6,0 x 10"3. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la constante de equilibrio es de 5,0 x 10"8 a 1,0 x 10"s. 22. El método de acuerdo con las reivindicaciones 17-21, en donde el factor de crecimiento es un miembro de la familia de TGF-ß. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el miembro de la familia de TGF-ß se selecciona del grupo que comprende BMP-2, BMP-4, BMP- 7, TGF-ß o GDF-5.