ES2326978T3 - Procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un antagonista de zvegf3 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de carcinoma hepatocelular en un mamífero, por ejemplo, en la que debe medirse la respuesta tumoral como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en la duración de la progresión, y en la que el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3 que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, estando constituida cada una de dichas cadenas polipeptídicas por una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por: restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº:
Description
Procedimiento de tratamiento del carcinoma
hepatocelular.
El carcinoma hepatocelular, o hepatoma, es el
tipo más frecuente de cáncer de hígado primario. Es particularmente
común (y una causa importante de muerte) en regiones de África y del
Sudeste de Asia en las que la hepatitis B crónica es endémica.
La etiología exacta del carcinoma hepatocelular
(CHC) es desconocida. Los tumores están compuestos por hepatocitos
malignos. Existe una fuerte correlación con la incidencia de la
hepatitis B, y la incorporación del ADN vírico en el genoma del
hospedador se cree que conduce a la transformación maligna. La
infección por hepatitis C crónica está también ligada al CHC,
aunque el virus de la hepatitis C (virus de ARN) no se incorpora en
el genoma del hospedador. La fibrogénesis (cirrosis) en los
pacientes de hepatitis C puede desempeñar una función en la
formación del tumor. El CHC es asimismo una complicación principal
de la hemocromatosis. Otros factores de riesgo para el CHC incluyen
las toxinas medioambientales (por ejemplo, aflatoxinas),
alcoholismo, antecedentes familiares y el ser
macho.
macho.
Los signos y síntomas de CHC incluyen dolor en
el abdomen superior derecho, presencia de masa de tejido o abdomen
hinchado, pérdida de peso, pérdida de apetito y sensaciones de
saciedad, debilidad o cansancio, náuseas y vómitos, ictericia y
fiebre. La \alpha-fetoproteína del suero y la
des-g-carboxi-protrombina
son marcadores para diagnóstico. Los procedimientos adicionales de
diagnóstico incluyen ultrasonidos, exploración por CT, diagnóstico
por imagen de resonancia magnética, arteriografía hepática y
biopsia.
Los tratamientos actuales para el CHC han
conseguido solo un éxito limitado. La cirugía es el más
satisfactorio, y puede producir la supervivencia prolongada de los
pacientes con tumores pequeños y localizados. El tratamiento del
CHC más avanzado incluye la quimioterapia y/ o la terapia de
radiación. El trasplante de hígado se ha utilizado también con
algún éxito a largo plazo. Sin embargo, el éxito de estos
tratamientos depende en gran medida del diagnóstico precoz. Otros
tratamientos dados a conocer para el CHC incluyen la ablación por
radiofrecuencia (Livraghi et al., Radiology
210:655-61, 1999; Curley et al., Ann. Surg.
230:1-8, 1999); la terapia con láser o microondas;
la inyección percutánea de etanol (Livraghi et al. ibid.;
Tanaka et al., Cancer 82:78-85,
1998); la criocirugía (Zhou y Tang, Semin. Surg. Oncol.
14:171-174, 1998); la infusión arterial hepática,
por ejemplo, con ^{125}I-lipiodol (Lau et al.,
Lancet 353(9155); 797-801, 1999),
5-fluorodesoxiuridina o diclorometotrexato
(Ensminger et al., Cancer Treat. Rep.
65:393-400, 1981); la quimioembolizacion
utilizando, por ejemplo, biscloroetilnitrosourea (Dakhil et al.,
Cancer 50:631-635, 1982) o aceite yodado e
hidrocloruro de doxorrubicina (Choi et al., Radiology
182:709-713, 1992); inmunoterapia (Takayama, et
al., Lancet 356(9232):802-807, 2000); y
una combinación de la terapia con cisplatino con radiación (Epstein
et al., Cancer 67:896-900, 1991).
La presente invención proporciona materiales y
procedimientos para tratar el carcinoma hepatocelular en un
mamífero.
En un aspecto del presente descubrimiento, se
proporciona un procedimiento de tratamiento del carcinoma
hepatocelular en un mamífero que comprende administrar a un
mamífero con carcinoma hepatocelular una composición que comprende
un antagonista de zvegf3 en combinación con un vehículo de
administración farmacéuticamente aceptable, en el que el
antagonista de zvegf3 se selecciona dentro del grupo constituido por
anticuerpos anti-zvegf3, polipéptidos de la
variante zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo y
polinucleótidos inhibidores, en una cantidad suficiente para
producir una respuesta tumoral en el mamífero. En una forma de
realización, se mide una respuesta tumoral como respuesta completa,
respuesta parcial o reducción en la duración de la evolución. En
otra forma de realización, el antagonista de zvegf3 se selecciona
dentro del grupo constituido por anticuerpos
anti-zvegf3 y polinucleótidos inhibidores. En una
forma de realización adicional, el antagonista es un anticuerpo
anti-zvegf3. En una forma de realización
relacionada, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonado, tal como
un anticuerpo monoclonal de IgG. En otras formas de realización de
la invención, el antagonista de zvegf3 es un anticuerpo que se une
específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas
polipeptídicas, en el que cada una de las cadenas polipeptídicas
está constituida por una secuencia de restos de aminoácidos
seleccionados de entre el grupo constituido por los restos 230 a 345
de la SEC. ID. nº: 2, los restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2,
los restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 233 a 345 de
la SEC. ID. nº: 2, los restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los
restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 236 a 345 de la
SEC. ID. nº: 2, los restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los
restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 239 a 345 de la
SEC. ID. nº: 2 y los restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2. En una
forma de realización adicional, el antagonista de zvegf3 se
administra por infusión intravenosa.
En un segundo aspecto del descubrimiento, se
proporciona un procedimiento de reducción de la proliferación de
células cancerosas que comprende administrar a un mamífero con
carcinoma hepatocelular una cantidad de una composición que
comprende un antagonista de zvegf3 en combinación con un vehículo de
administración farmacéuticamente aceptable, en el que el
antagonista de zvegf3 se selecciona de entre el grupo constituido
por anticuerpos anti-zvegf3, polipéptidos de la
variante zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo y
polinucleótidos inhibidores, en una cantidad suficiente para
reducir la proliferación de células cancerosas en el carcinoma
hepatocelular. En una forma de realización, el antagonista de zvegf3
se selecciona de entre el grupo constituido por anticuerpos
anti-zvegf3 y polinucleótidos inhibidores. En una
forma de realización adicional, el antagonista es un anticuerpo
anti-zvegf3. En una forma de realización
relacionada, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, tal como un
anticuerpo monoclonal de IgG. En otras formas de realización de la
invención, el antagonista de zvegf3 es un anticuerpo que se une
específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas
polipeptídicas, en la que cada una de las cadenas polipeptídicas
está constituida por una secuencia de restos de aminoácidos
seleccionados de entre el grupo constituido por los restos 230 a 345
de la SEC. ID. nº: 2, los restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2,
los restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 233 a 345 de
la SEC. ID. nº: 2, los restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los
restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 236 a 345 de la
SEC. ID. nº: 2, los restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los
restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 239 a 345 de la
SEC. ID. nº: 2 y los restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2. En una
forma de realización adicional, el antagonista de zvegf3 se
administra por infusión intravenosa.
En un tercer aspecto del descubrimiento se
proporciona la utilización de un antagonista de zvegf3 en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma
hepatocelular en un mamífero, en la que el antagonista de zvegf3 se
selecciona de entre del grupo constituido por anticuerpos
anti-zvegf3, polipéptidos de la variante zvegf3 que
se unen al receptor mitogénicamente inactivo y por nucleótidos
inhibidores. En una forma de realización el medicamento se formula
para infusión intravenosa.
Estos y otros aspectos de la invención se
pondrán de manifiseto haciendo referencia a la descripción detallada
siguiente de la invención y a los dibujos adjuntos, en los que:
Las Figs. 1A-1G son un perfil de
la capacidad de hidrofilia de Hopp/Woods de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2. El perfil se basa en un
intervalo de seis restos móviles. Se ignoraron los restos G, S y T
enterrados y los restos H, Y y W expuestos. Estos restos están
indicados en la figura por letras de la casilla inferior.
La Fig. 2 es una alineación de la secuencias de
aminoácidos humana (SEC. ID. nº: 2) y de ratón (SEC. ID. nº: 4).
El término "antagonista" se utiliza en la
presente memoria para indicar un compuesto que reduce una actividad
biológica de otro compuesto. En la presente invención, un
"antagonista de zvegf3" es un compuesto que reduce la
actividad biológica mediada por el receptor (por ejemplo actividad
mitógena) de zvegf3 en una célula diana. Los antagonistas pueden
ejercer su acción compitiendo con zvegf3 por los puntos de fijación
en un receptor de la superficie celular, uniéndose a zvegf3 y
previniéndolo de la unión a un receptor de la superficie celular,
interfiriendo de otra manera con la función del receptor, reduciendo
la producción de zvegf3 o por otros medios.
Las expresiones "cáncer" o "célula
cancerosa" se utiliza en la presente memoria para indicar un
tejido o célula encontrados en un neoplasma que posee
características que le diferencian del tejido normal o de las
células del tejido. Dichas características incluyen, pero no se
limitan al grado de anaplasia, irregularidad en la forma,
independencia del perfil celular, tamaño nuclear, alteraciones en la
estructura del núcleo o citoplasma, otras alteraciones fenotípicas,
presencia de proteínas celulares indicadoras de un estado canceroso
o precanceroso, aumento del número de mitosis y capacidad para
metastasizarse. Las palabras que están relacionadas con
"cáncer" incluyen, carcinoma, sarcoma, tumor, hepitelioma,
adenoma, leucemia, linfoma, pólipos, cirro, transformación,
neoplasma y similares.
Un "polinucleótido inhibidor" es una
molécula de ADN o ARN que reduce o impide la expresión
(transcripción o traducción) de un segundo polinucleótido (diana).
Los polinucleótidos inhibidores incluyen polinucleótidos
complementarios, ribozimas y secuencias guía externas. La expresión
"polinucleótido inhibidor" incluye además moléculas de ADN y
ARN que codifican las especies inhibidoras existentes, tales como
las moléculas de ADN que codifican ribozimas.
El término "neoplásica" cuando se refiere a
células, indica las células que experimentan proliferación nueva y
anormal, particularmente en un tejido en el que la proliferación es
incontrolada y progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las
células neoplásicas pueden ser malignas, es decir invasivas y
metastásicas, o benignas.
Los términos "tratar" y "tratamiento"
se utilizan extensamente para indicar intervenciones terapéuticas y
profilácticas que alteran favorablemente un estado patológico. Los
tratamientos incluyen procedimientos que moderan o invierten la
evolución de una enfermedad, reducen su gravedad, la previenen o la
curan. En el caso de los cánceres, el tratamiento incluye un
aumento de la tasa de supervivencia en un periodo de tiempo dado o
un aumento del periodo de supervivencia, la reducción en la masa
tumoral, la reducción en la metástasis tumoral, la interrupción de
la evolución de la enfermedad, la reducción en el tiempo de
evolución y similares.
El presente descubrimiento proporciona
procedimientos para el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un
paciente utilizando antagonistas de Zvegf3. Zvegf3 es una proteína
que está relacionada estructuralmente con el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF) y los factores de crecimiento
endoteliales vasculares (VEGF). Esta proteína se ha denominado
"VEGF-R" (Publicación WO 99/37671 de WIPO) y,
más recientemente, "PDGF-C" (documento WO
00/18212; Li et al., Nature Cell Biol.
2:302-309, 2.000; Cao et al., FASEB J. 16:
1575-1583, 2.002). Zvegf3/PDGF-C es
una proteína de multidominio con homología significativa con la
familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento. Las secuencias de
aminoácidos representativas de zvegf3 humano y de ratón se presentan
en la SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID. nº: 4, respectivamente. Los ADN que
codifican estos polipéptidos se presentan en las SEC. ID. nº: 1 y
nº: 3 respectivamente.
La expresión "proteína zvegf3" se utiliza
en la presente memoria para indicar proteínas que comprenden el
dominio del factor de crecimiento de un polipéptido zvegf3 (por
ejemplo, los restos 235-345 de zvegf3 humana (SEC.
ID. nº: 2) o zvegf3 ratón (SEC. ID. nº: 4)), en la que la proteína
es mitógena para las células que expresan la subunidad del receptor
\alpha de PDGF de la superficie celular. Se ha observado que
Zvegf3 se une a las isoformas \alpha\alpha y \alpha\beta
del receptor de PDGF. Zvegf3 es una proteína homodimérica que se
produce en la naturaleza como precursora que está proteolíticamente
activada para liberar la proteína madura, un dímero del dominio del
factor de crecimiento. Tal como se utiliza en la presente memoria,
"la proteína zvegf3" incluye los precursores que son
activables in vivo. Utilizando los métodos conocidos en la
técnica, pueden prepararse proteínas zvegf3 en varias formas,
incluyendo glucosiladas o no glucosiladas, pegiladas o no
pegiladas, con o sin un resto inicial de metionina y como proteínas
de fusión como se da a conocer con más detalle a continuación.
La cadena del polipéptido zvegf3 comprende un
dominio del factor de crecimiento y un dominio CUB. El dominio del
factor de crecimiento se caracteriza por una disposición de los
restos de cisteína y las cadenas beta que son características de la
estructura "nudo de cisteína" de la familia PDGF el dominio CUB
muestra la homología de secuencia para los dominios CUB en las
neuropilinas (Takagi et al., Neuron
7:295-307, 1991; Soker et al., Cell
92:735-745, 1998), proteína 1 morfogenética del
hueso humano (Wozney et al., Science
242:1528-1534, 1988), proteína del plasma seminal
porcino y proteína del fluido seminal ácido bovino (Romero et
al., Nat. Struct. Biol. 4:783-788, 1997) y la
proteína pseudo-tolloid de X. laevis (Lin
et al., Dev. Growth Differ. 39:43-51,
1997).
En la Fig. 2, se presenta una alineación de las
secuencias del polipéptido zevgf3 de ratón y humano. El análisis de
la secuencia de aminoácidos mostrado en la SEC. ID: nº: 2 indica que
los restos 1 a 14 forman un péptido secretor. El domino CUB se
extiende desde el resto 46 hasta el resto 163. Una secuencia de
pseudopropéptido se extiende desde el resto 164 hasta el resto 234,
e incluye dos secuencias de escisión potenciales en su terminal
carboxilo, un punto dibásico en los restos 231-232 y
un punto diana para furina o una proteasa similar a la furina en
los restos 231 a 234. El dominio del factor de crecimiento se
extiende desde el resto 235 hasta el resto 345. Los expertos en la
materia reconocerán que los límites del dominio son algo imprecisos
y puede esperarse que varíen hasta \pm 5 residuos en las
posiciones especificadas. Los puntos de escisión proteolítica
potenciales se producen en los restos 232 y 234. El tratamiento de
zvegf3 recombinante producido en células DHK se ha observado que se
produce entre los restos 225 y 226. La escisión del péptido señal se
prevé que se produzca después del resto 14 (\pm 3 restos). Este
análisis sugiere que la cadena de polipéptido zvegf3 puede fundirse
para producir muchas especies monoméricas tal como se muestra en la
Tabla 1. La escisión después de Arg-234 cabe que
produzca la eliminación de los restos 231-234, con
posible conversión de Gly-230 en una amida. La
escisión después de Lys-232 cabe esperar que
produzca una eliminación interior del resto 231, otra vez con
posible conversión de Gly-230 en una amida. Además,
puede ser ventajoso incluir hasta siete restos en la zona del
interdominio en el terminal carboxilo del dominio CUB. La zona
interdominio puede estar truncada en su terminal amino por una
cantidad similar. Véase
\vskip1.000000\baselineskip
Zvegf3 puede prepararse de este modo en varias
formas polímeras que comprenden un polipéptido zvegf3 tal como se
dio a conocer anteriormente. Estos polipéptidos zvegf3 incluyen
zvegf3_{15-345} zvegf3_{46-345}
zvegf3_{226-345} y
zvegf3_{235-345}. Las variantes y derivados de
estos polipéptidos pueden prepararse tal y como se da a conocer en
la presente memoria. Pueden producirse también formas intermedias.
Por ejemplo, un polipéptido con el dominio del factor de
crecimiento puede tener, como resto amino-terminal
alguno de los restos 226-240 de la SEC. ID. nº: 2,
inclusive.
Pueden prepararse proteínas zvegf3 como
proteínas de fusión que comprenden las prolongaciones del terminal
amino o carboxilo, tales como un resto de metionina con terminal
amino, una etiqueta de afinidad o un polipéptido de
direccionamiento. Por ejemplo, puede prepararse una proteína zvegf3
como fusión con una etiqueta de afinidad para facilitar la
purificación. En lo fundamental, puede utilizarse como etiqueta de
afinidad cualquier péptido o proteína para el que esté disponible
un anticuerpo u otro agente de fijación especifico. Las etiquetas de
afinidad incluyen, por ejemplo, una zona de
poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO
J. 4:1075,1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3;
1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31,
1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4,
1985), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology
6:1204-1210, 1988) péptido de fijación de
estreptavidina, proteína de fijación de la maltosa (Guan et al.,
Gene 67:21-30, 1987), proteína de fijación de la
celulosa tiorredoxina, ubiquitina, T7 polimerasa u otro epítopo
antigénico o dominio de fijación. La fusión de zvegf3 a, por
ejemplo, la proteína de fijación a la maltosa o glutación S
transferasa puede utilizarse para mejorar el rendimiento en los
sistemas de expresión bacteriana. En estos casos la fracción
distinta de zvegf3 de la proteína de fusión ordinariamente será
eliminada antes de su utilización. La separación del zvegf3 y los
fragmentos distintos de zvegf3 de la proteína de fusión se
facilitan para proporcionar un punto de escisión específico entre
las dos partes. Dichos procedimientos son bien conocidos en la
técnica. La zvegf3 puede fusionarse también a un péptido de
direccionamiento, tal como un anticuerpo (incluyendo anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de fijación al
antígeno de éstos tales como los fragmentos F(ab')_{2} y
Fab, anticuerpos monocatenarios y similares) u otro resto peptídico
que se une a un tejido diana.
Pueden realizarse variaciones en las secuencias
de aminoácidos de zvegf3 mostrados en las SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID.
nº: 4 para proporcionar polipéptidos mitogénicamente inactivos que
se unen al receptor que actúan como antagonistas de zvegf3. Tal
como se utiliza en la presente memoria, la expresión
"mitogénicamente inactiva" significa que la proteína no
presenta actividad estadísticamente significativa en un ensayo de
mitogenesis convencional en comparación con la referencia natural
de zvegf3. Dichas variaciones incluyen sustituciones, eliminaciones
e inserciones de aminoácidos. Aunque no se desea estar ligado por la
teoría, se cree que los restos Arg260-Trp271 de
zvegf3 humano (SEC. ID. nº: 2) forman un bucle que define la
capacidad de la proteína para unirse a los receptores de PDGF. Se
predice, por lo tanto, que la fijación a los receptores de PDGF
puede estar bloqueada o potenciada por mutaciones en esta zona.
Además, se predice que los restos Leu311-His321 de
SEC. ID. nº: 2 forman un bucle (bucle 3) que puede estar mutado para
bloquear la fijación al receptor. Los péptidos que simulan esta
zona de la molécula pueden actuar como antagonistas. Li et
al. (Cytokine & Growth Factor Rev.
14:91-98, 2003) dan a conocer que las formas
parcialmente procesadas de zvegf3 en las que solamente uno de los
dos dominios de CUB está eliminado de la molécula homodímera
(denominadas "hemi-dimeros") pueden ser
capaces de unir los receptores de PDGF pero bloquear la dimerización
del receptor.
Los efectos de los cambios de secuencia de
aminoácidos pueden predecirse por modelización informática
(utilizando, por ejemplo, el visor Insight II® y las herramientas
de modernización de homología; MSI, San Diego, CA) o determinarse
por análisis de la estructura cristalina (véase, p.ej., Lapthorn
et al., Nature 369:455, 1994), y pueden evaluarse utilizando
procedimientos de mutagénesis reconocidos en la técnica en
combinación con ensayos de actividad. Los procedimientos
representativos de mutagénesis incluyen, por ejemplo, mutagénesis
dirigida al punto y mutagénesis de exploración con alanina
(Cunningham and Well, Science 244, 1081-1085,
1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:4498-4502, 1991). Pueden hacerse y determinarse
muchas sustituciones de aminoácidos utilizando procedimientos
conocidos, tales como los dados a conocer por
Reidhaar-Olson y Sauer (Science
241:53-57, 1988) o Bowie and Sauer (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). Otros
procedimientos que pueden utilizarse incluyen la presentación del
fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem.
30:10832-10837, 1991; Ladner et al., patente
de EE.UU. nº. 5.223.409; Huse, publicación WO 92/06204 de WIPO),
mutagénesis dirigida a la zona (Derbyshire et al., Gene
46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988) y mezclado de ADN
como da a conocer Stemmer (Nature
370:389-391, 1994) y Stemmer (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:10747-10751, 1994). En las moléculas
mutantes resultantes se analiza la actividad mitógena u otras
propiedades (p.ej., la fijación al receptor) para identificar restos
de aminoácidos que son críticos para estas funciones. La
mutagénesis puede combinarse con procedimientos de identificación
de gran volumen o de gran resolución para detectar la actividad
biológica de los polipéptidos zvegf3 en particular la actividad
biológica en la modulación de la proliferación celular. Por ejemplo,
un análisis de mitogénesis que miden la incorporación de colorante
o la incorporación de ^{3}H-timidina puede
llevarse a cabo en gran número de muestras. Pueden emplearse
análisis competitivos para confirmar la actividad antagonista.
Las proteínas zvegf3, incluyendo los
polipéptidos completos, fragmentos y proteínas de fusión, así como
las variantes antagonistas, pueden producirse en células
hospedadoras modificadas genéticamente según las técnicas
convencionales. Células hospedadoras adecuadas son aquellos tipos de
células que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y
crecen en cultivo, e incluyen bacterias, células micóticas y células
eucarióticas superiores cultivadas (incluyendo las células
cultivadas de organismos pluricelulares). Las técnicas para la
manipulación de moléculas clonadas de ADN y la introducción de ADN
exógeno en varias células hospedadoras las da a conocer Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbord, NY, 1989, y
Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular
Biology, Greenm and Wiley and Sons, NY, 1993. Véase el
documento WHO 00/34474. En general, una secuencia de ADN que
codifica un polipéptido zvegf3 está operativamente unida a otros
elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo
generalmente un activador y terminador de transcripción, en un
vector de expresión. El vector contendrá asimismo normalmente uno o
más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación,
aunque los expertos en la materia reconozcan que en determinados
sistemas los marcadores seleccionables pueden proporcionarse en
vectores por separado, y la replicación del ADN exógeno puede
proporcionarse por integración en el genoma de la célula
hospedadora. La selección de activadores, terminadores, marcadores
seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño
de rutina dentro del nivel de la experiencia ordinaria en la
materia. Muchos de dichos elementos están descritos en la
bibliografía y están disponibles por los suministradores
comerciales. Véase, el documento WO00/34474.
Las proteínas zvegf3 y las variantes pueden
también comprender restos de aminoácidos no naturales. Los
aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación,
trans-3-metilprolina,
2,4-metanoprolina,
cis-4-hidroxiprolina,
trans-4-hidroxiprolina,
N-metilglicina, alo-treonina,
metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína,
nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico,
terc-leucina, norvalina,
2-azafenilalanina,
3-azafenilalanina,
4-azafenilalanina y
4-fluorofenilalanina. Se conocen en la técnica
varios procedimientos para incorporar restos de aminoácidos no
naturales en proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema
in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido
utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los
procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son
conocidos en la técnica. La transcripción y traducción de los
plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se realiza en un
sistema exento de células que comprende un extracto de E
coli S30 y enzimas disponibles en el mercado y otros reactivos.
Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo,
Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman
et al., Methods Enzimol. 202:301, 1991; Chung et al.,
Science 259:806-809, 1993; y Chung et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-10149,
1993). En un segundo procedimiento, se lleva a cabo la traducción
en ovocitos de Xenopus por microinyección del ARN mutado y los ARNt
supresores químicamente aminoacilados (Turcall et al., J. Biol.
Chem. 271:19991-19998, 1996). En un tercer
procedimiento, las células de E. coli se cultivan en
ausencia de un aminoácido natural que debe reemplazarse (p.ej.,
fenilalanina) y en presencia del o de los aminoácido(s) no
naturales deseado(s) (p.ej.,
2-azafenilalanina,
3-azafenilalanina,
4-azafenilalanina, o
4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural está
incorporado en la proteína en lugar de su contrapartida natural.
Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470-7476,
1994. Los restos de aminoácidos naturales pueden convertirse en
especies no naturales mediante una modificación química in
vitro. La modificación química puede combinarse con la
mutagénesis dirigida al punto para expandir la serie de
sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci.
2:395-403, 1993).
Los polipéptidos con zvegf3, los fragmentos o
los variantes de los mismos pueden prepararse por síntesis química
según los procedimientos conocidos en la materia, incluyendo la
síntesis exclusiva en fase sólida, los procedimientos en fase
solida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis clásica
en solución. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem.
Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide
Synthesis (2^{a} edición), Pierce Chemical Co., Rockford, IL,
1984; Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; y Atherton
et al., Solid Phase Peptide Synthesis; A Practical Approach.
IRL Press, Oxford, 1989.
Las proteínas con zvegf3 y las variantes de las
mismas se purifican por procedimientos de purificación de proteínas
convencionales, por lo general mediante una combinación de técnicas
cromatográficas. Véase, en general, Affinity Chromatography:
Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala,
Suecia, 1988; y Scopes. Protein Purification: Principles and
Practice, Sringer-Verlag, Nueva York, 1994. Las
proteínas que comprenden una etiqueta de afinidad de polihistidina
(por lo general aproximadamente 6 restos de hinstidina) se purifican
por cromatografía por afinidad en una resina quelato con níquel.
Véase, por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6:
1321-1325, 1988. Además, el propio dominio del
factor de crecimiento se une a la resina de níquel a pH
7,0-8,0 y fosfato Na 25 mM, NaCl, 0,25 M. La
proteína ligada puede eluirse con un gradiente de pH descendiente
por debajo de pH 5.0 o un gradiente de imidazol. La proteína con
dominio de factor de crecimiento zvegf3 recombinante puede
purificarse utilizando una combinación de cromatografía en un
intercambiador catiónico fuerte seguido de un conjunto de columna
en tándem que comprende un intercambiador aniónico fuerte es seguido
de una columna con afinidad a metal inmovilizada en serie. Se ha
descubierto asimismo que zvegf3 se une a varias matrices con
colorante (por ejemplo, BLUE 1, BLUE 2, ORANGE 1, ORANGE 3 y RED3 de
Lexton Scientific, Signal Hill, CA) en PBS a pH
6-8, a partir del cual la proteína de fijación puede
eluirse en NaCl 1-2 M en tampón de ácido bórico 20
mM a pH 8,8. La proteína eluida de RED3 puede pasarse sobre RED2
(Lexton Scientific) para eliminar los contaminantes restantes. Las
proteínas que comprenden una etiqueta glu-glu pueden
purificarse por cromatografía de inmunoafinidad según
procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Grussenmeyer
et al., ibid. Las fusiones de la proteína que se une a la
maltosa se purifican en una columna de amilosa según los
procedimientos conocidos en la técnica.
Tal como se da a conocer con mayor detalle a
continuación, la sobreexpresión de zvegf3 en los hígados de ratones
transgénicos condujo a una activación y proliferación notables de
las células estrelladas. A las 8 semanas de vida no había
acumulación de la matriz extracelular perisinusoidal (ECM) que
progresó hasta una deposición de FM perivenular a las 22 semanas y
posibles etapas iníciales de la cirrosis caracterizadas por bandeo
fibroso y formación del nódulo hepático a las 33 semanas de vida.
Se observó que los animales más viejos presentaban
hemagioendotelioma, hiperplasia hepatocelular ganglionar y adenoma
hepatocelular. Estas alteraciones son coherentes con el desarrollo
del carcinoma hepatocelular como resultado de la sobreexpresión a
largo plazo de zvegf3.
Asimismo, tal como se da a conocer con más
detalle a continuación, la estimulación de las células estrelladas
hepáticas de rata con la proteína con dominio del factor de
crecimiento de zvegf3 dio como resultado un aumento de
aproximadamente 5 veces en la producción de
TGF-\beta en comparación de las células de
referencia. Se cree que TGF-\beta es un modulador
importante de la fibrosis hepática que puede producir la expresión
de otros genes profibrósicos. Por consiguiente, los efectos
observados en los animales que sobreexpresan zvegf3 pueden ser
debidos tanto a efectos directos como indirectos de zvegf3.
Los antagonistas de zvegf3 incluyen, sin
limitación, anticuerpos anti-zvegf3 (incluyendo
anticuerpos neutralizantes), polinucleótidos inhibidores
(incluyendo los polinucleótidos complementarios, ribozimas y
secuencias de guía externas) y otros agentes peptídicos y no
peptídicos incluyendo pequeñas moléculas de inhibidores y
polipéptidos zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente
inactivo.
Los anticuerpos utilizados como antagonistas de
zvegf3 incluyen los anticuerpos que se unen específicamente a una
proteína zvegf3 y, uniéndose de este modo, reducen o impiden la
fijación de la proteína zvegf3 y, por consiguiente reducen o
bloquean la actividad de zvegf3 mediada por el receptor. Tal como se
utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpos"
incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales
purificados por afinidad, anticuerpos policlonales y fragmentos de
fijación del antígeno, tales como los fragmentos proteolíticos
F(ab')_{2} y Fab. Los anticuerpos completos o los
fragmentos modificados genéticamente, tales como los anticuerpos
híbridos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, así
como están también incluidos los péptidos y polipéptidos sintéticos
de fijación al antígeno. Los anticuerpos no humanos pueden
humanizarse injertando CDR no humanos en un marco humano y zonas
constantes o incorporando los dominios completos de variable no
humana (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie
humanoide mediante sustitución de los restos expuestos, en los que
el resultado es un anticuerpo "chapeado"). En algún caso, los
anticuerpos humanizados pueden conservar restos no humanos dentro
de los dominios del marco de la zona variable humana para potenciar
las propias características de fijación. Mediante los anticuerpos
humanizados, puede aumentarse la vida media biológica y se reduce el
potencial de reacciones inmunitarias adversas durante la
administración a seres humanos. Los anticuerpos monoclonales pueden
producirse también en ratones que se han alterado genéticamente para
producir anticuerpos que tienen una estructura humana. Generalmente
se prefieren los anticuerpos de la clase IgG para su utilización en
la presente invención.
Los procedimientos para preparar y aislar
anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Cooligan et al. (eds.), Current
Protocols in Immunology, National Institutes of Health, John Wiley
and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989;
and Hurrell (ed.) Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982. Como sería
evidente para un experto en la materia, pueden generarse
anticuerpos policlonales inoculando una variedad de animales de
sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros,
pollos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido zvegf3 o un
fragmento del mismo.
Los polipéptidos inmunógenos comprenderán una
fracción que lleva el epítopo de un polipéptido zvegf3 (por
ejemplo, como se muestra en la SEC. ID. nº: 2) o el receptor. Un
"epítopo" es una zona de una proteína a la que puede unirse un
anticuerpo. Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3998-4002, 1984. Los epítopos
pueden ser lineales o de configuración, estando estos últimos
compuestos por zonas discontinuas de la proteína que forman un
epítopo durante el plegamiento de la proteína. Los epítopos lineales
son generalmente de por lo menos 6 restos de aminoácidos de
longitud. Los péptidos sintéticos relativamente cortos que simulan
parte de una secuencia de proteína son por rutina capaces de
producir un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente
simulada. Véase Sutcliffe et al., Science
219:660-666, 1983. Los polipéptidos inmunógenos,
que llevan el epítopo contienen una secuencia de por lo menos seis,
con frecuencia por lo menos nueve, más a menudo de 15 a
aproximadamente 30 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido
zvegf3 por receptor. Se incluyen los polipéptidos que comprenden un
fragmento mayor de una proteína zvegf3 o el receptor, es decir de
30 a 50 restos hasta la secuencia completa. Es preferible que la
secuencia de aminoácidos del polipéptido que lleva el epítopo se
seleccione para proporcionar solubilidad sustancial en los
disolventes acuosos, es decir la secuencia incluye restos
relativamente hidrófilos, y los restos hidrófobos se evitan
sustancialmente. Véase las Figs. 1A - 1G. Dichas zonas incluyen los
restos 43-48, 96-101,
97-102, 260-265 y
330-335 de la SEC. ID. nº: 2. Como se señaló
anteriormente, se prefiere generalmente utilizar péptidos algo más
largos como inmunogenos, tales como un péptido que comprende los
restos 80-104, 195-225,
299-314 y 299-326 de la SEC. ID. nº:
2. Este último péptido puede prepararse con un resto en Cys
adicional con terminal N para facilitar el acoplamiento.
La inmunogenicidad de un polipéptido inmunógeno
puede aumentarse mediante la utilización de un adyuvante, tal como
alúminas (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o
incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización
también incluyen polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de
un polipéptido con zvegf3 o una porción de las mismas con un
polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína que se une a la
maltosa. Si la fracción del polipéptido es "haptenoforme",
dicha porción puede articularse o unirse ventajosamente a un
vehículo macromolecular (tal como la hemocianina de la lapa
californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), o vacuna
antitetánica) para la inmunización.
Las técnicas alternativas para generar o
seleccionar anticuerpos incluyen la exposición in vitro de
linfocitos a un polipéptido inmunógeno y la selección de bancos de
presentación del anticuerpo en el fago o vectores similares (por
ejemplo, mediante la utilización del polipéptido inmovilizado o
marcado). Las técnicas para crear e identificar dichos bancos
aleatorios para presentación de péptidos son conocidas en la técnica
(por ejemplo, Ladner et al., patente US nº 5.223.409; Ladner
et al., patente de US nº 4.946.778; Ladner et al.,
patente US nº 5.403.484 y Ladner et al., patente US nº
5.571.698) y los bancos de presentación del péptido aleatorios y
kits para identificar dichos bancos están disponibles en el mercado,
por ejemplo en Clontech Laboratorios (Palo Alto, CA), Invitrogen
Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y
Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ.). Los bancos de
presentación del péptido aleatorios pueden cribarse utilizando las
secuencias de zvegf3 dadas a conocer en la presente memoria para
identificar proteínas que se unen a zvegf3.
Se determinan anticuerpos que se unen
específicamente si se unen a su diana pretendida (por ejemplo,
proteína zvegf3 o receptor) con una afinidad por lo menos 10 veces
mayor que la afinidad de unión al polipéptido o proteína de
referencia (por ejemplo, sin zvegf3 o sin receptor). A este
respecto, un "polipéptido sin zvegf3" incluye las moléculas
VEGF, VEGF-B, VEGF-C,
VEGF-D, P1GF, PDGF-A y
PDGF-B, relacionadas, pero excluye los polipéptidos
zvegf3 de especies no humanas. Debido al elevado nivel de identidad
de secuencias de aminoácidos esperado entre los ortólogos de
zvegf3, los anticuerpos específicos para zvegf3 humano pueden
también unirse a zvegf3, de otras especies. La afinidad de enlace
de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por cualquier
experto en la materia, por ejemplo, por análisis Scatchard
(Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672,
1949). Los procedimientos para identificar y aislar anticuerpos
específicos son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo,
Paul (ed.), Fundamental Inmunology, Raven Press, 1993; Getzoff et
al., Adv. In Inmunol. 43:1-98, 1998; Goding
(ed.), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Inmunol.
2:67-101, 1984.
La afinidad de enlace puede determinarse también
utilizando un instrumento biodetector disponible en el mercado
(BIACORE, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), en el que se
inmoviliza la proteína en la superficie de un chip receptor. Véase,
Karlsson, J. Inmunol. Methods 145:229-240,
1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol.
234:554-563, 1993. Este sistema permite la
determinación de las proporciones en y fuera de las cuales puede
calcularse la afinidad de fijación y la evaluación de la
estequiometría de enlace.
Los anticuerpos se considera que están
"aislados" cuando están preparados esencialmente sin otros
anticuerpos de diferente especificidad. La utilización de
anticuerpos aislados facilita la dirección a la diana de los
epítopos específicos o de los fragmentos de zvegf3, tales como el
dominio del factor de crecimiento.
Una variedad de ensayos conocidos por los
expertos en la materia puede utilizarse para detectar anticuerpos
que se unen específicamente a proteínas zvegf3 o receptores. Ensayos
a título de ejemplo se describen con detalle en Antibodies: A
Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1988. Ejemplos representativos de dichos análisis
incluyen: inmunoelectroforesis a co-corriente,
radioinmunoanálisis, radioinmunoprecipitación, ensayo
inmunosorbente con enzima ligada (ELISA), transferencia de manchas o
análisis de transferencia Western, análisis de inhibición o
competencia y análisis en sandwich.
Para aplicaciones terapéuticas se prefiere
generalmente utilizar anticuerpos neutralizantes. Tal como se
utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo
neutralizante" indica un anticuerpo que inhibe por lo menos un
50% menos de la actividad biológica del antígeno afín cuando el
anticuerpo se añade en un exceso molar de 1000 veces. Los expertos
en la materia reconocerán que a veces es deseable una actividad
neutralizante mayor, y pueden emplearse ventajosamente anticuerpos
que proporcionan el 50% de inhibición a un exceso molar de 100 veces
o 10 veces.
Los antagonistas de zvegf3 incluyen además
polinucleótidos complementarios, que pueden utilizarse para inhibir
la transcripción del gen zvegf3 y de este modo inhibir la activación
celular y/o la proliferación in vivo. Polinucleótidos que
son complementarios para un segmento de un polinucleótido que
codifica a zvegf3 (por ejemplo, un polinucleótido como se indica en
la SEC. ID. nº: 1) se diseñan para unirse al ARNm que codifica a
zvegf3 y para inhibir la traducción de dicho ARNm. Los
polinucleótidos complementarios pueden dirigirse a tejidos
específicos utilizando un método de terapia génica con vectores y/o
activadores específicos, tales como los sistemas de administración
vírica dados a conocer con más detalle a continuación.
Pueden utilizarse asimismo ribozimas como
antagonistas de zvegf3. Las ribozimas son moléculas de ARN que
contienen un centro catalítico y una parte de unión al ARN diana.
El término incluye enzimas con ARN, ARN con
auto-corte y empalme, los ARN de autoescisión y
moléculas de ácido nucleico que realizan estas funciones
catalíticas. Una ribozima se une selectivamente a una molécula de
ARN diana por emparejamiento de bases complementarias, llevando el
centro catalítico en proximidad intima con la secuencia diana. La
ribozima escinde a continuación el ARN diana y se libera, tras lo
cual es capaz de unirse y escindir más moléculas. Una molécula de
ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina "gen
ribozima". Las ribozimas pueden diseñarse para expresar la
actividad de endonucleasa que se dirige a determinada secuencia
diana en una molécula de ARNm (véase, por ejemplo, Draper y
Macejak, patente US nº 5.496.698; McSwiggen, patente US nº
5.525.468; Chowrira y McSwiggen, patente US nº 5.631.359; y
Robertson y Goldberg, patente US nº 5.225.337). Puede construirse un
vector de expresión en el que un elemento regulador está
operativamente unido a una secuencia nucleotídica que codifica una
ribozima.
En otro enfoque, pueden construirse vectores de
expresión en los que un elemento regulador dirige la producción de
transcritos de ARN capaces de activar la escisión de las moléculas
de ARN que codifican un polipéptido zvegf3 mediada por RNasa P.
Según este método, puede construirse una secuencia guía externa para
dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a una especie determinada de
ARNm intracelular que es escindido posteriormente por la ribozima
celular (véase, por ejemplo, Altman et al., patente de EE.UU.
nº 5.168.053; Yuan et al., Science 263:1269, 1994; Pace
et al., publicación WIPO nº WO 96/18733; George et
al., publicación WIPO nº WO 96/21731; y Werner et al.,
publicación WIPO nº WO 97/33991). Una secuencia guía externa
comprende generalmente una secuencia de diez a quince nucleótidos
complementaria de ARNm de zvegf3 y una secuencia nucleotidica
3'-NCCA, en la que N es preferentemente una purina.
La secuencia guía externa transcribe la unión a la especie de ARNm
objetivo mediante la formación de pares de bases entre el ARNm y las
secuencias guía externas complementarias, activando de este modo la
escisión del ARNm por la RNasa P en el nucleótido situado en la
sección 5' de la zona de bases emparejadas.
Se ha descubierto que el dominio de zvegf3 en el
factor del crecimiento es la especie activa (fijación al receptor
de PDGF) de la molécula. Para activación se requiere tratamiento
proteolítico para eliminar la fracción del terminal N de la
molécula. De este modo, pueden utilizarse asimismo inhibidores de
esta activación proteolítica como antagonistas de zvegf3.
Para su utilización farmacéutica, se formulan
antagonistas de zvegf3 para administración parenteral,
particularmente intravenosa o intraperitoneal, según los
procedimientos convencionales. En general, las formulaciones
farmacéuticas incluirán un antagonista de zvegf3 en combinación con
un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua, albúmina de suero
humano al 5% o similares. Las formulaciones pueden incluir además,
uno o más excipientes, conservantes, disolventes, agentes
tamponantes, albúmina, para evitar la pérdida de proteínas en las
superficies del vial, etc. Los liposomas pueden utilizarse como
vehículos según los procedimientos conocidos. Los procedimientos de
la formulación son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer,
por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy,
Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ª ed., 1995. Un
antagonista de zvegf3 normalmente se formulará y envasará en una
forma farmacéutica unitaria. Los anticuerpos por lo general se
formularán a concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml a
aproximadamente 10 mg/ml. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" de un agente o composición terapéutica es la cantidad
que produce un efecto estadísticamente significativo, tal como un
aumento estadísticamente significativo en la tasa de supervivencia
en un periodo de tiempo dado, aumento del tiempo de supervivencia,
reducción de la masa tumoral, reducción de la metástasis tumoral,
reducción de la evolución de la enfermedad, reducción en tiempo
para la evolución y similares. La dosis exacta la determinará el
médico según las pautas aceptadas, teniendo en cuenta la naturaleza
y gravedad de la enfermedad que debe tratarse, características del
paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de
cualquier experto en la materia. Las formulaciones terapéuticas
generalmente se administrarán durante el periodo requerido para
conseguir un efecto beneficioso, comúnmente hasta varios meses. La
dosificación es diaria o intermitente durante el periodo de
tratamiento. La administración intravenosa ordinariamente será por
infusión durante un periodo típico de una a varias horas. Pueden
emplearse también formulaciones de liberación mantenida. Una gran
dosis de carga puede administrase inicialmente, seguida de dosis de
mantenimiento periódicas más pequeñas.
Otros factores mitógenos, incluyendo el factor
de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento insulinoide
(IGF) han estado implicados en el inicio o evolución del carcinoma
hepatocelular. Por consiguiente, puede presentar ventajas el hecho
de combinar un inhibidor de zvegf3 con uno o más inhibidores de
estos otros factores.
Puede administrarse un antagonista de zvegf3 en
combinación con terapias conocidas para el carcinoma hepatocelular,
incluyendo la cirugía, la quimioterapia, la extirpación quirúrgica
por radio frecuencia, la terapia con láser o microondas, la
inyección de etanol percutánea, la criocirugía, la inmunoterapia o
combinaciones de las mismas. Por ejemplo, un antagonista de zvegf3
puede administrarse en combinación con agentes quimioterapéuticos
convencionales tales con cisplatino (Epstein et al., Cancer
67:896-900, 1991), hidrocloruro de doxorrubicina
(Choi et al, Radiology 182:709-713, 1992),
5-fluorodesoxiuridina (Ensminger et al., Cancer
Treat. Rep. 65:393-400, 1981),
diclorometotrexato (Ensminger et al., ibid.) o
discloroetilnitrosourea (Dakhil et al., Cancer
50:631-635, 1982). La selectividad zonal de la
quimioterapia puede mejorarse y la toxicidad generalizada reducirse
por quimioembolización (p.ej., Choi et al., ibid.; Dakhil et al.,
ibid) o infusión arterial hepática (por ejemplo, Ensminger
et al., ibid.). La administración de múltiples agentes
terapéuticos puede ser simultánea o sucesiva. La
quimioembolización, criocirugía, inyección de etanol percutánea y la
extirpación por radio frecuencia son de particular interés en el
tratamiento de tumores localizados más pequeños (<5 cm) que son
irreseccionables debido a la situación o la presencia de otras
afecciones medicas.
En determinadas formas de realización de la
invención la administración de antagonistas de zvegf3 solos o en
combinación con otra terapia producirá una respuesta tumoral. Aunque
cada protocolo puede definir las evaluaciones de la respuesta
tumoral de manera diferente, pueden encontrarse directrices a título
de ejemplo en Clinical Research Associates Manual; Southwest
Oncology Group, CRAB, Seattle, WA; 6 de Octubre de 1998, actualizada
en Agosto de 1999 ("CRA Manual"). Según el Manual de CRA
(véase el capitulo 7, "Response Accessment"), la respuesta
tumoral significa una reducción o eliminación de todas las lesiones
o metástasis mensurables. La enfermedad se considera generalmente
mensurable si comprende lesiones mensurables en las dos direcciones
con márgenes claramente definidos por fotografía médica o rayos X,
tomografía axial computerizada (CT), diagnóstico por la imagen de
resonancia magnética (MRI) o palpación. Enfermedades evaluables
significa que la enfermedad comprende lesiones mensurables en una
dimensión, masas con márgenes no definidos claramente, la lesión con
ambos diámetros inferiores a 0,5 cm, lesiones en exploración con
diámetro más pequeño que la distancia entre los cortes, lesiones
palpables con un diámetro inferior a 2 cm u osteopatía. Las
enfermedades no evaluables incluyen los derrames de la pleura,
ascitis y la enfermedad documentada por pruebas indirectas. Las
lesiones previamente radiadas que no han evolucionado se consideran
generalmente también no evaluables.
Criterios para el estado objetivo se requieren
para protocolos para evaluar la respuesta al tumor solido. Los
criterios representativos incluyen los siguientes: (1) respuesta
completa (CR) definida como la desaparición completa de todas las
enfermedades mensurables y evaluables. Ninguna lesión nueva. Ningún
síntoma relacionado con la enfermedad. Ninguna prueba de enfermedad
no evaluable; (2) respuesta parcial (PR), definida como disminución
superior o igual al 50% de la referencia en la suma de los productos
de diámetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables.
Ninguna evolución de la enfermedad evaluable. Ninguna lesión nueva.
Aplica a pacientes con por lo menos una lesión mensurable; (3)
evolución, definida como 50% o un aumento de 10 cm^{2} en la suma
de productos de lesiones mensurables sobre la suma más pequeña
observada utilizando las mismas técnicas que la referencia, o
empeoramiento evidente de cualquier enfermedad evaluable, o la
reaparición de cualquier lesión que haya desaparecido, o la
aparición de alguna nueva lesión, o insuficiencia para retornar para
la evolución debida a la muerte o condición de deterioro (salvo que
no esté relacionada con este cáncer); (4) estable o sin respuesta,
definida como sin cualificación para CR, PR o evolución. (Véase,
Clinical Research Assocites Manual, anteriormente).
Los anticuerpos se administran por vía
parenteral, generalmente por infusión intravenosa (incluyendo la
infusión arterial hepática) durante el transcurso del tratamiento.
La administración puede ser también intraperitoneal. Los
anticuerpos se administran generalmente en el intervalo comprendido
entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20 mg/Kg del peso del
paciente, normalmente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10
mg/Kg y con frecuencia entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5
mg/Kg. A este respecto, es preferible utilizar anticuerpos con una
vida media circulante de por lo menos 12 horas, preferentemente por
lo menos 4 días, más preferentemente hasta 14-21
días. Los anticuerpos híbridos y humanizados es de esperar que
tengan vidas medias circulatorias de hasta cuatro y hasta
14-21 días, respectivamente. En muchos casos, será
preferible administrar una dosis de carga mayor seguida de dosis
periódicas (por ejemplo, semanalmente) de mantenimiento durante el
periodo del tratamiento. Los anticuerpos pueden también
administrarse por sistemas de administración de liberación lenta,
bombas y otros sistemas de administración conocidos para la infusión
continua. Los regímenes de dosificación pueden variarse para
proporcionar los niveles de circulación deseados de un anticuerpo
específico basándose en su farmacocinética. Por lo tanto, las dosis
se calcularán de modo que se mantenga el nivel de circulación
deseado del agente terapéutico.
La dosis actual y el régimen de tratamiento los
determinará el médico, teniendo en cuenta la naturaleza del cáncer
(primario o metastásico). El número y el tamaño de los tumores,
otras terapias y las características del paciente. A la vista de la
naturaleza del carcinoma hepatocelular que amenaza la vida, pueden
emplearse grandes dosis con efectos secundarios significativos.
Los expertos en la materia reconocerán que los
mismos principios guían la utilización de otros antagonistas de
zvegf3. El régimen de dosificación para un antagonista dado se
determinará mediante un número de factores que incluyen la
potencia, farmacocinética y la naturaleza fisicoquímica del
antagonista. Por ejemplo, pueden administrarse por vía enteral
antagonistas de zvegf3 no peptídicos.
Los polinucleótidos terapéuticos, tales como los
polinucleótidos complementarios, pueden administrarse a pacientes o
a animales de ensayo por medio de sistemas de administración vírica.
Los virus a título de ejemplo destinados a este fin incluyen
adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus de vacuna y virus
adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario,
es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado
para la administración de ácidos nucleícos heterólogos. Para el
estudio, véase Becker et al., Meth. Cell Biol.
43:161-189, 1994; y Douglas y Curiel, Science
& Medicine 4:44-53, 1997. El sistema de
adenovirus ofrece varias ventajas. El adenovirus puede (i) acomodar
inserciones de ADN relativamente grandes; (ii) desarrollarse hasta
un valor elevado; (iii) infectar un extenso intervalo de tipos de
células de mamífero; y (iv) utilizarse con muchos activadores
diferentes incluyendo los activadores omnipresentes, específicos
para el tejido y regulables. Debido a que los adenovirus son
estables en el torrente sanguíneo, pueden administrase por inyección
intravenosa.
Al eliminar las fracciones del genoma de
adenovirus, pueden acomodarse inserciones mayores (hasta de 7 kb)
de ADN heterólogo. Estas inserciones pueden incorporarse en el ADN
vírico por ligadura directa o por recombinación homologa con el
plásmido cotransfectado. Cuando se administran por vía intravenosa a
animales sanos, el adenovirus principalmente se dirige al hígado.
Si el sistema de administración adenovírico tiene una eliminación
del gen E1, el virus no puede replicarse en las células
hospedadoras. Sin embargo, el tejido del hospedador (por ejemplo,
el hígado) expresará y procesará (y, si está presente una secuencia
señal, segrega) la proteína heteróloga.
Un procedimiento alternativo de administración
génica comprende la eliminación de las células del cuerpo y la
introducción de un vector en las células como plásmido de ADN
desnudo. Las células transformadas se vuelven a implantar a
continuación en el cuerpo. Los vectores de ADN desnudo se introducen
en las células hospedadoras por los procedimientos conocidos en la
técnica, incluyendo la transfección, electroporación;
microinyección, transducción, fusión celular, precipitación con
DEAE dextrano, y fosfato cálcico utilización de una pistola
genérica o utilización de un transportador del vector ADN. Véase, Wu
et al., J. Biol. Chem: 263:14621-14624,
1988; Wu et al., J. Biol. Chem: 267:963-967,
1992; y Johnson y Tang, Meth. Cell Biol.
43:353-365, 1994.
La actividad de los antagonistas de zvegf3 puede
medirse in vitro utilizando análisis, (incluyendo los
análisis basados en células) diseñados para medir la actividad de
zvegf3. Los antagonistas reducirán los efectos de zvegf3 en el
análisis. El enlace ligando-receptor puede analizrse
por varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los
análisis de competencia del receptor (Bowen-Pope y
Ross, Methods Enzyme. 109:69-100, 1985) y
mediante la utilización de receptores solubles, incluyendo los
receptores producidos como proteínas de fusión IgG (patente de
EE.UU. nº 5.750.375). Los ensayos de fijación al receptor pueden
realizarse en estirpes celulares que contienen receptores de la
superficie celular conocidos para la evaluación. Pueden estar
presentes receptores de forma natural en la célula o pueden ser
receptores recombinantes expresados por células modificadas
genéticamente. La actividad mitógena puede medirse utilizando
análisis conocidos incluyendo los análisis de incorporación de
^{3}H-timidina (dados a conocer, por ejemplo, por
Raines y Ross, Methods Enzymol. 109:749-773,
1985; y Wahl et al., Mol. Cell Biol.
8:5016-5025, 1988), ensayos de incorporación de
colorante, (como los dados a conocer, por ejemplo, por Mosman,
J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983 y Raz et
al., Acta Trop. 68:139-147, 1997) o recuentos
celulares. Los ensayos de mitogénesis miden la incorporación de
^{3}H-timidina en (1) cultivos confluentes al 20%
para buscar la capacidad de las proteínas zvegf3 para estimular más
las células proliferantes, (2) células en reposo en confluencia
mantenidas durante 48 horas para buscar la capacidad de las
proteínas zvegf3 para superar la inhibición del crecimiento
provocada por contacto. Los ensayos de incorporación del colorante
adecuados incluyen la medición de la incorporación del colorante
azul Alamar (Raz metal., Ibid.) en la células diana. Véase
también Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol.
70:395-405, 1976; Ewton y Florini,
Endocrinol. 106:577-583, 1980; y Gospodarowicz
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
86:7311-7315, 1989.
Las actividades biológicas de los antagonistas
de zvegf3 pueden estudiarse en animales no humanos por
administración de compuestos exógenos, por expresión de
polinucleótidos complementarios de zvegf3 y por supresión de la
expresión zvegf3 endógena por técnicas de modificación genética.
Pueden emplearse sistemas de administración vírica (dados a conocer
anteriormente). antagonistas de zvegf3 pueden administrarse o
expresarse individualmente, en combinación con otros antagonistas
de zvegf3, o en combinación con otros compuestos, incluyendo otros
antagonistas del factor de crecimiento. Los animales de ensayo se
controlan por cambios en dichos parámetros como los signos
clínicos, el peso corporal, los recuentos de células sanguíneas, los
análisis clínicos, la histopatología, el tamaño y la evolución del
tumor y similares.
Los modelos animales que pueden utilizarse en la
evaluación de los tratamientos para el carcinoma hepatocelular
incluyen los ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Singh y
Kuman, Rev. Med. Virol. 13:243-253, 2003),
perfusión de dietilnitrosamina en ratas (por ejemplo, Wang et
al., World J. Gastroenterol. 9:930-935, 2003;
Hemmings y Strickland, Cellular Physiology and Biochemistry
12:345-352, 2002), implantación tumoral: (por
ejemplo, Qian et al., World J. Gastroenterol.
9:94-98, 2.003), el modelo de carcinogénesis
poliorgánico (Hideaki et al., Japanese Journal of Cancer
Research 93:1299-1307, 2.002) y marmotas
infectadas con virus crónicos (Tennant, Clin. Liver Dis.
5:43-68, 2.001).
La invención se ilustrara con mayor detalle
mediante los siguientes ejemplos no limitativos:
\vskip1.000000\baselineskip
Se cribó un banco de glándulas salivales humano
para un clon completo de zvegf3 por PCR. Este banco era un banco
ordenado que representa 9,6 x 10^{5} clones construido en el
vector pZP5x. El vector pZP5x es el mismo que pZP9 (depositado en
American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas,
VA con el número de registro 98668), pero contiene un activador de
citomegalovirus en lugar de una metaltioneína entre las secuencias
Asp718 y BamHI. El plásmido comprende de este modo un gen de
dihidrofolato-reductasa bajo el control del
activador precoz SV40 y de la secuencia de poliadenilación de SV40 y
una secuencia de clonación para insertar el gen de interés bajo el
control del activador CMV y secuencia de poliadenilación génica de
la hormona de crecimiento humana (hGH). La placa de operación que
contiene 80 grupos de 12.000 colonias cada uno fue identificada por
PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos ZC19.045 (SEC. ID.
nº: 6) y ZC19.047 (SEC. ID. nº: 7) con una temperatura de
hibridación de 60ºC durante 35 ciclos. Existen dos grupos muy
positivos 58 (T-8 F1-F12) y 77
(T-7 H1-H12). Los grupos
correspondientes en la placa de transferencia fueron identificadas
a continuación por PCR utilizando las mismas condiciones. Se
obtuvieron dos positivos en el nivel de transferencia. Los
positivos eran T-7 H11 y T-8 F10. Se
realizaron reacciones con 5' RACE en los grupos de la placa de
transferencia, y los fragmentos se secuenciaron para comprobar las
secuencias de zvegf3 y determinar si estaba presente un clon
completo. Para la PCR se utilizaron los cebadores oligonucleótidos
CZ12.700 (SEC. ID. nº: 8) y CZ19.045 (SEC. ID. nº: 6) a una
temperatura de hibridación de 61ºC durante 5 ciclos, a continuación
55ºC durante 30 ciclos. El secuenciado demostró que la mezcla
T-7 H11 presentaba un desplazamiento de los marcos.
La secuencia F10 del grupo de la placa de transferencia 8 parecía
ser correcta, de modo que esta mezcla de ADN se utilizó en los
filtros de vacío.
La mezcla F10 de la placa de transferencia 8 se
colocó en placas y se filtró utilizando membranas de nilón
(Hybond-N^{TM}; Amersham Corporation, Arlington
Heights, IL). Se tomaron aproximadamente 1.200 colonias por placa
en cada uno de los 5 filtros para un total de aproximadamente 6.000
colonias. Los filtros se marcaron con una aguja caliente para
orientación, a continuación se desnaturalizaron durante 6 minutos en
NaOH 0,5 M y Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Se
neutralizaron a continuación los filtros en NaCl 1,5 M y
Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. Se fijo
el ADN a los filtros utilizando un reticulador UV (Stratalinker®
Stratagene, La Jolla, CA) a 1.200 julios. Se prelavaron los filtros
a 65ºC: en tampón de prelavado consistente en 0,25 x SSC, SDS al
0,25% y EDTA 1 mM. Se cambió la solución un total de tres veces
durante un periodo de 45 minutos para eliminar los desechos
celulares. Se prehibridaron los filtros durante aproximadamente 3
horas a 65ºC en 25 ml de solución de hibridación
(ExpressHyb^{TM}; Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto CA). Se
generó la sonda utilizando un fragmento de aproximadamente 400 pb
producido por digestión de un clon que comprende una etiqueta con
la secuencia expresada de zvegf3 con EcoRl y BgIII seguido de
purificación en gel utilizando una columna rotativa que contiene
una membrana de sílica gel (QIAquick^{TM} Gel Extraction Kit;
Quiagen, Inc., Valencia CA). Se marcó la sonda por radioactividad
con ^{32}P por cebado aleatorio utilizando un kit disponible en
el mercado (Rediprime^{TM} II, Amersham Corp., Arlintong Heights,
IL) y se purificó utilizando una columna de impulsión. Se utilizó
la solución ExpressHyb^{TM} para la solución de hibridación
destinada a los filtros. La hibridación tuvo lugar durante la noche
a 65ºC. Se enjuagaron las transferencias dos veces en solución 1 a
65ºC (2 x SSC, SDS al 0,1%), a continuación se lavaron 4 veces en la
solución 1 a 65ºC. Se expusieron los filtros a la película durante
la noche a -80ºC. Existían 14 positivos en los filtros. Se tomaron
85 clones de las áreas positivas y se identificaron por PCR
utilizando sondas oligonucleotídicas ZC19.045 (SEC. ID. nº: 6) y
ZC19.047 (SEC. ID. nº: 7) y una temperatura de hibridación de 60ºC.
Se obtuvieron trece positivos y se rayaron para los clones
individuales. Se tomaron veinticuatro colonias y se comprobaron por
PCR como se describió anteriormente. Se obtuvieron seis positivos,
dos de los cuales se secuenciaron. Ambas secuencias eran iguales y
completas. La secuencia se presenta en la SEC.ID. nº: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cribó un panel por PCR para el ADN de zvegf3
de ratón. El panel contenía 8 muestras de ADNc de bancos de
cerebro, medula ósea, embrión de 15 días, testículos, glándulas
salivales, placenta, embrión de 15 días (Clontech Laboratories) y
embrión de 17 días (Clontech Laboratories).
Las mezclas de la PCR contenían los cebadores
oligonucletilicos ZC21.222 (SEC. ID. nº: 9) y ZC21.224 (SEC. ID.
nº: 10). La reacción se realizó a una temperatura de hibridación de
66ºC con un tiempo de prolongación de 2 minutos durante un total de
35 ciclos utilizando la Ex Taq^{TM} ADN polimerasa (PanVera,
Madison, WI) más anticuerpo. Se observó que las muestras de ADN
eran positivas para zvegf3 por PCR y se confirmó por secuenciado
incluido el ADNc de la mezcla total del banco de embriones de 15
días de ratón, embriones de 15 días de ratón (Clontech
Laboratories) y embriones de 17 días (ambos adquiridos en Clontech
Laboratories), ADNc de la mezcla total del banco de glándulas
salivales de ratón y del ADN de la mezcla total del banco de
testículos de ratón. Se secuenciaron los fragmentos de
aproximadamente 600 pb de cada uno de los ADNc de la mezcla total
del banco de embriones de 15 días de ratón, del ADNc de embriones
de 15 días de ratón y de los productos de la PCR con ADNc de
embriones de 17 días de ratón. La secuencia del ADNc del embrión de
17 días de ratón y los productos del ADNc de la mezcla total del
banco de embriones de 15 días de ratón confirmó que los fragmentos
eran de ADN con zvegf3 de ratón.
Se identificó el ADN con zvegf3 completo en el
banco de embriones de 15 días de ratón. Este banco era un banco
ordenado que representa 9,6 x 10^{5} clones en el vector
pCMV\cdotSPORT 2 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La placa
de operación, que contiene 80 grupos de 12.000 colonias cada una,
fue identificada por PCR utilizando los cebadores oligonucletídicos
ZC21.223 (SEC. ID. nº: 11) y ZC21.224 (SEC. ID. nº: 10) con una
temperatura de hibridación de 66ºC durante 35 ciclos. Se obtuvieron
dieciocho positivos. Se secuenciaron los fragmentos de cuatro
grupos (A2, A10, B2 y C4); todos confirmaron que codifican zvegf3.
Rondas adicionales de identificación utilizando las mismas
condiciones de reacción y las mezclas en las placas de operación y
de origen identificaron un grupo positivo (5D).
Se identificaron colonias positivas por
hibridación. El grupo 5D de la placa nº 5 de la fuente original se
colocó en placas a razón de aproximadamente 250 colonias por placa y
se transfirió a membranas de nilón (Hybond-N^{TM};
Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). Se recogieron cinco
filtros para un total de \sim 1250 colonias. Se marcaron los
filtros con una aguja caliente para orientación, a continuación se
desnaturalizaron durante 6 minutos en NaOH 0,5 M y
Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Se neutralizaron a
continuación los filtros en NaCl 1,5 M y Tris-HCl
0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. Se fijó el ADN a los filtros
utilizando un reticulador UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla,
CA) a 1.200 julios. Se generó una sonda por PCR utilizando los
cebadores oligonucleotídicos CZ21.223 (SEC. ID. nº: 11) y ZC21.224
(SEC. ID. nº: 10) y una plantilla de ratón de 15 días a una
temperatura de hibridación de 66ºC durante 35 ciclos. Se purificó
en gel el fragmento de PCR utilizando una columna rotativa que
contenía una membrana de gel de sílice (QIAquick^{TM} Gel
Extraction Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA). El ADN se marcó por
radioactividad con ^{32}Putilizando un kit disponible en el
mercado (Sistema de marcado con cebador aleatorio Rediprime^{TM};
Amersham Corp., Arlington Heights, IL) según las especificaciones
del fabricante. Se purificó la sonda utilizando una columna de
impulso disponible en el mercado (columna NucTrap®; Stratagene, La
Jolla, CA; véase la patente de EE.UU. nº 5.336.412). Se prelavaron
los filtros a 65ºC en tampón de prelavado consistente en 0,25X SSC,
SDS al 0,25% y EDTA 1 mM. Se cambió la solución un total de tres
veces durante un periodo de 45 minutos para eliminar los desechos
celulares. Se prehibidaron los filtros durante la noche a 65ºC en
25 ml de una solución de hibridación (ExpressHyb^{TM}
Hibridization Solution; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA), a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en la
misma solución. Se enjaguaron los filtros dos veces a 65ºC en
tampón de prelavado (0,25X SSC, SDS al 0,25%, y EDTA 1 Mm), a
continuación se lavaron dos veces en tampón de prelavado a 65ºC. Se
expusieron los filtros a la película durante 2 días a -80ºC. Habían
10 positivos en los filtros. Se cogieron 3 clones de las áreas
positivas, se rayaron y se identificaron 15 colonias individuales
de estos tres positivos por PCR utilizando los cebadores ZC21.223
(SEC. ID. nº: 11) y ZC21.334 (SEC. ID. nº: 12) a una temperatura de
hibridación de 66ºC. Se recuperaron dos positivos y se
secuenciaron. Se descubrió que ambas secuencias eran iguales y se
codificó el zvegf3 de ratón completo (SEC. ID. nº: 4).
La secuencia de aminoácidos está muy conservada
entre los zvegf3 de ratón y humano, con una identidad de la
secuencia total de aminoácidos del 87%. El péptido segregador, el
dominio CUB, el interdominio y el dominio del factor de crecimiento
presentan una identidad de aminoácidos del 82%, 92%, 79% y 94%,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un vector de expresión de células
de mamífero para el dominio del factor de crecimiento zvegf3
uniendo el fragmento zvegf3 a una secuencia que codifica una
secuencia señal segregadora de t-PA optimizada
(patente US nº 5.641.655) en el vector pZMP11 linealizado del
activador de CMV. El plásmido pZMP11 es un vector de expresión de
mamífero que contiene una casete de expresión que tiene el activador
precoz inmediato a CMV, un intrón de consenso de la zona variable
del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón,
secuencias Kosak, secuencias de restricción múltiples para la
inserción de las secuencias de codificación, un codón de
terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humano. El
plásmido contiene asimismo un elemento IRES del poliovirus, la
secuencia de codificación del dominio extracelular de CD8 truncada
en el extremo del terminal C del dominio transmembranario, un
origen de replicación de E. coli , una unidad de expresión
del marcador seleccionable del mamífero que tiene un activador SV40,
potenciador y origen de replicación, un gen DHFR, el terminador
SV40 y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para
la selección y replicación en S. cerevisiae. El vector
resultante se denominó pZMP11/zv3GF-otPA.
Se transfectaron las células BHK 570 con
pZMP11/zv3GF-otPA por transfección mediada por
liposomas utilizando una formulación de liposomas 3:1 (w/w) del
lípido policatiónico
2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N-N-dimetil-1-propaniminio-trifluoroacetato
y el lípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina en agua filtrada
por membrana (Lipofectamina^{TM};Life Technologies) y se cultivó
según los procedimientos convencionales.
Se ajustó el medio acondicionado con células BHK
hasta MES 20 mM a pH 5,5. Una columna de resina de intercambio
catiónico (Poros® HS 50; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) (2
cm de diámetro; de volumen de lecho de 50 ml) se equilibró en MES
20 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. El medio ajustado se bombeó en la
columna a razón de 20 ml/minuto. Cuando se terminó la carga, se
lavó la columna, en primer lugar en MES 20 Mm, NaCl 150 mM, pH 5,5,
a continuación con el mismo tampón de composición a pH 6,0. Una vez
la referencia volvió a absorbancia cero, la columna se eluyó con un
gradiente de 10 volúmenes de columna a MES 20 mM, NaCl 1 M, pH 6,0.
El dominio del factor de crecimiento de zvegf3 eluyó a una
conductividad de 25 a 50 mS durante el gradiente en desarrollo. La
SDS-PAGE reductora puso de manifiesto una banda
distinta a 20 kD, que se confirmó como zvegf3 por
inmunotransferencia Western. Este material se mezcló y se preparó
para cargar a un conjunto con columna tándem que comprende una
resina de intercambio aniónico fuerte (Poros® HQ 50; PerSeptive
Biosystems) seguido de una columna de afinidad con metal
inmovilizado (níquel) en serie. El sistema de columnas se equilibró
en tampón MOPS 20 Mm a pH 7,0. La mezcla de zvegf3 se diluyó en
línea a 1:10 (v/v) con el tampón de equilibrio MOPS mientras se
cargaba. Una vez completada la carga la columna en serie se lavó
con tampón MOPS 20 mM, pH 7,0, hasta que se obtuvo la absorbancia
de referencia. A continuación se desconectó la columna con níquel
del intercambiador aniónico y se lavó con MOPS 20 mM pH 7,0 que
contenía NaCl 150 mM. Se eluyó la columna con un gradiente de 1
volumen de columna entre el tampón del último lavado y el mismo
tampón que contenía imidazol 20 mM a pH 7,0. Las fracciones que
contenían el dominio del factor de crecimiento de zvegf3 se
mezclaron y se concentraron utilizando una membrana de corte de 5
kD en preparación para el intercambio de tampón y la purificación en
una columna por exclusión de tamaño equilibrada en PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar animales transgénicos que expresan
genes zvegf3 se requiere machos fértiles y adultos (sementales)
(B6C3f1, de 2 a 8 meses de vida, (Taconic Farms, Germantown, NY)),
machos vasectomizados (estériles) (B6D2f1, de 2 a 8 meses, (Taconic
Farms)), hembras fecundas prepuberales (donantes) (B6C3f1, 4 a 5
semanas, (Taconic Farms)) y hembras fecundas adultas (receptoras)
(B6D2f1, de 2 a 4 meses, (Taconic Farms)).
Se aclimataron los donantes durante 1 semana, a
continuación se les inyectó aproximadamente 8 UI/ratón de
gonadotropina (hCG (Sigma Chemical Co.)) I.P. para provocar
superovulación. Los donantes se aparean con sementales después de
las inyecciones de hormonas. La ovulación se produce generalmente a
las 13 horas de la inyección hCG. Se confirma la copulación por la
presencia de un tapón vaginal la mañana siguiente del
apareamiento.
Se recogieron óvulos fecundados bajo un
microescopio quirúrgico (microscopio Leica MZ12 Stereo, Leica,
Wetzlar, Alemania). Se recogieron los oviductos y se liberaron los
huevos en portaobjetos para análisis de orina que contenían
hialuronidasa (Sigma Chemical Co). Se lavaron los huevos una vez en
hialuronidasa y dos veces en medio W640 de Whitten (Tabla 2; todos
los reactivos están disponibles en Sigma Chemical Co.) que se había
incubado con 5% de CO_{2}, 5% de O_{2} y 90% de N_{2} a 37ºC.
Se almacenaron los huevos en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5%
hasta la microinyección.
El ADNc con zvegf3 se inserta en el vector de
expresión pHB12-8. El vector pHB12-8
procede del p2999B4 (Palmiter et al., Mol. Cell Biol.
13:5266-5275, 1993) por inserción de un intrón de
insulina II de rata (aprox. 200 pb) y la zona no traducida de la
hormona de crecimiento humano (hGH) y una señal de poliadenilación
(aprox. 650 pb) flanqueada por 10 kb de la secuencia de flanqueo 5'
de MT-1 y 7 kb de la secuencia de flanqueo 3' de MT-
1. El ADNc se inserta entre la insulina II y las secuencias de
hGH.
De 10 a 20 microgramos del ADN plásmido se
linealizan, se purifican en gel y se vuelven a poner en suspensión
en Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 0,25 mM pH 8,0 a una concentración final
de 5 a 10 nanogramos por microlitro para microinyectables.
El ADN plásmido se microinyecta en los óvulos
recogidos contenidos en una gota de medio de W640 cubierta una capa
aceite mineral caliente equilibrado con CO_{2}. El ADN se coge en
una aguja de inyección (se impulsa desde un DI de 0,75 mm, capilar
de vidrio de borosilicato de 1 mm de diámetro externo) y se inyecta
en cada óvulo. Cada huevo se penetra con la aguja de inyección en
uno o ambos pronúcleos haploides.
Se inyectan picolitros de ADN en los pronúcleos,
y la aguja de inyección se retira sin entrar en contacto con los
nucléolos. El procedimiento se repite hasta que todos los huevos
están inyectados. Los huevos microinyectados con éxito se
transfieren a una placa de cultivo para tejido orgánico con medio
W640 pregasificado para el almacenamiento durante la noche en una
incubadora a 37ºC/5% de CO_{2}.
Al día siguiente, embriones de 2 células se
transfieren a receptoras pseudoembarazadas. Se identifican los
receptores por la presencia de tapones de copulación, después de
copulación con estériles vasectomizados. Los receptores se
anestesian y se rasura el lado izquierdo dorsal y se transfiere a un
microscopio quirúrgico. Se practica una pequeña incisión en la piel
y a través de la pared muscular en la mitad del área abdominal
perfilada por la caja torácica, el cuarto trasero y la pata trasera,
a medio camino entre la rodilla y el bazo. Los órganos
reproductores se sacan al exterior en un pequeño paño quirúrgico. La
almohadilla de grasa se extiende sobre el paño quirúrgico, y una
pequeña pinza hemostática (Roboz, Rockvilles, MD) se acopla a la
almohadilla de grasa y se deja colgando sobre el lomo del ratón,
impidiendo que los órganos se vuelvan a deslizar. Con una pipeta
fina de transferencia que contiene un aceite mineral seguido W640
alternativo y burbujas de aire, de 12 a 17 embriones sanos de 2
células de la inyección del día anterior se transfieren al
receptor. La ampolla hinchada se sitúa, y manteniendo el oviducto
entre la ampolla y la bolsa, se hace una señal en el oviducto con
una aguja de calibre 28 próxima a la bolsa, asegurándose de que no
se desgarre la ampolla o la bolsa. La pipeta se transfiere a la
señal en el oviducto, y los embriones se hinchan, permitiendo que
escape la primera burbuja de aire de la pipeta. La almohadilla de
grasa se empuja suavemente dentro del peritoneo y los órganos
reproductores se dejan que se deslicen en él. La pared del peritoneo
se cierra con una sutura y la piel se cierra con un punto de
herida. El ratón se recupera en un calentador de platina a 37ºC
durante un mínimo de 4 horas.
Los receptores se devuelven a las jaulas por
parejas, y se dejan entre 19 y 21 días de gestación. Después del
nacimiento, entre 19 y 21 días después del parto se les deja antes
del destetado. Los destetados se sexan y se colocan en jaulas
separadas por sexos y se extrae una biopsia de 0,5 cm (utilizada
para genotipados) de la cola con tijeras limpias.
El ADN genómico se prepara a partir de los
recortes de la cola utilizando un kit disponible en el mercado
(DNeasy^{TM}96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las
instrucciones del fabricante. El ADN genómico se analiza por PCR
utilizando cebadores diseñados para la fracción 3' UTR de la hormona
de crecimiento humano (hGH) del vector transgénico. La utilización
de una zona única para la secuencia humana (identificada en una
alineación de las secuencias de ADN 3' UTR de la hormona de
crecimiento humana y de ratón) asegura que la reacción de PCR no
amplia la secuencia de ratón. Los cebadores ZC17.251 (SEQ ID nº: 13)
y ZC17.252 (SEQ ID nº:14) amplían un fragmento de 368 pares de
bases de hGH. Además, los cebadores ZC17.156 (SEQ ID nº: 15) y
ZC17.157 (SEQ ID nº: 16), que se hibridan con las secuencias del
vector y amplían la inserción del ADNc; pueden utilizarse junto con
los cebadores de hGH. En estos experimentos, el ADN de los animales
positivos para el transgén generarán dos bandas, una banda 368
pares de bases correspondiente al fragmento 3' UTR de hGH y una
banda de tamaño variable correspondiente a la inserción del
ADNc.
Una vez se confirma que los animales son
transgénicos (TG), se vuelven a cruzar en una cepa consanguínea
colocando una hembra TG con un macho natural o un macho TG con una
o dos hembras naturales. A medida que los cachorros nacen y son
destetados, se separan los sexos, y sus colas se recortan para
genotipado.
Para comprobar la expresión de un transgén en un
animal vivo, se realiza una hepatectomia parcial. Se lleva a cabo
una preparación quirúrgica del abdomen superior directamente a
continuación de la apófisis xifoides. Utilizando la técnica
estéril, se practica una pequeña incisión de 1,5 a 2 cm bajo el
esternón y se extrae el lóbulo lateral izquierdo del hígado.
Utilizando seda 4-0, se hace una atadura alrededor
del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad corporal. Una
pinza no traumática se utiliza para mantener la atadura mientras se
coloca próximo a la primera atadura un segundo lazo de Dexson
absorbible (American Cyanamid, Wayne, N.J.). Se realiza un corte
distal en la atadura Dexson, y se colocan aproximadamente 100 mg del
tejido de hígado extirpado en una placa petri esterilizada. La
sección de hígado extirpado se transfiere a un tubo de fondo
redondo de polipropileno de 14 ml, congelado al instante en
nitrógeno líquido y almacenado en nieve carbónica. La zona
quirúrgica se cierra con sutura y puntos para heridas y la jaula del
animal se coloca en una almohadilla de calentamiento a 37ºC durante
24 horas después de la operación. Se comprueba al animal a diario
después de la operación y se extraen los puntos para heridas 7 a 10
días después de la intervención quirúrgica.
El análisis del nivel de expresión del ARNm de
cada transgén se realiza utilizando un análisis de hibridación con
solución de ARN o PCR en tiempo real en el equipo de PCR disponible
en el mercado (ABI Prism^{TM} 7700; PE Applied Biosystems, Inc.,
Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se preparó un vector de adenovirus utilizando un
gen potenciador de albúmina específico para el hígado y un
activador basal (denominado "activador AEO"). Se construyó el
montaje del activador de albúmina (denominado pAEO) insertando un
fragmento Not1/EcoRV de 2,2 kb procedente pALBdelta2L (Pinkert et
al., Genes Dev. 1:268-276, 1987) y un segmento
NruI/Not1 de ADN de 850 pb que comprende el intrón de insulina II de
rata, como polienlazador de FseI/PmeI/AscI, y la secuencia poliA de
la hormona de crecimiento humano en un vector fagómido disponible
en el mercado (pBluescript®KS(+); Stratagene, La Jolla, CA). Para la
microinyección, se digiere el plásmido con Not1 para la liberar la
casete de expresión.
Se construyó un vector de adenovirus adicional
utilizando un activador del gen de queratina especifico para
células epiteliales (K14) (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1563-1567, 1989). El marco de lectura
abierto de 1038 pb que codifica zvegf3 humano completo fue ampliado
por PCR con el fin de introducir un cordón de iniciación optimizado
y las secuencias flanqueantes 5' PmeI y 3' AscI
utilizando los elevadores ZC20.180 (SEC ID nº: 17) y ZC20.181 (SEQ.
ID. nº: 18). El fragmento resultante PmeI/AscI se
subclonó en el polienlazador de pKF0114, vector transgénico limitado
de queratinocitos vasales que comprende el activador de queratina
14 (K14) humano (un fragmento de aproximadamente 2,3 Kb del ADN
genómico humano [adquirido en Clontech Laboratories, Inc.] basado
en la secuencia de Staggers et al., "Sequence of the promoter
for the epidermal Keratin gene, K14", nº de registro en el
GenBank U11076, 1994), seguido de un intrón heterólogo (un
fragmento BstXII PstI de 294 pb procedente de
pIRES1hyg (Clontech Laboratories, Inc; véase, Huang y Gorman,
Nucleic Acids Res. 18:937-947, 1990), un
polienlazador PmeIIAscI y la señal de poliadenilación
del gen de la hormona de crecimiento humana (un fragmento
SmalI/EcoRI de 627 pb; véase, Seeburg, DNA
1:239-249, 1982). La inserción del transgén se
separó del eje central del plásmido por digestión con NotI y
la purificación en gel de agarosa, y se fecundo el ovulo de los
emparejamientos de los ratones B6C3F1Tac o los ratones FVB/NTac:
endogámicos se microinyectaron y se implantaron en hembras
esencialmente pseudopreñadas tal como describe Malik et al.,
Molec. Cell. Biol. 15:2349-2358, 1995). Se
identificaron fundadores transgénicos por PCR en el ADN genómico de
la cola utilizando cebadores específicos para la señal poli A de la
hormona de crecimiento humano (ZC 17.252, SEC. ID. nº: 14; y
ZC17.251, SEC. ID. nº: 13) para ampliar un producto de diagnostico
de 368 pb. Se iniciaron estirpes transgénicas cruzando fundadores
con ratones C57Bl/6Tac o FVB/NTac.
Se generaron ratones transgénicos esencialmente
tal como se dio a conocer anteriormente utilizando los activadores
MT-1, K14 y AEO. Se generaron cuatro ratones
transgénicos MT-1/zvegf3. En un animal (hembra) se
produjeron aproximadamente 800 moléculas de ARNm con zvegf3/célula
en el hígado tras la inducción con cinc. Este animal presentaba
dilatación del hígado y del bazo. Se observó también proliferación
de células sinusoidales hepáticas y de hematopoyesis extramedular.
Un ratón transgénico K-14/zvegf3 (hembra) presentaba
un nivel bajo de expresión con bajo peso corporal, bajo hematocrito
y bajo recuento de plaquetas. Un ratón transgénico AEO/zvegf3
(macho) con un bajo nivel de expresión presentaba proliferación
celular sinusoidal en el hígado.
Se realizó un análisis histológico en hígados de
ratones transgénicos N1 que sobreexpresan zvegf3 completo del
activador AEO y las referencias de la camada no transgénicas a las
8, 16, 22 y 33 semanas de vida. Se observaron cambios similares en
animales machos y hembras. Cepas H&E y tricrómicas indicaban un
aumento definido del número de células sinusoidales (estrelladas)
en el hígado y deposición de la matriz extracelular perisinusoidal
(FM) a las 8 semanas de vida. Había un aumento persistente en el
número de células estrelladas y en la cantidad y espesor de FM
perisinusoidal así como alguna deposición de FM perivenular durante
16 semanas. A las 22 semanas se observaron cambios similares, pero
con un aumento en la frecuencia y en la gravedad de la fibrosis
perivenular (esteatofibrosis). Se observaron cambios similares a
los de las semanas 16 y 22 en la semana 33, sin embargo algunos
animales presentaban áreas fibrósas, de bandeo y múltiples,
encapsuladas, en las que los hepatocitos parecían dilatados y
vacuolados. Estas áreas tendían a estar rodeadas por una capsula de
tejido fibroso y los hepatocitos dentro de estas áreas aparecían
normales. Estas alteraciones eran coherentes con la cirrosis
precoz.
Se observaron cambios similares en ratones N2 de
8 semanas y en machos reproductores sacrificados aproximadamente en
un periodo comprendido entre las 32 y las 34 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sacrificaron cinco ratones transgénicos AEO
(generación N7) con zvegf3 humano, se les practicó la necropsia, y
se recogieron los tejidos en formalina tamponada al 10%. Muestras
adicionales de hígado en fijadores de Carnoy y de zinc tris para
inmunohistoquímica. A continuación, se presentan informes
individuales del animal para cada uno de los cinco ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
En la necropsia, el hígado apareció
difusivamente grande e hinchado con bordes redondeados, y el lóbulo
lateral izquierdo tenía un aspecto nodular distinto. Al
microscopio, los descubrimientos principales fueron en el hígado e
incluían proliferación celular sinusoidal, hiperplasia nodular y
adenoma hepatocelular. Además, se vacuolaron los hepatocitos,
especialmente alrededor de la vena central, y existían algunos
infiltrados celulares mononucleares leves o ligeramente focales e
hiperplasia del conducto biliar. Se observaron también infiltrados
celulares mononucleares ligeros a moderados en los pulmones,
riñones, páncreas y glándulas salivales. Se observó hiperplasia
linforreticular en el timo, bazo y medula ósea, siendo esta última
de aspecto nodular.
\vskip1.000000\baselineskip
En la necropsia, los lóbulos mayores del hígado
contenían quistes grandes y múltiples nódulos. Además, se observó
que el bazo presentaba de 2 a 3 veces su tamaño normal. Al
microscopio, el hígado fue el órgano examinado más gravemente
afectado, los descubrimientos incluían proliferación celular
sinusoidal moderada, hiperplasia nodular/hepatocelular y dilatación
vascular grave (difusa). Una sección presentaba un área de trombosis
y de necrosis cuaguladora, esta última indicadora de infarto
posiblemente causado por la trombosis. El bazo presentaba
hiperplasia linforreticular moderada, lo que se correlaciona con la
observación grosera de haberse dilatado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las primeras observaciones en la necropsia ya
incluían un hígado dilatado con bordes redondeados que contenía
múltiples nódulos por todas partes. Los lóbulos laterales derecho e
izquierdo destacaban especialmente y los bazos sanguíneos en el
lóbulo lateral derecho destacaban. El lóbulo medio pequeño era de
color marrón y el bazo apareció ligeramente dilatado. Al
microscopio, una sección del hígado contenía un área de adenoma
hepatocelular, y existían múltiples áreas con hiperplasia
hepatocelular nodular. El hígado también presentaba proliferación
celular sinusoidal moderada, dilatación sinusoidal y dilatación
vascular focal. Los descubrimientos en otros tejidos incluían
hiperplasia de endometrio quística del útero; infiltrado celular
mononuclear en el pulmón (peribronquial), riñones, páncreas y
glándulas salivales; hiperplasia linforreticular en el timo, bazo y
ganglios linfáticos. Los riñones presentaban una glomerulopatía
leve que se caracterizaba como aumento de material hialino en el
conducto glomerular y/o aumento del mesangio. Existían también áreas
focales de regeneración tubular y túbulos dilatados con material
acuoso con proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
En la necropsia, el hígado aparecía pálido y
contenía múltiples nódulos por todas partes. Al microscopio, el
hígado presentaba múltiples áreas de tamaño variable de hiperplasia
nodular (hepatocelular) que se correlacionan con la observación a
simple vista. El hígado también presentaba proliferación celular
sinusoidal moderada e infiltrado mononuclear, y dilatación
sinusoidal y vacuolar leve o ligera, algunas con pruebas de fibrosis
perivenular. Los riñones presentaban una glomerulopatía moderada
que se caracterizaba por el aumento de material hialino en el
conducto glomelular y/o mesangio aumentado. Existían también aéreas
focales de regeneración tubular y túbulos dilatados con material
proteínico. Los descubrimientos en otros tejidos incluían la
hiperplasia quística en el endometrio del útero; infiltrado celular
mononuclear en el pulmón (peribronquial), riñones, páncreas y
glándulas salivales; e hiperplasia linforreticular en el bazo y
ganglios linfáticos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la necropsia se observó que el hígado estaba
dilatado con vasos sanguíneos destacados, múltiples nódulos de
tamaño variable y formación de quiste focal. El lóbulo lateral
derecho presentaba una masa papilar acoplada a su superficie por un
tallo estrecho y se observaba que el lóbulo caudal estaba hinchado y
de color oscuro. Al microscopio, el hígado tenía múltiples áreas de
hiperplasia nodular (hepatocelular) y proliferación moderada de
células sinusoidales con un área focal de fibrosis perivenular.
Otros descubrimientos en este animal incluían infiltrado celular
mononuclear en el hígado, pulmones (peribronquial), riñones,
páncreas y glándulas salivales e hiperplasia linforreticular en el
timo, bazo y ganglios linfáticos. Los riñones presentaban
glomerulopatía leve o ligera similar a la descrita anteriormente
pero carecía de algunos alteraciones tubulares obvias.
En resumen, los cinco animales presentaban
alteraciones similares en los tejidos examinados al microscopio.
Los descubrimientos más destacados fueron el hígado, que eran
fenotípicos de este montaje. Existía un aumento moderado en el
número o hiperplasia de células sinusoidales, que, aunque no
identificadas positivamente, se cree que eran células estrelladas
hepáticas (HSC). La inmunohistoquímica y cepas especiales pusieron
de manifiesto que, aunque estas células no presentan ninguna prueba
de actina alfa del musculo liso (indicador de activación de HSC),
había un aumento significativo en la cantidad de colágeno
intrasinusoidal, esto último observado por tinción con rojo Sirius.
Existían algunas pruebas de fibrosis perivenular en una pareja de
animales. Puede haberse iniciado el aumento de deposición de
colágeno y/o contribuir a la hiperplasia hepatocelular y a la
formación de nódulos, lo que a su vez dio como resultado la
formación del tumor representada por los adenomas hepatocelulares
observados en algunos hígados. Todos los descubrimientos en los
tejidos restantes examinados de estos animales, tal como los
infiltrados celulares mononucleares en varios órganos, la
hiperplasia linforreticular en los tejidos linfoides y las
alteraciones renales, eran reflejo de la disminución general de la
salud de cada animal y no se cree que este directamente
relacionados con el transgén. Algunos descubrimientos son frecuentes
en la mayoría de las cepas de ratón a esta edad.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos ratones macho transgénicos, generación N4,
se sacrificaron a las 52 semanas de vida y se les practicó la
necropsia, y se realizó un examen fisiológico. Al microscopio, el
hígado fue el órgano diana primario, con multitud de alteraciones
que incluían la telangiectasia, dilatación vascular, proliferación
celular sinusoidal, hiperplasia, hepatocítica nodular y fibrosis
sinusoidal. Al menos en uno de cada dos animales, el hígado
presentaba también áreas de hemorragia, infarto, hiperplasia del
conducto biliar, formación de quistes e infiltrados celulares
linfoides. Las observaciones al microscopio en los tejidos restantes
examinados se consideraron descubrimientos fortuitos corrientes en
ratones de un año de vida.
La fibrosis hepática progresiva en estos dos
animales dio como resultado la destrucción de la arquitectura del
sistema vascular produciendo hipertensión grave demostrada por los
bazos dilatados y la telangiectasia en los sinusoides. Debido a la
extensa pérdida del parénquima hepático normal en las áreas de
telangiectasia, la gravedad de la proliferación celular sinusoidal
fue difícil de evaluar, aunque existían áreas con obvio número
creciente de estas células en ausencia de pérdida de
hepatocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un solo ratón macho transgénico AEO/zvegf3,
generación N4, se sacrificó a las 57 semanas de vida y se le
practicó la necropsia y se realizó una observación fisiológica de
rutina. En la necropsia, se observó que el hígado era deforme,
oscuro y nodular. Al microscopio, el hígado presentaba áreas de
hiperplasia celular perisinusoidal (estrellada) difusa y moderada
así como dilatación sinusoidal moderada, alteración mixomatosa,
fibrosis perivascular e hiperplasia hepatocelular nodular.
Asimismo, estaban presentes en una o más de las secciones un quiste,
un adenoma hepatocelular y un área focal de necrosis. Este último
descubrimiento se cree que representa un área de infarto que estaba
posiblemente asociada a la fibrosis y áreas de alteración
mixomatosa. Todas estas alteraciones se consideraron típicas de la
fibrosis hepática progresiva y crónica y eran similares a las
observadas en otros ratones transgénicos de este montaje y edad.
Todas las observaciones microscópicas restantes en este animal se
consideraron descubrimientos fortuitos y no relacionados con el
transgén.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sacrificaron cuatro ratones transgénicos (N4)
AEO/zvegf3 a aproximadamente las 62 semanas de vida y se les
practicó la necropsia, se recogieron los tejidos y se conservaron en
PNF (formalina neutra tamponada) al 10%. En la necropsia, se
observó que el hígado de cada uno de estos ratones estaba dilatado y
con aspecto fibroso. Todos los tejidos se cortaron y se procesaron,
se prepararon secciones y las secciones se tiñeron con hematoxilina
y eosina para un examen microscópico de rutina. Además, se tiñeron
secciones de hígado con tricromo de Masson y Rojo Sirius, y se
realizó la inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la actina
\alpha del musculo liso, desmina y colágeno de
tipo I.
tipo I.
\vskip1.000000\baselineskip
Los descubrimientos microscópicos más destacados
fueron en el hígado, siendo primero la hiperplasia/proliferación
celular sinusoidal difusa grave con áreas multifocales de
acumulación en la matriz pseudomixomatosa, esta última
caracterizada como acumulación de material ácido de tipo
mucopolisacárido rodeando las células con forma de husillo que eran
de aspecto similar a las células sinusoidales (posiblemente
estrelladas) proliferantes adyacentes. Hubo una aparente dilatación
de los vasos sanguíneos, especialmente las venas centrales, así como
las aéreas multifocales de dilatación sinusoidal y telangectasia.
Las últimas alteraciones estaban, con frecuencia, acompañadas por
un aumento de las cifras del número de células pseudoendoteliales
hinchadas, que recubren las paredes de estas áreas dilatadas.
Algunas áreas en las secciones tenían un aumento obvio de fibrosis e
indicio de formación de nódulo hepático, este último observado más
fácilmente con las secciones teñidas con tricromo y rojo sirio. La
inmunohistoquímica (IHC) demostró un aumento de la tinción con
actina alfa de los músculos lisos (actina SM), asociado
principalmente a las áreas de dilatación sinusoidal y a la
proliferación de células pseudoendoteliales, y fue muy indicadora
de posible angiogénesis. Existía también un aumento correlacionado
en la tinción para desmina. La tinción con colágeno de tipo I,
estaba correlacionada íntimamente con la fibrosis; el colágeno era
el más abundante en la fibrosis asociada a la posible formación del
nódulo hepático. En otros tejidos, los descubrimientos destacados
incluían la hiperplasia linfoide perivascular en el pulmón, un
quiste cortical en un riñón, infiltrado linfoide multifocal y
glomerulopatía difusa en ambos riñones. La glomerulopatía estaba
caracterizada por un aumento en el tamaño global de los glomérulos
así como por un aumento de celularidad. Algunos de los glomérulos,
afectados contenían gotitas eosinófilas de tamaño variable que se
creía que representan proteínas. (Estos descubrimientos en el
pulmón y en el riñón no son infrecuentes en ratones viejos y
posiblemente puede que sean consecuencia de la patología del
hígado). Los ganglios linfáticos mesentéricos se sustituyeron
completamente por un neoplasma que estaba compuesto de células con
forma de husillo impregnadas en una matriz con aspecto fibroso.
Este tumor se diagnosticó como sarcoma de células de husillo y se
consideró un descubrimiento accidental y no relacionado con el
transgén. Todas las alteraciones microscópicas observadas en los
tejidos restantes se consideraron también descubrimientos
fortuitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los descubrimientos microscópicos en este animal
fueron similares a los observados en el animal nº 24811 y de nuevo,
los descubrimientos más destacados fueron en el hígado. Sin embargo,
la diferencia principal fue la presencia de neoplasmas algo mayores
en dos o más lóbulos del hígado que estaban caracterizados por estar
compuestos por numerosas células pseudoendoteliales gruesas que
estaban recubiertas o tendían a apilarse en sinusoides dilatados y
áreas destacadas de telangiectacia. Este tumor fue diagnosticado
como hemangioendotioloma. Existían también áreas focales de
necrosis, posiblemente infarto, asociadas al neoplasma. Excepto en
ausencia de áreas mixomatosas, el hígado restante presentaba
alteraciones similares a las descritas anteriormente, es decir,
hiperplasia celular sinusoidal, hiperplasia hepatocelular nodular,
infiltrado linfoide, dilatación vascular y fibrosis. En las
secciones teñidas con IHC, la actina SM y la desmina eran las más
destacadas en el neoplasma y posiblemente eran reflejo de
angiogénesis. El colágeno de tipo I no se destacó en el tumor sino
que se destacó más en las áreas de fibrosis y de hiperplasia
nodular. Otras alteraciones destacadas en el riñón y pulmón fueron
similares tanto en la distribución como en la gravedad de los
descritos anteriormente para el animal nº 24811. Todas las
alteraciones microscópicas observadas en los tejidos restantes se
consideraron también descubrimientos fortuitos y no relacionados con
el trasgén.
\vskip1.000000\baselineskip
Los descubrimientos microscópicos en el hígado
de este animal fueron muy similares a los observados en los
animales nº 24811 y nº 24957 a excepción de una gran masa en un
lóbulo. Este neoplasma se caracterizó como una masa finamente
encapsulada compuesta de cordones de grandes hepatocitos vacuolados
separados por sinusoides dilatados con aéreas focales de micosis
debidas al infarto. Este neoplasma era característico de un adenoma
hepatocelular. Existían cantidades mínimas de actina SM, desmina y
colágenos de tipo I en el tumor, pero aumento de las cantidades de
tres de estos estaban presentes en las demás secciones del hígado,
este último fue el más destacado en las áreas con aumento de
hiperplasia celular sinusoidal y fibrosis. Las alteraciones
microscópicas en el riñón y en los pulmones fueron también similares
a las observadas en los dos animales anteriores. Todas las demás
alteraciones microscópicas observadas en los tejidos restantes se
consideraron descubrimientos fortuitos y no relacionados
directamente con el transgén.
\vskip1.000000\baselineskip
Los descubrimientos microscópicos en los tejidos
examinados procedentes de este animal fueron muy similares a los
observados en los tres ratones machos descritos anteriormente. El
hígado presentaba hiperplasia sinusoidal difusa grave, fibrosis e
hiperplasia hepatocelular nodular así como una dilatación vascular
sinusoidal, hiperplasia del conducto biliar y áreas focales de
acumulación de la matriz pseudomixomatosa. Se produjo un aumento en
la cantidad de fibrosis en todas las secciones de hígado examinadas,
que era más destacada en torno a las aéreas de formación del nódulo
hepatocítico. El aumento de la tinción para la desmina y el colágeno
de tipo I fue también destacado en estas áreas y estaba íntimamente
asociado a la fibrosis. Había algunas áreas focales de aumento de
la tinción para actina SM, pero estas estaban asociadas
principalmente a las áreas de dilatación sinusoidal y de
telangiectasia, y posiblemente representaban angiogénisis. Las
alteraciones microscópicas observadas en el riñón y pulmón eran
también similares a las descritas anteriormente. Sin embargo, el
pulmón en este animal también presentaba una pleuritis crónica
moderada caracterizada principalmente como fibrosis de la pleura.
Esta última observación así como las alteraciones observadas en los
tejidos restantes examinados se consideraron descubrimientos
fortuitos y no relacionados con el transgén.
Las alteraciones microscópicas observadas en los
hígados de estos cuatro ratones transgénicos pueden representar la
etapa final de una fibrosis crónica progresiva. El nódulo
hepatocítico y la formación del tumor son similares a las que se
atribuye a la fibrosis hepática y a la cirrosis en el hombre.
Además, es evidente el impacto de la fibrosis resultante y de la
acumulación celular sinusoidal en el sistema vascular a partir de la
dilatación vascular sinusoidal así como el desarrollo de neoplasmas
vasculares y de alteraciones preneoplásicas asociadas.
Significativamente, los resultados de la tinción con IHC para una
actina \alpha del musculo liso, que parecían estar asociados
principalmente a alteraciones angiógenas y no a las células
sinusoidales o a las áreas fibrosas, sugeriría que las células
implicadas en la matriz y la producción de colágeno pueden haberse
diferenciado en células más especializadas que han perdido su actina
y por consiguiente ya no pueden denominarse miofibrobastos.
Como se da a conocer en los ejemplos 5 a 8, doce
ratones transgénicos con zvegf3 humana AEO entre 52 y 62 semanas de
vida se sacrificaron y se practicó la necropsia. En la necropsia, se
recogieron los tejidos seleccionados y se procesaron para
evaluación microscópica dando especial atención a la patología del
hígado. En la necropsia se observó que el hígado de cada uno de
estos animales estaba dilatado de forma variable, hinchado, deforme,
anormalmente oscuro o de color claro, fibroso, nodular y/o que
contenía quistes. Al microscopio, los variables pero consistentes
descubrimientos destacados en el hígado eran fenotípicos de este
montaje transgénico. Aunque no están presentes en todos los
animales, se observaron uno o más de las siguientes alteraciones
hepáticas: aumento del número de hiperplasia de células
perisinusoidales (estrelladas), dilatación sinusoidal y vascular,
telangiectasia, formación de quistes, fibrosis perivenular e
intrasinusoidal, hiperplasia hepatocelular nodular y adenoma
hepatocelular. Ocasionalmente asociada a la fibrosis y a las células
perisinusoidales proliferantes existía una alteración mixomatosa
caracterizada por la presencia de células en forma de husillo
impregnadas en una matriz mucilaginosa. Un animal presentaba un
tumor hepático compuesto de gruesas células pseudoendoteliales
asociadas a áreas de dilatación vascular y sinusoidal. Este tumor se
caracterizó como hemangioendotelioma y su formación estaba
posiblemente relacionada con la fibrosis y las alteraciones
vasculares asociadas. Algunas de las áreas de hiperplasia nodular y
de formación de adenoma presentaban frecuentemente áreas de necrosis
que se atribuyeron al infarto.
Las alteraciones macroscópicas y las
macroscópicas correspondientes observadas en los hígados de estos
ratones transgénicos más viejos eran típicas en la etapa final de
una fibrosis progresiva y crónica. El aumento progresivo en la
deposición de colágeno y la fibrosis posterior observada es similar
a la fibrosis hepática y a la cirrosis en el hombre, y se cree
normalmente que contribuye a la hiperplasia hepatocelular nodular y
a la formación de tumor, incluyendo una evolución de hiperplasia a
adenoma a carcinoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la construcción de vectores adenovíricos,
la zona codificadora de la proteína de zvegf3 humano se amplió por
PCR utilizando cebadores que añadían secuencias de restricción Pmel
y AscI en los terminales 5' y 3' respectivamente, se utilizaron
cebadores ZC20.180 (SEC. ID. nº: 17) y ZC20.181 (SEC. ID. nº: 18) de
PCR con una plantilla de ADNc completa con zvegf3 en una reacción
de PCR de la manera siguiente: incubación a 72ºC durante 7 min.;
seguido de remojado a 4ºC. El producto de reacción se cargó en un
gel de agarosa al 1,2% de temperatura de fusión baja en tampón TAE
(Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001 M). El producto
zvegf3 de la PCR se extrajó del gel y se purificó utilizando un kit
disponible en el mercado que comprende una columna rotativa con
membrana de gel de sílice (kit de purificación por PCR
QIAquick^{TM} y kit para limpieza con gel; Qiagen, Inc.) como
para instrucciones del kit. El producto zvegf3 se digirió a
continuación con PmeI y AscI, se extrajo con fenol/cloroformo, se
precipitó con EtOH y rehidrató en 20 ml de TE (Tris/EDTA, pH 8). El
fragmento de zvegf3 de 1038 pb se ligó a continuación en las
secuencias Pmel-AscI del vector transgénico
TG12-8 (conocido también como
pHB12-8; véase el Ejemplo 4) y se transformó en
células competitivas DH10B^{TM} E. coli por
electroporación. Los clones que contienen zvegf3 se identificaron
por minipreparación del ADN plásmido seguido de digestión con PmeI
y AscI. Se secuenció un clon positivo para asegurar que no existían
eliminaciones u otras anomalías en el montaje. Se confirmó la
secuencia de ADN con zvegf3.
Se preparó ADN utilizando un kit disponible en
el mercado (Maxi Kit, Qiagen, Inc.) y se liberó el ADNc con zvegf3
de 1038 pb del vector pTG12-8 utilizando las enzimas
PmeI y AscI. Se aisló el ADNc en un gel de agarosa de bajo punto de
fusión al 1% y se extrajo del gel. La oblea de gel se fundió a 70ºC
y el ADN se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol
tamponado con Tris y se precipitó con EtOH. Se volvió a poner en
suspensión ADN en 10 \mul de H_{2}O.
Se clonó el ADNc con zvegf3 en las secuencias
EcoRV-AscI de un cAdTrack-CMV
modificado (He, T-C. et al., Proc.Natl.
Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998). Este montaje
contiene el gen marcador de la proteína verde fluorescente (GFP).
La expresión de GFP que conduce al activador CMV se sustituyó con el
activador SV40 y la señal de poliadenilación SV40 se sustituyó con
la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano.
Además se sustituyó el polienlazador natural con las secuencias
FseI, EcoRV, y AscI. Esta forma modificada de
pAdTracK-CMV se denominó pZyTrack. Se efectúo la
ligadura utilizando un ligadura de ADN disponible en el mercado y
el kit de identificación (Fast-Link^{TM} Kit;
Epicentre Technologies, Madison, WI). Se identificaron los clones
que contienen zvegf3 por digestión de ADN de minipreparación con
Fsel y AscI. Con el fin de alinear el plásmido, aproximadamente 5
\mug del plásmido pZyTracK zvegf3 resultante se dirigió con Pmel.
Aproximadamente 1 \mug del plásmido linealizado se cotransformó
con 200 mg de pAdEasy superenrollado (He et al., Ibid) en la
células BJ5183 de E. Coli (He et al., ibid). La
cotransformación se realizó utilizando equipo de electroporación
disponible en el mercado (Gene Pulser®; Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA) a 2,5 kV, 200 ohmios y 25 \muFa. La
mezcla de cotransformación completa se colocó en 4 placas LB que
contenían 25 \mug/ml de kanamicina. Se recogieron las colonias
más pequeñas y se expandieron Lb/kanamicina y se identificó el ADN
adenovírico recombinante por procedimientos de minipreparación de
ADN convencional. La digestión del ADN adenovírico recombinante con
Fsel y AscI confirmó la presencia de la inserción zvegf3. El ADN de
minipreparación de adenovirus recombinante se transformó de células
competitivas DH10B^{TM} de E., Coli y se preparó ADN
utilizando un kit de purificación de ADN disponible en el mercado
(adquirido en Qiagen, Inc.) según las instrucciones del kit.
Aproximadamente 5 \mug de ADN de adenovirus
recombinante se digirieron con la enzima Pacl (New England Biolabs)
durante 3 horas a 37ºC en un volumen de reacción de 100 \mul que
contenía 20 a 30 U de PacI. El ADN digerido se extrajo dos veces
con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó con etanol.
Se volvió a poner en suspensión el sedimento de ADN en 10 \mul de
agua destilada. Un matraz T25 de células QBI-293A
(Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canadá), inoculadas el
día anterior y cultivadas a 60-70% de confluencia,
se transfectaron con el ADN digerido con PacI. El ADN digerido con
PacI se diluyó hasta un volumen total de 50 \mul con HBS
esterilizado (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM). En un tubo aparte 20 \mul
de 1 mg/ml de sales
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propiI]-N,N,N-trimetiI-amonio
(DOTAP) (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN) se diluyó hasta un
volumen total 100 \mul con HBS. El ADN se añadió al DOTAP, se
mezcló suavemente pipeteando arriba y abajo, y se dejó a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Se separó el medio de las
células 293A y se lavó con 5 ml de medio alfa esencial mínimo
exento de suero (MEM) que contenía piruvato sódico 1 mM, aminoácidos
no esenciales en MEM 0,1 mM y tampón HEPES 25 mM (reactivos
adquiridos en Life Technologies, Gaithersburg. MD). Se añadieron 5
ml de MEM exento de suero y la células se mantuvieron a 37ºC. La
mezcla ADN/lípido se añadió gota a gota a los matraces de las
células, se mezcló suavemente y se incubó a 37ºC durante 4 horas.
El medio que contiene la mezcla ADN/lípido se aspiró a continuación
y se sustituyó con 5 ml de MEM completo que contenía suero bobino
fetal al 5%. En las células transfectadas se controlaron la
expresión de GFP y la formación de focos (placas víricas).
Siete días después de la transfección de las
células 293 A con el ADN adenovírico recombinante las expresaron a
GFP y comenzaron a formar focos. Se recogió el lisado vírico en
bruto utilizando un rascador de células para recoger todas las
células 293 A. Se transfirió el lisado a un tubo cónico de 50 ml.
Para liberar la mayor parte de las partículas de virus de las
células, se efectuaron tres ciclos de congelación/descongelación en
un baño con hielo/etanol y un baño de agua a 37ºC.
El lisado en bruto se amplió (ampliación
primaria (1ª)) para obtener una solución madre de trabajo del lisado
de rAdV con zvegf3. Diez placas de 10 cm de células 293A
(80-90%) casi confluentes se crearon 20 horas antes,
a continuación se añadieron 200 \mul de lisado rAdV en bruto a
cada placa 10 cm, y las placas se controlaron durante 48 a 72 horas
buscando el efecto citopático (CPE) bajo el microscopio de luz
blanca y la expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente.
Cuando todas las células mostraban el CPE se recogió este primer
lisado de solución madre y se realizaron ciclos de
congelación/descongelación tal como se describió anteriormente.
La segunda (2ª) ampliación de rAdV con zvegf3 se
obtuvo de la manera siguiente: Se prepararon veinte placas de
cultivo de tejido de 15 cm de células 293 A de modo que las células
eran 80 y 90% confluentes. Todo el medio MEM al 5% menos 20 ml se
retiró y cada placa se inoculó con 300 a 500 \mul del primer
lisado d rAdV ampliado. Después de 48 horas se lisaron las células
de la producción de virus, se recogió el lisado en botellas de
centrifuga de polipropileno de 250 ml y se purificó el rAdV.
Se añadió detergente NP-40 a una
concentración final de 0,5% de las botellas de lisado en bruto con
objeto de lisar todas le células. Se colocaron las botellas en una
plataforma rotativa durante 10 minutos agitando tan rápido como era
posible sin que cayeran las botellas. El residuo se sedimentó por
centrifugación a 20.000 X G durante 15 minutos. El sobrenadante se
transfirió a botellas de centrifugadora de policarbonato de 250 ml
y se añadió un volumen de 0,5 de solución PEG8000 al 20%/NaCl 2,5 M.
Se agitaron las botellas durante la noche en hielo. Se
centrifugaron las botellas a 20.000 X G durante 15 minutos y se
descartó el sobrenadante en una solución de blanqueador. Utilizando
un rascador de células esterilizado, el precipitado blanco de
virus/PEG de dos botellas se volvió a poner en suspensión en 2,5 ml
de PBS. La solución de virus resultante se colocó en tubos de
microcentrifuga de 2 ml y se centrifugó a 14.000 X G en la
microcentrifugadora durante 10 minutos para separar cualquier
residuo adicional de células. El sobrenadante de los tubos de
microcentrifugadora de 2 ml se transfirió a un tubo de cierre a
presión de polipropileno de 15 ml y se ajustó a una densidad de 1,34
g/ml con CsCl. Se estimó el volumen de solución de virus y se
añadieron 0,55 g/ml de CsCl. Se disolvió CsCl y 1 ml de esta
solución pesaba 1,34 g. Se transfirió la solución a tubos de
centrifugadora de pared gruesa de policarbonato de 3,2 ml y se
centrifugó a 348.000 X G durante 3 a 4 horas a 25ºC. El virus formó
una banda blanca. Utilizando puntas de pipeta de boca ancha, se
recogió la banda de virus.
El virus recuperado del gradiente tenía una gran
cantidad de CsCl, que tenía que eliminarse antes de utilizar el
virus en las células. Se utilizaron columnas de intercambio iónico
disponibles en el mercado (columnas PD-10 rellenas
previamente con Sephadex® G-25M; Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ) para desalar la preparación del virus. Se equilibró
la columna con 20 ml de PBS. Se cargó el virus y se dejó desarrollar
en la columna. Se añadieron 5 ml de PBS a la columna, y se
recogieron fracciones de 10 a 8 gotas. La densidad óptica de una
dilución 1:50 de cada fracción se determinó a 260 nm en un
espectrofotómetro. Un pico de absorbancia transparente estaba
presente entre las fracciones 7-12. Se agruparon las
fracciones del pico, y se determinó la densidad óptica (D.O) de una
dilución 1:25. La D.O. se convirtió a la concentración de virus
utilizando la formula: (OD a 260 nm)(25)(1,1x10^{12})=
viriones/ml. La D.O. de una dilución 1:25 del rADV con zvegf3 fue
0,145 dando una concentración de virus de 4x10^{12}
viriones/ml.
Para almacenar el virus, se añadió glicerol más
virus purificado hasta una concentración final de 15%, se mezcló
suavemente pero con eficacia y se almacenó en alícuotas a -80ºC.
Se siguió un protocolo desarrollado por Quantum
Biotechnologies, Inc. (Montreal. Canadá) para medir la capacidad de
infección del virus recombinante. En resumen, se sembraron dos
placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 1x10^{4} células
293A por pocillo en MEM que contenía suero bovino fetal al 2% para
cada virus recombinante que ha de ensayarse. Tras 24 horas se
realizaron diluciones de 10 veces de cada virus desde 1x10^{-2}
hasta1x10^{-14} en MEM que contenía suero bovino fetal al 2%. Se
colocaron 100 \mul de cada dilución en cada uno de los 20
pocillos. Después de 5 días a 37ºC, se leyó el CPE positivo o
negativo en los pocillos y se calculó un valor para las unidades
formadoras de placa (pfu)/ml.
La formulación de TCID_{50} utilizada fue como
para Quantum Biotechnologies, Inc., anteriormente. Se determino el
valor (T) de una placa en la que el virus se diluyó desde 10^{-2}
a 10^{-14}, y se leyó 5 días después de la infección. Se
determinó a cada dilución una relación (R) de pocillos positivos al
CPE para el número total de pocillos. Para calcular el valor de la
muestra de virus no diluida: el factor, F' =
1+d(S-0,5); en la que "S" es la suma de
las relaciones (R); y "d" es el log 10 de la dilución en serie,
por ejemplo, "d" es igual a 1 para una dilución en serie de
diez veces. El valor de la muestra no diluida es
T=10^{(1+F)}=TCID_{50}/ml. Para convertir TCID_{50}/ml en
pfu/ml, se sustrajeron 0,7 del exponente en el calculo del valor
(T).
El adenovirus zvegf3 tenía un valor de 1,8 x
10^{10} pfu/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon anticuerpos
anti-péptido policlonales inmunizando dos conejos
blancos New Zealand hembra con los péptidos
huzvegf3-1 (restos 80-104 de la SEQ
I.D. nº: 2) huzvegf3-2 (restos
299-314 de la SEQ I.D. nº:2),
huzvegf3-3 (restos 299-326 de la SEQ
I.D. nº: 2 con un resto cys N-terminal) o
huzvegf3-4 (restos 195-225 de la
SEQ I.D. nº: 2 con un resto cys C-terminal). Se
sintetizaron los péptidos utilizando un sintetizador de péptidos
modelo 431A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster
City, CA) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos
huzvegf3-1, huzvegf3-3 y
huzvegf3-4 se conjugaron a continuación con
hemocianina de lapa californiana (KLH) activada con la proteína
vehículo maleimida mediante los restos de cisteína (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL). El péptido huzvegf3-2 se conjugó
con la proteína portadora KLH utilizando gluteraldehído. Se puso a
cada conejo una inyección intraperitoneal (IP) de 200 \mug de
péptido conjugado en adyuvante completo de Freund (Pierce Chemical
Co.) seguido de inyecciones IP de refuerzo de 100 \mug de péptido
conjugado adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. Enre
siete y diez días después de la administración de la tercera
inyección de refuerzo, se extrajo sangre a los animales y se recogió
el suero. Se suministró un refuerzo a los conejos y se les extrajo
sangre cada tres semanas.
Los anticuerpos específicos para péptido
huzvegf3 se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo
utilizando una columna de péptido 4B CNBr-Sepharose®
que se preparó utilizando 10 mg de los péptidos respectivos por
gramo de CNBr-Sepharose®; seguido en diálisis PBS
durante la noche: los anticuerpos huzvegf3 específicos para el
péptido se caracterizaron mediante una comprobación de valor de
ELISA utilizando 1 \mug/ml del péptido apropiado como objetivo
del anticuerpo. Los anticuerpos específicos para el péptido
huzvegf3-1 tenían un limite inferior de detección
(LLD) de 500 pg/ml por ELISA en anticuerpo objetivo apropiado y se
reconoció la proteína recombinante completa
(MBP-fusión) por ELISA. Los anticuerpos específicos
para el péptido huzvegf3-2 tenían una LLD de 1
ng/ml por ELISA. Los anticuerpos específicos para el péptido
huzvegf3-3 tenían una LLD de 50 pg/ml por ELISA y
la proteína recombinante se reconoció por análisis de
inmunotransferencia Western. Los anticuerpos específicos para el
péptido huzvegf3-4 tenían una LLD de 50 pg/ml por
ELISA y la proteína recombinante reconocida por análisis de
inmunotransferencia Western.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo antisuero policlonal, denominado
"E2243" en un conejo por inmunización con el polipéptido zvegf3
humano completo fusionado a la proteína de fijación a la maltosa
(MBP) de E. Coli y se purificó por afinidad utilizando la
proteína de fusión. Se examinó la especificidad del antisuero en
formato de inmunotrasferencia Western en el que se redujeron las
muestras de varias proteínas zvegf3 y se realizó la electroforesis
en un gel de poliacrilamida. Las proteínas utilizadas fueron:
dominio del factor de crecimiento de zvegf3 humano recombinante,
zvegf3 humana recombinante completa y zvegf3 humana recombinante
completa fusionada a MBP, cada una a concentraciones 13,9, 41,7 y
125 ng/banda; y medio acondicionado de las células HaCat que
expresan a zvegf3 humana completa. Las proteínas electroforizadas
se transfirieron a continuación a una membrana de nitrocelulosa, se
enjuagaron y se bloquearon por incubación durante la noche en tampón
que contenía leche en polvo sin grasa al 2,5%. El anticuerpo
primario (antisuero E2243) se diluyó a 300 ng/ml y se añadió a la
inmunotransferencia de nitrocelulosa, que se incubó a continuación
durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La
transferencia se enjuagó a continuación, se añadió anticuerpo
secundario (IgG anti-conejo conjugada con
peroxidasa de rábano picante) y la transferencia se incubó durante 1
hora a temperatura ambiente con agitación. Se enjuagó a
continuación la inmunotransferencia, se desarrolló con sustratos
disponibles en el mercado y se expuso a una película durante 10
segundos. La inmunotransferencia Western demostró que el antisuero
E2243 reconocía todas las muestras de zvegf3 completa (fusionada y
sin fusionar) y la zvegf3 en medio acondicionado, pero no reconoció
ninguna de las muestras del dominio del factor de crecimiento de
zvegf3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron hibridomas de ratón que producen
anticuerpos monoclonales (MAb) específicos para la proteína con
dominio del factor de crecimiento (GFD) con zvegf3 humana
recombinante utilizando GFD con zvegf3 humana recombinante,
purificada y sin etiqueta producida en las células BHK
(huzvegf3-GFD-BHK). Se inyectó IP a
cada uno de los diez ratones BALB/c el día uno 20 \mug de
huzvegf3-GFD-BHK, se mezcló 1:1
(v/v) en adyuvante completo de Freund. Se inyectó IP posteriormente
a cada ratón 10 \mug de
huzvegf3-GFD-BHK se mezcló 1:1
(v/v) en adyuvante incompleto de Freund los días 15, 29, 41, 57, 71,
89 y 115. El día 118, se fusionaron los esplenocitos y linfocitos
de los ganglios linfáticos dilatados de dos ratones con el valor
mayor del anticuerpo anti-huzvegf3 (determinado en
un ELISA de captura de huzvegf3-GFD biotinilado;
véase a continuación) se fusionaron en una proporción 2,76:1 con la
estirpe celular de mieloma de ratón X63-Ag8.653
(Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-1550,
1979) esencialmente como fue dado a conocer por Lane (J. Immunol.
Methods 81:223-228, 1985). La mezcla de fusión
se colocó en 24 placas de 96 pocillos con una densidad media de 1,2
x 10^{5} células totales/pocillo en el medio de Dulbecco
modificado por Iscove (IMDM; Live Technologies Inc. Gaithersburg,
MD) que contenía 10% de suero fetal de clon I (HyClone Laboratories,
Inc. Logan, UT), 10% de complemento de clonación de hibridoma (BM
Condimed® H1; Roche Diagnostics Corp., Indianapolis IN),
L-glutamina 2 mM (Life Technologies Inc.), 100 U/ml
de penicilina G sódica (Life Technologies Inc.) y 100 \mug/ml de
sulfato de estreptomicina (Life Technologies Inc.). Se alimentaron
los pocillos los días 4 y 7 por aspiración y sustitución de
aproximadamente tres cuartos de los contenidos del medio en cada
pocillo. Esta fusión se denominó HH1.
Se detectaron los mAb
anti-huzvegf3 de clase IgG los días 9/10 después de
la fusión utilizando una ELISA de captura de
huzvegf3-GFD biotinilado. Se recubrieron los
pocillos de las placas (Immunol® II; Dinex Technologies, Chantilly,
VA) con 1 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra
(adquirido en Kirkegaard & Perry Laboratories Gaithersburg, MD)
en tampón de carbonato/bicarbonato 0,05 M (Sigma, St Louis, MO), 50
\mul/pocillo. Se incubaron las placas a 4ºC durante la noche, a
continuación se lavaron tres veces con solución salina tamponada con
fosfato que contenía 0,05% de monolaurato de polioxietilensorbitán
(Tween 20) (PBST) para eliminar el anticuerpo no ligado. Se
bloquearon los pocillos con PBST que contenía albúmina de suero
bovino (Sigma) al 1% (p/v) (Tampón PTB), 200 \mul/pocillo,
durante 1 hora a temperatura ambiente (T.A.), a continuación se
lavaron como anteriormente. Los sobrenadantes del cultivo de las
placas de fusión se colocaron en placas de réplica en placas
recubiertas con anticuerpo, 100 \mul/pocillo y se incubaron a
T.A.. durante 1 hora. Se biotiniló la proteína
zvegf3-GFD humana con
sulfo-NHS-LC-biotina
(Pierce Chemical Company, Rockford, IL), según las instrucciones del
fabricante durante 45 minutos a T.A. Se interrumpió la reacción con
glicina 2 M. La proteína biotinilada se diluyó hasta 1 \mug/ml en
tampón PTB. Se lavaron las placas cuatro veces con PBST,
zvegf3-GFD biotimilada se añadió a razón de 100
\mul/pocillo y las placas se incubaron a T.A. durante 1 hora. Se
lavaron las placas a continuación cuatro veces con PBST, y se
diluyó estreptavidina conjugada con HRP (Pierce Chemical Company) se
diluyó hasta 0,5 \mug/ml en tampón TPB y se añadió a las placas a
razón de 100 \mul/pocillo. Se incubaron las placas a T.A. durante
1 hora, a continuación se lavaron cinco veces con PBST. Se diluyó
1:100 el sustrato TMB (EIA chromagen, nº de Cat. R6R; Genetic
Systems Corp.) en tampón de sustrato (Genetic. Systems Corp.) y se
añadieron a las placas a razón de 100 \mul/pocillo. Se incubaron
las placas 10 a 15 minutos a T.A. en la oscuridad. Se interrumpió
el desarrollo de color por adición de 100 \mul/pocillo de
H_{2}SO_{4} 1 N. Se leyó la densidad óptica en un lector de
placas ELISA (Molecular Devices Sunnyvale, CA) a longitudes de onda
de 450 mm (L1) y 650 mm (L2). Se determinó la medición final de
D.O. mediante la fórmula L1-L2.
78 pocillos patrón contenían un anticuerpo que
fue capaz de capturar huzvegf3-GFD biotinilado.
Estos pocillos patrón se expandieron para crioconservación del
híbrido y generación de sobrenadante adicional. El análisis por
ELISA de los sobrenadantes del pocillo patrón expandido demostró que
27 de los 78 pocillos patrón originales conservaban el anticuerpo
específico para huzvegf3-GFD, poseyendo 20 de 27
reactividad significativa con el antígeno.
Se clonaron seis de los pocillos patrón
designados limitando la dilución a una densidad inferior a una
célula por pocillo. Se evaluó la monoclonalidad por examen al
microscopio de los pocillos para un solo foco de crecimiento
celular. Se ensayó el anticuerpo específico en los clones por el
mismo ensayo utilizado en la criba patrón. Cinco a seis de los
clones más fuertes se expandieron brevemente. Los sobrenadantes de
estos clones se diluyeron en serie a continuación y se analizaron
por ELISA para identificar los tres clones que producen el mejor
anticuerpo. En la verificación, el mejor clon de cada pocillo
patrón se volvió a clonar posteriormente y se ensayó como se
describió anteriormente.
Seis de los clones de la segunda ronda con
valoración mayor se adaptaron al crecimiento en medio de
fusión/clona-
ción menos la adición de suplemento de clonación de hibridoma. Cada uno de los clones se adaptó posteriormente al crecimiento en una formulación del medio de producción que consiste esencialmente en medio de Eagle modificado por Dulbecco + 2,5% de suero de clon 1 fetal y varios complementos. Se diluyeron de nuevo en serie los sobrenadantes y se analizaron por ELISA en huzvegf3-GFD para identificar los clones valorados más alto y los siguientes valorados más altos (denominados clones primarios y secundarios, respectivamente): el MAb producido por cada serie de clones se evaluó a continuación para la sub clase IgG utilizando el kit de subtipado de hibridoma de ratón (Cat. nº 1183117; Roche Diagnostics Corp.). Los clones HH1-24, -40, -57 y 76 se observó que todos producían un anticuerpo IgG_{1}. Los clones HH1-58 y -78 produjeron un anticuerpo IgG_{2b}. Todos los anticuerpos poseían una cadena ligera \kappa.
ción menos la adición de suplemento de clonación de hibridoma. Cada uno de los clones se adaptó posteriormente al crecimiento en una formulación del medio de producción que consiste esencialmente en medio de Eagle modificado por Dulbecco + 2,5% de suero de clon 1 fetal y varios complementos. Se diluyeron de nuevo en serie los sobrenadantes y se analizaron por ELISA en huzvegf3-GFD para identificar los clones valorados más alto y los siguientes valorados más altos (denominados clones primarios y secundarios, respectivamente): el MAb producido por cada serie de clones se evaluó a continuación para la sub clase IgG utilizando el kit de subtipado de hibridoma de ratón (Cat. nº 1183117; Roche Diagnostics Corp.). Los clones HH1-24, -40, -57 y 76 se observó que todos producían un anticuerpo IgG_{1}. Los clones HH1-58 y -78 produjeron un anticuerpo IgG_{2b}. Todos los anticuerpos poseían una cadena ligera \kappa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emprendió un estudio para determinar si
zvegf3 administrado adenovíricamente estimulaba la proliferación
celular determinada por incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU)
en los tejidos.
Se dividieron los ratones (macho C57B1, 7
semanas de vida) en tres grupos. El día 0 se administró por vía
parental adenovirus con zvegf3 al primer (n=11) y segundo (n=12)
grupos respectivamente por la vena de la cola recibiendo cada ratón
una dosis de \sim1 x 10^{11} partículas en un volumen de \sim
0,1 ml. El tercer grupo (n=8) no recibió tratamiento. Se
administraron a cada ratón dos dosis intraperitoneales de 3 mg de
solución de BrdU preparada recientemente a aproximadamente 24 y 12
horas del sacrificio. Los días 2, 4, 6, 8 y 10, dos ratones de cada
grupo de tratamiento y uno o dos ratones no tratados se
sacrificaron, y se recogieron los tejidos y la sangre. Se
analizaron las muestras para recuento de sangre completa (CBC) y
análisis químico del suero y se prepararon obleas para análisis de
sangre diferencial manual y de las células madre de la médula. Se
sometieron un fémur, un pulmón, un corazón, un timo, un hígado, un
riñón, un bazo, un páncreas, un duodeno, y ganglios linfáticos
mesentéricos a histología convencional y evaluación por
incorporación de BrdU. La íntima del duodeno sirvió como tejido de
referencia para la incorporación de BrdU.
Además, dos ratones que recibieron
aproximadamente la mitad de la dosis de partículas de adenovirus con
zvegf3 y un ratón que recibió la dosis completa de adenovirus
paterno se sacrificaron y se analizaron tal como se describió
anteriormente el día 16.
Una pieza de hígado de cada ratón se rasuró para
el ensayo con ARNm de la proteína de adenovirus para examinar el
transcurso de tiempo de la expresión de las preparaciones de
adenovirus.
Al comienzo del día 6, la mayoría de los
animales tratados con adenovirus presentaban hígados y bazos
visiblemente dilatados en comparación con los ratones no tratados.
Los hígados de los ratones tratados con adenovirus con zvegf3
tendían a parecer más pálidos que los animales tratados con el virus
paterno. Se observó proliferación de células sinusoidales en el
hígado. La inspección visual sugirió que estas células eran células
estrelladas y/o fibroblastos. El color del bazo fue el mismo en
ambos grupos. La mayoría de los animales que recibieron el
adenovirus con zvegf3 presentaba las diáfasis de fémur más pálidas,
con la médula de color más claro.
Las CBC de la sangre periférica presentaban una
diferencia posible en los recuentos de plaquetas, pero no en los
recuentos de RBC o WBC entre los animales tratados con virus zvegf3
y paterno. En comparación con los grupos sin tratar y tratados con
virus paterno, en grupo con zvegf3 presentaba recuentos de plaquetas
menores los días 2,4, 6 y 8 pero no el día 10. El volumen de
plaquetas medio (tamaño medio de las plaquetas individuales) en el
grupo con zvegf3 tendía también a ser mayor, coherente con el
aumento relativo en la población mayor de plaquetas inmaduras.
El marcado con BrdU presentaba un aumento de la
proliferación celular en el riñón, principalmente en la médula y en
una medida inferior en la corteza celebrar. Las células
proliferantes parecían ser células intersticiales, que pueden haber
incluido fibroblastos y/o células del mesangio.
\vskip1.000000\baselineskip
En la proteína con dominio del factor de
crecimiento con zvegf3 humano producidas en células BHK se determinó
la capacidad para estimular la producción de
TGF-\beta en células estrelladas. Se colocaron en
grupos de cultivo tisular en placas de 48 pocillos células
estrelladas hepáticas de rata (conseguidas del Dr. Nelson Fausto,
Universidad de Washington) (Costar®: Corning: Corning. NY) en medio
de crecimiento DMEM (Life Technologies, Inc.) enriquecido con
piruvato y suero al 10% (HyClone Laboratories, Inc.). En la
confluencia, el medio se cambió por medio exento de suero
sustituyendo BSA al 0,1% (Fracción V; Sigma. St. Louis, MO) por
suero. 48 horas después, se cambió el medio, se sustituyó por el
mismo medio exento de suero, y se añadió la proteína GFD con zvegf3
a 100 ng/ml en los pocillos. 48 horas después, se recogió el medio
acondicionado y se centrifugó para deshacerse de las células
exentas de células flotantes o de los desechos. Las concentraciones
de TGF- \beta1 se determinaron en estos medios utilizando el kit
ELISA disponible en el mercado (R&D Systems, St. Paul, MN). La
estimulación de las células estrelladas con 100 ng/ml de GFD con
zvegf3 produjo un aumento de 5 veces aproximadamente en la
producción de TGF-\beta en comparación con una
referencia de BSA.
<110> ZymoGenetics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DEL
CARCINOMA HEPATOCELULAR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03-14PC
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/490,047
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-07-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1760
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (154)...(1191)
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 345
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 2
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\newpage
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<210> 3
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<211> 3571
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1049)...(2086)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 345
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 4
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<211> 370
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 6
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<210> 8
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<211> 21
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<210> 9
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 10
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\hfill25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<210> 12
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipggtaaatgga gcttggctga g
\hfill21
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<210> 13
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 13
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipggtatggagc caggggcaag ttggg
\hfill25
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<210> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleótido
\newpage
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipcttttgctag cctcaaccct gactatc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador oligonucleótido ZC20,180
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcgcggttt aaacgccacc atgagcctct tcggg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleótido ZC20,181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtatcggcg cgccctatcc tcctgtgctc cc
\hfill32
Claims (6)
1. Utilización de un antagonista de zvegf3 en la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de carcinoma
hepatocelular en un mamífero, por ejemplo, en la que debe medirse la
respuesta tumoral como respuesta completa, respuesta parcial o
reducción en la duración de la progresión, y en la que el
antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3 que se une
específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas
polipeptídicas, estando constituida cada una de dichas cadenas
polipeptídicas por una secuencia de restos de aminoácidos
seleccionados de entre el grupo constituido por:
restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y
restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización de un antagonista de zvegf3 en la
preparación de un medicamento destinado a reducir la proliferación
de células cancerosas en un mamífero con carcinoma hepatocelular, en
la que el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3
que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos
cadenas polipeptídicas, en la que cada una de dichas cadenas
polipeptídicas comprende una secuencia de restos de aminoácidos
seleccionados de entre el grupo constituido por:
restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;
restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y
restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en
la que el anticuerpo anti-zvegf3 es un anticuerpo
monoclonal.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgG.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el medicamento está destinado a la
administración del antagonista de zvegf3 por infusión
intravenosa.
6. Antagonista de zvegf3 según la reivindicación
1, destinado a su utilización en el tratamiento del carcinoma
hepatocelular en un mamífero o en la reducción de la proliferación
de células cancerosas en un mamífero con carcinoma hepatocelular,
opcionalmente en el que el anticuerpo se define con más detalle por
las características según cualquiera de las reivindicaciones 3 a
5.
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