ES2902420T3 - Composiciones para el tratamiento del cáncer que expresa ADAM8 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo de unión al ectodominio ADAM8 o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer de mama o metástasis asociada al cáncer de mama caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la SEQ ID No 9 y que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la actividad del dominio de metaloproteinasa y el dominio de desintegrina de ADAM8.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para el tratamiento del cáncer que expresa ADAM8

Campo técnico

Se proporcionan métodos para pronosticar, diagnosticar y tratar cánceres asociados con ADAM8, para reducir o prevenir la metástasis de tumores establecidos y para identificar fármacos que se dirigen a ADAM8.

Apoyo gubernamental

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo las subvenciones CA129129 y ES011624 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud y la subvención W81XWH-10-1-1003 otorgada por el Ejército de los EE.UU. El gobierno posee ciertos derechos sobre la presente invención.

Antecedentes

La metástasis del cáncer es el resultado de un proceso de varias etapas que selecciona células tumorales invasoras capaces de escapar del sitio primario y colonizar órganos distantes. Al principio del proceso de tumorigénesis, el estrés hipóxico que caracteriza el microambiente con bajo nivel de oxígeno en los tejidos de un tumor sólido puede estimular la angiogénesis inducida por el tumor, que a su vez suministra los nutrientes y el oxígeno necesarios para prevenir la latencia del tumor y apoyar el crecimiento del tumor, así como también proporciona rutas para la diseminación de células tumorales (Harris et al. Nat Rev Cancer 2:38-47, 2002; Majmundar et al. Mol Cell 40:294-309, 2010). La secreción de mediadores proangiogénicos por células tumorales, más notablemente factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), promueve la migración y proliferación de células endoteliales (Adams y Alitalo Nat Rev Mol Cell Biol 8:464-478, 2007). La neovascularización resultante del estroma circundante facilita la propagación de las células tumorales al torrente sanguíneo. El proceso implica adherencia y transmigración a través del endotelio, en particular a través de procesos que involucran integrinas (Avraamides et al. Nat Rev Cancer 8:604-617, 2008; Mierke J Biophys 2008:183516, 2008). Las células tumorales en circulación (CTC) se pueden medir en la sangre periférica incluso antes de que el tumor sea clínicamente detectable (Eyles et al. J Clin Invest 120:2030-2039, 2010). La concentración de CTC en pacientes con cáncer de mama se ha asociado con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad y un resultado precario (Cristofanilli et al. N Engl J Med 351:781-791,2004). Moss et al. muestra un método para predecir el estado de la enfermedad cancerosa utilizando ensayos de muestras de orina con un sustrato fluorescente para detectar la actividad metaloproteinasa (MMP) de un gran número de miembros de la familia MMP, incluyendo ADAM8 y ADAM12 (WO 2012/088105 A2 publicado el 28 de junio de 2012).

Más de 500.000 mujeres en todo el mundo mueren anualmente de enfermedad mamaria metastásica a pesar de los avances recientes en el tratamiento del cáncer según informes de la Organización Mundial de la Salud. La identificación de nuevas dianas terapéuticas para bloquear eficazmente la diseminación del cáncer de mama es fundamental para mejorar la supervivencia general de las pacientes con alto riesgo. En particular, mujeres con cáncer de mama triple negativo (CMTn ) cuyos tumores se caracterizan como negativos para el receptor de estrógeno, receptor de progesterona y HER2 (también conocido como HER2/neu) carecen de terapia dirigida (Boyle Ann Oncol 23 Supl 6: vi7-12, 2012).

El documento WO0109189 desvela niveles aumentados de ARNm de ADAM8 en tejido de cáncer de mama.

Sumario

La presente invención se refiere en varias realizaciones a un anticuerpo de unión al ectodominio ADAM8 o un fragmento de anticuerpo que inhibe el dominio de metaloproteinasa (MP) y el dominio de desintegrina (DI) para el uso en el tratamiento de cáncer de mama o metástasis asociada con cáncer de mama en un sujeto. Además, el anticuerpo de unión al ectodominio ADAM8 o el fragmento de anticuerpo se caracteriza por unirse a la SEQ ID NO. 9. La solicitud describe además que el cáncer de ADAM8 se selecciona de cáncer de mama, cerebro, pulmón, próstata, piel, ovario, colorrectal, hueso, renal, cabeza y cuello, esofágico, gástrico, hígado, vejiga, cuello de útero, útero, tiroides, testículo y páncreas.

En una realización, el cáncer de mama a tratar se selecciona del grupo que consiste en: receptor de estrógeno negativo, receptor de progesterona negativo, HER2 negativo, inflamatorio triple negativo, triple negativo, tipo basal, invasivo, ductal, carcinoma ductal in situ (CDIS), lobular, HER2 positivo y cáncer de mama mixto. La solicitud incluye además tratar el cáncer o la metástasis observando una disminución en el tamaño de un tumor establecido o una disminución en el tamaño o frecuencia de metástasis.

Según la solicitud, el anticuerpo se puede obtener inmunizando con un péptido de una proteína ADAM8 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7. Como alternativa, el anticuerpo se obtiene inmunizando con un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos de los restos de aminoácidos 158 a 653 de la proteína ADAM8 correspondientes al ectodominio.

La actividad de ADAM8 en varias realizaciones se selecciona del grupo que consiste en: actividad de la enzima metaloproteinasa ADAM8; liberación de VEGF-A; promoción de la angiogénesis; y extravasación o intravasación de células cancerosas metastásicas a través del endotelio vascular; y activación de la integrina p1.

En diversas realizaciones, el uso incluye además administrar al paciente un agente terapéutico que es una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la solicitud, el uso incluye además seleccionar el al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al menos a un dominio extracelular seleccionado de un grupo que consiste en una metaloproteinasa (MP) y una desintegrina (DI), para la administración al paciente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une e inhibe la actividad de una pluralidad de ectodominios, por ejemplo, el dominio de metaloproteinasa y el dominio de desintegrina. Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se produce de forma recombinante.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es al menos uno de IgG, IgM e IgA.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es policlonal.

Según la solicitud, al menos uno del anticuerpo, el fragmento de anticuerpo, o una región de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo de: un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo recombinante solo de cadena pesada de camélidos (VHH), un anticuerpo solo de cadena pesada de tiburón (VNAR), una microproteína, un darpin, una anticalina, una adnectina, un aptámero, un Fv, un Fab, un Fab' y un F(ab')2.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un inmunoconjugado.

Según la solicitud, el anticuerpo inmunoconjugado o el fragmento de anticuerpo se une al menos a uno de: un agente quimioterapéutico, un agente fotosensibilizante, un producto natural citotóxico, una fitotoxina, un antibiótico citotóxico, una toxina bacteriana, una toxina fúngica, una proteína bioactiva, un radioisotipo, una enzima y una o más enzimas que activa un agente precitotóxico inerte.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye un primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un dominio de desintegrina (DI) y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un dominio de metaloproteinasa (MP).

Según la solicitud, después de administrar el tratamiento incluye además medir una disminución de al menos un síntoma seleccionado del grupo que consiste en: tamaño del tumor primario, número de tumores metastásicos, tamaño de los tumores metastásicos, formación de nuevas lesiones metastásicas, angiogénesis y concentración de células tumorales en circulación.

Un aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o compuesto que se une específicamente, se une e inhibe un dominio ADAM8 o una porción de al menos un dominio de ADAM8 seleccionado del grupo: dominio de metaloproteinasa y un dominio de desintegrina. Una realización proporciona la composición formulada para administración sistémica a un sujeto. La solicitud proporciona además que la vía de administración es una inyección. La composición farmacéutica se administra al sujeto que es un ser humano. Como alternativa, el sujeto es un animal de gran valor.

Según la solicitud, la composición farmacéutica incluye además al menos un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio, una reducción de la expresión de ADAM8 y un inhibidor de la síntesis de ADAM8. Según la solicitud, la composición de reducción de la expresión de ADAM8 es al menos uno del grupo: ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc) y microARN (miARN) inhibidor de la síntesis de ADAM8.

Según la solicitud, el agente vasopresor de la composición farmacéutica es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: óxido nítrico, bloqueantes de los canales de calcio, inhibidores de colagenasa, esteroides tópicos, inhibidores de metaloproteinasa de matriz, ascorbatos, angiotensina II, angiotensina III, calreticulina, tetraciclinas, fibronectina, colágeno, trombospondina, factores del crecimiento transformante, (TGF), factores de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento similar a la insulina (IGF), proteínas de unión a IGF, factores de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de diferenciación neu, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento endotelial vascular, EGF de unión a heparina, factor C de von Willebrand, heparina, sulfatos de heparina y ácido hialurónico.

Según la solicitud, la composición farmacéutica incluye además al menos uno del grupo que consiste en un agente anticoagulante, agente antitumoral, agente antivírico, agente antibacteriano, agente antimiobacteriano, agente antifúngico, agente antiproliferativo y agente antiapoptótico.

Según la solicitud, la composición se formula en una dosis unitaria.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la composición farmacéutica es monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es policlonal. En diversas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o compuesto se proporciona en una dosis eficaz para disminuir al menos un síntoma seleccionado del grupo que consiste en: crecimiento o angiogénesis de un tumor primario o metastásico, presencia de células tumorales en circulación y aparición de nuevas metástasis. Según la aplicación la composición, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se produce de forma recombinante.

Según la aplicación la composición farmacéutica, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o al menos una región de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo se seleccionan del grupo de: un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo recombinante solo de cadena pesada de camélidos (VHH), un anticuerpo solo de cadena pesada de tiburón (VNAR), una microproteína, un darpin, un anticalina y adnectina, un aptámero, un Fv, un Fab, un Fab' y un F(ab')2.

Según la solicitud, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se proporciona en una dosis eficaz para disminuir un síntoma de progresión de cáncer o metástasis. Por ejemplo, el síntoma se selecciona del grupo que consiste en: tamaño del tumor primario, crecimiento del tumor primario, número de metástasis, tamaño de las metástasis; número de células tumorales en circulación en sangre, vascularización en tejido adyacente al tumor o metástasis, cantidad de ADAM8 en los fluidos corporales, cantidad de VEGF-A en los fluidos corporales y pérdida de peso del sujeto.

Según la solicitud, la cantidad terapéuticamente eficaz se formula en una dosis dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg. En determinadas formas de realización, la dosis se selecciona de aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 125 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 175 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg y aproximadamente 500 mg.

Según la solicitud, la dosis unitaria se calcula a partir del peso de un sujeto en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. Por ejemplo, una dosis unitaria se calcula a partir del peso de un sujeto en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 1,5 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg. En diversas realizaciones, la composición se administra en al menos un régimen seleccionado del grupo que consiste en: diariamente, semanalmente, quincenalmente y en semanas alternas

Según la solicitud, el al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un inmunoconjugado. Dicho anticuerpo inmunoconjugado o fragmento de anticuerpo se une al menos a uno seleccionado del grupo de un agente quimioterapéutico, un agente fotosensibilizante, un producto natural citotóxico, una fitotoxina, un antibiótico citotóxico, una toxina bacteriana, una toxina fúngica, una proteína bioactiva, un radioisotipo, una enzima y una combinación de enzimas que activan un agente precitotóxico inerte.

Según la solicitud, la cantidad terapéuticamente eficaz se formula en una dosis seleccionada del grupo que consiste en: aproximadamente 1 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 125 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 175 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg y aproximadamente 500 mg. Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz se formula en una dosis unitaria. En determinadas realizaciones, el método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde la dosis unitaria se calcula a partir del peso del paciente, en donde la dosis/peso del paciente está en un intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg.

En un aspecto de la invención, el ectodominio de ADAM8 es un dominio de metaloproteinasa (MP) y un dominio de desintegrina (DI).

En un aspecto de la invención, el primer ectodominio y el segundo ectodominio son el dominio de metaloproteinasa (MP) y el dominio de desintegrina (DI). Según la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un ectodominio de ADAM8 e inhibe dos actividades de ectodominio. De acuerdo con la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al ectodominio de ADAM8 e inhibe el dominio de metaloproteinasa (MP) y el dominio de desintegrina (DI).

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1G muestran que ADAM8 se sobreexpresa en el cáncer de mama humano.

Las Figuras 1A-1C son gráficos y una tabla que analiza la expresión de ARNm de ADAM8 en muestras de tumores de pacientes con cáncer de mama utilizando la base de datos de micromatrices ONCOMINE™. La Figura 1A analiza la expresión de ARNm de ADAM8 que se observó que era significativamente mayor en muestras de cáncer de mama invasivo en comparación con tejido normal (P<0,001). El conjunto de datos del atlas del genoma del cáncer (TCGA) incluye el carcinoma de mama humano normal (1) y el carcinoma de mama invasivo: origen desconocido (2), ductal (3), lobulillar (4) y mixto (5). La Figura 1B analiza el conjunto de datos de Van de Vijver que incluye muestras de carcinoma primario de mama humano negativo para el receptor de estrógeno (ER)a-negativo y ERa positivo. n: tamaño muestral. La Figura 1C agrupa 14 análisis de 6 estudios de micromatrices diferentes y muestra que ADAM8 es uno de los genes más expresados en el cáncer de mama en comparación con el tejido mamario normal (P = 0,025).

Las Figuras 1D-1F analizan la expresión de la proteína ADAM8 en muestras tumorales de pacientes con cáncer de mama mediante inmunohistoquímica (IHC). Se utilizó IHC para medir la tinción de ADAM8 analizada en muestras de tejido epitelial normal adyacente (normal adyacente) y de cáncer de mama primario triple negativo (CMTN) de 50 pacientes, en 37 muestras de carcinoma ductal in situ (CDIS) y en 56 muestras de metástasis a distancia derivadas del cáncer de mama.

La Figura 1D muestra los porcentajes de muestras positivas para ADAM8 (Pos.) En relación con el total analizado para cada grupo examinado. La Figura 1E muestra imágenes representativas de la tinción de ADAM8 en sitios primarios. La Figura 1F muestra imágenes representativas de tinción para metástasis positivas de ADAM8. La Figura 1G es una gráfica del valor pronóstico de la expresión de ADAM8 en cáncer de mama que se analizó utilizando la base de datos de micromatrices bc-GenExMiner. Este análisis incluye 2.314 pacientes con cáncer de mama y 628 eventos de recaída metastásica. Se observó que los niveles elevados de ARNm de ADAM8 se correlacionan con una peor supervivencia sin recaída de metástasis.

Las Figuras 2A-2E son un diagrama y conjuntos de fotografías que muestran que ADAM8 se expresa abundantemente y es activo en células de CMTN.

La Figura 2A es una representación esquemática de la proteína ADAM8 que muestra los diferentes dominios y formas procesadas con los pesos moleculares indicados. Rico en CIS: dominio rico en cisteína, EGF: dominio similar a EGF, TM: dominio transmembrana. La Figura 2B muestra extractos de células completas (ECC) de células MCF-10A no tumorales humanas y las líneas celulares de CMTN indicadas examinadas por análisis por transferencia de Western para la expresión de ADAM8, utilizando el anticuerpo ADAM8 Millipore y para la p-actina como control de carga. Se muestra una transferencia representativa (n = 3). Todos los carriles eran del mismo gel, pero cortados para realinear como lo indica la línea. Se indican las formas de ADAM8 proformas, activas y remanentes y los marcadores de peso molecular (PM). ns: banda no específica. MDA-231: MDA-MB-231. MDA-468: MDA-MB-468. La Figura 2C es un conjunto de microfotografías de células cultivadas en cultivos adherentes (2D) o en suspensión en placas de fijación ultrabaja (3D) durante 48 h. En suspensión, las células MDA-MB-231 y Hs578T forman esferas. Barra de escala: 100 pm. Las Figuras 2D-2E muestran fotografías de células MDA-MB-231 (Figura 2D) y Hs578T (Figura 2E) transfectadas de forma inversa con cualquiera de ARNip Control (Ctrlip) o dos ARNip de ^a D^a M8 específicos (A8ip n.° 1 y A8ip n.° 2 ) durante 24 h, luego en placa durante 48 h en cultivo 2^d o 3D como se describe en la Figura 2C. Las CEC se analizaron mediante análisis de transferencia Western para ADAM8 usando solo anticuerpos LSBio (Figura 2D), o usando anticuerpos LSBio y Millipore (Figura 2E). Como control de carga, se utilizó tubulina (Figura 2D) o p-actina (Figura 2E). Se muestran transferencias representativas de tres ejemplos independientes.

Las Figuras 3A-3F muestran que ADAM8 mantiene el fenotipo agresivo de las células de cáncer de mama en cultivo tridimensional.

Las Figuras 3A-3D son un conjunto de gráficos de barras de datos y fotomicrografías de células transfectadas con ARNip como en las Figuras 2D-2E durante 24 h, y probadas para la formación de colonias en agar blando (Figura 3A), migración celular (Figura 3B), invasión (Figura 3C) y el crecimiento de 3D-Matrigel (Figura 3D). Para ensayos en agar blando, las células se cultivaron durante 8-12 días y las colonias se tiñeron con violeta de iodonitrotetrazolio y se fotografiaron. Las colonias que tenían un diámetro superior a 20 pm en tres pocillos/condición se contaron con el programa informático ImageJ. Se muestra un representante de dos ejemplos con resultados similares (Figura 3A). Los ensayos de migración (Figura 3B) e invasión (Figura 3C) se realizaron utilizando Transpocillos sin o con prerrevestimiento de Matrigel, respectivamente. Después de 24 h, las células que migraron o invadieron el lado inferior del filtro se evaluaron mediante tinción con violeta cristal y determinación con DO^{570 nm}. La condición de control (Ctrlip) se establece en 100 % (media ± desviación estándar (DE) de tres ejemplos independientes). Los datos obtenidos de los ensayos de crecimiento de Matrigel son fotografías con un aumento de 20x de las colonias formadas después de 5-7 días (Figura 3D). Los resultados mostrados se verificaron a partir de ensayos duplicados. La Figura 3E muestra fotografías de CEC de células MDA-MB-231 y líneas LM1 y LM2 derivadas in vivo, ya sea sin transfectar (izquierda) o transfectado con Ctrlip, A8ip n.° 1 o A8ip n.° 2 durante 48 h (derecha), y se analizó para ADAM8 mediante análisis de transferencia de Western (anticuerpo LSBio). La Figura 3F muestra fotomicrografías de células LM1 y LM2 analizadas mediante un ensayo de crecimiento 3D-Matrigel 24 h después de la transfección de ARNip, como en la Figura 3D, en el que se fotografiaron las colonias después de 4 días. El ensayo se realizó dos veces y se obtuvieron resultados similares. Barras de escala: 100 pm * P < 0,05, # P < 0,001, prueba de la t de Student.

Las Figuras 4A-4K son un conjunto de fotografías y gráficos de datos que muestran que la reducción de la expresión de ADAM8 disminuye profundamente la formación de tumores en la almohadilla de grasa mamaria, la diseminación de CTC y metástasis tumoral.

La Figura 4A es un análisis por transferencia de Western de clones MDA-MB-231 de reducción de la expresión de ADAM8 estable (A8hc) que se caracterizaron in vitro. Expresión de ADAM8 en CEC de dos clones A8hc (ARNhc de ADAM8) (A8hc-17 y A8hc-20) se compararon con dos clones Ctrlhc (Ctrlhc-3 y Ctrlhc-5) usando análisis por transferencia de Western (anticuerpo LSBio). La Figura 4B es un gráfico de barras de datos de clones desarrollados en cultivos bidimensionales durante 48 horas y analizados mediante ensayo de ATP (n = 3 ejemplos independientes). NS: no significativo. La Figura 4C es un gráfico de barras de datos de ensayos de migración realizados usando Transpocillos como se describe en la Figura 3B. La Figura 4D es un conjunto de fotografías de ensayos de crecimiento de Matrigel realizados como en la Figura 3D. Barra de escala: 100 pm.

Las Figuras 4E-4G muestran datos de un análisis por transferencia de western, un ensayo de migración y un ensayo de crecimiento de Matrigel 24 horas después de transfectar células A8hc-20 MDA-MB-231 con ADAM8 o un a Dn de vector vacío (EV). La Figura 4E muestra los resultados de un análisis de transferencia de Western para ADAM8 (anticuerpo LSBio) y tubulina en un extracto de células completas. La Figura 4F muestra los resultados de un ensayo de migración realizado como en la Figura 3C. La Figura 4G es un conjunto de fotografías de ensayos de crecimiento de Matrigel realizados como en la Figura 3D. Los resultados en 4F y 4G muestran que se observó que la expresión ectópica de ADAM8 en células A8hc-20 rescata parcialmente la capacidad de las células para migrar y formar colonias invasoras.

Las Figuras 4H-4K muestran datos de las células Ctrlhc-3 y A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231 inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NOD/SCID hembra (n = siete/grupo). La Figura 4H es un gráfico del volumen tumoral medido dos veces por semana (media ± DE). La Figura 4I muestra los tumores que fueron fotografiados in situ (superior) o después de la disección (medio) y se pesó al final del ejemplo (peso medio ± DE) (inferior). Barra de escala: 1 cm. Los resultados muestran un tamaño reducido y una vascularización deficiente del A8hc-20 en comparación con los tumores Ctrlhc-3. La Figura 4J muestra datos de sangre recolectada por punción cardíaca a partir de la cual se detectaron CTC positivas para GFP mediante citometría de flujo. El recuento medio de CTC ± De se da por pl de sangre (n = siete/grupo). La Figura 4K es un conjunto de fotografías representativas que muestran la presencia de metástasis cerebrales examinadas por microscopía fluorescente (n = seis/grupo). Todos los animales de control mostraron al menos una metástasis, mientras que se observó una única micrometástasis en un solo ratón A8hc-20, y no se observaron metástasis en otros ratones A8hc-20. Barras de escala: 1 mm. * P < 0,05, # P < 0,001, Prueba de la t de Student.

Las Figuras 5A-5M muestran que ADAM8 es inducida por hipoxia y promueve la angiogénesis.

La Figura 5A es una fotografía del análisis de transferencia de Western de CEC de células cultivadas en condiciones hipóxicas (+, O2 al 1 %) o condiciones normóxicas (-) durante 24 horas (izquierda) o 6 horas (derecha) y se analizaron mediante análisis por transferencia de Western para ADAM8 (anticuerpo LSBio). Se muestran transferencias representativas de tres ejemplos independientes. La Figura 5B es una fotografía del análisis de transferencia Western de CEC de células Hs578T cultivadas en condiciones de adherencia (2D) o en placas de adherencia ultrabaja (3D) a partir de la suspensión durante 48 h. La Figura 5C es una fotografía del análisis de transferencia Western de extractos nucleares de células incubadas durante 8 horas en condiciones hipóxicas para HIF-1a y Lamin B. La línea vertical indica los dos tiempos diferentes de exposición utilizados: 5 minutos para las células Hs578T y 30 minutos para las líneas derivadas de MDA-MB-231. La Figura 5D es un conjunto de fotografías que muestran la expresión de ADAM8 en tumores mamarios de ratón analizados por inmunohistoquímica. Tinción con HyE (hematoxilina y eosina). Se muestran fotografías representativas (n = siete/grupo). La Figura 5E representa el análisis de cantidades de ARN de VEGF-A en células Ctrlhc-3 y A8hc-20 en cultivo, lo que indica que no hay cambios en la transcripción de VEGF-A con la reducción de la expresión de ADAM8. La Figura 5F es un gráfico y fotografías que muestran la angiogénesis evaluada mediante tinción inmunohistoquímica con CD31 de secciones tumorales de los grupos Ctrlhc-3 y A8hc-20 (n = siete/grupo). La densidad de vasos para cada ratón se da como el número medio de vasos observados en dos portaobjetos/tumor (tres puntos calientes peritumorales/portaobjetos). P: área peritumoral, T: Tumor. Barras de escala: 100 pm, * P < 0,05, ** P < 0,0001, prueba de la t de Student. La Figura 5G es un gráfico de correlación por pares de Pearson que muestra una correlación positiva significativa observada entre la expresión de ARNm de ADAM8 y CD31 (PECAM1) en tumores de pacientes con cáncer de mama de tipo basal que se obtuvieron de la base de datos de micromatrices GenExMiner. r: razón de correlación. P < 0,0001. Las figuras 5H-5I son un gráfico de barras y fotografías de células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) analizadas mediante ensayos de formación de tubos en presencia de medio acondicionado de los clones A8hc y Ctrlhc indicados, u obtenidos en ausencia de células tumorales (-). Los valores de las redes cerradas se dan como promedios de nueve campos ± D.E. **P < 0,0001, Prueba de la t de Student (Figura 5H). La Figura 5I muestra imágenes representativas de los tres ejemplos independientes que se muestran en la Figura 5H. La Figura 5J es una tabla que muestra los niveles de expresión de mediadores de angiogénesis en medios acondicionados de dos clones Ctrlhc y dos A8hc que se analizaron mediante una matriz de anticuerpos de angiogénesis humana. Los niveles de expresión de las proteínas detectadas se cuantificaron usando ImageJ. La tabla muestra que los mediadores de la angiogénesis se regularon significativamente a la baja en más del doble en los clones A8hc (intervalo de 2,05 veces a 4,31 veces). Datos presentados como media de los dos clones ± D.E. Se dan el cambio de pliegue (F.C.) y los valores de P. La Figura 5K es una fotografía de un análisis de transferencia de Western (n = 3) de medio libre de suero acondicionado de los clones Ctrlhc y A8hc analizados para los niveles de proteína VEGF-A. La Figura 5L es una fotografía del análisis de transferencia de Western que muestra los niveles de proteína VEGF-A en el medio libre de suero acondicionado de los clones Ctrlhc-3 o A8hc-20 transfectados con las formas ADAM8 indicadas (completas o remanentes) o ADN de vector vacío (EV) (inferior) y un gráfico de barras de cuantificación de los niveles promedio de tres experimentos como porcentaje relativo al Ctrlhc establecido en 100 % (superior). La Figura 5M es una fotografía del análisis de transferencia de Western de la cantidad de expresión ectópica de ADAM8 de longitud completa y forma remanente en células de reducción de la expresión de ADAM8 estables.

Las Figuras 6A-6J muestran que ADAM8 promueve la adhesión de las células cancerosas a las células endoteliales y la activación de la integrina p1.

La Figura 6A es un gráfico de barras de datos de sangre que se extrajo usando el método submandibular de ratones (n = cuatro/grupo) en los días indicados después de la implantación de células tumorales y analizados por citometría de flujo para medir CTC positivas para GFP. El recuento medio de CTC ± DE se da por pl de sangre. La Figura 6B es un gráfico de barras que muestra la adhesión relativa (%) de las células incubadas en una monocapa de CEVUH o en pocillos vacíos (sin CEVUH) durante 15 minutos. Las células unidas se contaron en tres campos por pocillo (n = 6 campos). Se muestra la media ± D.E. de tres ejemplos independientes. La Figura 6C es un gráfico de barras de datos de los clones ADAM8hc y Controlhc analizados mediante un ensayo de migración transendotelial durante la noche en monocapas de células CEVUH. Se muestra la media ± D.E. de tres ejemplos independientes. La Figura 6D es un gráfico de barras que muestra la adhesión relativa (%) a CEVUH de células clon Ctrlhc-3 derivadas de MDA-MB-231 y células MdA-MB-231 que se han transfectado con ARNip de control (Ctrlip) o dos ARNip de ADAM8 (A8ip n.° 1 y A8ip n.° 2) durante 72 h. La Figura 6E es un gráfico de barras del ensayo de migración de células transendoteliales de las células descritas en la Figura 6D a través de CEVUH. *P < 0,05, prueba de la t de Student. La Figura 6F es una fotografía del análisis de transferencia de Western para ADAM8 en CEC de CEVUH y MDA-MB-231 como control positivo para la expresión de ADAM8. La Figura 6G es un gráfico de barras de la adhesión de células Ctrlhc-3 en CEVUH evaluadas como en la Figura 6B con incubación previa de células Ctrlhc-3 con un anticuerpo antagonista de la integrina p1 (+) o un isotipo de control (-). Media ± D.E. de tres experimentos independientes. Las Figuras 6H y 6I son gráficos de barras que muestran los resultados de los ensayos de adhesión (Figura 6H) y migración transendotelial (Figura 6I) de células Ctrlhc-3 en CEVUH evaluadas como en las Figuras 6B y 6C, respectivamente. Antes de los ensayos, las células Ctrlhc-3 se incubaron con anticuerpos monoclonales dirigidos al ectodominio de ADAM8 (Mab10311 específico para CRD/ELD o Mab1031 específico para los dominios MP/DI) o con un control de isotipo apropiado (IgG 1 o IgG2B, respectivamente). El ensayo de transmigración se realizó durante 9 h. Media ± DE de tres experimentos independientes. La Figura 6J es un conjunto de fotografías que muestran la expresión de integrina p1 activa evaluada por inmunohistoquímica (IHC) en tumores mamarios de ratón (Ctrlhc-3 y A8hc-20) y glándulas mamarias contralaterales (Ctrlhc-3; n = siete/grupo). P: área peritumoral, T: Tumor. Barra: 100 pm. NS, no significativo, * P < 0,05, # P < 0,001, **P < 0,0001, prueba de la t de Student.

Las Figuras 7A-7H son un conjunto de gráficos, fotografías, una tabla y un dibujo que muestra que el anticuerpo monoclonal ADAM8 disminuye la formación de tumores ortotópicos, la angiogénesis, y la metástasis. Las Figuras 7A-7H se realizaron con células MDA-MB-231 Ctrlhc-3 inyectadas en las almohadillas de grasa mamarias de ratones hembra NOD/SCID. Los animales se trataron con 0,5 mg/kg de anti-ADAM8 (anti-A8, Mab1031, n = 9) o control de isotipo coincidente (IgG2B, n = 8) en inyección intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana desde el momento de la implantación celular.

La Figura 7A es un gráfico de líneas del volumen del tumor medido dos veces por semana (media ± D.E.). La Figura 7B muestra el peso del tumor al final del transcurso de tiempo (media ± D.E.). La Figura 7C es una tabla que resume la aparición, el número y el tamaño de las metástasis cerebrales detectadas por microscopía fluorescente al final del curso de tiempo. La Figura 7D muestra la angiogénesis evaluada mediante tinción inmunohistoquímica con CD31 de secciones tumorales. La densidad de vasos para cada ratón se muestra en la ordenada (izquierda), determinado como el número medio de vasos en dos portaobjetos/tumor (cinco puntos calientes peritumorales/portaobjetos) e imágenes representativas (derecha). P: área peritumoral, T: Tumor. Barra: 100 pm. La Figura 7E es un gráfico que muestra los niveles de VEGF-A en los extractos tumorales determinados por análisis por transferencia de Western y normalizados a la tinción de Coomassie. *P < 0,05, #P < 0,001, prueba de la t de Student. La Figura 7F es una fotografía del análisis por transferencia de Western de la cantidad de CD23 escindida (29 kDa) en el medio de células HEK293 que se cotransfectaron con vectores que expresan CD23 y las formas indicadas de ADAM8. Se recolectaron las células y se evaluó la expresión de ADAM8 y tubulina en las CEC. La Figura 7G es un dibujo de un esquema del diseño experimental usado para evaluar el efecto terapéutico del anticuerpo anti-ADAM8 (Mab1031) sobre la metástasis en un modelo clínicamente relevante. La Figura 7H es un conjunto de fotografías de metástasis al cerebro y pulmones detectadas por microscopía fluorescente. Imágenes representativas y frecuencia de metástasis (porcentaje de animales positivos por grupo: IgG2B, n = 8; anti-A8, n = 9) se presentan. Barra: 250 pm.

La Figura 8 es un conjunto de fotografías y un gráfico de barras de datos que muestran que ADAM8 promueve la metástasis en un modelo de ratón de colonización cardíaca.

La Figura 8A es un conjunto de fotografías de ratones hembra que se inyectaron en el ventrículo izquierdo (n = cuatro/grupo) con células Ctrlhc-3 y A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231, que expresan establemente Luciferasa. La carga tumoral se midió semanalmente durante tres semanas mediante la detección de la actividad luciferasa usando el sistema Xenogen Biophotonic Imaging. La Figura 8B muestra la actividad luciferasa medida correspondiente a la carga metastásica total como media ± EE por grupo para cada semana. La Figura 8C muestra órganos y huesos recolectados al final del experimento y fotografiados como se describió anteriormente. NS: no significativo, *P < 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney.

La Figura 9 es un dibujo de un modelo de funciones de ADAM8 en el crecimiento y diseminación del tumor de mama, previsto a partir de los datos observados en los ejemplos. Cuando los tumores sólidos alcanzan unos pocos milímetros de diámetro, se induce el estrés hipóxico, lo que conduce al reclutamiento de células endoteliales y a la angiogénesis. Los datos del presente documento muestran que, en condiciones en las que no se indujo ADAM8, hubo una respuesta angiogénica insuficiente, lo que conduce a la inactividad de la masa tumoral. Cuando se induce ADAM8 en las células tumorales por hipoxia, fuerte señalización proangiogénica, en parte, a través de la actividad metaloproteinasa (MP) que conduce a la liberación de VEGF-A en el compartimento extracelular, se evita la latencia angiogénica y se mantiene el crecimiento tumoral. ADAM8 a través de su desintegrina (DI), dominio rico en cisteína (CRD) y el dominio similar a EGF (ELD) promueven aún más la activación de la integrina p1 en las células tumorales necesarias para la adhesión y la transmigración a través de la pared de los vasos sanguíneos, que apoya la diseminación de CTC y metástasis.

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína ADAM8 humana usando el código de aminoácidos de una letra (SEQ ID NO: 3).

La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos de inmunógenos de anticuerpos anti-proteína ADAM8 para preparaciones de anticuerpos utilizadas en el presente documento. Se preparó Millipore AB19017 con un inmunógeno peptídico que tiene los restos 795-824 de la proteína ADAM8 (SEQ ID NO: 4). Se preparó LSBio LS-B4068 con un inmunógeno peptídico que tiene los restos 763-824 de la proteína ADAM8 (SEQ ID NO: 5). Se preparó MAB10311 con un péptido que tiene los restos 498-653 de la proteína ADAM8 (SEQ ⁱD NO: 6). Se preparó MAB1031 con un inmunógeno peptídico que tiene los restos 201-498 (SEQ ID NO: 9) de la proteína ADAM 8. Se preparó AF1031 con un inmunógeno peptídico que tiene los restos 158-653 de la proteína ADAM8 (SEQ ID NO: 7). La barra superior muestra las posiciones de los dominios peptídicos que funcionan como inmunógenos para la preparación de Millipore AB19017, LSBio LS-B4068, MAB10311, MAB1031 y AF1031 entre sí. Los marcadores indican la posición de N-glucosilación de la proteína ADAM8. El lado de la tabla muestra el porcentaje de identificaciones positivas de las tres variantes de la proteína ADAM8 humana por cada anticuerpo.

Las Figuras 12A-12C muestran que la metástasis se reduce en el tejido cerebral mediante la administración de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al dominio rico en cisteína (CRD) y al dominio similar al factor de crecimiento epidérmico (ELD).

La Figura 12A muestra la migración de líneas celulares de cáncer de mama Ctrlhc-3 usando un ensayo de transmigración. Se analizó la migración de células transendoteliales a través de CEVUH después del tratamiento con el control de isotipo IgG1, control de isotipo IgG2B, el anticuerpo monoclonal Mab10311 que se une específicamente a C^r D y ELD de ADAM8 (anti-ADAM8 CRD/ELD) y el anticuerpo monoclonal Mab1031 (anti-ADAM8 MP/DI) que se une específicamente a los dominios MP y DI de ADAM8. Cada isotipo se normalizó al 100%. La migración celular del grupo tratado con Mab10311 se comparó con el grupo tratado con IgG1, y la migración celular del grupo tratado con Mab1031 se comparó con el grupo tratado con IgG2B. La muestra tratada con anti-ADAM8 CRD/ELD y la muestra tratada con anti-ADAM8 MP/DI tuvieron una migración celular significativamente menor a través de la monocapa de CEVUH que la muestra tratada con el control de isotipo apropiado.

La Figura 12B es una fotografía del análisis de transferencia de Western de la cantidad de CD23 escindido en células HEK293 que se habían cotransfectado con vectores CD23 y ADAM8 y se habían tratado con anti-ADAM8 CRD/ELD o anti-ADAM8 MP/DI en comparación con el tratamiento con IgG1 o IgG2B. Los resultados muestran que en presencia de anti-ADAM8 CRD/ELD, la escisión de CD23 se redujo modestamente en comparación con la presencia de anti-ADAM8 MP/DI, lo que indica que el anticuerpo anti-ADAM8 MP/DI inhibe con más fuerza la actividad de MP.

La Figura 12C muestra el efecto del tratamiento con anti-ADAM8 CRD/ELD sobre el peso del tumor primario y la metástasis de la almohadilla de grasa mamaria (AGM) de ratones hembra. Se inyectaron células Ctrlhc-3 en la AGM, luego, cada ratón se trató con anti-ADAM8 CRD/ELD o con IgG1 de control de isotipo coincidente. El gráfico de la izquierda analiza las diferencias en el peso del tumor primario utilizando una prueba de la t de Student después del tratamiento. Los resultados muestran que las diferencias en el peso del tumor primario entre los ratones tratados con anti-ADAM8 CRD/ELD y los ratones tratados con IgG1 no fueron estadísticamente significativas (NS). La fotografía de la derecha analiza la metástasis cerebral mediante microscopía fluorescente después del tratamiento con anti-ADAM8 CRD/ELD o IgG1. Los resultados muestran que el tratamiento con anti-ADAM8 CRD/ELD redujo en gran medida tanto el tamaño como la frecuencia de la metástasis cerebral.

Descripción detallada

ADAM8 pertenece a una gran familia de proteínas que consta de más de 30 miembros. Sintetizado como proforma, ADAM8 puede dimerizar o multimerizar y recortar autocatalíticamente su prodominio, dejando una metaloproteinasa anclada a la membrana activa (Figura 2A). El ADAM8 activo puede procesarse adicionalmente mediante la liberación del dominio de metaloproteinasa en la matriz extracelular, que deja una forma remanente dentro de la membrana. Las proteínas ADAM comparten similitud en la estructura general, sin embargo, el dominio rico en cisteína contiene una región hipervariable que permite la diferenciación entre los miembros de la familia y se ha descubierto que es fundamental para la función de las proteínas ADAM. Existe un sitio importante de glucosilación entre los dominios similares a EGF y ricos en cisteína.

Un aspecto de la invención proporciona una composición, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra la región del ectodominio ADAM8 que inhibe aún más el crecimiento y/o la propagación de las células cancerosas en pacientes con tumores de mama que expresan ADAM8. En particular, un anticuerpo contra una región que abarca parte o todos los dominios de metaloproteinasa/desintegrina será eficaz. El término "contra" como se usa en el presente documento se refiere a la especificidad del anticuerpo, de manera que un anticuerpo contra un polipéptido tenga afinidad para reconocer y unirse a ese péptido. Además, ya que aproximadamente la mitad de las metástasis derivadas del cáncer de mama mostraron expresión de ADAM8, las moléculas de señalización ADAM8 o aguas abajo son útiles como biomarcadores para la progresión de la enfermedad. La identificación de nuevas dianas terapéuticas para bloquear eficazmente la diseminación del cáncer de mama es fundamental para mejorar la supervivencia general de las pacientes con alto riesgo, por ejemplo, mujeres con tumores de mama triple negativo. Dado que ADAM8 se expresa también en otros cánceres humanos, incluyendo los cánceres de cerebro, pulmón, próstata, piel, colorrectal, ovario, hueso, renal, cabeza y cuello, esófago, gástrico, hígado, vejiga, cuello de útero, testicular, de útero, tiroides y páncreas, los inhibidores de ADAM8 también deberían ser eficaces en el tratamiento de pacientes con este tipo de tumores. Además, se pueden usar ADAM8 o moléculas de señalización aguas abajo como biomarcadores para el diagnóstico de estos cánceres.

ADAM8 es una proteína transmembrana que pertenece a la familia ADAM (una desintegrina y metaloproteinasa) y media la adhesión celular, la migración celular y proteólisis de una variedad de sustratos, incluyendo receptores o ligandos de citocinas, moléculas de adhesión celular y componentes de la matriz extracelular (Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281, 2009). Sintetizado como proforma, ADAM8 puede dimerizar o multimerizar y recortar autocatalíticamente su prodominio, dejando una metaloproteinasa anclada a la membrana activa (Figuras 2A y 11). El ADAM8 activo puede procesarse adicionalmente mediante la liberación del dominio de metaloproteinasa en la matriz extracelular, que deja una forma remanente dentro de la membrana. Tanto las formas activas como las remanentes de ADAM8 median la adhesión celular a través de dominios desintegrina/ricos en cisteína/similares a EGF (Schlomann et al. J Biol Chem 277:48210-48219, 2002), notablemente por unión directa a integrinas (Rao et al. J Bone Miner Res 21:1657-1665, 2006).

Se descubrió que ADAM8 no es esencial en condiciones fisiológicas, como lo demuestra el desarrollo normal y la ausencia de defectos patológicos en ratones deficientes en ADAM8 (Kelly et al. Dev Dyn 232:221-231, 2005), a pesar de su expresión en una variedad de células inmunes (Richens et al. Immunobiology 212:29-38, 2007 y Yoshiyama et al. Genomics 41:56-62, 1997). La expresión de ADAM8 se detectó en varias afecciones patológicas caracterizadas por inflamación y remodelación de la matriz extracelular, incluido el cáncer (Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281, 2009). Usando análisis de micromatrices, ADAM8 se identificó como una diana de una vía de varias etapas aguas abajo de NF-kB RelB, que se sabe que promueve un fenotipo agresivo en el cáncer de mama (Wang et al. Nat Cell Biol 9:470-478, 2007). El análisis en el presente documento de bases de datos de micromatrices disponibles públicamente indicó que ADAM8 se expresa en cánceres de mama agresivos, incluyendo CMTN, y se correlacionó con un mal resultado del paciente (Figura 1). Por consiguiente, los Ejemplos descritos en el presente documento intentaron determinar el papel de ADAM8 en el cáncer de mama.

Los datos en el presente documento muestran que se requiere ADAM8 para mantener el fenotipo agresivo de las células de CMTN en cultivo tridimensional (3D) y promueve la angiogénesis, la propagación de CTC y la diseminación metastásica en modelos ortotópicos de ratón de mama y cardíacos. El término "ortotópico", como se usa en el presente documento, se refiere convencionalmente a un modelo de enfermedad que afecta al mismo tejido y ubicación que en la enfermedad original.

Usando los modelos ortotópicos en el presente documento, se descubrió que ADAM8 induce tanto la remodelación vascular por la liberación de factores proangiogénicos solubles, incluyendo VEGF-A (factor de crecimiento endotelial vascular A) y adhesión y transmigración a través del endotelio después de la activación de la integrina p1. En su conjunto, estos hallazgos indican que la proteína ADAM8 transmembrana constituye una diana terapéutica para el tratamiento de tumores de mama agresivos.

Los resultados del presente documento del análisis de muestras obtenidas de conjuntos de datos de micromatrices de cáncer disponibles públicamente, muestra que los niveles de ARNm de ADAM8 estaban significativamente elevados en el cáncer de mama en comparación con el tejido de mama normal y, más específicamente, en subtipos agresivos que incluyen tumores de mama con receptores de estrógeno negativos. Además, el análisis inmunohistoquímico de una cohorte de pacientes con tumores de mama triple negativos (negativo para el receptor de estrógeno, receptor de progesterona y HER2) revelaron que el 34 % (17/50) eran positivos para la proteína ADAM8 y que los tejidos normales adyacentes eran negativos. De forma importante, el 48 % (27/56) de todas las metástasis de tumores de mama en las muestras fueron positivas para ADAM8. Se observó que los niveles de ARNm de ADAM8 consistentemente altos estaban significativamente correlacionados con una escasa supervivencia libre de recaída de metástasis.

ADAM8 se probó en el presente documento dentro de células de cáncer de mama en cultivo, y los datos muestran que esta proteína juega un papel esencial en las propiedades migratorias e invasivas de las células cancerosas. En particular, ADAM8 promovió la formación de colonias ramificadas invasivas y el crecimiento independiente del anclaje en ensayos 3D de células de CMTN. Se utilizó un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico para mostrar que los tumores derivados de células de CMTN MDA-MB-231 en las que se redujo la expresión de ADAM8 por un ARNhc específico, no pudieron crecer más allá de un tamaño palpable. En cambio, los tumores derivados de las células Controlhc MDA-MB-231 crecieron hasta un tamaño medio de 1 cm3 a lo largo del tiempo. Se observó que ADAM8 se inducía en células de cáncer de mama cultivadas en condiciones hipóxicas. La alta expresión de ADAM8 in vivo se detectó alrededor de áreas necróticas dentro de tumores derivados de células Controlhc MDA-MB-231 pero no en los de células ADAM8hc. Los tumores ADAM8hc no pudieron inducir la angiogénesis y, por tanto, permanecieron inactivos. La densidad de los vasos endoteliales se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica para el marcador angiogénico CD31 en ambos grupos de tumores. La tinción con CD31 reveló que la densidad de vasos (angiogénesis) disminuyó significativamente en el área peritumoral de ADAM8hc en comparación con los tumores derivados de células Controlhc MDA-MB-231. Todos los animales inyectados con células Controlhc fueron positivos para macrometástasis cerebrales. En cambio, solo un ratón tuvo una pequeña metástasis en el grupo ADAM8hc.

Para determinar el mecanismo por el cual ADAM8 induce la angiogénesis, se ensayó el efecto del medio acondicionado obtenido a partir de células MDA-MB-231 sobre la capacidad de las células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) para formar estructuras similares a vasos (formación de tubos). Los medios acondicionados de células Controlhc MDA-MB-231 promovieron poco la formación de tubos. Los medios acondicionados de ADAM8hc MDA-MB-231 no promovieron la formación de tubos. Además, se observó que la liberación de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A y otros cuatro mediadores de angiogénesis se reducían en el medio acondicionado obtenido a partir de células ADAM8hc MDA-MB-231 en comparación con células Controlhc utilizando una matriz de proteínas de angiogénesis. Además, se descubrió que el dominio de metaloproteinasa de ADAM8 era necesario para la liberación de VEGF-A.

La unión de las células tumorales primarias y luego las células tumorales en circulación (CTC) a una capa endotelial seguida de la transmigración de las CTC a través de la pared de los vasos sanguíneos (intravasación y extravasación, respectivamente) son etapas críticas en la metástasis. Se observó que la reducción de la expresión de ADAM8 reduce la unión de las células MDA-MB-231 a las CEVUH en cultivo, es decir, se descubrió que las células Controlhc se adhieren mucho más eficientemente que las células ADAM8hc a una monocapa confluente de CEVUH. Además, en un ensayo de migración de células transendoteliales (TEM), las células ADAM8hc mostraron una capacidad profundamente disminuida para migrar a través de una monocapa confluente de CEVUH en comparación con las células Controlhc. Por lo tanto, ADAM8 promueve la adhesión de las células tumorales a una capa endotelial, como se encuentra en la pared de un vaso, y migración a través de la pared del vaso.

Se investigó el papel de la participación de ADAM8 en la modulación de la activación de la integrina p1, una etapa crítica en la adhesión de las células cancerosas al endotelio. El pretratamiento de las células Controlhc con un anticuerpo antagonista dirigido a la integrina p1 redujo en gran medida la capacidad de las células para unirse a las CEVUH. Los anticuerpos monoclonales dirigidos a los dominios extracelulares ricos en cisteína/similares a EGF o metaloproteinasa/desintegrina de ADAM8, provocaron la inhibición de la adhesión de las células Controlhc a las CEVUH esencialmente en la misma medida que el anticuerpo de la integrina p1, y de forma similar evitó la transmigración de las células en un ensayo TEM.

Los ejemplos en el presente documento muestran que los ratones con tumores ADAM8hc tenían menos CTC en comparación con aquellos con tumores Controlhc, según lo revelado por el análisis de muestras de sangre. El resultado es consistente con el papel de ADAM8 en la adhesión y migración de células cancerosas desde el sitio del tumor primario a través de la inducción de angiogénesis e interacciones con el endotelio. Este efecto se observó incluso en puntos de tiempo tempranos después de la inyección de células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria del ratón cuando los tumores de ambos grupos eran apenas palpables y no mostraban ninguna diferencia significativa de tamaño.

Para validar ADAM8 como diana terapéutica para CMTN, se seleccionó el anticuerpo Mab1031 ADAM8 dirigido a los dominios MP/DI para su uso en un modelo ortotópico.

Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg de anticuerpo Mab1031 (n = 9) o con esta dosis de una IgG2B coincidente con el control de isotipo (n = 8) mediante inyección i.p. dos veces por semana desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3. Se observó que el tratamiento con anti-ADAM8 daba como resultado una carga tumoral primaria significativamente reducida en aproximadamente un 50 % (Figura 7A) y el peso del tumor en aproximadamente un 36 % (Figura 7B) después de tres semanas de tratamiento. En animales tratados con anti-ADAM8, también se observó una reducción sustancial en el tamaño y el número de metástasis cerebrales por ratón, y en la frecuencia de metástasis cerebrales (Figura 7C). La angiogénesis que rodea a los tumores (Figura 7D) y los niveles de VEGF-A en los tumores (Figura 7E) se redujeron de manera similar mediante el tratamiento con el anticuerpo ADAM8. El sustrato de metaloproteinasa ADAM8 CD23 (Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281, 2009) se utilizó en un análisis in vitro de la actividad de MP. La actividad de ADAM8 resultó en una reducción sustancial en la actividad in vitro, que indica inhibición de metaloproteinasa en presencia de un anticuerpo anti-ADAM8 (Figura 7F).

Para probar el posible uso de este anticuerpo ADAM8 en un sistema clínicamente más relevante, se utilizó un modelo de extirpación tumoral (Figura 7G). Se probó la capacidad para tratar tumores preexistentes con el anticuerpo anti-ADAM8 Mab1031.

Se inyectaron ratones en la AGM con células MDA-MB-231 Ctrlhc-3 y se observaron tumores palpables 12 días después. El tratamiento se inició con 1,5 mg/kg de anticuerpo anti-ADAM8 Mab1031 o IgG2B de control de isotipo. Se administraron dosis adicionales de anticuerpo el día 15 y el día 17, en cuyo punto los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 0,15 cm3 y se realizó la extirpación del tumor (Figura 7^g ). El tratamiento con el anticuerpo anti-ADAM8 o IgG2B de control se continuó dos veces por semana durante un período de 5 semanas, y luego se examinó la metástasis en el cerebro y los pulmones usando microscopía fluorescente (Figura 7H).

En el grupo de control, se observaron metástasis en el cerebro y los pulmones en casi todos los sujetos (8/8 y 7/8), respectivamente. En contraste, en el grupo tratado con anti-ADAM8, solo 2/9 y 1/9 ratones mostraron metástasis en el cerebro y los pulmones, respectivamente. Por lo tanto, el tratamiento con un anticuerpo anti-ADAM8 MP/DI resultó en una reducción profunda en la frecuencia de metástasis en cada uno de los pulmones y el cerebro en comparación con la frecuencia de metástasis en el grupo tratado con anticuerpo de control de isotipo.

Para probar el papel de ADAM8 en la capacidad de las células de cáncer de mama para colonizar sitios típicos de metástasis distantes, las células Ctrlhc-3 y A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231, que expresan establemente luciferasa, se inyectaron en el ventrículo izquierdo de ratones hembra NOD/SCID (n = 4/grupo). La carga tumoral total se controló semanalmente mediante la medición de la actividad de luciferasa usando el sistema Xenogen Biophotonic Imaging. Las metástasis de órganos y huesos se evaluaron en el momento del sacrificio utilizando este método.

La inyección cardíaca de células A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231 dio como resultado una carga tumoral total significativamente reducida después de 2 y 3 semanas en comparación con la inyección de células Ctrlhc-3 (Figura 8A-B). Al final del ejemplo, se descubrió que las células Ctrlhc-3 colonizaban numerosos órganos y huesos, en contraste con las células A8hc-20 (Figura 8C). Por lo tanto, se observó que se había requerido ADAM8 para la colonización de sitios de metástasis distantes por células de CMTN.

Dado que tanto los anticuerpos Mab10311 (CRD/ELD) como Mab1031 (MP/DI) redujeron la cantidad de migración de células transendoteliales aproximadamente en la misma medida (Figuras 6I y 12A), se probó el direccionamiento de la región CRD/ELD de ADAM8 para determinar la inhibición de crecimiento tumoral y diseminación de CMTN en un modelo ortotópico. Se compararon las capacidades de cada uno de los anticuerpos Mab10311 (CRD/ELD) y el anticuerpo Mab1031 (MP/DI) para inhibir la actividad MP de ADAM8.

Se observó que el anticuerpo Mab10311 inhibió la actividad de MP en aproximadamente un 40 %, en menor medida que Mab1031, 70 %. (Figura 12B) A continuación, se probó el anticuerpo Mab10311 ADAM8 en el modelo ortotópico. Los ratones se trataron con 1,5 mg/kg de anticuerpo Mab10311 (n = 7) o una IgG1 de coincidente de control de isotipo (n = 7) mediante inyección i.p. dos veces por semana desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3.

Después de tres semanas, no se observó ningún cambio significativo en la carga del tumor primario como resultado del tratamiento con Mab10311 anti-ADAM8 (Figura 12C, gráfico de barras de la izquierda). Sin embargo, se observó una reducción sorprendente en el tamaño y los números de metástasis cerebrales por ratón y en la frecuencia general de metástasis en animales tratados con anticuerpo anti-ADAM8 Mab10311 (Figura 12C, gráfico de la derecha). Estos resultados indican que la inhibición de la actividad DI de ADAM8 mediante la interacción de un anticuerpo con regiones CRD/ELD fue suficiente para reducir profundamente la diseminación tumoral de CMTN. Estos datos indican además que la inhibición de la actividad de MP, que se requiere para la liberación de factores proangiogénicos, es necesaria para prevenir el crecimiento tumoral. Por lo tanto, se observó que la inhibición de las actividades MP y DI de ADAM8 era necesaria para prevenir tanto el crecimiento como la diseminación del tumor.

Una parte de la presente invención se ha publicado en un artículo titulado, "ADAM8 expression in invasive breast cancer promotes tumor dissemination and metastasis", EMBO Molecular Medicine 6(2): 278-294,2014, publicado en línea el 27 de diciembre de 2013, por los coautores Mathilde Romagnoli, Nora D. Mineva, Michael Polmear, Catharina Conrad, Srimathi Srinivasan, Delphine Loussouarn, Sophie Barille-Nion, Irene Georgakoudi, Áine Dagg, Enda W. McDermott, Michael J. Duffy, Patricia M. McGowan, Uwe Schlomann, Maddy Parsons, Joerg W. Bartsch y Gail E. Sonenshein.

La invención que ahora se ha descrito completamente se ejemplifica mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones, que son ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes adicionales.

Anticuerpos

La presente invención se refiere a composiciones, métodos y kits para el pronóstico, diagnóstico y tratamiento de afecciones cancerosas relacionadas con ADAM8. El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un "anticuerpo" de origen natural es una glucoproteína que incluye al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o es un anticuerpo de camélido que tiene una sola cadena.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente" a una proteína o célula diana pretende hacer referencia a un anticuerpo que se une a un dominio o porción de la diana que tiene una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el anticuerpo tiene una K^d de 5 x 10'9 M o menos, 2 x 10'9 M o menos, o 1 x 10'1° M o menos. Por ejemplo, el anticuerpo es monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo es policlonal. Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por la diana o por un epítopo particular de la diana. El anticuerpo es una IgM, IgE, IgG tal como IgG1 o IgG2b e IgA.

También es útil para sistemas, el método y kits del presente documento un anticuerpo que se produce de manera recombinante. La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos anti-ADAM8 o de control que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de genes humanos expresados en un animal (por ejemplo, ratón, cerdo, cabra, conejo, oveja, primate, mono, perro y animales de alto valor). Las células hospedadoras de mamíferos para expresar los anticuerpos anti-ADAM8 recombinantes usados en los métodos del presente documento incluyen el ovario de hámster chino (células CHO), incluidas las células dhfr-CHO y las células de mieloma NSO, (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. e E.UU. 77:4216-4220, 1980) usadas con un marcador seleccionable DHFR (por ejemplo, R.J. Kaufman et al. Mol. Biol. 159:601-621, 1982), células COS y células SP2. El análisis se realizó con el sistema de expresión del gen GS que se muestra en el documento WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841.

Para producir anticuerpos, los vectores de expresión que codifican anti-ADAM8 o genes de anticuerpos de control se introducen en células hospedadoras de mamíferos, levadura o bacterianas, y las células hospedadoras se cultivan durante un período de tiempo suficiente para la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos se recuperan del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Se conocen en la técnica ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia cualquiera de los diversos antígenos de ectodominio de especies diana de ADAM8, incluyendo, por ejemplo, ELISA, análisis por transferencia de Western y RIPA. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos se evalúa mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tal como por el análisis de Biacore.

Las metodologías generales para la producción de anticuerpos, incluidos los criterios que deben tenerse en cuenta al elegir un animal o una línea celular para la producción de antisueros, se describen en Harlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 93-117, 1988. Por ejemplo, un animal de tamaño adecuado como un ratón, cerdo, cabra, conejo, oveja, primate, mono, perro, camello, o animal de alto valor, se inmuniza mediante la administración de una cantidad de inmunógeno, tal como la proteína intacta o una porción de la misma que contiene un epítopo que es una secuencia de aminoácidos de un ectodominio ADAM8 humano, eficaz para producir una respuesta inmunitaria. En determinadas realizaciones, el animal se inyecta por vía subcutánea en la espalda con 100 microgramos a 100 miligramos de antígeno, dependiendo del tamaño del animal, seguido tres semanas más tarde con una inyección intraperitoneal de 100 microgramos a 100 miligramos de inmunógeno dependiendo del tamaño del animal con adyuvante, por ejemplo, el adyuvante completo de Freund. Las inyecciones i.p. adicionales cada dos semanas con adyuvante, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund, se administran hasta que se alcanza un título adecuado de anticuerpos en la sangre del animal. Los títulos ilustrativos incluyen un título de al menos aproximadamente 1:5000 0 un título de 1:100.000 o más, es decir, teniendo la dilución una actividad detectable. Los anticuerpos se purifican, por ejemplo, mediante purificación por afinidad en columnas que contienen el factor de virulencia o una porción del mismo.

La técnica de inmunización in vitro de linfocitos humanos se utiliza para generar anticuerpos monoclonales. Las técnicas para la inmunización in vitro de linfocitos humanos son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Inai et al. Histochemistry 99(5):335362, 1993; Mulder et al. Hum. Immunol. 36(3): 186 192, 1993; Harada et al. J. Oral Pathol. Med. 22(4):145 152, 1993; Stauber, et al. J. Immunol. Methods 161(2):157 168, 1993; Venkateswaran, et al. Hybridoma 11(6) 729 739, 1992). Estas técnicas se utilizan para producir anticuerpos monoclonales reactivos a antígenos, incluyendo anticuerpos monoclonales IgG, IgA e IgM específicos de antígeno.

En diversas realizaciones de la composición farmacéutica, al menos uno del anticuerpo anti-ADAM8 o al menos una región de unión del anticuerpo se selecciona del grupo de: un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo recombinante solo de cadena pesada de camélidos (VHH), un anticuerpo solo de cadena pesada de tiburón (VNAR), una microproteína, un darpin, una anticalina, una adnectina, un aptámero, un Fv, un Fab, un Fab' y un F(ab')2.

Las bibliotecas de péptidos utilizadas para seleccionar un anticuerpo que se une específicamente a un ectodominio de proteína ADAM8 y pueden construirse para mostrarse en cualquiera de los diversos vectores que tienen unidades viables que se manipulan fácilmente. Por ejemplo, las unidades viables incluyen cualquiera de una biblioteca de presentación en fago, una biblioteca de presentación de esporas de Bacillus, una biblioteca de presentación de células de E. coli y una biblioteca de presentación de levadura. Se utiliza un vector para transfectar la unidad viable con un gen que codifica una proteína de interés insertado en un gen expresado en el exterior de la unidad, lo que hace que la proteína de interés se muestre en el exterior del fago, la célula de levadura, o la espora de Bacillus (Marks et al. Journal of Molecular Biology 222(3): 581-597, 5 de Diciembre de 1991; Boder et al. Nature Biotechnology 15, 553-557, 1 de junio de 1997; Isticato et al. J. Bacteriol. 183(21): 6294-6301,2001). En los Ejemplos en el presente documento, el gen codifica una porción extracelular (ectodominio) de la proteína ADAM8 o una proteína que inhibe una actividad de ADAM8.

Composiciones farmacéuticas

Un aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen al menos uno de un anticuerpo, cadena de anticuerpo, o fragmento de anticuerpo específico para al menos parte de una proteína diana que es la proteína ADAM8 o un fragmento de la misma, para tratar un trastorno de cáncer asociado a ADAM8 modulando negativamente la cantidad de expresión o actividad de ADAM8 de la proteína o ruta de ADAM8. Por ejemplo, el modulador es un anticuerpo anti-ADAM8 unido a una toxina. En la solicitud, la composición farmacéutica se prepara para la administración sistémica a un sujeto, por ejemplo, la composición se formula como una inyección. En otra realización, la composición se formula como una formulación sistémica para la administración al paciente y se puede combinar para su administración a los tejidos afectados. En realizaciones relacionadas, la composición farmacéutica está formulada suficientemente pura para su administración a un sujeto humano, por ejemplo, al sistema vascular o endotelial de un paciente humano que necesita tratamiento para el cáncer.

En la solicitud, las composiciones del presente documento incluyen opcionalmente además uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos nuevos o conocidos. El agente o agentes terapéuticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en factores de crecimiento, agentes antiinflamatorios, agentes vasopresores que incluyen, entre otros, óxido nítrico y bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de colagenasa, esteroides tópicos, inhibidores de metaloproteinasa de matriz, ascorbatos, angiotensina II, angiotensina III, calreticulina, tetraciclinas, fibronectina, colágeno, trombospondina, factores de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento de tipo insulínico (IGF), proteínas de unión a IGF (IGFBP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de diferenciación neu (NDF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), EGF de unión a heparina (HBEGF), trombospondinas, factor C de von Willebrand, heparina y sulfatos de heparina y ácido hialurónico.

En la solicitud, se incluyen una pluralidad de agentes terapéuticos en la composición farmacéutica para tratar el mismo, un síntoma, afección o enfermedad concurrente o relacionada. En diversas realizaciones, el agente terapéutico es un fármaco que puede incluir, sin limitación, agentes anticoagulantes, antitumorales, antivíricos, antibacterianos, antimicobacterianos, antifúngicos, antiproliferativos o antiapoptóticos. En particular, los pacientes con cáncer se presentan con frecuencia con una infección bacteriana o vírica debido a insuficiencia inmunológica, y las tasas de comorbilidad son elevadas por neumonía bacteriana. Los fármacos para tratar diagnósticos comórbidos tales como infecciones bacterianas que se incluyen en las composiciones de la invención son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13a Ed., Brenton, L. et al., eds., McGraw-Hill, 2010. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el agente terapéutico es azitromicina, claritromicina, eritromicina, doxiciclina, gemifloxacino, levofloxacino, moxifloxacino, cefaclor, cefadroxilo, cefprozilo, cefuroxima, cefalexina, amoxicilina, amoxicilina con clavulanato, ampicilina, piperacilina, ticarcilina con clavulanato, rifamicina, isoniazida y vancomicina.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en varias realizaciones es un anti-ADAM8 que se une a un ectodominio de ADAM8 y se conjuga con un agente de modo que se inhibe el crecimiento de una célula tumoral diana o se destruye la célula tumoral diana (patente de EE.UU. número 7.226.596). Los anticuerpos se conjugan con agentes anticancerígenos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, toxina, o un isótopo radiactivo, es decir, un radioconjugado para formar un inmunoconjugado (publicación de solicitud de patente estadounidense número 2008/0175842). Una variedad de radionúclidos se une covalentemente o forma complejos como quelatos para formar anticuerpos radioconjugados (patente de EE. UU. Número 7.226.596), por ejemplo, 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. (Igual que la referencia anterior). Las toxinas para los inmunoconjugados incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, toxina colérica, toxina botulínica, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, saporina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2008/0175842). Las toxinas de molécula pequeña para conjugar con anticuerpos anti-ADAM8 incluyen caliqueamicinas (patente de EE.UU. número 5.053.394), maitansinoides (patente de EE.UU. número 5.208.020), palitoxina y CC1065 (patente de EE.UU. número 7.226.596).

Los agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales se utilizan para producir inmunoconjugados de anticuerpos/agentes citotóxicos, por ejemplo, N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato h Cl ), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bisazido (tal como bis (pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos, tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (publicación de solicitud de patente de EE.UU. número 2008/0175842). Por ejemplo, la preparación de una inmunotoxina de ricina se describe en Vitetta. et al. Science 238:1098 (1987) (Ibíd.).

Se han aprobado dos anticuerpos conjugados para su uso en la clínica. Por ejemplo, T-DM1 (trastuzumab emtansina, el primer conjugado anticuerpo-fármaco) se aprobó en febrero de 2014 para pacientes con cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2. T-DM1 es un inmunoconjugado de trastuzumab con DM1, un fármaco de quimioterapia.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otro vehículo líquido, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma farmacéutica particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed.; Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA (1995) proporciona diversos vehículos utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Ejemplos de materiales que sirven como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, azúcares tales como glucosa y sacarosa; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tal como un propilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones de tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, la elección de los agentes y las concentraciones no irritantes se determinarán según el criterio del formulador.

Dosis terapéuticamente eficaz

El uso reivindicado en el tratamiento del cáncer de mama proporcionado en este documento implica poner en contacto células o tejidos cancerosos o precancerosos o tumorales con una composición farmacéutica que modula o inhibe la cantidad o actividad de ADAM8, por ejemplo, administrar a un sujeto que tiene cáncer o células o tejido una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene como agente activo al menos uno de un anticuerpo específico para ADAM8, al sujeto que lo necesite, en las cantidades y durante el tiempo que sea necesario para lograr el resultado deseado que es la reducción o la prevención de indicios de la afección relacionada con el cáncer.

Las composiciones, se pueden administrar usando cualquier cantidad y mediante cualquier vía de administración eficaz para tratar el trastorno relacionado con el cáncer. Por lo tanto, la expresión "cantidad eficaz para tratar una enfermedad o afección relacionada con el cáncer", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad suficiente de la composición para prevenir o mejorar de manera beneficiosa los síntomas de la enfermedad o afección.

La dosis exacta la elige el médico individual en función del paciente que se va a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente o agentes activos o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad de la patología, por ejemplo, función del hígado, progresión del cáncer y/o estadio intermedio o avanzado de degeneración macular; edad, peso y género del paciente; la dieta, el momento y la frecuencia de administración; la vía de administración; combinaciones de fármacos; sensibilidades de reacción; y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada hora, dos veces por hora, cada tres o cuatro horas, diariamente, dos veces al día, cada tres o cuatro días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la semivida y de la tasa de eliminación de la composición en particular.

Los agentes activos de las composiciones anti-ADAM8 de la invención se formulan preferentemente en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La expresión "forma farmacéutica unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente concreta de agente activo adecuada para el paciente para tratar. El uso diario total de las composiciones de la presente invención se decidirá por el médico especialista dentro del alcance del buen criterio médico. Para cualquier agente activo, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, como se proporciona en el presente documento, normalmente ratones, pero también posiblemente de cerdos, cabras, conejos, oveja, primates, monos, perros, camellos o animales de alto valor. Los modelos basados en células, animales e in vivo proporcionados en el presente documento también se usan para lograr una concentración deseable y un intervalo de dosificación total y una vía de administración. Tal información se puede usar entonces para determinar dosis y vías de administración útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de agente activo que mejora los síntomas o afección o previene la progresión de la enfermedad o afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de los agentes activos se determinan mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, la DE⁵⁰ (la dosis es terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL⁵⁰ (la dosis es letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la relación, DL⁵⁰/DE⁵⁰. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se usan para formular un intervalo de dosis para uso humano.

La dosis diaria de los productos puede variar en un amplio rango, tales como de 0,1 mg a 500 mg por ser humano adulto por día. Para administración intravenosa o intratumoral local, las composiciones se proporcionan, por ejemplo, en forma de una solución que contiene al menos aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 250 mg o aproximadamente 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar.

Una dosis unitaria contiene típicamente de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de principio activo, más preferentemente de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 10 mg de principio activo. Habitualmente, se administra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal. Por ejemplo, el intervalo es de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 0,5 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal por día, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal peso por día. Las composiciones se pueden administrar en un régimen de, por ejemplo, de una a cuatro o más veces al día o a la semana. Una dosis unitaria se puede dividir, por ejemplo, administrado en dos o más dosis divididas.

Administración de composiciones farmacéuticas

Como está formulado con un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado en una dosis deseada, la composición farmacéutica de anticuerpo anti-ADAM8 o el modulador de expresión de ADAM8 proporcionado en el presente documento se administra a humanos y otros mamíferos, por ejemplo, tópicamente para tumores de piel (tales como polvos, pomadas, cremas o gotas), por vía oral para cánceres de boca y lengua, por vía rectal, por vía mucosa, por vía sublingual, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía intravaginal, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía bucal, por vía sublingual, por vía ocular o por vía intranasal, dependiendo de los objetivos preventivos o terapéuticos y la gravedad y naturaleza del trastorno o afección relacionada con el cáncer.

Las inyecciones de anticuerpos anti-ADAM8 incluyen inyección intravenosa o inyección intraocular directamente en el tumor, por ejemplo, para tumores de esófago, mama, cerebro, cabeza y cuello y próstata.

Las formas de dosificación líquida para administración intravenosa, ocular, mucosal u otra administración incluyen, pero no se limitan a, emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además de al menos un agente activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes; agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, semillas de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán; y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones administradas por vía ocular, oral o sistémica también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes y agentes emulsionantes y de suspensión.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica inventiva incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizadores, inhaladores o parches. El agente activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario, según sea necesario. Por ejemplo, las vías de administración ocular o cutánea se logran con gotas acuosas, una nebulización, una emulsión o una crema. La administración puede ser terapéutica o profiláctica. La invención incluye dispositivos de implantación, dispositivos quirúrgicos o productos que contienen las composiciones descritas (por ejemplo, vendas o tiras de gasa) y métodos para fabricar o usar tales dispositivos o productos. Estos dispositivos pueden estar recubiertos con, impregnados con, unidos o tratados de otro modo con una composición como se describe en el presente documento.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de los ingredientes activos al ojo y al cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden prepararse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio adecuado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.

Las preparaciones inyectables de anticuerpo anti-ADAM8, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas inyectables estériles pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico por vía parenteral aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, habitualmente se usan aceites no volátiles, estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención bacteriana, mediante irradiación o mediante incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso. Para prolongar el efecto de un agente activo, frecuentemente es deseable ralentizar la absorción del agente por inyección subcutánea o intratumoral. La absorción retardada de un agente activo administrado por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo el agente en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan mediante la formación de matrices microencapsuladas del agente en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la relación de agente activo respecto al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del agente activo. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el agente en liposomas o microemulsiones que con compatibles con tejidos corporales.

La invención proporciona un anticuerpo de unión al ectodominio ADAM8 o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer de mama o metástasis asociada al cáncer de mama caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la SEQ ID No 9 y que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la actividad del dominio de metaloproteinasa y el dominio de desintegrina de ADAM8.

El uso reivindicado proporciona un anticuerpo anti-ADAM8 que se une al ectodominio ADAM8, producido que tiene afinidad específica por un antígeno que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un ectodominio de proteína ADAM8 seleccionado entre un dominio de desintegrina (DI) y un dominio de metaloproteinasa (MP). El antígeno inmunizante tiene una longitud de al menos cuatro a siete aminoácidos, y puede ser tan largo como el ectodominio completo con una longitud de varios cientos de aminoácidos.

En la realización del cáncer de mama, el uso en el tratamiento incluye cáncer de mama triple negativo o receptor de estrógeno negativo. El uso reivindicado incluye el cáncer que es un tumor primario, por ejemplo, el tumor no es metastásico. Como alternativa, el uso reivindicado incluye un cáncer metastásico. En dicho uso, el sujeto es un ser humano; como alternativa, el sujeto es un animal de alto valor o es un animal de investigación.

El anticuerpo en la solicitud se obtiene inmunizando o seleccionando de una levadura o fago u otro tipo de biblioteca de presentación con un péptido de una proteína ADAM8 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de secuencias como se muestra en cualquiera de: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; y SEQ ID NO: 9 como diana. Por ejemplo, el anticuerpo se obtiene inmunizando con un péptido que incluye una secuencia de aminoácidos dentro de los restos 158 a 653 correspondientes al ectodominio de ADAM8, o seleccionando un miembro de la biblioteca que se une al ectodominio o fragmento de ectodominio.

La solicitud además implica analizar una disminución en al menos un síntoma de progresión del cáncer o metástasis. Como alternativa, el síntoma es al menos uno seleccionado de: tamaño reducido del tumor primario; cese del crecimiento del tumor primario; disminución del número de metástasis; tamaño reducido de las metástasis; ausencia de nuevas metástasis; disminución del número de células tumorales circulantes en sangre; disminución de la vascularización en el tejido en la periferia o dentro del tumor o metástasis; disminución de la cantidad de ADAM8 en los fluidos corporales; disminución de la cantidad de VEGF-A en los fluidos corporales; y, pérdida de peso del sujeto.

La solicitud proporciona un método para diagnosticar o pronosticar la presencia de una enfermedad cancerosa en un paciente y seleccionar un curso de tratamiento para el paciente, incluyendo el método: analizar la cantidad de expresión de la proteína ADAM8 en el paciente o el tumor del paciente; medir la cantidad en un sujeto normal o en un tejido no afectado del paciente con cáncer, de manera que un aumento de la expresión en el cáncer del paciente en comparación con el sujeto normal o el tejido normal del paciente es un indicio del cáncer; y, pronosticar un curso de tratamiento para el paciente, de tal manera que el indicio de cáncer relacionado con ADAM8 guía la selección de al menos un agente terapéutico que inhibe o reduce la expresión o actividad de ADAM8.

Una realización del uso reivindicado implica además administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una porción extracelular (ectodominio) de la proteína ADAM8 e inhibe la actividad de ADAM8.

La actividad de ADAM8 es al menos una de las siguientes: actividad de la enzima metaloproteinasa ADAM8; liberación de VEGF-A; promoción de la angiogénesis; extravasación o intravasación de células cancerosas a través del endotelio vascular; y activación de la integrina p1.

La solicitud también proporciona un método de cribado de una biblioteca de compuestos para identificar un agente terapéutico candidato para tratar un cáncer, incluyendo el método:

poner en contacto una primera muestra de ADAM8 con al menos un compuesto y poner en contacto una segunda muestra de ADAM8 con un control que carece del compuesto y por lo demás es idéntico; analizar cantidades de ADAM8 o una actividad de ADAM8 en la primera y segunda muestras, de manera que una cantidad reducida o una actividad reducida en la primera muestra en comparación con la segunda muestra identifique al compuesto como el agente terapéutico candidato; probar el compuesto para al menos una de las propiedades químicas estructurales y funcionales biológicas; y, probar el compuesto para determinar la especificidad de ADAM8 determinando si hay reactividad cruzada con miembros de la familia de ADAM estrechamente relacionados: ADAM9, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17, ADAM19 y ADAM33. El compuesto específico inhibe ADAM8 y no inhibe a los miembros de la familia ADAM estrechamente relacionados.

Ejemplos

Ejemplo 1. Condiciones de cultivo y células

Las líneas celulares de CMTN humanas (MDA-MB-231, Hs578T, MDA-MB-468, BT549), la línea celular epitelial mamaria no tumoral MCF-10A y la línea celular endotelial de la vena umbilical CEVUH se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en el medio recomendado por la ATCC. La línea celular SUM149 de cáncer de mama inflamatorio se mantuvo como se describe en Forozan et al. Br J Cáncer 81(8): 1328-1334, 1999. Se aislaron células LM1 y LM2 derivadas de MDA-MB-231 in vivo debido a la capacidad de las células para hacer metástasis en el pulmón (Minn et al. Nature 436:518-524, 2005). Los clones estables de ARNhc de ADAM8 (A8hc) y ARNhc Control (Ctrlhc) en células MDA-MB-231, que expresan GFP, se establecieron mediante la transfección de cualquiera ARNhc ADAM8 o vector de control de scramble (Origene), respectivamente, usando LTX Lipofectamine (Invitrogen), selección con 1 pg/ml de puromicina (Sigma) y dilución limitante. Los clones de MDA-MB-231 se autenticaron mediante análisis de repetición en tándem cortos (Genetica DNA Laboratories), que demostró una identidad del 100 % con la línea celular MDA-MB-231 de ATCC. Para cultivo en condiciones de suspensión 3D, las suspensiones unicelulares en medio completo se sembraron en placas a 1,25 x 104 células por pocillo en placas de 6 pocillos de fijación ultrabaja (Costar) y se incubaron durante 48 h. Para cultivo en condiciones hipóxicas, las células se incubaron en oxígeno al 1 % durante 6 o 24 h en placas de 6 pocillos.

Ejemplo 2. Análisis de eliminación de ARNip

La eliminación de ADAM8 mediada por ARNi transitoria se realizó con los siguientes ARN de interferencia cortos (ARNip; QIAGEN):

ADAM8ip (A8ip)n.° 1 (Hs_ADAM8_6): 5'-CGGCACCTGCATGACAACGTA-3' (SEQ ID NO: 1) y

A8ip n.° 2 (Hs_ADAM8_7): 5'-CTGCGCGAAGCTGCTGACTGA-3' (SEQ ID NO: 2).

Se usó ARNip de control negativo AllStar (QIAGEN) en cada ejemplo como ARNip de control no silenciador (Ctrlip). Se introdujeron ARNip (10 nM) en las células usando el reactivo de transfección Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen) mediante transfección inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se usaron 24 h después en ensayos funcionales.

La secuencia diana del ARNhc de ADAM8 utilizado en el presente estudio fue GCGGCACCTGCATGACAACGTACAGCTCA (SEQ ID NO: 8).

Ejemplo 3. Análisis por transferencia de Western

Se prepararon CEC de células en cultivo o tejido tumoral homogeneizado congelado utilizando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Pierce), y adicionalmente complementado con EDTA y fenantrolina para inhibir la actividad autocatalítica de ADAM8. Las muestras (25 pg) se analizaron mediante inmunotransferencia como se describe en Romagnoli et al. Cancer Res 72:6268-6278, 2012. Los anticuerpos específicos para ADAM8 se adquirieron de Millipore (AB19017) y LSBio (B4068). El anticuerpo específico para VEGF-A se adquirió de R&D Systems (AF293NA). Los anticuerpos específicos para p-actina (AC-15) y p-tubulina (TUB 2.1) se adquirieron de Sigma. El anticuerpo HIF-1a (NB100-105) se adquirió de Novus Biologicals. Los anticuerpos contra la etiqueta HA (sc-805) y Lamin B (sc-6217) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Para el análisis por transferencia de Western de VEGF-A liberado, se recogió medio libre de suero incubado con células durante 16 h, se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 min para eliminar los restos celulares y se concentró usando filtros centrífugos de 10 K (Amicon Ultra-15). Los volúmenes del medio acondicionado correspondientes a 2,5 x 105 células se analizaron mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo VEGF-A (R&D Systems, MAB293).

Ejemplo 4. Ensayo de ATP

Como medida del metabolismo celular y, por tanto, del crecimiento celular, los niveles de ATP se evaluaron en 3 x 103 células MDA-MB-231 que utilizan un sistema de ensayo de detección de ATP de luminiscencia ATPlite (Perkin Elmer), tal como se describe en Mineva et al. J Cell Physiol; 220(3):593-9, 2009. Los niveles promedio de ATP para muestras por triplicado se presentan en relación con la condición de control establecida en 1 (Media ± DE de tres ejemplos independientes).

Ejemplo 5. Ensayos de crecimiento de matrigel y agar blando

Para ensayos en agar blando, 5 x 104 células en una mezcla de 0,4 % de Bacto Agar (BD Biosciences) en medio completo se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos prerrevestidas con una mezcla 1:1 de medio 2x DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1,6 % de Bacto Agar. Las células se alimentaron tres veces por semana con medio completo. Después de 8-12 días, las células se tiñeron durante la noche con 0,2 mg/ml de cloruro de yodonitrotetrazolio (Sigma) y se fotografiaron con un aumento de 10x. Se contaron las colonias con diámetros de aproximadamente 20 |jm o más usando el programa informático ImageJ (NIH). Los ensayos de crecimiento de Matrigel se llevaron a cabo como en Wang et al. Nat Cell Biol 9:470-478, 2007, usando 5 x 10³ células sembradas por duplicado en placas de 24 pocillos. Los cultivos se incubaron durante 4-7 días y se fotografiaron con un aumento de 20x.

Ejemplo 6. Ensayos de migración/invasión y migración transendotelial

Los ensayos de migración e invasión se realizaron por triplicado utilizando un filtro de policarbonato transpocillo (Costar) con poros de 8 jm de diámetro, sin prerrevestimiento o prerrecubrimiento con Matrigel reducido en factor de crecimiento (BD Biosciences, 356231), respectivamente. Los ensayos de migración transendotelial se realizaron como se describe en el presente documento con transpocillos prerrevestidos con CEVUH que se habían dejado crecer hasta que se logró una monocapa confluente. Las suspensiones de 1 x 10⁵ células tumorales se colocaron en capas en los compartimentos superiores del transpocillo y se incubaron a 37 °C. Después de 24 h, se evaluó el número de células que migraron o invadieron al lado inferior del filtro mediante tinción con cristal violeta y determinación con DO^{570 nm}. La condición de control (Ctrlip, Ctrlhc, o control de anticuerpo de isotipo) se estableció en 100 % y se proporciona la media ± DE de tres ensayos replicados independientes.

Ejemplo 7. Ensayo de formación de tubos

Los ensayos de formación de tubos se realizaron como se describe (Kim et al. Mol Cancer Res 5:321-329, 2007). En resumen, se colocaron en placas 2 x 10⁴ células CEVUH, por triplicado, en cámaras de vidrio recubiertas con factor de crecimiento de Matrigel reducido. Las células se incubaron en 200 j l de medio basal EBM-2 suplementado con FBS al 1 % y medio acondicionado concentrado de los clones Ctrlhc y A8hc MDA-MB-231 (volumen correspondiente a 5 x 10⁵ células tumorales) o medios acondicionados en ausencia de células tumorales. Después de la incubación durante 13 h, se fotografiaron tres campos aleatorios por pocillo (aumento de 40x). Se excluyeron las redes incompletas y el número de redes cerradas de tubos con forma de recipiente se contó en tres campos (n = 9). El porcentaje medio relativo a las muestras de control se presenta ± D.E. de un representante de tres ensayos replicados independientes.

Ejemplo 8. Ensayo de adhesión de células endoteliales

Los ensayos de adhesión de células endoteliales se realizaron como se describe en Price et al. Br J Cancer 74:1762-1766, 1996. En resumen, se colocaron en placas 1 x 10⁵ células CEVUH, por duplicado, en placas de 48 pocillos. Después de 24 h, se incubaron 5 x 10⁴ células Ctrlhc o A8hc MDA-MB-231 teñidas con NucBlue (Invitrogen) durante 15 min a 37 °C en 300 j l de medio basal EBM-2 suplementado con FBS al 1 % en la parte superior de la monocapa confluente de CEVUH o en pocillos vacíos (sin CEVUH). Las células MDA-MB-231 no unidas se lavaron tres veces con PBS y las células positivas a NucBlue unidas se contaron en tres campos aleatorios por pocillo (n = 6). El porcentaje medio relativo a las muestras de control se presenta ± D.E. de tres ejemplos independientes. Para ejemplos de inhibición con anticuerpos, las células tumorales y/o CEVUH se pretrataron con 10 jg/m l de anticuerpo de integrina p1 (BD Biosciences, 552828), 20 jg/m l de anticuerpo específico para un ectodominio ADAM8 (R&D Systems, MAB10311 y Mab1031), o isotipos de control (rata o ratón, respectivamente) durante 30 min a temperatura ambiente y luego se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de usarse en el ensayo de adhesión de células endoteliales.

Ejemplo 9. Matriz de angiogénesis humana

Los niveles secretados de 55 proteínas relacionadas con la angiogénesis se analizaron en el medio acondicionado de los clones Controlhc (Ctrlhc-3 y -5) y ADAM8hc (A8hc-17 y -20) MDA-MB-231 utilizando la matriz de anticuerpos de angiogénesis humana Proteome Profiler™ (R&D Systems, ARY007). Las células incubadas con medio acondicionado de suero bovino fetal (FBS) al 2 % durante 24 h se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 min para eliminar los restos celulares y un volumen de medio correspondiente a 2,5 x 10⁵ células se analizaron mediante la matriz de anticuerpos de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de la señal de las proteínas detectadas (dos puntos para cada proteína) se midió usando ImageJ, se restó la señal de fondo y se calculó la intensidad media (media ± D.E.) para los dos clones.

Ejemplo 10. Modelo de ratón con almohadilla de grasa mamaria (AGM)

Se implantaron ratones hembra no obesos diabéticos/inmunodeficientes combinados graves (NOD/SCID) de seis semanas (Laboratorio Jackson) con 2,5 x 10⁶ células en 50 j l de solución de Matrigel al 50 % (BD Biosciences, CB-40230A) (dilución a 1:1 de Matrigel con medio DMEM) en la cuarta almohadilla de grasa mamaria inguinal. El crecimiento del tumor primario se controló mediante medición con calibre dos veces por semana. Los volúmenes tumorales se calcularon como (largo x ancho²)/2. Los ratones se sacrificaron después de 3-4 semanas cuando los tumores derivados de las células Ctrlhc MDA-MB-231 habían alcanzado un volumen de aproximadamente 1 cm³. Se fotografiaron ratones, los tumores se extirparon, fotografiaron, pesaron y fijaron en formalina tamponada neutra al 10% para análisis histológicos e IHC. Para ejemplos de tratamiento con anticuerpos contra metaloproteinasa/desintegrina, el isotipo de control IgG2B (n = 8) o anticuerpo para ADAM8 (mAb anti-A8; n = 9; Mab004 y Mab1031 respectivamente, R&D Systems) se inyectó i.p. dos veces por semana a una dosis de 0,5 mg/kg desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3 en la AGM.

Para los ejemplos de tratamiento con anticuerpos ricos en cisteína/similares a EGF, IgG1 de control de isotipo (n=7) o Ab anti-A8 (n=7; Mab002 y Mab10311, R&D Systems) se inyectó i.p. dos veces por semana a 1,5 mg/kg desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3 en la AGM.

Como alternativa, el tratamiento con dosis de 1,5 mg/kg se realizó utilizando un régimen de dosificación de administrar el tratamiento después de que los tumores primarios se volvieron palpables y continuar con una inyección el día de la extirpación cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 0,15 cm3 y dos veces por semana durante las siguientes cinco semanas. Para la detección de metástasis, se extrajeron cerebros y pulmones mediante disección, se almacenaron en PBS frío y se examinaron para determinar la expresión de GFP utilizando un microscopio de disección fluorescente (Leica MZ f L iII).

Ejemplo 11. Modelo de ratón de colonización cardíaca

Se implantaron ratones hembra no obesos diabéticos/inmunodeficientes combinados graves (NOD/SCID) de seis semanas (Laboratorio Jackson) con 0,5 x 106 células en 100 pl de PBS usando una inyección guiada por ultrasonido con una aguja de calibre 27© en el ventrículo izquierdo. Inmediatamente después de la inyección cardíaca, la diseminación vascular sistémica de las células tumorales se analizó mediante la detección de la actividad de luciferasa utilizando el sistema Xenogen Biophotonic Imaging. La carga tumoral total se controló semanalmente como se describe en el presente documento. Los ratones se sacrificaron tres semanas después de la inyección celular inicial. Se recolectaron órganos y huesos y se detectó la actividad luciferasa específica como se describe en el presente documento.

Ejemplo 12. Detección de CTC

La sangre se recogió en el momento del sacrificio mediante punción cardíaca (aproximadamente 500 pl; día 33), o extrayendo de ratones usando el método de recolección de sangre submandibular (aproximadamente 100 pl) en los puntos de tiempo 7, 14 y 21 días después de la inoculación de células tumorales en la AMG. Para evaluar el nivel de autofluorescencia, también se extrajo sangre de ratones NOD/SCID de control a los que no se les inyectó ninguna célula tumoral. Las muestras de sangre se recolectaron en heparina (100 unidades USP/muestra), y se diluyeron y procesaron el mismo día para la detección de CTC positivas para GFP utilizando un sistema de citometría de flujo confocal a una tasa de flujo de 4,5 pl por minuto, como se describe en Greiner et al. Cytometry A 79:874-883, 2011. Las células enumeradas se identificaron con un algoritmo como se describe en Hwu et al. J Biomed Opt 16:040501, 2011 basado en la detección combinada de picos que aparecen simultáneamente en un canal de fluorescencia optimizado para la detección de GFP y en al menos uno de los canales que detectan la dispersión a 405 o 488 nm.

Se hicieron fluir muestras de sangre entera diluida en dispositivos de microfluidos, cada uno tiene cinco canales individuales de 50 pm (ancho) por 70 pm (alto) y 10 mm (largo). Para hacer fluir las células en un canal de microfluidos para mediciones de dispersión de luz y emisión de fluorescencia, el tubo de salida se colocó en tubos Eppendorf y la suspensión celular se extrajo con una bomba de jeringa (Aparato Harvard) a un caudal de 6 pl min-1. Operando a una presión constante, el caudal de 6 pl min’1 ajustado calibrado para agua arrojó un valor real de 4,5 pl min’1 debido al aumento de la viscosidad de la sangre. Los canales se humedecieron previamente con PBS y se dejó que el flujo de la muestra de sangre se estabilizara antes de la adquisición de datos. De los aproximadamente 100 pl iniciales de sangre total recolectados, 34 ± 17, 55 ± 17 y 57 ± 9 pl, respectivamente, fueron analizados para ratones no portadores de tumores, Controlhc, y ADAM8hc, respectivamente. En el último punto de tiempo del día 33, se analizaron 100 pl de sangre.

Se detectaron recuentos positivos para la fluorescencia de GFP en el canal "verde" de 500 a 590 nm después de la excitación con luz de 488 nm y se correlacionaron en el tiempo con valores de dispersión de 405 y 488 nm de intensidad suficiente. La luz incidente de 633 nm interrogó a las células en busca de autofluorescencia roja, que se detectó en el canal de 650-690 nm y se analizó por separado de los recuentos correlacionados con verde. Dentro del volumen analizado, los leucocitos y las CTC constituían aproximadamente el 0,5% del flujo de datos de luz fluorescente y retrodispersada adquirida. Usando una frecuencia de muestreo de 25 kHz, el 99,5 % más bajo de los valores de intensidad definió la desviación media y estándar de la señal de fondo. Los picos individuales se demarcaron mediante 6 a 7 puntos de datos y el valor máximo definió la intensidad utilizada para determinar si el recuento contenía valores de fluorescencia y dispersión suficientemente intensos para la identificación de CTC. Dentro de un programa de Matlab, el umbral de intensidad se definió en función del número de desviaciones estándar por encima de la media de la señal de fondo. Se observó que el número de desviaciones estándar era, respectivamente, 4, 4, 7 y 5 para los canales de 405, 488, 650-690 y 500-590 nm, respectivamente. De las muestras no portadoras de tumores analizadas, se detectó una concentración de media ± DE pl-1 células autofluorescentes verdes y se restaron de los recuentos detectados en muestras con tumores, produciendo los valores de concentración de c Tc informados.

Ejemplo 13. Ensayo de actividad de metaloproteinasas ADAM8

Las células HEK-293 se sembraron en placas a 5 x 105 células/ml en placas P60. Después de 24 h, los cultivos se cotransfectaron con 1 |jg de ADN plasmídico que codifica CD23 marcado con HA C-terminal (isoforma b de la membrana CD23, adquirido en Addgene), y 1 jg de ADN de vector que expresa ADAM8 de longitud completa o remanente, o vector vacío (EV) ADN de pCDNA3.1 Versión B. El medio se reemplazó después de 6 h con medio de cultivo sin FBS. Después de 16 h, el medio sin suero se recogió y se centrifugó para eliminar los restos celulares, y las células se tripsinizaron y contaron. Los sobrenadantes se concentraron usando unidades de filtro centrífugo Amicon-ultra 4 (Millipore), y se evaluaron los volúmenes correspondientes a números de células iguales para CD23 escindido usando transferencia Western. Las CEC de células lisadas se evaluaron para determinar los niveles de ADAM8.

Ejemplo 14. Inmunohistoquímica de muestras de pacientes

Se seleccionaron tejidos incluidos en parafina de tumores fijados con formalina (véanse la Tabla 1 y las Figuras 1D-1F) y se analizaron para determinar la expresión de la proteína ADAM8 mediante inmunohistoquímica.

Tabla 1. Características clínicas de los tumores de mama primarios y metastásicos analizados para la expresión de la proteína ADAM8 por inmunohistoquímica, incluyendo 37 carcinoma ductal in situ (CDIS), 50 cánceres de mama _________________triple negativos (CMTN) y 56 metástasis. N(%) se muestra entre paréntesis._________________ Característica del tumor CDIS Triple negativo Metástasis

Edad

< 50 años 12 (32,4) 13 (26,0) 0

> 50 años 25 (67,6) 37 (74,0) 0

Desconocido 0 0 56 (100,0)

Grado

1 y 2 0 14 (28,0) 4 (7,1)

3 0 35 (70,0) 9 (16,1)

Desconocido 37 (100,0) 1 (2 ,0) 43 (76,8)

Estado de ER

Negativo 0 50 (100,0) 6 (10,7)

Positivo 0 0 7 (12,5)

Desconocido 37 (100,0) 0 43 (76,8)

Estado de HER2

Negativo 0 50 (100,0) 8 (14,3)

Positivo 0 0 5(8,9)

Desconocido 37 (100,0) 0 43 (76,8)

Estado nodal

Negativo 0 33 (66,0) 6 (10,7)

Positivo 0 16 (32,0) 5(8,9)

Desconocido 37 (100,0) 1 (2 ,0) 45 (80,4)

Histología

Ductal 37 (100,0) 44 (88,0) 12 (21,4)

Lobular 0 3 (6,0) 1 (1,8)

Otros 0 3 (6,0) 0

Desconocido 0 0 43 (76,8)

Las muestras se cortaron en secciones de 3 jm de espesor y se tiñeron con HyE. Como alternativa, las secciones se procesaron para inmunohistoquímica. Las secciones se desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de un gradiente de alcohol, y la actividad peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3 %. Las muestras se vaporizaron antes de la incubación para la recuperación del antígeno con tampón citrato (pH 6,0). Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo primario dirigido a ADAM8 (1:150, B4068, LSBio) en un inmunotindor automático usando un método de estreptavidina-biotina marcado (Dako) seguido de detección de cromógeno de 3,3'-diaminobencidina. Los portaobjetos inmunoteñidos se contratiñeron con hematoxilina. Se incluyeron controles negativos en cada ejecución omitiendo el anticuerpo primario. Un patólogo puntuó la inmunorreactividad de ADAM8 en células carcinomatosas utilizando un sistema semicuantitativo de cinco niveles (0: sin tinción; 1 : tinción débil focal <10 %; 2+: 10-25 %; 3+: 25-50 %; 4+: >50 %). Las células no carcinomatosas se excluyeron de la puntuación.

Ejemplo 15. Inmunohistoquímica de muestras de ratón

Los anticuerpos primarios dirigidos a ADAM8 (1:150, B4068, LSBio), CD31 (1:50, ab28364, Abcam) y la conformación activa de la integrina p1 (1:100, B2861, LSBio) se utilizaron en el mismo protocolo descrito en el presente documento para las muestras de pacientes. Para evaluar la densidad de los vasos, dos portaobjetos/tumor se cortaron a una distancia de 200 jm y se analizaron mediante inmunotinción para CD31. Los portaobjetos se examinaron a bajo aumento y se identificaron tres áreas con el mayor número de vasos (puntos calientes) en la periferia del tumor para cada segmento de tumor. Estos fueron fotografiados con un aumento de 40x, el número de vasos/puntos calientes contados y el valor medio de densidad de vasos/tumor representado (n = 6/tumor).

Ejemplo 16. Expresión genética y análisis estadístico

Los conjuntos de datos de cáncer se descargaron de ONCOMINE ™ (Compendia Bioscience, www.oncomine.com). tal como se describe en Romagnoli et al.. 2012. El rango para ADAM8 en los 14 análisis y su valor de P para la comparación de la expresión de ADAM8 entre carcinoma de mama y mama normal. se obtuvieron directamente del sitio web de ONCOMINE™. Un conjunto completo de datos de micromatrices de expresión génica de 295 tumores de mama primarios (obtenido de Rosetta Inpharmatics) preparado por van de Vijver y sus colegas (van de Vijver et al. N Engl J Med 347:1999-2009. 2002). se utilizó para comparar niveles de ARNm de ADAM8 en los diferentes subtipos de cáncer de mama molecular y para evaluar la correlación de esta proteína con variables clínico-patológicas y el resultado del paciente. Las relaciones univariadas entre los datos de la relación logarítmica de ARNm de ADAM8 y el resultado del paciente se evaluaron mediante la prueba de rango logarítmico (RR. IC). Un RR (riesgo relativo) de 1 indica que el riesgo de recaída o mortalidad es el mismo en ambos grupos. mientras que un RR de más de 1 indica un mayor riesgo. Se calcularon los intervalos de confianza (IC) para el RR. que luego se probó para determinar su significación estadística mediante la prueba de Wald. A los datos se les asignaron puntos de corte arbitrarios. Los datos mostrados son representativos de los resultados obtenidos con el percentil 75. Los resultados se presentan utilizando curvas de Kaplan-Meier. Los valores de P inferiores a 0.05 (P <0.05) se consideraron estadísticamente significativos. Los datos se analizaron utilizando la estadística PASW versión 18.0 (SPSS Inc.). El gráfico de correlación por pares de Pearson que muestra la correlación entre la expresión de ADAM8 y CD31 (PECAM1) se obtuvo utilizando conjuntos de datos de micromatrices de tumores de mama de la base de datos bc-GenExMiner (http://bcgenex.centregauducheau.fr). Todos los demás análisis se realizaron utilizando una prueba de t de Student de dos colas para muestras con igual varianza. en la que los valores de P menores de 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Se utilizó el análisis de la base de datos ONCOMINE™™ para comparar el número de copias de ADN de ADAM8 en muestras de cáncer de mama con el de tejido de mama normal. No se encontró ganancia en el número de copias entre las muestras de carcinoma ductal y lobulillar invasivo (n = 14). ductal invasivo (n = 647). lobulillar invasivo (n = 71). mixto lobulillar y ductal (n = 9). o mucinoso (n = 9) tejidos cancerosos en comparación con tejido mamario normal (n = 111). De hecho. se observó una disminución en el número de copias para el tejido ductal invasivo en comparación con el tejido mamario normal. y para el tejido mucinoso en comparación con el tejido mamario normal. como es típico de las deleciones que surgen durante el cáncer.

Ejemplo 17. La alta expresión de ADAM8 en los tumores de mama humanos se correlaciona con un mal pronóstico

Se utilizó la base de datos de micromatrices ONCOMINE™ para evaluar los niveles de ARNm de ADAM8 en cáncer de mama. Se observaron niveles de ADAM8 significativamente sobreexpresados en muestras de carcinoma de mama invasivo de diferentes orígenes (ductal. lobular. mixto). en comparación con los tejidos mamarios normales (Figura I A) . Además. para las muestras de tumores se estratificaron según el estado de ERa. se observó que los niveles de ADAM8 eran significativamente más altos en los carcinomas de mama ERa-(receptor de estrógeno negativo) (Figura IB ) . que son conocidos por tener un pronóstico más pobre en comparación con los ERa+. De forma importante. ADAM8 fue identificado como uno de los genes más expresados en tumores de mama humanos en comparación con el tejido de mama normal (Figura 1C).

Se realizó un análisis IHC para evaluar la expresión de ADAM8 directamente en tumores de mama (Figura 1D-1E). La tinción de ADAM8 se localizó en el citoplasma y la membrana plasmática de las células cancerosas. y se observó abundantemente en el 34.0 % (17/50) de CMTN (Figura 1D-E). De manera interesante. en sitios de tumores primarios. la expresión de ADAM8 se detectó en el frente principal de las áreas microinvasoras (Figura 1E. parte inferior). En cambio. ADAM8 no fue detectable en tejido mamario normal adyacente de CMTN (Figura 1E. arriba). Además. solo el 13.5 % (5/37) de los tumores de carcinomas ductales in situ (CDIS). que se definen por la falta de invasión local fuera de los conductos mamarios. fueron positivos para la tinción de ADAM8 (Figura 1D).

El análisis IHC de 56 metástasis derivadas del cáncer de mama humano reveló que el 48.2 % (27/56) eran positivas para la expresión de ADAM8 (Figura 1D y 1F). incluida la mayoría de las metástasis cerebrales (63 %) y porcentajes significativos de ganglios linfáticos (44.5 %). metástasis en hígado (29.4 %) y otros órganos (33.3 %. 1/3). Consecuentemente. utilizando la base de datos bc-GenExMiner. los niveles elevados de ADAM8 se correlacionaron con la recaída de metástasis. como lo indica la curva de Kaplan-Meier resultante de datos que contienen más de 2000 muestras de cáncer de mama de pacientes y 600 eventos (Figura 1G).

Estos hallazgos demuestran que ADAM8 se expresa de manera anómala en una gran cantidad de cánceres de mama. en particular en pacientes con CMTN. y la expresión de ADAM8 se asocia con un peor pronóstico. Por lo tanto. se observó un papel de ADAM8 en CMTN. cánceres que se caracterizan por altas tasas de recurrencia y diseminación a órganos distantes y tienen menos terapias dirigidas efectivas (Boyle. 2012).

Ejemplo 18. La expresión de ADAM8 en células CMTN aumenta en cultivos en suspensión 3D

ADAM8 se sintetiza como una proforma de 120 kD, que multimeriza y recorta automáticamente su prodominio, dejando una metaloproteinasa anclada a membrana de 90 kD proteolíticamente activa, que se puede procesar más a una forma remanente de 60 kD (Figura 2A; Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281, 2009).

Utilizando análisis de transferencia de western, se encontró una alta expresión de proforma de ADAM8 en todas las líneas celulares de CMTN probadas en comparación con la línea celular epitelial mamaria no tumoral MCF-10A cuando se cultivaron en condiciones adherentes (Figura 2 B). Las formas ADAM8 activas y remanentes procesadas fueron prominentes en células MDA-MB-231 y s Um 149 en cultivo 2D. El crecimiento de células MDA-m B-231 y Hs578T en condiciones de baja adherencia, que selecciona un fenotipo más agresivo, se utilizó para estudiar más células con o sin procesamiento activo evidente en cultivo 2D. Ambas líneas celulares formaron esferas cuando se cultivaron en cultivo en suspensión 3D (Figura 2C). En las células MDA-MB-231, se observaron aumentos robustos en todas las formas con el cultivo 3D (Figura 2D). Sorprendentemente, cuando las células Hs578T se cultivaron en condiciones de cultivo 3D, ahora se observaron niveles sustanciales de forma activa, así como niveles más altos de proforma precursora de ADAM8 (Figura 2E). La proforma de ADAM8 en esferas Hs578T mostró una migración más rápida, similar a la banda observada en las células MDA-MB-231 (Figura 5A), que puede deberse a modificaciones postraduccionales alteradas. Las formas precursoras y activas de ADAM8 en las células Hs578T se detectaron mejor utilizando anticuerpos LSBio y Millipore, respectivamente. El uso de dos ARNip de ADAM8 diferentes específicos condujo a la eliminación eficaz de ADAM8 en estas dos líneas en ambas condiciones de crecimiento (Figura 2^d y 2E). En conjunto, se observó que ADAM8 se expresaba y procesaba a una forma activa en células de CMTN, y se observaron niveles aumentados en células cultivadas en suspensión como "tumoralesferas".

Ejemplo 19. ADAM8 mantiene las propiedades invasivas y migratorias de células CMTN

Para probar el papel de ADAM8 en el fenotipo agresivo de las células MDA-MB-231 y Hs578T in vitro, se midieron los efectos de la caída de ADAM8 sobre el crecimiento en agar blando y la migración e invasión a través de Matrigel, ensayos que se realizan en condiciones de cultivo 3D.

La disminución de la expresión de ADAM8 condujo a la reducción de la capacidad de ambas líneas celulares para crecer en condiciones independientes del anclaje (Figura 3A), para migrar (Figura 3B) e invadir a través de Matrigel (Figura 3C). Consecuentemente, la capacidad de estas células agresivas para formar colonias de ramificación características en un ensayo de crecimiento de Matrigel 3D fue fuertemente inhibida después de la eliminación de la expresión de ADAM8 (Figura 3D). Las células derivadas de MDA-MB-231, LM1 y LM2, que fueron seleccionadas in vivo para la capacidad de las células de hacer metástasis en el pulmón (Minn et al. Nature 436:518-524, 2005), expresaron niveles más altos de ADAM8 que la línea parental MDA-MB-231 (Figura 3E), y formaron más rápidamente colonias muy grandes en Matrigel (es decir, dentro de 3-4 días frente a 6-7 días para las células parentales; Figura 3F). La capacidad de las células LM1 y LM2 para formar estas colonias altamente invasivas en Matrigel fue contrarrestada sorprendentemente por la caída de ADAM8 (Figura 3E y 3F).

Por lo tanto, se observó que la presencia de ADAM8 era necesaria para el mantenimiento de un fenotipo migratorio e invasivo en células CMTN en cultivo.

Ejemplo 20. ADAM8 promueve el crecimiento tumoral, la propagación de células tumorales en circulación y la metástasis

Los efectos de la reducción de la expresión de ADAM8 in vivo se probó utilizando un modelo de xenoinjerto ortotópico de ratón. Se aislaron los clones de células MDA-MB-231 que expresan un ARNhc de ADAM8 (A8hc-17 y A8hc-20) o ARNhc de Control (Ctrlhc-3 y Ctrlhc-5). Los clones de ARNhc de Control expresaron niveles de ADAM8 comparables a los de las células parentales. La eliminación eficaz de la expresión de ADAM8 por ADAM8hc se verificó mediante análisis por transferencia de Western (Figura 4A). La reducción de ADAM8 no tuvo ningún efecto detectable sobre el crecimiento 2D según se evaluó mediante un ensayo de ATP (Figura 4B).

Los dos clones ADAM8hc MDA-MB-231 mostraron una capacidad significativamente reducida tanto para migrar como para invadir a través de Matrigel en comparación con los clones Controlhc (Figuras 4C y 4D). Se transfectó transitoriamente ADN de ADAM8 (A8) o vector vacío (EV) en células A8hc-20 ^m D^a -MB-231 durante 24 h. Las CEC se aislaron y se sometieron a análisis de transferencia Western para ADAM8 (anticuerpo LSBio) y tubulina (Figura 4E). Los ensayos de migración y excrecencia de Matrigel también se realizaron como se describe en las Figuras 3B y 3D, respectivamente. La expresión ectópica de ADAM8 en células A8hc-20 rescató parcialmente la capacidad de las células para migrar (Figura 4F) y formar colonias invasoras (Figura 4G), de acuerdo con la eficacia de transfección observada de aproximadamente el 40 %. El rescate de estos fenotipos mediante la expresión ectópica de ADAM8 en el clon A8hc-20 demostró el papel de la reducción de la expresión de ADAM8 en estas células.

Para probar los efectos de la reducción de la expresión de ADAM8 sobre el crecimiento tumoral y la metástasis, se inyectaron 2,5 x 106 células MDA-MB-231 Ctrlhc-3 y A8hc-20 en la cuarta almohadilla de grasa mamaria inguinal de ratones hembra NOD/SCID (n = siete por grupo). El crecimiento del tumor en el sitio ortotópico se registró mediante mediciones con calibre dos veces por semana. Entre 13-16 días después de la implantación celular, los ratones del grupo Controlhc comenzaron a desarrollar tumores mamarios que progresaron con una alta tasa de crecimiento (Figura 4H). De manera muy destacable, los tumores derivados del clon A8hc-20 no crecieron más allá de 0,05 cm3 incluso después de más de 4 semanas (día 33). El transcurso del tiempo terminó cuando los tumores del grupo Controlhc alcanzaron un tamaño de aproximadamente 1 cm3 según el protocolo de ratón aprobado. Los tumores fueron recolectados, fotografiados y pesados (Figura 4I). Se midió una disminución espectacular en el peso medio del tumor (2,00 ± 0,08 frente a 0,16 ± 0,01 g). Visualmente, los tumores derivados del clon A8hc-20 parecían estar sustancialmente menos vascularizados (Figura 4I).

Las CTC se detectaron basándose en la expresión estable de GFP en los clones MDA-MB-231, utilizando citometría de flujo en sangre recién extraída después de la finalización del curso de tiempo. Se observó una profunda disminución en el número de CTC con la reducción de la expresión de ADAM8 (12,8 ± 7,0 frente a 0,0 ± 2,0 por pl de sangre; Figura 4J). Estos datos muestran que ADAM8 podría estar involucrado en la difusión de CTC; aunque la posibilidad de que esto se relacione con la gran diferencia en la carga tumoral no puede excluirse en ese momento. Esta pregunta se aborda en más ejemplos en este documento.

Para probar si la reducción de la expresión de ADAM8 afecta a la metástasis, se examinaron cerebros aislados de seis animales por grupo bajo un microscopio de disección fluorescente para detectar la presencia de metástasis positivas para GFP. Se observó que todos los animales inyectados con células Controlhc eran positivos para metástasis cerebrales (Figura 4K). En cambio, solo se detectó un ratón con una metástasis muy pequeña en el grupo ADAM8hc (Figura 4K). Por lo tanto, se observó que la reducción de la expresión de ^a DA^m 8 había afectado profundamente a la capacidad de los tumores mamarios derivados de células MDA-MB-231 para crecer y diseminarse en un modelo de xenoinjerto ortotópico, lo cual es consistente con la alta expresión de ADAM8 detectada en metástasis distantes de pacientes con cáncer de mama (Figuras 1D y 1F).

Ejemplo 21. La reducción de la expresión de ADAM8 induce latencia tumoral angiogénica

Cuando los tumores sólidos alcanzan unos pocos milímetros de diámetro, los nutrientes y el oxígeno se vuelven insuficientes y se induce el estrés hipóxico (Majmundar et al. Mol Cell 40:294-309, 2010). Esto conduce a la muerte celular por necrosis, así como a la liberación de factores que promueven el reclutamiento de células endoteliales y la angiogénesis que son necesarios para apoyar el crecimiento continuo del tumor (Bergers et al. Nat Rev Cancer 3:401-410, 2003; Naumov et al. Cell Cycle 5:1779-1787, 2006). Se ha demostrado que los niveles de ADAM8 se inducen bajo hipoxia en células de cáncer de páncreas (Val kovskaya et al. J Cell Mol Med 11:1162-1174, 2007). Por lo tanto, se midieron los efectos del crecimiento bajo oxígeno reducido sobre la expresión de ADAM8 en células de cáncer de mama MDA-MB-231 y Hs578T.

Se observó que la incubación de estas células en condiciones de 1 % de oxígeno condujo a aumentos sustanciales en los niveles de proteína ADAM8 (Figura 5A, fotografía de la izquierda). Los niveles de la forma proforma y activa de ADAM8 aumentaron, y la forma proforma ahora co-migró con la banda observada en las células MDA-MB-231. Similar a la línea celular parental MDA-MB-231, la expresión de ADAM8 aumentó en células Ctrlhc-3 en condiciones hipóxicas; mientras que no se observó inducción de ADAM8 bajo hipoxia en el clon A8hc-20 (Figura 5A, fotografía derecha). Para probar si otras líneas celulares de cáncer de mama se comportan de manera similar a MDA-MB-231, se cultivaron células Hs578T en condiciones de adherencia (2D) o en suspensión en placas de adherencia ultrabaja (3D) durante 48 h. Las células MDA-MB-231 se cultivaron únicamente en condiciones adherentes. Los extractos de células completas (CEC) se analizaron mediante análisis por transferencia de Western para ADAM8 (anticuerpo LSBio) y para p-actina. (Figura 5B) Como se ve con las células MDA-MB-231, la proforma de ADAM8 se induce en células Hs578T cultivadas en cultivos 3D (Figura 5B).

Para determinar si las células Hs578T se comportaron de manera similar en condiciones hipóxicas en comparación con las líneas celulares MDA-MB-231, MDA-MB-231, Hs578T, las células Ctrlhc-3 y A8hc-20 se incubaron durante 8 h en condiciones hipóxicas y los extractos nucleares se sometieron a análisis de transferencia de Western para HIF-1a y Lamin B. Todos los carriles eran del mismo gel, pero se utilizaron dos tiempos de exposición diferentes para las células Hs578T (5 minutos) y las líneas derivadas de MDA-MB-231 (30 minutos), como indica la línea vertical. Por lo tanto, HIF-1a se induce en varias líneas celulares de cáncer de mama bajo hipoxia (Figura 5C).

Se detectó una tinción de ADAM8 constantemente fuerte alrededor de las áreas necróticas en los tumores Ctrlhc-3, y estuvo ausente en los tumores derivados de las células A8hc-20 (Figura 5D), aunque la extensión de la necrosis fue similar en ambas poblaciones de tumores (Figura 5D).

Determinar si los niveles de expresión de ARNm de VEGF-A están alterados por la reducción de la expresión de ADAM8. El ARN aislado de células MDA-MB-231 Ctrlhc-3 o A8hc-20 se evaluó para determinar la expresión de VEGF-A mediante transcripción inversa (RT)-PCR. Las muestras se normalizaron en función de los niveles de expresión de GAPDH. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de VEGF-A no cambian en las células de reducción de la expresión de ADAM8 estables (Figura 5E).

Para evaluar la angiogénesis se realizó la tinción IHC de los tumores para el marcador de células endoteliales CD31. Se midió una disminución significativa en el número de vasos peritumorales en tumores A8hc-20 frente a Ctrlhc-3 (Figura 5F). De acuerdo con el modelo de este documento de que los tumores con niveles más altos de ADAM8 se caracterizan por un aumento de la angiogénesis, se encontró una correlación positiva entre la expresión de ARNm de ADAM8 y CD31 (PECAM1) en muestras de tumores de pacientes con cáncer de mama de tipo basal (Figura 5G). En conjunto, estos hallazgos indican que en ausencia de ADAM8, los tumores derivados de MDA-MB-231 experimentaron latencia angiogénica y, por lo tanto, no pudieron crecer más allá de un tamaño palpable.

Ejemplo 22. ADAM8 es necesario para la liberación de factores proangiogénicos

Para determinar el mecanismo por el cual ADAM8 induce la angiogénesis, se evaluó la capacidad de los medios acondicionados de los clones de MDA-MB-231 para estimular la formación de estructuras similares a vasos (formación de tubos) por las células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) en Matrigel (Figuras 5H-5I). Las células Ctrlhc liberaron factores que aumentaron sustancialmente el número de tubos formados por CEVUH en comparación con los medios de control. En cambio, la formación de tubos se redujo severamente en presencia de medio acondicionado de clones A8hc (Figuras 5H-5I), lo que indica que ADAM8 promueve la angiogénesis en parte a través de un factor soluble.

Para identificar los factores proangiogénicos liberados por ADAM8, los medios acondicionados de los dos clones de células Controlhc y dos ADAM8hc MDA-MB-231 se analizaron utilizando una matriz de anticuerpos de angiogénesis humana, que puede detectar la expresión de 55 proteínas relacionadas con la angiogénesis. Se cuantificaron los niveles de expresión de las proteínas detectadas y en la Figura 5J se presentan aquellas que estaban significativamente reguladas a la baja en más de un promedio de dos veces en los clones de ADAM8hc. La reducción de la expresión de ADAM8 condujo a disminuciones sustanciales en cinco importantes mediadores de la angiogénesis (VEGF-A, angiogenina, factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF-AA, Endotelina-1 y factor de crecimiento plaquetario P1GF), con el mayor cambio observado en VEGF-A. Para validar estos resultados, la expresión de VEGF-A, un inductor importante de la angiogénesis y la formación de tubos por las células endoteliales (Lohela et al. Curr Opin Cell Biol 21:154-165, 2009; Mahoma et al. Br J Cancer 96:1092-1100, 2007), se examinó mediante transferencia de Western. Se observó un nivel sustancialmente disminuido de VEGF-A en el medio de A8hc en comparación con las células Ctrlhc (Figura 5K). La cuantificación a partir de este y dos ejemplos independientes adicionales indicó que las células MDA-M^b -231 liberaron entre un 60-70 % menos de VEGF-A (P = 0,002) en el medio en las células en las que se ha reducido la expresión de ADAM8. Notablemente, la liberación de VEGF-A de las células A8hc podría restaurarse mediante la expresión ectópica de ADAM8 de longitud completa pero no mediante la forma remanente (Figura 5L), lo que indica que se requería el dominio de metaloproteinasa. Por lo tanto, en ausencia de ADAM8, se liberan cantidades más pequeñas de VEGF-A y otros factores proangiogénicos, que puede explicar la reducción de la angiogénesis observada in vivo.

Para determinar si la forma remanente de ADAM8 puede inducir VEGF-A, se transfectaron clones Ctrlhc-3 o A8hc-20 derivados de MDA-MB-231 con los vectores que expresan la forma remanente de ADAM8 (Remanente) o con un ADN de vector vacío (EV) (Figura 5M). Las células se incubaron con el vector indicado durante 24 h. Luego, el medio se reemplazó por medio sin suero y se incubó durante 16 h. Se recogieron los sobrenadantes y las células. Las células se lisaron y las CEC se evaluaron mediante transferencia de Western para determinar la expresión de ADAM8 (Figura 5M). Los datos aquí indicados indican que la forma remanente de ADAM8 no pudo inducir la liberación de VEGF-A de las células A8hc-20, en contraste con el ADAM8 de longitud completa.

Para probar la expresión ectópica de ADAM8 de longitud completa y la forma remanente en células estables con reducción de la expresión de ADAM8, se transfectaron clones Ctrlhc-3 o A8hc-20 derivados de MDA-MB-231 con los vectores indicados que expresan ADAM8, su forma remanente (Remanente) o ADN de vector vacío (EV) durante 24 h. Luego, el medio se reemplazó por medio sin suero y se incubó durante 16 h. Se recogieron los sobrenadantes y las células. Las células se lisaron y las CEC se evaluaron mediante análisis por transferencia de Western para determinar la expresión de ADAM8. Se midió el VEGF-A liberado en el medio (Figura 5L). Los datos indicaron que la forma remanente no pudo inducir la liberación de VEGF-A de las células A8hc-20, en contraste con el ADAM8 de longitud completa.

Ejemplo 23. ADAM8 está involucrado en la adhesión y activación de células endoteliales de la integrina B1

Las CTC se pueden medir antes de la formación de un tumor primario detectable (Eyles et al. J Clin Invest 120:2030-2039, 2010). Por lo tanto, se investigó el papel de ADAM8 en la aparición de estas CTC tempranas utilizando un segundo grupo de ratones (n = cuatro/grupo; Figura 6A). Se extrajo sangre el día siete, cuando los tumores eran apenas detectables, y en los días 14 y 21, cuando se observó y midió inicialmente una diferencia de tamaño. Las CTC se detectaron tan pronto como siete días después de la implantación celular. El número de CTC fue significativamente menor en los ratones inyectados con células A8hc-20 frente a Ctrlhc-3 durante el transcurso del tiempo (Figura 6A). Esto sugiere un posible riesgo menor de desarrollar metástasis a órganos distantes cuando se reduce la expresión de ADAM8, que es independiente del tamaño del tumor.

La unión de las células tumorales primarias y luego las CTC a una capa endotelial seguida de la transmigración a través de la pared de los vasos sanguíneos (intravasación y extravasación, respectivamente) son etapas críticas en la metástasis (Scott et al. Nat Rev Cancer 12:445-446, 2012; Steeg Nat Med 12:895-904, 2006). Por lo tanto, se determinaron los efectos de ADAM8 sobre la unión de células MDA-MB-231 a CEVUH. Se añadieron células Controlhc y ADAM8hc a placas de cultivo de tejidos en presencia o ausencia de una monocapa de CEVUH. Se observó que los dos clones Controlhc se adherían mucho más eficazmente a una monocapa confluente de CEVUH que los dos clones ADAM8hc, y la adhesión al plástico no se vio afectada por la expresión de ADAM8 (Figura 6B). Además, en un ensayo de migración transendotelial de células, las células ADAM8hc fueron mucho menos eficaces para migrar a través de una monocapa confluente de CEVUH que las células Controlhc (Figura 6C). Por lo tanto, ADAM8 promueve la adhesión de las células tumorales y la migración a través de una capa de células endoteliales, como se encuentra en la pared de un vaso.

El clon Ctrlhc-3 derivado de MDA-MB-231 y la población total de MDA-MB-231 se transfectaron con ARNip de control (Ctrlip) o dos ARNip de ADAM8 específicos (A8ip) durante 72 h. La adhesión de las células cancerosas a (Figura 6D) y la migración transendotelial a través de (Figura 6E) CEVUH se evaluaron como en la Figura 6B y 6C, respectivamente. *P < 0,05, prueba de la t de Student. Los resultados muestran que la reducción en la expresión de ADAM8 mediada por ARNip en células MDA-MB-231 reduce la capacidad de adherirse y transmigrar a través de CEVUH.

Las CEC de CEVUH y células MDA-MB-231, como control positivo para la expresión de ADAM8, se sometieron a análisis por transferencia de Western para ADAM8 (anticuerpo LSBio) y tubulina (Figura 6F). ADAM8 no se detectó en CEVUH, lo que indica que ADAM8 participa en el establecimiento del contacto célula-célula entre las células del tumor de mama y las células endoteliales. La observación de que las CEVUH no expresan ADAM8 en condiciones normales de cultivo excluye la posibilidad de que ADAM8 forme homodímeros en trans, es decir, entre las células tumorales y endoteliales. Se ha demostrado que la integrina betal participa en la adhesión de las células MDA-MB-231 a una monocapa de células endoteliales (Price et al. Br J Cancer 74:1762-1766, 1996).

Se observó que la activación de la integrina p1 en las células Ctrlhc-3 era necesaria para la adhesión a las CEVUH, a juzgar por la reducción de la unión a las células endoteliales in vitro tras la adición de un anticuerpo antagonista p1-integrina (Figura 6G). Se observó que un anticuerpo monoclonal dirigido contra los dominios metaloproteinasa y desintegrina de ADAM8 (Mab1031) inhibía la adhesión de las células Ctrlhc-3 a las CEVUH, esencialmente en el mismo grado que el anticuerpo antagonista de la integrina p1 (Figura 6H) y también para haber impedido la capacidad de estas células para transmigrar a través de una monocapa de células endoteliales (Figura 6I). Además, otro anticuerpo ectodominio monoclonal (Mab10311) que se dirige a los dominios extracelulares ricos en cisteína y similares a EGF de ADAM8, tuvo efectos similares (Figuras 6H y 6I). De forma importante, utilizando un anticuerpo específico para la forma activada de la integrina p1 (12G10), se observó una fuerte activación de la integrina p1 en los tumores mamarios derivados de las células Ctrlhc-3, especialmente en la zona peritumoral, pero estuvo ausente en los tumores A8hc-20 y en las glándulas mamarias contralaterales de los ratones Ctrlhc (Figura 6J), de acuerdo con el modelo propuesto en el presente documento de que ADAM8 promueve la adhesión de las células tumorales al endotelio y la diseminación mediante la activación de la integrina p1 in vivo.

Ejemplo 24. El anticuerpo del ectodominio ADAM8 MP/DI reduce el crecimiento y la diseminación del tumor

Para validar ADAM8 como diana terapéutica para CMTN, se seleccionó el anticuerpo Mab1031 ADAM8 para su uso en un modelo ortotópico.

Los ratones se trataron con 0,5 mg/kg de anticuerpo Mab1031 (n = 9) o con un control IgG2B de isotipo coincidente (n = 8) mediante inyección ip dos veces por semana desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3. Se observó que el tratamiento con anti-ADAM8 dio como resultado una disminución significativa de la carga del tumor primario en aproximadamente un 50 % (Figura 7A) y del peso del tumor en aproximadamente un 36 % (Figura 7B) después de tres semanas de tratamiento. En animales tratados con anti-ADAM8, también se observó una reducción sustancial en el tamaño y el número de metástasis cerebrales por ratón, y en la frecuencia de metástasis cerebrales (Figura 7C). La angiogénesis que rodea a los tumores (Figura 7D) y los niveles de VEGF-A en los tumores (Figura 7E) se redujeron de manera similar mediante el tratamiento con el anticuerpo ADAM8. El sustrato de metaloproteinasa ADAM8 CD23 (Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281,2009) se utilizó en un análisis in vitro.

El anticuerpo anti-ADAM8 MP/DI inhibe la actividad metaloproteinasa de ADAM8. Las células HEK293 se cotransfectaron con vectores que expresan CD23, que es un sustrato bien establecido de la actividad de la proteasa ADAM8, y ADAM8 o su forma remanente o ADN de EV. Seis horas después, el medio se reemplazó con medio sin suero. Después de 16 h, se recogieron los sobrenadantes y se evaluaron los volúmenes correspondientes a números de células iguales para CD23 escindido (29 kDa) usando análisis por transferencia de Western. Se recolectaron las células y se evaluó la expresión de ADAM8 y tubulina en las CEC. Todos los carriles eran del mismo gel, pero cortados para realinear como lo indica la línea vertical (Figura 7F, izquierda). En presencia de ADAM8 de longitud completa pero no en su forma remanente que carece del dominio metaloproteinasa, el CD23 se escinde con la liberación de un fragmento de diagnóstico soluble de 29 kDa (Figura 7F, derecha). Se cotransfectaron células HEK293 con vectores que expresan CD23 y ADAM8. Seis horas después, el medio se reemplazó con medio sin suero en presencia de 10 |jg/ml de anticuerpo anti-ADAM8 (Mab1031) o de control de isotipo IgG2B (Mab004). Después de 16 h, los presentes inventores midieron CD23 de 29 kDa escindido en sobrenadantes y expresión de ADAM8 en CEC, tal como se describió anteriormente. En presencia del anticuerpo anti-ADAM8 MP/DI, la escisión de CD23 por ADAM8 se redujo sustancialmente. (Figura 7F, derecha) En presencia de un anticuerpo ADAM8, el análisis in vitro mostró una reducción sustancial de la actividad que indica la inhibición de la metaloproteinasa por el anticuerpo (Figura 7F).

Ejemplo 25. El anticuerpo del ectodominio ADAM8 MP/DI reduce la diseminación de tumores preexistentes en una configuración neoadyuvante

Para probar el uso de este anticuerpo ADAM8 en un entorno clínicamente más relevante, se utilizó un modelo de extirpación tumoral (Figura 7G). Se probó la capacidad para tratar tumores preexistentes con el anticuerpo de ADAM8.

Doce días después de que las células MDA-MB-231 Ctrlhc-3 fueran implantadas en la AGM de ratones, se observaron tumores palpables y se inició el tratamiento con 1,5 mg/kg de anticuerpo anti-ADAM8 MP/DI (Mab1031) o IgG2B de control de isotipo (Mab004). Se administraron más dosis de anticuerpo el día 15 y el día 17, en cuyo punto los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 0,15 cm3 y se realizó la extirpación del tumor. El tratamiento con anticuerpos se continuó dos veces por semana durante un período de 5 semanas, y luego se examinó la metástasis de órganos usando microscopía fluorescente (Figura 7H).

En el grupo de control tratado con isotipo, se observaron metástasis en el cerebro y los pulmones en 8/8 y 7/8 ratones, respectivamente. En el grupo tratado con anti-ADAM8, solo 2/9 y 1/9 ratones mostraron metástasis en el cerebro y los pulmones. Por lo tanto, el tratamiento con un anticuerpo anti-ADAM8 dio como resultado una reducción profunda en la frecuencia de metástasis tanto en el cerebro como en los pulmones en comparación con la frecuencia de metástasis en el grupo tratado con anticuerpo de control de isotipo.

Ejemplo 26. La reducción de la expresión de ADAM8 reduce la capacidad de las CMTN para colonizar órganos distantes

Para probar el papel de ADAM8 en la capacidad de las células de cáncer de mama para colonizar sitios típicos de metástasis distantes, las células Ctrlhc-3 y A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231, que expresan establemente luciferasa, se inyectaron en el ventrículo izquierdo de ratones hembra NOD/SCID (n = 4/grupo). La carga tumoral total se controló semanalmente mediante la medición de la actividad de luciferasa usando el sistema Xenogen Biophotonic Imaging. Las metástasis de órganos y huesos se evaluó utilizando este método en el momento del sacrificio.

La inyección cardíaca de células A8hc-20 derivadas de MDA-MB-231 provocó una carga tumoral total significativamente menor después de 2 o 3 semanas en comparación con la inyección de células Ctrlhc-3 (Figuras 8A y 8B). Al final del ejemplo, se descubrió constantemente que las células Ctrlhc-3 colonizaban numerosos órganos y huesos, en contraste con las células de control A8hc-20 (Figura 8C). Por lo tanto, se observó que ADAM8 era necesario para la colonización de sitios de metástasis distantes por células CMTN.

Ejemplo 27. El anticuerpo del ectodominio ADAM8 CRD/ELD reduce la diseminación del tumor

Dado que el tratamiento de las células de cáncer de mama con anticuerpos Mab10311 (CRD/ELD) y Mab1031 (MP/DI) redujo la cantidad de migración de células transendoteliales a través de una monocapa de CEVUH aproximadamente en la misma medida (Figuras 6I y 12A), el direccionamiento de la región CRD/ELD de ADAM8 se probó para la inhibición del crecimiento tumoral y la diseminación de CMTN en un modelo ortotópico. Se compararon el anticuerpo Mab10311 (CRD/ELD) y la capacidad del anticuerpo Mab1031 (MP/DI) para inhibir la actividad MP de ADAM8. Se observó que el Mab10311 inhibe la actividad de MP en aproximadamente un 40 %, que fue en menor medida que Mab1031, 70 % (Figura 12B). A continuación, se probó el anticuerpo Mab10311 ADAM8 en el modelo ortotópico. Los ratones se trataron con 1,5 mg/kg de anticuerpo Mab10311 (n = 7) o una IgG1 de coincidente de control de isotipo (n = 7) mediante inyección i.p. dos veces por semana desde el día de la implantación de las células Ctrlhc-3.

Después de tres semanas, no se observó ningún cambio significativo en la carga del tumor primario después del tratamiento anti-ADAM8 Mab10311 (Figura 12C, gráfico de barras de la izquierda). Sin embargo, se observó una reducción sorprendente en el tamaño y el número de metástasis cerebrales por ratón y en la frecuencia general de metástasis en animales tratados con anticuerpo anti-ADAM8 Mab10311 (Figura 12C, gráfico de la derecha). Estos resultados indican que la inhibición de la actividad DI de ADAM8 mediante la interacción de un anticuerpo con regiones CRD/ELD fue suficiente para reducir profundamente la diseminación tumoral de CMTN. Estos datos indican además que la inhibición de la actividad de MP, que se requiere para la liberación de factores proangiogénicos, es necesaria para prevenir el crecimiento tumoral. Por lo tanto, los datos en este documento indican que se requiere la inhibición de las actividades de los dominios MP y DI de ADAM8 para prevenir tanto el crecimiento como la diseminación del tumor.

En su conjunto, los datos de este documento validan ADAM8 como una diana terapéutica para CMTN. ADAM8, que se expresa abundantemente en metástasis y tumores de mama agresivos de pacientes, se demostró que es esencial para el crecimiento y la diseminación tumoral en modelos de ratón ortotópicos utilizando estrategias de eliminación y anticuerpos. Notablemente, el tratamiento de tumores preexistentes con un anticuerpo dirigido a los dominios MP/DI de ADAM8 redujo profundamente la capacidad del tumor para hacer metástasis en un modelo de extirpación. Se identificaron dos funciones novedosas esenciales para ADAM8 en la progresión tumoral (Figura 9). ADAM8 facilita la liberación de factores proangiogénicos, incluyendo VEGF-A, en el microambiente del tumor, que conduce a la neovascularización y al crecimiento continuo del tumor. ADAM8 también activa la integrina p1 en las células tumorales, lo que permite la unión de las células al endotelio vascular y la entrada a la circulación sanguínea. Un mayor número de CTC aumenta el riesgo de desarrollar metástasis en órganos distantes como el cerebro y los pulmones. LOS CMTN son muy agresivos y tienen más probabilidades de diseminarse en comparación con otros tumores de mama, y actualmente no hay opciones de tratamiento dirigidas disponibles. Dada la importancia de ADAM8 en el crecimiento y diseminación del CMTn , y su localización ventajosa en la superficie de la célula tumoral y la falta de un fenotipo de ratones con inactivación para ADAM8. Los datos del presente documento identifican a ADAM8 como una diana novedosa y prometedora a la que puede administrarse fármacos para el tratamiento de cánceres de mama.

La unión de las integrinas a las moléculas de adhesión a la superficie celular y a las proteínas de la matriz extracelular gobierna la adhesión y la forma celular a través de la transducción de señales intracelulares (Avraamides et al. Nat Rev Cancer 8:604-617, 2008; Desgrosellier et al. Nat Rev Cancer 10:9-22, 2010). Se descubrió que la integrina beta mediaba la adhesión del cáncer de mama y otras células tumorales a las células endoteliales inactivas (Price et al. Br J Cancer 74:1762-1766, 1996). Varias proteínas ADAM, que contienen motivos de unión a integrina similares a RGD en el dominio desintegrina, constituyen ligandos para las integrinas (Bridges & Bowditch, Curr Pharm Des 11:837-847, 2005). Notablemente, se observó que un anticuerpo dirigido a los dominios MP/DI de ADAM8 había reducido en gran medida la capacidad de las células CMTN para unirse a las células endoteliales. in vitro y diseminar en ratones. Además, otro anticuerpo dirigido contra los dominios ADAM8 CRD/ELD fue igualmente eficaz in vitro, lo que sugiere un obstáculo alostérico o una estructura ADAM8 alterada también puede desempeñar un papel. Este anticuerpo inhibió constantemente la diseminación in vivo.

Al principio del proceso de tumorigénesis, los tumores sólidos dejan de aumentar en masa (latencia del tumor) a menos que puedan superar el estrés hipóxico estimulando la angiogénesis, que proporciona oxígeno y nutrientes esenciales para un mayor crecimiento tumoral (Bergers et al. Nat Rev Cancer 3:401-410, 2003; Majmundar et al. Mol Cell 40:294-309, 2010; Naumov et al. Cell Cycle 5:1779-1787, 2006). En las células CMTN, se observó que la hipoxia había inducido la expresión de ADAM8 proforma y forma procesada activa. Los tumores mamarios de células Ctrlhc mostraron un aumento sustancial de la proteína ADAM8 alrededor de las áreas necróticas, pero no en tumores de animales A8hc. Usando el análisis Transfac, se identificaron varios elementos de respuesta de hipoxia afines en el promotor de ADAM8. La extensión de la inducción de HIF-1a y la cantidad de necrosis en los tumores derivados de Ctrlhc en comparación con las células A8hc fue similar (Figura 5C), y la reducción de la expresión de ADAM8 no altera la respuesta inicial a la hipoxia. También se observaron niveles altos de ADAM8 en las pacientes con CMTN, especialmente en las metástasis al cerebro, coherente con la inducción relacionada con el estrés hipóxico. En conjunto, estos hallazgos son consistentes con el modelo previsto en el presente documento de que se requiere la inducción de ADAM8 para que los tumores de mama superen el estrés hipóxico.

La activación del receptor de tirosina quinasa VEGFR2 por VEGF-A, que promueve la proliferación de células endoteliales, los brotes, la migración, así como la permeabilidad vascular, es una vía importante que induce la angiogénesis (Lohela et al. Curr Opin Cell Biol 21:154-165, 2009). La alta expresión de VEGF-A se ha asociado con una mayor densidad de microvasos, metástasis, y una supervivencia global más corta en pacientes con cáncer de mama invasivo primario (Mohammed et al. Br J Cancer 96:1092-1100, 2007). La actividad de VEGF-A está regulada en gran medida en el espacio extracelular, donde los reservorios de VEGF-A unidos a la superficie celular o la matriz extracelular pueden hacerse biodisponibles a través de la escisión proteolítica por varias enzimas, incluyendo metaloproteinasas MMP-3, -7 y -9. (Hawinkels et al. Eur J Cancer 44:1904-1913, 2008; Lee et al. J Invest Dermatol 130:763-773, 2005). Los CMTN con niveles más altos de VEGF-A intratumoral en comparación con los no CMTN tienen un tiempo de recaída más corto (Linderholm et al. Ann Oncol 20:1639-1646, 2009).

La reducción de la expresión de ADAM8 en células MDA-MB-231 resultó en niveles reducidos de VEGF-A en medios acondicionados, pero no pareció afectar a los niveles de ARNm de VEGF-A (Figura 5E). Consecuentemente, se observó en el presente documento que tanto el tratamiento con el anticuerpo de ADAM8 como la reducción de la expresión tenían una angiogénesis tumoral reducida. Como se identificó una correlación positiva entre los niveles de ARNm de ADAM8 y CD31 en tumores de tipo basal, los niveles elevados de ADAM8 parecen estar asociados con una mayor vascularización del tumor en estos pacientes. Los datos del presente documento muestran que la actividad metaloproteinasa de ADAM8 juega un papel esencial en el procesamiento o liberación de VEGF-A y potencialmente otros factores proangiogénicos.

Funciones biológicas de las proteínas ADAM en la malignidad identificadas en Duffy et al. (Duffy et al. Clin Proteomics, 8:9, 2011; Maretzky et al. Nat Commun 2:229, 2011; Duffy et al. Clin Cancer Res 15:1140-1144, 2009). Las variantes del dominio citoplásmico de ADAM15 se han implicado en el carcinoma de mama (Zhong et al. Mol Cancer Res 6:383-394, 2008). Una isoforma secretada por ADAM12 promueve la metástasis del tumor de mama in vivo (Roy et al. J Biol Chem 286:20758-20768, 2011). ADAM10 está regulado positivamente en la metástasis de melanoma en comparación con el melanoma primario (Lee et al. J Invest Dermatol 130:763-773, 2010). La expresión de ADAM8 se correlacionó previamente con el estadio tumoral o con un pronóstico desfavorable para pacientes con cánceres esofágico-gástrico, de pulmón, páncreas o de cerebro, y con la invasividad de las células tumorales en cultivo (Baren et al. Br J Cancer 107:143-149, 2012; Koller et al. Curr Pharm Des 15:2272-2281, 2009), aunque se exploró poco sobre su mecanismo de acción. Se informó de que no hay evidencia de la amplificación de genes ADAM8 en estos cánceres. Se encontró

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de unión al ectodominio ADAM8 o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer de mama o metástasis asociada al cáncer de mama caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la SEQ ID No 9 y que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la actividad del dominio de metaloproteinasa y el dominio de desintegrina de ADAM8.

2. El anticuerpo de ADAM8 o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1, en el que el cáncer de mama es un carcinoma ductal in situ o triple negativo.

3. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de mama o metástasis asociada al cáncer de mama que comprende:

una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores o el fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en donde la composición comprende una pluralidad de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben la actividad del dominio metaloproteinasa y el dominio desintegrina de ADAM8.