ES2253223T3 - Diagnostico y tratamiento de tumores neuroectodermicos. - Google Patents

Diagnostico y tratamiento de tumores neuroectodermicos.

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ES2253223T3
ES2253223T3 ES00926105T ES00926105T ES2253223T3 ES 2253223 T3 ES2253223 T3 ES 2253223T3 ES 00926105 T ES00926105 T ES 00926105T ES 00926105 T ES00926105 T ES 00926105T ES 2253223 T3 ES2253223 T3 ES 2253223T3
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Abstract

Uso de una composición farmacéutica que comprende clorotoxina condensada a un resto citotóxico para la elaboración de un medicamento para tratar un tumor neuroectodérmico, en la que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing.

Description

Diagnóstico y tratamiento de tumores neuroectodérmicos.
Antecedentes de la invención Leyenda acerca de los fondos federales
Esta invención se produjo en parte usando fondos del gobierno Federal bajo subvención de NIH Nº.: R01 NS 36692. De acuerdo con ello, el gobierno federal tiene ciertos derechos en esta invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a los campos de la fisiología celular, neurología, biología del desarrollo, y oncología. Más específicamente, la presente invención se refiere a usos novedosos de una proteína citoplásmica sensible a clorotoxina para la elaboración de un medicamento para la diagnosis y tratamiento de tumores neuroectodérmicos seleccionados del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing.
Descripción de la técnica relacionada
Durante el embarazo embrionario, el futuro sistema nervioso se forma a partir de una capa especializada de células ectodérmicas llamadas el neuroectodermo. Esta capa se extiende longitudinalmente a lo largo del eje del cuerpo de forma congruente con la futura columna vertebral. Una invaginación del neuroectodermo da origen al tubo neural del cual se desarrollan esencialmente todos los componentes del sistema nervioso incluyendo la médula espinal. Los grupos celulares especializados a lo largo del borde del tubo neural que se invagina permanecen separados del tubo y de la cresta neural. Estas células neuroectodérmicas altamente migratorias dan origen a células especializadas por todo el cuerpo incluyendo células de Schwan, células neuronales del sistema nervioso periférico (PNS) (neuronas entéricas, parasimpáticas, simpatoadrenales, y neuronas sensoriales), células pigmentarias (melanocitos), células endocrinas y células que forman tejido conectivo de la cara y cuello. Dado que estas células muestran un origen embrionario común con las células del sistema nervioso central, no es sorprendente que estas células, o los tumores desarrollados a partir de estas células, compartan algunos fenotipos genéticos y antigénicos con células del sistema nervioso central.
Por ejemplo, los melanomas y glioblastomas presentan una mutación común en el gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (1). Los astrocitomas y neurocitomas malignos no sólo expresan altos niveles de los receptores de factores de crecimiento epidérmico sino también receptor del factor de crecimiento endotelial (VEGF-R) y factor receptor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R) (2). Se ha demostrado una alta expresión de la variante mutante, EGFRvIII, en tumores gliales al igual que las proteínas de la matriz extracelular, GP 240 y tenascina (3). Tenascina y el gangliósido-3',6'-isoLD1 se han encontrado tanto en gliomas como en tejidos tumorales neuroectodérmicos primitivos (3). En otro estudio, los anticuerpos para tenascina se unen extensivamente a los gliomas del SNC y también a los melanomas, y carcinomas de mama, pulmón y células escamosas (4). Otro gangliósido, GD2, ha mostrado ser un marcador antigénico común tanto en gliomas como en tejidos tumorales neuroectodérmicos primitivos (5). Otros antígenos comunes entre melanomas y gliomas se demostraron mostrando que los productos de los genes Tyr, TRP-1, TRP-2 y gp100 se encuentran comúnmente tanto en tumores de tipo melanoma como en tumores de tipo glioma (6). Las citoquinas comunes o sus tumores de unión a receptores de astrocitomas, ependimomas, y tumores neuroectodérmicos primitivos se han identificado como: interleuquina (IL) IL-1 alfa, IL-1, IL-R1, antagonista de IL-R1 y factor de crecimiento transformante (TGF) TGF-beta 1 (11).
Otra clase de proteínas usadas como marcadores para gliomas y tumores neuroectodérmicos primitivos son las proteínas citoesqueléticas, neurofilamento (NF), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), filamentos intermedios (IF), filamento proteico asociado intermedio (IFAP), vimentina, nestina y queratinas. Estos marcadores se han usado para determinar fases de diferenciación por todas las diversas líneas celulares (12). El marcador citoesquelético de IFAP de 300 kilodaltons, un marcador de glía inmadura (13) es evidencia nueva que vincula a los astrocitomas con ciertos tumores de tipo tumor neuroectodérmico primitivo.
Se pueden elaborar argumentos adicionales a favor de un vínculo estrecho de células derivadas neuroectodérmicamente en el sistema nervioso central y periferia basados en su dependencia similar en influencias epigenéticas. Por ejemplo, las neuronas precursoras simpatoadrenales requieren factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) para proliferar y diferenciarse, pero la supervivencia de estas células depende de la capacidad de respuesta al factor de crecimiento nervioso (NGF) y disponibilidad del factor de crecimiento nervioso (14). Se requiere un escenario similar para cada uno de los otros tipos celulares. No sólo son necesarios factores de crecimiento y tróficos sino que se necesitan citoquinas y hormonas para enlaces los cuales permanecen para elucidarse entre tumores neuroectodérmicos primitivos y gliomas.
Sin embargo, a pesar de esta lista de similaridades compartidas entre las células derivadas neuroectodérmicamente, estas células son entidades distintas con características únicas citológicas, bioquímicas y funcionales. Es más, la lista de características únicas no compartidas con otras células derivadas neuroectodérmicamente excede con mucho los fenotipos compartidos anteriormente mencionados. Así, alguien no puede asumir a priori que la expresión de cierto antígeno o fenotipo se espera en un tipo celular dado en base a la expresión por otro miembro de los tipos celulares derivados neuroectodérmicamente.
Los neuroblastomas expresan generalmente un incremento selectivo en el número de copias génicas del gen MYCN en estados fetales de desarrollo cerebral que sugieren vínculos entre el origen de las células y la capacidad de las células neoplásicas para desdiferenciarse (7). Sin embargo, este gen ya se ha demostrado en las células de glioma. Se han demostrado otras proteínas que no son comunes tanto para glioma como para tumores neuroectodérmicos primitivos. La inmunorreactividad a CD99 se usa como una herramienta en identificar tumores neuroectodérmicos primitivos (8) y se ha mostrado en tumores de sarcoma de Ewing aunque no en gliomas (9). Otro factor, factor de células madre y su receptor, c-kit, se expresan también tanto en tumor neuroectodérmico primitivo como en tumores del Sarcoma de Ewing (10).
El origen común y la capacidad de respuesta a señales internas y externas durante los procesos de desarrollo normal sugieren que las células del sistema nervioso central y las células derivadas neuroectodérmicamente periféricas pueden compartir también mecanismos comunes durante desarrollos patológicos como por ejemplo, durante neoplasia. Tales tejidos neoplásicos incluyen gliomas del SNC que son células tumorales derivadas de la glía específicas del SNC. Ellos sólo metastatizan en el SNC incluida la médula espinal. Se cree que se originaron a partir de al menos tres linajes separados bien a partir de células precursoras indiferenciadas o bien mediante la desdiferenciación de astrocitos, oligodendrocitos u otras células ependimales.
Los tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET) se encuentran tanto en el SNC como en el SNP. Los tumores neuroectodérmicos primitivos encontrados sólo en el SNP se refieren como tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos (PPNET). Los tumores neuroectodérmicos primitivos se manifiestan principalmente en niños y tienen capacidad para desarrollarse en una diversidad de líneas neuronales, astrocíticas, ependimales, musculares y melanóticas. Las bases conceptuales de agrupar estos tumores conjuntamente se basan en compartir células progenitoras comunes igual que en compartir transformaciones neoplásicas similares que conducen a tumores de características morfológicas y comportamiento biológico similar. Sin embargo, queda controversia sobre situar todos los tumores neuroectodérmicos primitivos dentro de la misma categoría. Los siguientes párrafos demuestran ejemplos del sobrelapamiento de antígenos comunes entre los diversos tipos de tumores de SNC y de SNP.
Los tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales incluyen meduloblastomas cerebrales, neuroblastomas cerebrales, tumores "azules", ependimoblastoma y otros tumores neuroectodérmicos primitivos, tales como pineoblastomas (grado IV de WHO). Los marcadores más útiles para estos tumores incluyen GFAP, NFP, desmina y melanina. Otros antígenos encontrados en estos tumores son vimentina, nestina, queratina, pero no son útiles para propósitos diagnósticos.
Los tumores neuroblásticos periféricos de la glándula adrenal (médula) y del sistema nervioso simpático son el tipo más común de tumor de la niñez fuera del SNC. Los sitios primarios para estos tumores neuroectodérmicos primitivos están en los ganglios adrenales, abdominales, torácicos, cervicales y pélvicos pero incluyen otros sitios primarios como órbita, riñón, piel, ovario, cordón espermático, y vejiga urinaria. Los nombres específicos de estos tumores relativos son feocromocitomas, paraglanglioma, neuroblastomas, ganglioneuronas, ganglioneuroblastomas, neurofibromas, scwannomas, y tumores de la cubierta nerviosa periférica malignos. Todos estos comparten origen común en la cresta neural. Los neuroblastomas comparten todos expresiones elevadas de TRK-A (NGFR) y CD44. La enolasa neuronal específica (NSE), sinaptofisina, proteína de filamento neural (NF), GD2, tirosina hidroxilasa (TH) y cromogranina se usan como marcadores diagnósticos encontrados también en meduloblastomas. Los neuroblastomas expresan generalmente un incremento selectivo en el número de copias de génicas del gen MYCN encontrado en etapas fetales de desarrollo cerebral (7).
Los meduloblastomas son miembros de los tumores neuroectodérmicos primitivos que se describen como tumores embrionarios altamente malignos del SNC encontrados en el cerebro (grado IV de WHO). Un antígeno común de estos meduloblastomas y otros tumores de linaje neuronal es sinaptofisina (no encontrada en tumores cerebrales gliales o mesenquimales). La nestina (proteína IF) se encuentra en células precursoras del SNC en desarrollo y en meduloblastomas y en algunas células de origen neuroectodérmico periféricas. Nestina (y vimentina) se encuentran en meduloblastomas, astrocitomas, glioblastomas, ependimomas, gangliogliomas y meningliomas (sólo GFAP se encuentra en células derivadas de astrocitos, las cuales ocasionalmente se "atrapan" en meduloblastomas). Los niveles incrementados de molécula de adhesión neural-celular (N-CAM) hallados en estos tumores, pueden reflejar niveles de diferenciación en el desarrollo de tumores (15). Mientras los niveles de factor de crecimiento nervioso (NGF) variantes, se encuentran en cerca de todos los tumores, los meduloblastomas presentan reactividad sustancial al receptor NGF y proteínas relacionadas, neurotrofina (NT) NT-3, TRK-C y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (16).
Los melanomas, que surgen de melanocitos siguen un desarrollo graduado de melanocitosis difusa, de melanocitoma a melanomas malignos. La proteína S100 es un marcador para estos tumores, como vimentina y reactividad de NSE son variables.
Los carcinomas neuroendocrinos de células pequeñas del pulmón son altamente invasivos y se encuentran típicamente en fumadores adultos. Han mostrado presentar reactividad a muchos de los marcadores neurales y neuroendocrinos (algunos de ellos similares a los N-CAM) para diferenciación tumoral como tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos, gliomas, y ependimomas. Estos marcadores incluyen enolasa específica neural y expresión de c-src extremadamente alta (17).
Una característica compartida notablemente entre células del SNC en desarrollo y células derivadas de la cresta neural es su propensión a migrar bien hacia una diana o bien hacia un área diana. Sin embargo, tumores del SNC muestran migración e invasión celulares significativas en el cerebro sano, sugiriendo que la célula ha mantenido o recuperado su capacidad migratoria potenciada. Así, no es sorprendente que la transformación neoplásica de las células derivadas neuroectodérmicamente fuera del SNC tendría capacidades migratorias similares. En el destino deseado, estas células se diferencian en su fenotipo final, similar al desarrollo normal, influido mediante diversos factores tróficos cruciales para la proliferación y la diferenciación de diversos tipos celulares.
El documento WO 7/24619 describe el uso de clorotoxina fusionada con un resto citotóxico para el diagnóstico y tratamiento de gliomas y meningiomas.
La técnica previa es deficiente en la carencia de agentes diagnósticos y terapéuticos específicamente dirigidos a tumores neuroectodérmicos específicos. La presente invención satisface esta necesidad que ha existido desde hace largo tiempo y se desea en la técnica.
Sumario de la invención
En una realización de la invención actual, el uso de una composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tumores de origen neuroectodérmico administrando un ligando específico para esta clase de tumores condensado con un resto citotóxico, en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón, y sarcoma de Ewing. El ligando específico del tumor neuroectodérmico es clorotoxina en forma de una proteína de fusión de clorotoxina con resto citotóxico. La clorotoxina puede ser nativa, sintética o recombinante. Los posibles restos citotóxicos incluyen, gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína antiviral de fitolaca, toxina diftérica, y proteínas del complemento. El ligando específico del tumor neuroectodérmico también incluye un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina, presumiblemente un canal cloruro de 72 kDa. El anticuerpo se puede condensar a gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína antiviral de fitolaca, toxina diftérica, y proteínas del complemento.
En otra realización de la invención actual, se presenta el uso de clorotoxina marcada para la elaboración de un medicamento para diferenciar tejido tumoral neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico, en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing. Esto se lleva a cabo exponiendo el tejido con clorotoxina etiquetada y midiendo la unión de la clorotoxina etiquetada. Un nivel elevado de unión relativa al tejido normal es un indicio de que el tejido es neoplásico. En una realización, la etiqueta es un resto fluorescente el cual se detecta mediante microscopía de fluorescencia, clasificación de células con fluorescencia activada o un lector de placa fluorescente. Alternativamente, la clorotoxina se puede etiquetar radiactivamente (por ejemplo, ^{131}I-clorotoxina o ^{125}I-clorotoxina; una persona que tenga habilidad normal en esta técnica reconocería fácilmente otras etiquetas radioactivas útiles) y detectar mediante realización de escáner de tomografía de emisión de positrones. Alternativamente, la clorotoxina se puede conjugar a un resto de detección no fluorescente tal como biotina y detectar inmunohistoquímicamente o mediante el uso de un ensayo colorimétrico.
En aún otra realización de la invención actual, un procedimiento para detectar la presencia de una célula derivada de tumor neuroectodérmico en una muestra de tejido, en la que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing, que comprende poner en contacto la muestra de tejido con clorotoxina y detectar la presencia de la unión de la clorotoxina marcada a la muestra de tejido.
Breve descripción de los dibujos
Con el fin de que la materia en la cual las características, ventajas y objetos de la invención anteriormente enumerados, igual que otros los cuales llegarán a estar claros, se consiguen y se pueden entender en detalle, descripciones más particulares de la invención resumidas brevemente anteriormente se pueden tener mediante referencia a ciertas realizaciones de la misma las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman parte de la especificación. Se destacará, sin embargo, que los dibujos añadidos ilustran realizaciones preferidas de la invención y por lo tanto no se consideran limitantes en su alcance.
La figura 1 muestra la tinción inmunohistoquímica positiva de un tumor glioblastoma multiforme (GBM) con clorotoxina. El producto de reacción marrón de 3',3'-diaminobenzidina con clorotoxina biotinilada se ve claramente en la sección teñida con TM-601. TM-601: clorotoxina teñída biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 2 demuestra que el cerebro normal no se tiñe inmunoquímicamente con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina. El cerebro normal se tiñó también con anticuerpos biotinilados contra GFAP (Proteína Ácida Fibrilar Glial) la cual tiñe positivamente astrocitos en el tejido cerebral normal.
La figura 3 muestra tinción con clorotoxina de un tumor de neuroblastoma de masa adrenal. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 4 ilustra que la clorotoxina biotinilada tiñe inmunoquímicamente feocromocitomas. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 5 ilustra que el tejido adrenal normal no se tiñe inmunohistoquímicamente mediante clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 6 muestra la tinción inmunohistoquímica con clorotoxina biotinilada de células tumorales de melanoma metastatizadas al cerebro. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 7 ilustra la tinción inmunohistoquímica de clorotoxina biotinilada de células tumorales de melanoma metastatizadas al pulmón. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 8 muestra la tinción inmunohistoquímica de piel normal con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 9 muestra la tinción inmunohistoquímica de carcinomas pulmonares de células pequeñas con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 10 muestra que la clorotoxina biotinilada no tiñe inmunohistoquímicamente el tejido pulmonar normal. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 11 muestra la tinción inmunohistoquímica de un tumor meduloblastoma con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 12 muestra que el cáncer óseo raro, derivado neuroectodérmicamente, sarcoma de Ewing, también presenta tinción inmunohistoquímica positiva con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 13 muestra los resultados negativos obtenidos en la tinción inmunohistoquímica del tejido estomacal normal con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 14 muestra la falta de tinción inmunohistoquímica de tejido de hígado normal con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
La figura 15 demuestra que el tejido de bazo normal no se tiñe inmunohistoquímicamente con clorotoxina biotinilada. TM-601: clorotoxina biotinilada, contrateñida con verde de metilo; Control: sólo verde de metilo; y, tinción de HyE: hematoxilina y eosina.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente invención se pueden emplear técnicas de biología molecular convencional, de microbiología, y de DNA recombinante dentro de la habilidad en la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobiliced Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Por lo tanto, si aparecen en el presente documento, los siguientes términos tendrán las definiciones expuestas más adelante.
Como se usa en el presente documento, el término "cDNA" se referirá a la copia de DNA del tránscrito de mRNA de un gen.
Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de aminoácidos derivada" significará la secuencia de aminoácidos determinada por lectura de la secuencia de tripletes de las bases nucleotídicas en el cDNA.
Como se usa en el presente documento el término "rastrear una librería" se referirá al procedimiento de usar una sonda marcada para comprobar si, bajo las condiciones apropiadas, hay una secuencia complementaria a la sonda presente en una biblioteca de DNA particular. Además, "rastrear una biblioteca" podría llevarse a cabo mediante PCR.
Como se usa en la presente invención, el término "PCR" se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa que es el sujeto de las Patentes de los Estados Unidos N^{os}.: 4.683.195 y 4.683.202 cedidas a Mullis, igual que otras mejoras no conocidas en la técnica.
Se prefiere que el aminoácido descrito en el presente documento esté en la forma isómera "L". Sin embargo, los residuos en la forma isómera "D" se pueden sustituir por cualquier residuo de L-aminoácido, mientras la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina se retenga por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo aminoácido presente en el extremo aminoterminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxiterminal de un polipéptido. De acuerdo con nomenclatura polipeptídica estándar, J. Biol. Chem. 243: 3552-59 (1969), las abreviaturas para residuos de aminoácidos se conocen en la técnica.
Se destacaría que todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en el presente documento mediante fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal. Además, se destacaría que un guión al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un péptido unido a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos.
Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de DNA in vivo; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al cual se puede unir otro fragmento de DNA para llevar a cabo la replicación del segmento unido.
Una "molécula de DNA" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) bien en su forma de cadena simple, o bien en su forma de hélice de doble cadena. Este término se refiere sólo a la estructura primaria o secundaria de la molécula, y no limita a cualesquiera estructuras terciarias particulares. Así, este término incluye DNA de doble cadena encontrado, entre otras cosas, en moléculas de DNA lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al tratar en el presente documento la estructura se hace de acuerdo con la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección 5'-3' a lo largo de la cadena no transcrita de DNA (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al mRNA).
Un "origen de replicación" se refiere a aquellas secuencias de DNA que participan en la síntesis de DNA.
Una "secuencia codificante" de DNA es una secuencia de DNA de doble cadena la cual se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y el codón de detención de traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas, cDNA a partir de DNA eucariótico, secuencias de DNA genómico a partir de DNA eucariótico (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de DNA sintético. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizará usualmente en posición 3' con respecto a la secuencia codificante.
Las secuencias de control transcripcional y traduccional son secuencias reguladoras de DNA, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que estimulan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped.
Una "secuencia promotora" es una región reguladora de DNA capaz de unir RNA polimerasa en una célula e iniciar transcripción de una secuencia codificante más adelante en la cadena (dirección 3'). Para propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se une en su extremo 3' por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar transcripción a niveles detectables por encima de los precedentes. En la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción, igual que dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión a RNA polimerasa. Los promotores eucarióticos a menudo, pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de secuencias consenso -10 y -35.
Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de DNA que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de DNA. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control transcripcionales y traduccionales en una célula cuando la RNA polimerasa transcribe la secuencia codificante en mRNA, la cual se traduce después en la proteína codificada mediante la secuencia codificante.
Se puede incluir una "secuencia señal" cerca de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, en posición N-terminal con respecto al polipéptido, que se comunica con la célula huésped para dirigir al polipéptido a la superficie celular o segregar el polipéptido dentro de los medios, y este péptido señal se corta por la célula huésped antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal se pueden encontrar asociadas con una diversidad de proteínas nativas de procariotas y eucariotas.
El término "oligonucleótido" como se usa en el presente documento en referencia a la sonda de la presente invención, se define como una molécula que consta de dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores los cuales, en cambio, dependen de la función y uso últimos del oligonucleótido.
El término "cebador" como se usa en el presente documento se refiere a un oligonucleótido, que se da en la naturaleza como en una digestión de restricción purificada o se produce sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se sitúa bajo condiciones en las cuales se induce síntesis de un primer producto de extensión, el cual es complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una DNA polimerasa y una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser bien de cadena simple o bien de doble y debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseada en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del cebador y uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.
Los cebadores en el presente documento se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de DNA diana particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia cebadora no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento nucleotídico no complementario se puede unir al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia cebadora siendo complementaria a la cadena. Alternativamente, se pueden interdispersar bases o secuencias más largas no complementarias en el cebador, siempre que la secuencia cebadora tenga suficiente complementariedad con la secuencia o hibride con ella y por lo tanto forme la plantilla para la síntesis del producto de extensión.
Como se usan en el presente documento, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, cada una de las cuales corta la doble cadena de DNA en o cerca de una secuencia nucleotídica específica.
Una célula se ha "transformado" mediante DNA exógeno o heterólogo cuando tal DNA se ha introducido dentro de la célula. El DNA transformante puede o no puede integrarse (unirse covalentemente) en el genoma de la célula. En procariotas, levaduras, y células de mamífero por ejemplo, el DNA transformante se puede mantener en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada establemente es una en la cual el DNA transformante ha llegado a integrarse en un cromosoma de tal forma que se hereda por las células hijas a través de replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones comprendidos en una población de células hijas que contienen el DNA transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una única célula o ancestro mediante mitosis. Una "línea celular" es un clon de células primarias que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.
Una región "heteróloga" de la construcción de DNA es un segmento identificable de DNA dentro de una molécula de DNA mayor que no se encuentre en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Así, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen se flanqueará usualmente por DNA que no flanquea el DNA genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, la secuencia codificante es una construcción donde la secuencia codificante por sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un cDNA donde la secuencia codificante genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Las variaciones alélicas de los eventos mutacionales que se dan en la naturaleza no dan origen a una región heteróloga de DNA como se define aquí.
Las etiquetas más comúnmente empleadas para estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, productos químicos los cuales presentan fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta y otros. Se conoce un número de materiales fluorescentes y se pueden usar como etiquetas. Estos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo de Texas, azul de AMCA y Amarillo de Lucifer. Un material detectado en particular es un anticuerpo anticonejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un enlace isotiocianato.
Las proteínas se pueden etiquetar también con un elemento radiactivo o con una enzima. La etiqueta radiactiva se puede detectar mediante cualquiera de los procedimientos de recuento actualmente disponibles. El isótopo preferido se puede seleccionar de ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.
Las etiquetas enzimáticas son asimismo útiles, y se pueden detectar mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluorospectrofotométricas, amperométricas o gasométricas utilizadas actualmente. La enzima se conjuga con la partícula seleccionada mediante reacción con moléculas de unión tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, y similares. Muchas enzimas las cuales se pueden usar en estos procedimientos se conocen y se pueden utilizar. Las preferidas son peroxidasa, \beta-glucuronidasa, \beta-D-glucosidasa, \beta-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes de los Estados Unidos N^{os}.: 3.654.090, 3.850.752, y 4.016.043 se refieren por medio de ejemplos por su descripción de materiales y procedimientos de etiquetaje alternos.
Un sistema de ensayo particular desarrollado y utilizado en la técnica se conoce como ensayo de receptor. En un ensayo de receptor, el material a ensayarse está etiquetado apropiadamente y después ciertas colonias de prueba celulares se inoculan además con una cantidad de la etiqueta después de lo cual se llevan a cabo los estudios de unión para determinar la extensión a la cual los materiales señalados se unen a los receptores celulares. De este modo, se pueden averiguar diferencias en afinidad entre materiales.
Un ensayo útil en la técnica se conoce como un ensayo "cis/trans". Brevemente, este ensayo emplea dos construcciones genéticas una de las cuales es típicamente un plásmido que expresa continuamente un receptor particular de interés cuando se transfecta dentro de una línea celular apropiada, y la segunda de los cuales es un plásmido que expresa un comunicador tal como luciferasa, bajo el control de un complejo receptor/ligando. Así, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando para un receptor particular, uno de los plásmidos sería una construcción que daría como resultado la expresión del receptor en la línea celular elegida, mientras el segundo plásmido poseería un promotor unido al gen de la luciferasa en el cual se inserta el elemento de respuesta al receptor particular. Si el compuesto a prueba es un agonista para el receptor, el ligando formará un complejo con el receptor, y el complejo resultante unirá al elemento de respuesta e iniciará transcripción del gen de la luciferasa. La quimioluminiscencia resultante se mide después fotométricamente, y las curvas de respuesta a dosis se obtienen y comparan con aquellas de ligandos conocidos. El protocolo precedente se describe en detalle en la Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.981.784.
La invención actual se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende un ligando específico de tumor neuroectodérmico condensado con un resto citotóxico para la elaboración de un medicamento para tratar un tumor neuroectodérmico en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona de un grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón, y sarcoma de Ewing. El ligando específico del tumor neuroectodérmico es clorotoxina condensada a un resto citotóxico. Los ejemplos de posibles restos citotóxicos incluyen gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína antiviral de fitolaca, toxina diftérica, y proteínas del complemento. El ligando específico del tumor neuroectodérmico también incluye un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina que se cree que es un canal de cloro de 72 kDa. El anticuerpo se puede fusionar a gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína antiviral de fitolaca, toxina diftérica, y proteínas del complemento.
La invención actual se refiere también al uso de una clorotoxina etiquetada para la elaboración de una composición diagnóstica para diferenciar el tejido tumoral neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico del tejido no neoplásico, en el que un tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing incubando el tejido de interés con clorotoxina etiquetada y midiendo la unión de la clorotoxina etiquetada, en relación al tejido normal donde ello sea posible. La clorotoxina se puede etiquetar bien con un resto fluorescente o bien etiquetar radiactivamente con etiquetas radiactivas tales como ^{131}I o ^{125}I. Los restos fluorescentes se pueden usar para detección mediante microscopía de fluorescencia o clasificación de células activadas fluorescentes. La clorotoxina marcada radiactivamente se puede detectar mediante escaneo de tomografía de emisión de positrones.
La invención actual se refiere también a un procedimiento de detectar la presencia de una célula derivada de tumor neuroectodérmico en una muestra de tejido, en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing, que comprende poner en contacto la muestra de tejido con clorotoxina y detectar la presencia de de la unión de la clorotoxina etiquetada a la muestra de tejido.
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no significan limitar en modo alguno la presente invención.
Ejemplo 1 Sumario de Resultados de Clorotoxina a partir de Experimentos con Gliomas
Estudios recientes demostraron que un antígeno común se expresa en la inmensa mayoría de las células con glioma. Este antígeno se etiquetó mediante clorotoxina (Ctx o TM-601), un péptido de 36 aminoácidos aislado originalmente del veneno del escorpión Leiurus quinquestriatus. La clorotoxina se une selectivamente a la membrana de las células de glioma permitiendo el etiquetado selectivo de estas células en el SNC (18). El antígeno señalado como objetivo por este péptido parece ser un canal iónico de cloruro aunque el antígeno no se ha identificado aún inequívocamente al nivel molecular. Hasta ahora, los datos indican que la clorotoxina se une a una proteína de membrana de 72 kDa de peso molecular que se expresa preferentemente en la membrana citoplásmica de la célula de gliomas. La unión del péptido potencia la proliferación de las células de gliomas (19) e inhibe la capacidad de las células de gliomas para migrar en ensayos Transwell, un ensayo in vitro para evaluar la invasividad del tumor (20). La clorotoxina parece ejercer estos efectos reduciendo la permeabilidad de membrana a iones Cl^{-} previniendo de este modo cambios en volumen celular que se requieren para permitir a las células invadir el tejido sano (20). Así, la acción más probable de clorotoxina es sobre un canal de cloruro en un glioma caracterizado extensivamente previamente (19).
Ejemplo 2 Tinción Inmunohistoquímica de Gliomas con Clorotoxina
Más de 250 secciones de tejidos de biopsias humanas congelados o en parafina se tiñeron histoquímicamente con una forma químicamente sintetizada de clorotoxina que contiene un grupo de biotina detectable unido químicamente al extremo N-terminal (TM-601). La unión de la molécula TM-601 se observó en células selectivas asociadas con esencialmente todos los tumores tipo glioma con hasta el 95% de células positivas por tumor. Tomando como base estos estudios, se ha propuesto utilizar clorotoxina como un marcador específico de glioma y una herramienta terapéutica potencial para marcar tumores de glioma. Para tales propósitos, se puede emplear la unión a clorotoxina de moléculas radiactivas tales como saporina.
Ejemplo 3 Manipulación de DNA Recombinante de Clorotoxina
Usando técnicas bien conocidas en la técnica, alguien puede preparar proteínas recombinantes específicamente manipuladas para imitar la unión y acción de la toxina nativa. La actividad biológica de la clorotoxina sintética es igual de efectiva para bloqueo de canal iónico de cloruro como la toxina de veneno nativa. Las técnicas recombinantes se usan para sintetizar clorotoxina en E. coli usando un sistema de vector PGEX y la toxina se puede ligar a diversas proteínas de fusión citotóxica que incluyen glutation-S-transferasa (GST), gelonina, ricina, saponina, toxina diftérica, proteínas del complemento y radioligandos y otras tales proteínas como se conocen bien en la técnica de
inmunotoxina.
Ejemplo 4 Anticuerpos contra el canal iónico de cloruro de unión a clorotoxina
Los anticuerpos para los canales iónicos de cloruro en tumores derivados de células gliales se pueden preparar como sigue. Los antisueros policlonales se generan inyectando proteínas de fusión creadas entre la glutation-S-transferasa y el inserto de clorotoxina en ratones o conejos. Los ratones se inmunizan con 0,5 ml de una emulsión 1:1 de 1 mg/ml de proteína de fusión purificada en el coadyuvante completo de Feund y subsiguientemente con dos inyecciones adicionales después de 14 y 28 días en coadyuvante incompleto de Feund. Los anticuerpos de ratón y conejo se purifican a partir del antisuero usando proteína de fusión GST inmobilizada en filtros de nitrocelulosa. Los anticuerpos se examinan después en su especificidad de unión en diversos tejidos.
Ejemplo 5 Fundamento para el examen de tumores derivados neuroectodérmicamente en su unión a clorotoxina
Dadas las similaridades que se pueden compartir entre gliomas y otras células neuroectodérmicamente derivadas, y los argumentos desarrollados que proponen tendencias similares de las células neuroectodérmicas a migrar, se emprendió una investigación minuciosa para examinar tumores derivados neuroectodérmicamente para la expresión de sitios de unión a clorotoxina.
Ejemplo 6 Preparación de secciones a partir de biopsias humanas congeladas o incrustadas en parafina
La mayoría de las muestras de tejido humano, de ambos sexos, de todas las edades y razas se obtuvieron a través de la Cooperative Human Tissue Network, Tissue Procurement en UAB, hospitales UAB y el Human Brain Tissue Bank en Londres, Canadá. Tejido congelado de golpe y tejido fresco incrustado en un gen congelante se cortaron en lonchas de 8 micrones y se recogieron sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Las secciones se fijaron después en paraformaldehído al 4% o milloniqs de acuerdo con el protocolo de tinción. Los bloques de parafina se seccionaron y prepararon de acuerdo a procedimientos estándar.
Ejemplo 7 Examen de muestras de biopsia para unión a clorotoxina
Las secciones de biopsia se bloquearon durante 1 hora en suero de cabra normal al 10% en PBS y se trataron con una disolución de clorotoxina biotinilada durante toda una noche a 4ºC. Después de aclarados minuciosos, las tinciones se desarrollaron con técnica del complejo avidina-biotina (ABC) (Vectastain Elita ABC Kit de Vector Laboratories, Burlington, CA) y se visualizaron mediante la reacción colorimétrica de DAB (3'3'-diaminobenzidina; Vector Laboratories) con el complejo ABC.
Las secciones de biopsia se contratiñeron con verde de metilo, una tinción nuclear para visualizar más fácilmente las células no teñidas. La etiqueta antecedente específica puede variar de experimento a experimento debido a cambios en concentraciones efectivas de la etiqueta, condición del tejido o duración de la reacción. Por lo tanto, se tiñó de forma idéntica una sección control con verde de metilo pero sin la clorotoxina biotinilada. La tinción de células positivas se identificó mediante etiquetado con clorotoxina anterior precedente cuando se compara con su control individual de una loncha sucesiva. Las células que contienen cantidades altas de peroxidasa endógena presentan tinción precedente oscura en los controles debido a la reacción de DAB con las peroxidasas.
Finalmente, una tercera sección adyacente se tiñó tanto con hematoxilina, una tinción específica de núcleos celulares, como con eosina, una tinción citoplásmica. Por lo tanto, para cada tejido analizado, se tiñeron tres
secciones adyacentes. Estas se muestran en fotomicrografías que proporcionan evidencia de la especificidad de unión de clorotoxina TM-601 a tumores de derivación neuroectodérmica en comparación con controles. En las
fotomicrografías, las secciones adyacentes se identifican como sigue: TM-601: clorotoxina biotinilada detectada mediante un producto de reacción marrón de DAB con la biotina y contrateñida adicionalmente con verde de metilo; Control: la sección control teñida sólo con verde de metilo; y, HyE: la sección teñida con hematoxilina y
eosina.
Ejemplo 8 Tumores de glioblastoma multiforme (GBM)
El glioblastoma multiforme (GBM) se tiñó con la clorotoxina biotinilada (TM-601). Estos tumores son extremadamente reactivos a la clorotoxina biotinilada ya que 25 de cada 25 muestras de pacientes dieron positivo en la prueba como se ve en la figura 1. Este glioblastoma multiforme se puede comparar a la tinción del tejido cerebral normal con clorotoxina biotinilada (18/23 negativos). La figura 2 muestra una tinción representativa. El tejido cerebral normal demuestra una carencia de tinción con TM-601. Esto es consistente con la evidencia más temprana de especificidad de unión de clorotoxina a gliomas.
Ejemplo 9 Tinción con GFAP en el tejido cerebral normal
La sección de biopsia se bloqueó durante 1 hora en suero de cabra normal en PBS y después se tiñó con anticuerpos contra proteína glial fibrilar acídica (GFAP; corporación DAKO, Carpintería CA) durante toda una noche. El anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa se aplicó al tejido aclarado durante 2 horas, se aclaró de nuevo antes de que la tinción se visualizara con DAB. Una tinción de proteína ácida fibrilar glial típica de cerebro normal se muestra en figura 2. El cerebro normal fue positivo para tinción de proteína ácida fibrilar glial donde se tiñeron los astrocitos típicamente presentes en tejido normal.
Ejemplo 10 Neuroblastomas
Los neuroblastomas son un tumor encontrado primariamente en niños con una alta incidencia en adrenales. El neuroblastoma muestra reactividad con TM-601 por encima de la tinción control como se ve en la figura 3. Seis de siete neuroblastomas fueron positivos para unión a neurotoxina.
Ejemplo 11 Feocromocitomas
Los feocromocitomas son células cromoafines neoplásicas de las glandulas adrenales. Este tumor se muestra también en un alto grado de tinción como se ve en la figura 4. Cinco de seis feocromocitomas fueron positivos para tinción con clorotoxina biotinilada, especialmente en comparación a tinción con TM-601 de las adrenales normales (3/3 negativas) vistas en figura 5.
Ejemplo 12 Melanomas
La figura 6 muestra la tinción con clorotoxina biotinilada de un melanoma metastatizado al cerebro. Siete de siete metástasis cerebrales de melanoma fueron positivas para TM-601. Además, el melanoma metastatizado al pulmón se analizó como se ve en la figura 7. La piel normal, sin embargo, no es reactiva a TM-601 (6/6 negativa) (figura 8) aunque hay alguna tinción precedente en los melanocitos incluso en los controles.
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Ejemplo 13 Carcinomas de pulmón de células pequeñas
Los carcinomas de pulmón de células pequeñas son reactivos a TM-601. Hay buen contraste entre las células que se tiñen y aquellas que no (figura 9). Las células positivas para TM-601 en el control (panel medio) son células rojas de la sangre las cuales presentan altos niveles de tinción con peroxidasa precedente. Esta especificidad se puede demostrar adicionalmente comparando la tinción con TM-601 del carcinoma de células pequeñas (2/3 positivas) y del pulmón normal (3/3 negativas) (figura 10).
Ejemplo 14 Meduloblastomas
Cualquier tipo de tumor derivado neuroectodérmicamente son los meduloblastomas. Ellos muestran reactividad específica a TM-601 como se ve en la figura 11 (4/4 positivos).
Ejemplo 15 Sarcoma de Ewing
El sarcoma de Ewing, un raro cáncer óseo encontrado algunas veces en tejidos blandos, es positivo para TM-601 (2/2) (figura 12).
Ejemplo 16 Análisis de sitios potenciales de administración de clorotoxina con respecto a los efectos secundarios
Para ayudar en el diseño de terapia con fármacos con este producto, diversos tejidos normales se tiñeron con TM-601 para determinar sitios posibles donde pueden ocurrir los efectos secundarios. La evidencia preliminar indica que algunas de las dianas más comunes para efectos secundarios tales como el estómago y el hígado, son negativos para TM-601 (2/2 muestras negativas para ambos tejidos, hasta ahora) (figuras 13 y 14, respectivamente). La tinción de tejido del hígado se muestra también en la figura 15 (3/3 negativas).La tinción de TM-601 de otros tejidos normales se resume en la tabla 1.
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TABLA I
Tipo de Tumor o Tejido # de Casos Unión a clorotoxina
Tumores Cerebrales Primarios
Gliomas
Grado IV de WHO: glioblastoma multiforme 25 Positiva
Grado III de WHO: astrocitoma anaplásico 2 Positiva
Grado II de WHO: grado bajo 2 Positiva
Grado I de WHO: astrocitoma pliocítico 11 Positiva
Oligodendrogliomas 6 Positiva
Otros gliomas 3 Positiva
Gangliomas 3 Positiva
Meningiomas 18 Positiva
Ependimomas 3 Positiva
Otros tumores cerebrales primarios:
Quistes epidermoides en cerebro 3 2/3 Positivos
Tumores cerebrales - patología desconocida 15 14/15 Positivos
Glándula pituitaria de pacientes de GBM 2 Positiva
Tumores Cerebrales Secundarios:
Tumores metastásicos al cerebro 14 12/14 Positivos
TABLA I (continuación)
Tipo de Tumor o Tejido # de Casos Unión a clorotoxina
Comparación de tejidos cerebrales
Cerebros con Alzheimer 8 Negativa
Cerebro, normal o no implicado 24 18/24 Negativos
Eplilepsia/Gliosis/Infarto 6 Positiva
Cerebro no implicado de GBM 3 Negativa (autopsia)
Tumores de Origen Neuroectodérmico
Meduloblastoma 4 Positiva
Neuroblastoma 7 6/7 Positivos
Ganglioneuroma 4 Positiva
Melanomas 7 Positiva
Feocromocitoma 6 5/6 Positivos
PPNET 1 Negativa
Carcinoma de pulmón de células pequeñas 2 2/3 Positivos
Sarcoma de Ewing 2 Positiva
Otros Tejidos Humanos
Colon 3 Negativa
Endometrio/miometrio 2 Negativa
Corazón 2 Negativa
Riñón 2 En córtex es positiva/
En médula es negativa
Glándula Adrenal 3 Negativa
Hígado 3 Negativa
Pulmón 3 Negativa
Pulmón, carcinoma de células normales 1 Positiva
Meninges 3 Negativa
Esqueleto, músculo 2 Negativa
Páncreas, fibrosis 1 Negativa
Ovario 2 Mayoritariamente Negativa/en
unas pocas células es positiva
Piel, del muslo, abdomen o mama 6 Negativa
Bazo 3 Negativa
Estómago 2 Negativa
Testículos 2 Mayoritariamente Negativa/en
unas pocas células es positiva
Tiroides 1 Negativa
Ejemplo 17 Sumario de Tumores y Tejidos Sometidos a Prueba
Como se resume en la tabla I, la inmensa mayoría de los tumores derivados neuroectodérmicamente unen clorotoxina, indicando que la clorotoxina tiene una utilidad más extensa para marcar como objetivo tumores de origen neuroectodérmico. Específicamente, los tumores de tipo tumor neuroectodérmico primitivo se han analizado a partir de 34 pacientes, 31 de los cuales mostraron especificidad de clorotoxina en el material tumoral como se ve en la tabla 1. Esta tinción se comparó con la tinción de clorotoxina de otros tipos de tumores del SNC y del SNP igual que la comparación con diversos tejidos humanos normales.
TM-601 se asocia específicamente con tumores derivados neuroectodérmicamente que incluyen meduloblastomas, neuroblastomas, ganglioneuromas, melanomas, feocromocitomas, carcinomas pulmonares de células pequeñas y sarcomas de Ewing. Así, las moléculas derivadas de clorotoxina se pueden utilizar para marcar como objetivo específicamente para propósitos terapéuticos o diagnósticos los tumores identificados anteriormente derivados neuroectodérmicamente. Asimismo, estos tumores se pueden marcar también mediante otras moléculas tales como anticuerpos que se unen al receptor de clorotoxina, que se presume que es el canal iónico de Cl^{-} de 72 kD.
Las siguientes referencias se han citado en el presente documento:
1. Hemizygous or homozygous deletion of the cromosomal region containing the p16INK4 gene is associated with amplification of the EGF receptor gene in gliloblastomas. Hegi M.E., Hausen A.Z., Ruedi D., Malin G. y Kleihues P. (1997) Int. J. Cancer 73: 57-63.
2. Ras activation in astrocytomas and neurofibromas. Guha A. (1998) Can J. Neurol. Sci. 25: 267-281.
3. Tumor antigens in astrocytic gliomas. Kurpad S.N., Zhao X.G., Wikstrand C.J., Batra S.K., McLendon R.E., y Bigner D.D. (1995) Glia 15: 244-256.
4. Iodine-131-labeled anti-tenascin monoclonal antibody 81C6 treatment of patients with recurrent malignant gliomas: phase 1 trial results. Bigner D.D., Brown M.T., Friedman A.H., Coleman R.E., Akabani G., Friedman H.S., Thorstad W.L., McLendon R.E., Bigner S.H., Zhao X.-G., Pegram C.N., Wikstrand C.J., Herndon, J.E., Vick N.A., Paleologos N., Cokgor I., Provenzale J.M. y Zalutsky M.R. (1998) J. Clin. Onco. 16: 2202-2212.
5. Trilateral tumors in four differents lines of transgenic mice expressing SV40 T-antigen. (1996) Marcus D.M., Lasudry J.G., Windle J., Howes K.A., Al Ubaidi M.R., Baehr W., Overbeek P.A., Font R.L., y Albert D.M. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 37: 392-396.
6. Molecular detection of tumor-associated antigens shared by human cutaneous melanomas and gliomas. Chi D.D.J., Merchant R.E., Rand R., Conrad A.J., Garrison D., Turner R., Morton D.L., y Hoon D.S.B. (1997) Am. J. Pathol. 150: 2143-2152.
7. Pathology and Genetics of Tumors of the Nervous System. Eds. Paul Kleihues y Webster K. Cavenee, International Agency for Research on Cancer, Lyon, 1997.
8. Peripheral primitive neuroectodermal tumor of the ovary confirmed by CD99 immunostaining, karyotypic analysis, and RT-PCR for EWS/FLI-1 chimeric mRNA. Kawauchi S., Fukuda T., Miyamoto S., Yoshioka J., Shirahama S., Saito T., y Sukamoto N. (1998) Am. Surg. Pathol. 11: 1417-1422.
9. Cytology of typical and atypical Ewing's sarcoma/PNET. Renshaw A.A., Pérez-Atayde A.R., Gletcher J.A., y Granter S.R. (1996) Am. J. Clin. Pathol 106: 620-624.
10. C-kit is expressed in soft tissue sarcoma of neuroectodermic origin and its ligand prevents apoptosis of neoplastic cells. Ricotti E., Fagioli F., Garelli E., Linari C., Crescenzio N., Horenstein A.L., Pistamiglio P., Vai S., Berger M., Cordero di Montezemolo L., Madon E., y Basso G. (1998) Blood 91: 2397-2405.
11. Interleukin-1 alpha, IL-1 beta, IL-1R type1, IL-1 R antagonist, y TGF-beta mRNAs in pediatric astrocytomas, ependymomas, and primitive neuroectodermal tumors. Ilyin S.E., González-Gómez I., Gilles F.H., y Plata-Salaman C.R. (1998). Mol. Chem. Neuropathol. 33: 125-137.
12. Immunohistochemical characterization of primitive neuroectodermal tumors and their possible relationship to the stepwise ontogenetic development of the CNS. 2. Tumor studies. Kleinert R. (1991) Acta Neuropathol 82: 508-15.
13. Proteins of the intermediate filament citoskeleton as markers for astrocytes and human astrocytomas. Yang H.Y., Lieska N., Shao D., Kriho V., y Pappas G.D. (1994). Mol. Chem. Neuropathol 21: 155-176.
14. Human primitive neuroectodermal tumour cells behave as multipotent neural precursors in response to FGF2. Derrington E.A., Dufay N., Rudkin B.B., y Belin M.-F. (1998) Oncogene 17: 1663-1672.
15. Neuroectodermal tumors of the periferal and the central nervous system share neuroendocrine N-CAM-related antigens with small cell lung carcinomas. Molenaar W.M. de Leij L., y Trojanowski J.Q. (1991) Acta Neuropathol. 83: 46-54.
16. Neurotrophins and neuronal versus glial differentiation in medulloblastomas and other pediatric brain tumors. Tajima Y., Molina R.P. Jr., Rorke L.B., Kaplan D.R., Radeke M., Feinstein S.C., Lee V.M., y Trojanowsky J.Q. (1998) Acta Neuropathol. 95: 325-332.
17. Expression of c-src in cultured human neuroblastoma and small-cell lung carcinoma cell lines correlates with neurocrine differentiation. Mellstrom K., Bjelfman C., Hammerling U., y Pahlam S. (1987) Mol. Cell Biol. 7: 4178-4184.
\newpage
18. Use of chlorotoxin for targeting of primary brain tumors. Soroceanu L., Gillespie Y., Khazaeli M.B. y Sontheimer H.W. (1998) Cancer Res. 58: 4871-4879.
19. Cell cycle-dependent expression of a glioma-specific chloride current: proposed link to cytoskeletal changes. Ullrich N. y Sontheimer H. (1997) Am. J. Physiol. 273: C1290-1297.
20. Modulation of glioma cell migration and invasion using Cl^{-} and K^{+} ion channel blockers. Soroceanu L., Manning T.J. Jr. y Sontheimer H. (1999) J. Neuroscience. Presentado.
Cualesquiera patentes o publicaciones mencionadas en esta especificación son un indicio de los niveles de conocimiento de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención.

Claims (23)

1. Uso de una composición farmacéutica que comprende clorotoxina condensada a un resto citotóxico para la elaboración de un medicamento para tratar un tumor neuroectodérmico, en la que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing.
2. Uso de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina condensado a resto citotóxico para la elaboración de un medicamento para tratar tumor neuroectodérmico, en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing.
3. Uso de la reivindicación 1, en la que la clorotoxina se selecciona del grupo que consta de clorotoxina nativa, clorotoxina sintética y clorotoxina recombinante.
4. Uso de la reivindicación 1 ó 2, en la que la citotoxina se selecciona del grupo que consta de gelonina, ricina, saponina, exotoxina de pseudomonas, proteína antiviral de fitolaca y toxina diftérica.
5. Uso de la reivindicación 1 ó 2, en la que la clorotoxina o anticuerpo contra la clorotoxina está etiquetada.
6. Uso de la reivindicación 5, en la que la etiqueta es radioetiqueta.
7. Uso de la reivindicación 6, en la que la radioetiqueta se selecciona del grupo que consta de ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{186}Re, ^{131}I y ^{125}I.
8. Uso de clorotoxina etiquetada para la elaboración de una composición diagnóstica para diferenciar tejido neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico de tejido normal, en el que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing.
9. Uso de la reivindicación 8, en la que la clorotoxina está etiquetada.
10. Uso de la reivindicación 9, en el que la etiqueta es radioetiqueta.
11. Uso de la reivindicación 10, en el que la radioetiqueta se selecciona del grupo que consta de ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{186}Re, ^{131}I y ^{125}I.
12. Un procedimiento para detectar la presencia de una célula neuroectodérmica derivada de tumor en una muestra de tejido, en la que el tumor neuroectodérmico se selecciona del grupo que consta de meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón y sarcoma de Ewing, comprendiendo poner en contacto la muestra de tejido con clorotoxina y detectar la presencia de la unión de la clorotoxina etiquetada a las muestras del tejido.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en la que la clorotoxina está etiquetada.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en la que un nivel elevado de unión, en relación al tejido normal, indica que el tejido es neoplásico.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en la que la etiqueta es una etiqueta fluorescente.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la etiqueta fluorescente se selecciona del grupo que consta de fluoresceína, rodamina, auramina, rojo de Texas, azul de AMCA y Amarillo de Lucifer.
17. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la etiqueta es biotina.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, comprendiendo adicionalmente poner en contacto el tejido de interés con avidina para formar complejos de clorotoxina etiquetados con avidina-biotina.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, comprendiendo adicionalmente poner en contacto los complejos de clorotoxina con 3'3-diaminobenzidina etiquetados con avidina-biotina para formar un producto colorimétrico en el que el nivel de producto colorimétrico es un indicativo del nivel de unión de clorotoxina.
20. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la muestra de tejido es una muestra congelada.
21. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la muestra de tejido es una muestra incrustada en parafina.
\newpage
22. El procedimiento de la reivindicación 20 ó 21, en el que la muestra de tejido se contratiñe.
23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la contratinción se selecciona del grupo que consta de verde de metilo, hematoxilina y eosina.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6667156B2 (en) * 1995-12-27 2003-12-23 Uab Research Foundation Diagnosis and treatment of neuroectodermal tumors
AU2003240496B2 (en) * 2002-05-31 2008-01-10 Eisai Inc. Combination chemotherapy with chlorotoxin
US20060088899A1 (en) * 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
WO2006115633A2 (en) 2005-04-22 2006-11-02 University Of Washington Cyanine-chlorotoxin conjugate and method for intra-operative fluorescent visualization of cancer
ES2527961T3 (es) * 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
US20070237714A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Alvarez Vernon L Diagnosis and treatment of tumors
MX2009006277A (es) * 2006-12-14 2009-07-24 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan a cd70 y usos de los mismos.
AU2008285364A1 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Transmolecular, Inc. Chlorotoxins as drug carriers
EP2211913A4 (en) * 2007-10-12 2010-12-22 Transmolecular Inc SYSTEMIC ADMINISTRATION OF CHLOROTOXIN AGENTS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMORS
US8097284B2 (en) * 2007-11-13 2012-01-17 Arthur Mikaelian Polarized scorpion venom solution and a method for making polarized scorpion venom solution
BRPI0912683A2 (pt) 2008-05-15 2016-01-26 Transmolecular Inc tratamento de tumores metastáticos
CN102438646A (zh) * 2008-05-15 2012-05-02 特兰斯莫莱库拉公司 转移性肿瘤的治疗
EP2531206B1 (en) 2010-02-04 2017-05-31 Morphotek, Inc. Chlorotoxin polypeptides and conjugates and uses thereof
CN106957356B (zh) 2010-05-11 2021-05-25 弗雷德哈钦森癌症研究中心 氯毒素变体、缀合物及其使用方法
US8524239B2 (en) 2010-07-09 2013-09-03 The United States of America as represented by the Secrectary, Department of Health and Human Services Photosensitizing antibody-fluorophore conjugates
CN102552943A (zh) * 2010-12-31 2012-07-11 复旦大学 一种氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂及其制备方法和应用
WO2013003507A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Morphotek, Inc. Multifunctional agents
RU2015126650A (ru) 2012-12-10 2017-01-12 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисёрч Сентер Партнеры липокалина по слиянию
US9784730B2 (en) 2013-03-21 2017-10-10 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Nanoparticle for targeting brain tumors and delivery of O6-benzylguanine
US11559580B1 (en) 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
US10588972B2 (en) * 2014-06-02 2020-03-17 Li-Cor, Inc. Phthalocyanine probes and uses thereof
JP6796058B2 (ja) 2014-08-08 2020-12-02 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ インビトロおよびインビボにおける標的の光制御除去
CN104877016A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 温州生物材料与工程研究所 折叠氯代毒素、氯代毒素变异体与折叠氯代毒素变异体及其制备工艺
US9518099B1 (en) * 2015-09-13 2016-12-13 Wenzhou Institute Of Biomaterials And Engineering Refolded chlorotoxin, chlorotoxin variant, refolded chlorotoxin variant, and preparation technology thereof
US11826399B2 (en) 2017-09-15 2023-11-28 Eisai Inc. Chlorotoxin agents and uses thereof
CA3086040A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Blaze Bioscience, Inc. Tumor homing and cell penetrating peptide-immuno-oncology agent complexes and methods of use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988002117A1 (en) * 1986-09-19 1988-03-24 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal paratopic molecule directed to human ganglioside gd2
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5223253A (en) 1989-09-28 1993-06-29 American Home Products Corporation Bovine vaccine compositions and method for preventing trichomonas infections using same
US5750376A (en) 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5626862A (en) 1994-08-02 1997-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Controlled local delivery of chemotherapeutic agents for treating solid tumors
US5756340A (en) 1995-05-08 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Insect control with multiple toxins
US6667156B2 (en) * 1995-12-27 2003-12-23 Uab Research Foundation Diagnosis and treatment of neuroectodermal tumors
US5905027A (en) * 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
BRPI0912683A2 (pt) * 2008-05-15 2016-01-26 Transmolecular Inc tratamento de tumores metastáticos

Also Published As

Publication number Publication date
EP1200123A4 (en) 2003-05-02
ATE308340T1 (de) 2005-11-15
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