MXPA01010595A - Diagnostico y tratamiento de tumores neuroectodermicos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de fusión para la detección y tratamiento de tumores neuroectodérmicos. Los trabajos anteriores demuestran que la clorotoxina es específica para células de tumor derivadas de la glía o de meningioma. La presente invención ha extendido el uso de las proteínas de fusión de clorotoxina citotoxina para tratar la clase completa de tumores neuroectodérmicos tales como gliomas, meningiomas, epéndimomas, meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromocitomas, melanomas, tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos, carcinoma de célula pequeña de pulmón, sarcoma de Ewing y tumores metastáticos en el cerebro. Además se proveen métodos de diagnóstico para seleccionar tumores neuroectodérmicos neoplásicos.

Description

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES NEUROECTODERMICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en forma general a los campos de fisiología celular, neurología, biología del desarrollo y oncología. En forma más específica, la presente invención se refiere a métodos novedosos para utilizar una proteína ci t oplasmát ica sensible a clorotoxina para el diagnóstico y tratamiento de tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET por sus siglas en inglés ) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante el desarrollo embrionario, el futuro sistema nervioso se forma a partir de una capa especializada de células ectodérmicas denominada el neuroectodermo . Esta capa se extiende longitudinalmente junto con el eje del cuerpo congruente con la futura columna espinal . La invaginación del neuroectodermo da origen al tubo neura l desde el cual se desarrollan esencialmente todos los componentes del Sistema Nervioso Central (SNC) incluyendo la médula espinal. Grupos especializados de células junto con el borde del tubo neural que se invagina, permanecen separados del tubo y de la cresta del tubo neural. Estas células del neuroectodermo con capacidad de migración muy alta dan origen a células especializadas a través de todo el cuerpo, incluyendo las células de Schwann, las células neuronales del sistema nerviosos periférico (SNP) (neuronas entéricas, paras impát icas , simpat i coadrenales y sensoriales) , células pigmentadoras (melanocitos), células endocrinas y las células que forman el tejido conectivo de la cara y cuello. Debido a que estas células comparten un origen embrionario común con las células del sistema nervioso central no es de sorprender que estas células, o los tumores que se desarrollan a partir de estas células, compartan algunos fenotipos genéticos y antigénicos con las células del sistema nervioso central. Por ejemplo, los melanomas y gl ioblastomas comparten una mutación común en el gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento epi dérmi co (EGFR por sus siglas en inglés) (1) . Los astrocitomas y los neurof ibromas malignos no solo expresan niveles elevados de los factores de crecimiento epidérmico sino también del receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEFG-R) y del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R) (2) . Se ha demostrado una expresión elevada de la variante mutante, EGFRvIII, en tumores de la glía así como de las proteínas de matriz extracelular GP 240 y tenascina (3) . En otro estudio, los anticuerpos para tenascina se unen en forma intensiva a los gliomas del SNC y también a los melanomas y carcinomas de tejido mamario, de pulmón y de células escamosas (4) . Se ha demostrado que otro gangliósido, GD2 , es un marcador de antígeno común tanto en gliomas como en tejidos de tumor neuroectodérmico primitivo (5) . Se han mostrado otros antígenos comunes entre los melanomas y los gliomas demostrando que los productos génicos Tyr, TRP-1, TRP-2 y gplOO se encuentran en forma común tanto en melanoma como en tumores de tipo glioma (6) . Las citocinas comunes o sus receptores que se relacionan con tumores de astrocitomas, epéndimomas y tumores neuroectodérmicos primitivos han sido i den t i f i cada s como: interleucina (IL) IL-1 alfa, IL-1, IL-1R1, IL-1R antagonista y factor de crecimiento transformante (TGF) TGF-beta 1 (11) . Las proteínas ci toesquelét icas , neurof ilamento (NF) , proteína acida fibrilar de la glía (GFAP) , filamentos intermedios (IF) , filamento de proteína asociado intermedio (IFAP) , vimentina, nestina y las queratinas son otra clase de proteínas utilizadas como marcadores para gliomas y tumores neuroectodérmicos primitivos. Estos marcadores han sido utilizados para determinar las etapas de diferenciación junto con los diversos linajes celulares (12) . La evidencia reciente que vincula los astrocitomas con ciertos tumores neuroectodérmicos primitivos es el marcador ci toesquelét ico de IFAP-300 Da, un marcador de la glía inmadura (13) . Se pueden formular argumentos adicionales respecto a un fuerte vínculo de las células derivadas del neuroectodermo en el sistema nervioso central y periférico tomando como base su dependencia similar sobre influencias epigenét icas . Por ejemplo, las neuronas precursoras simpat icoadrenales requieren del factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) para que proliferen y se diferencien, pero la supervivencia de estas células depende de la capacidad de respuesta hacia el factor de crecimiento de nervio (NGF) y de la disponibilidad del factor de crecimiento de nervio (14) . Se requiere de un escenario similar para cada uno de los otros tipos celulares. No sólo los factores tróficos y de crecimiento son necesarios sino que se necesitan citocinas y hormonas para las cuales permanecen sin elucidar los vínculos entre los tumores neuroectodérmicos primitivos y los gliomas. Sin embargo, a pesar de esta lista de similitudes compartidas entre las células de origen neuroectodérmico , estas células son entidades distintas con características citológicas, bioquímicas y funcionales únicas. En efecto, la lista de características exclusivas no compartidas con otras células de origen neuroectodérmico excede con mucho los fenotipos compartidos antes mencionados. Por lo tanto, no se puede considerar a pri ori que se deba esperar la expresión de un cierto antígeno o fenotipo en un tipo celular determinado tomando como base la expresión mediante cualquier otro miembro de los tipos de células de origen neuroectodérmico. Los neuroblastomas por lo general expresan un incremento selectivo en el número de copias de gen del gen MYCN encontrado en etapas fetales del desarrollo del cerebro, lo que sugiere un vínculo entre el origen de las células y la capacidad de las células neoplásicas para desdi ferenciarse (7) . Sin embargo aún falta demostrar este gen en las células de glioma. Se han demostrado otras proteínas que no son comunes tanto para el glioma como para los tumores neuroectodérmicos primitivos. La inmunoreact ividad de CD99 se utiliza como una herramienta en la identificación de tumores neuroectodérmicos primitivos (8) y se ha demostrado en los tumores de sarcoma de Ewing aunque no en los gliomas (9) . Otro factor, el factor de célula madre y su receptor, c-kit, también se expresan tanto en tumores neuroectodérmicos primitivos como en tumores de sarcoma de Ewing (10) . El origen común y la capacidad de respuesta a las señales internas y externas durante los procesos de desarrollo normales sugieren que las células del sistema nervioso central y las células de origen neuroectodérmico también podrían compartir mecanismos comunes durante los desarrollos patológicos tales como por ejemplo, du n t e la neoplasia. Tales tejidos neoplásicos incluyen gliomas del SNC que son células de tumor derivadas de la glía específica para el SNC. Estas presentan metástasis únicamente dentro del SNC incluyendo la columna espinal. Se cree que éstas se originan a partir de por lo menos tres linajes separados provenientes de células precursoras no diferenciadas o por desdiferenciación de astrocitos, ol igodendrocitos o células ependimales. Los tumores neuroectodérmicos primitivos se encuentran tanto en el SNC como en el SNP. Los tumores neuroectodérmicos primitivos encontrados únicamente en el SNP son conocidos como tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos (PRET por sus siglas en inglés) . Los tumores neuroectodérmicos primitivos se manifiestan en forma preferente en niños y tienen la capacidad de desarrollarse en una variedad de líneas neuronales, ast rocí t icas , ependimales, musculares y melanóticas. La base conceptual para agrupar estos tumores en un solo grupo se basa en que comparten células precursoras comunes así como en el hecho de que comparten transformaciones neoplásicas similares que conducen a tumores que presentan características morfológicas y comportamiento bi ol ógi co similares. Sin embargo, sigue existiendo una controversia en cuanto a colocar todos los tumores neuroectodérmicos primitivos en las mismas categorías. Los siguientes párrafos demuestran ejemplos del traslape de antígenos comunes entre los diversos tipos de tumores del SNC y del SNP. Los tumores neuroectodérmicos primitivos suprat entoriales incluyen meduloblastomas del cerebro, neuroblastomas del cerebro, tumores "azules", ependimoblastomas y otros tumores neuroectodérmicos primitivos, tales como los píneoblastomas [grado IV de la WHO (Organización Mundial de la Salud)] . Los marcadores más útiles para estos tumores incluyen GFAP, NFP, desmina y melanina. Vimentina, nestina y queratina son otros antígenos encontrados en estos tumores, pero no son útiles para propósitos de diagnóstico. Los tumores neuroblást icos periféricos de la glándula adrenal (medula) y del sistema nervioso simpático son el tipo más común de tumor infantil fuera del SNC. Los sitios primarios para estos tumores neuroectodérmicos primitivos son los ganglios simpáticos de las glándulas adrenales, del abdomen, tórax, cervicales y pélvicos pero incluyen otros sitios primarios tales como la órbita, riñon, pul món , piel, ovario, cordón espermático y vejiga urinaria. Los nombres específicos de estos tumores relacionados son feocromocitomas , paragangl iomas , neuroblastomas, gangl ioneuromas , gangl ioneuroblastomas , neurof ibromas , schwannomas y tumores malignos de vaina de nervio periférico. Todos éstos comparten un origen común en la cresta neural . Todos los neuroblastomas comparten expresiones elevadas de TRK-A (NGFR) y de CD44. Le enolasa específica de neuronas (NSE por sus siglas en inglés) , sinaptof i sina , proteína de filaento neural (NF) , GD2 , tirosina hidroxilasa (TH) y la cromogranina como marcadores para diagnóstico que también se encuentran en los meduloblastomas. Los neuroblastomas por lo general expresan un incremento selectivo en el número de copias de gen del gen MYCN encontrado en las etapas fetales del desarrollo del cerebro (7) . Los meduloblastomas son miembros de los tumores neuroectodérmicos primitivos que se describen como tumores embrionarios altamente malignos del SNC encontrados en el cerebelo (grado IV de la WHO) . Un antígeno común de estos meduloblastomas y de otros tumores de linaje neuronal es la sinaptof isina (no encontrada en t umore s cerebrales del mesénquima o de la glía) . La nestina (proteína IF) se encuentra en células precursoras del SNC y en meduloblastomas y en algunas células de origen neuroectodérmico periférico. La nestina (y vimentina) se encuentran en meduloblastomas,, astrocitomas, gl ioblastomas , epéndimomas, gangl iogl iomas y meningiomas (únicamente GFAP se encuentra en las células derivadas de astrocitos, las cuales quedan "atrapadas" en algunas ocasiones en los meduloblastomas) . Los niveles incrementados de la molécula de adhesión a células neural (N-CAM) encontrados en estos tumores, podrían reflejar niveles de diferenciación en el desarrollo de tumores (15) . Aunque en casi todos los tumores se encuentran niveles variables del factor de crecimiento de nervio (NGF) , los meduloblastomas presentan reactividad sustancial hacia el receptor de NGF y las proteínas relacionadas, neurotrofina (NT) NT-3, TRK-C y factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) (16) . Los melanomas, que surgen de los melanocitos siguen un desarrollo por pasos desde la melanoci tosi s difusa a melanocitoma y hasta melanomas malignos. La proteína SlOO es un marcador para es t os tumores, debido a que la reactividad para vimentina y para NSE es variable. Los carcinomas neuroendocrinos de célula pequeña del pulmón son altamente invasivos y se encuentran típicamente en fumadores adultos. Se ha demostrado que estos presentan reactividad hacia muchos de los marcadores neuroendocr inos y neuronales (algunos de ellos similares a las moléculas N-CAM) para la diferenciación de tumor como tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos, gliomas, y epéndimomas. Estos marcadores incluyen enolasa específica neuronal y la expresión de c - src elevada en grado extremo (17) . Una característica compartida en forma conspicua entre las células del SNC en desarrollo y las células derivadas de la cresta neuronal es su propensión a migrar ya sea hacia un objetivo o hacia un área objetivo. Se cree que esta capacidad se pierde después de la diferenciación y maduración de la célula. Sin embargo, los tumores del SNC muestran una migración e invasión celular significativas hacia el cerebro sano, lo que sugiere que la célula ha mantenido o a recuperado esta capacidad migratoria mejorada. Por lo tanto, no es sorprendente que la transformación neoplásica de las células de origen neuroectodérmico fuera del SNC podría tener capacidades migratorias similares. En el destino pretendido, estas células se diferencian hasta su fenotipo final, en forma similar al desarrollo normal, influenciada por varios factores tróficos cruciales para la proliferación y diferenciación de los diversos tipos de células. La técnica anterior carece de un diagnóstico y de agentes terapéuticos dirigidos en forma específica a los tumores neuroectodérmicos primitivos. La presente invención satisface esta necesidad y deseos presentes desde hace mucho tiempo en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad de la presente invención, se describe un método para el tratamiento de tumores de origen neuroectodérmico administrando un ligando específico para esta clase de tumores, fusionado a una porción citotóxica. Los tumores neuroectodérmicos específicos que pueden ser tratados en esta forma incluyen gliomas, meni ngi oma s , epéndimomas, meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, f eocromoc i tomas , melanomas, tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos, carcinoma de célula pequeña de pulmón, sarcoma de Ewing y tumores metastáticos de origen neuroectodérmico en el cerebro. En la modalidad preferida, el ligando específico de tumor neuroectodérmico es clorotoxina en forma de una proteína de fusión de clorotoxina con una porción citotóxica. La clorotoxina puede ser clorotoxina original, sintética o recombinante. Las posibles porciones citotóxicas incluyen gelonina, ricina, saponina, exotoxina de Pseudomonas , proteína antiviral de fitolacácea, toxina de difteria y proteínas del complemento. En otra modalidad preferida de la presente invención, el ligando específico de tumor neuroectodérmico es un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina, posiblemente un canal de cloruro de 72 kDa. El anticuerpo podría estar fusionado a gelonina, ricina, saponina, exotoxina de Ps eudomona s , proteína antiviral de fitolacácea, toxina de difteria y proteínas del complemento. Incluso en otra modalidad de la presente invención, se presenta un método para diferenciar tejido de tumor neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico proveniente de tejido no neoplásico. Esto se logra exponiendo el tejido a clorotoxina marcada y midiendo la unión de la clorotoxina marcada. Un nivel elevado de unión con relación al tejido normal indica que el tejido es de tipo neoplásico. En una modalidad, la marca es una porción fluorescente que se detecta mediante microscopía fluorescente, clasificación de célula activada fluorescente o mediante una lectora de placas fluorescente. De manera alternativa, la clorotoxina se puede marcar con radioactividad (por ej emplo 131 I -clorotoxina 125 I - clorotoxina ; una persona con habilidad ordinaria en esta campo podrá reconocer otros radiomarcadores útiles) y detectar mediante barrido tomográfico de emisión de positrones. Como alternativa, se podría conjugar la clorotoxina a una porción para detección no fluorescente tal como biotina, y detectar mediante inmunohi stoquímica o utilizando una prueba colorimét rica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Así que la materia en la cual las características, ventajas y objetivos de la invención antes mencionadas, así como otras que se harán evidentes, se logran y se pueden entender con mayor detalle, se pueden obtener descripciones más particulares de la invención descrita en forma breve haciendo referencia a ciertas modalidades de la misma las cuales se ilustran en los dibujos anexos. Los dibujos forman parte de la especificación. Cabe mencionar, sin embargo, que los dibujos anexos ilustran modalidades preferidas de la invención y por lo tanto no se deben considerar como limitativos del campo de la misma. La figura 1 muestra la tinción inmunohistoquímica positiva de un tumor multiforme de glioblastoma (GBM) con clorotoxma. El producto de reacción de calor café de DAB 3'3'-diaminobenc idina con clorotoxina conjugada con biotina se puede observar claramente en la sección TM-601 teñida. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E : heraatoxilina y eosina.

La figura 2 demuestra que el cerebro normal no se tiñe en forma inmunohi stoquímica con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, contra-teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E : hematoxilina y eosina. El cerebro normal se tiñe además con anticuerpos conjugados con biotina contra GFAP (Proteína Acida Fibrilar de la Glía) los cuales tiñen en forma positiva los astrocitos en tejido normal de cerebro . La figura 3 muestra la tinción con clorotoxina de un tumor de neuroblastoma de la masa adrenal. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 4 ilustra que la clorotoxina conjugada con biotina tiñe en forma inmunohi stoquímica a los feocromoci tomas . TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eos ma . La figura 5 ilustra que el tejido adrenal normal no se tiñe en forma inmunohi stoquímica con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, contra-teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 6 muestra la tinción inmunohi stoquímica con clorotoxina conjugada con biotina de células de tumor tipo melanoma que presentan metástasis hacia el cerebro. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina . La figura 7 ilustra la tinción inmunohistoquímica con clorotoxina conjugada con biotina, de células de tumor tipo melanoma que presentan metástasis hacia el pulmón. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina . La figura 8 muestra la tinción inmunohistoquímica de piel normal con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con cl oro t oxi na conjugada con biotina, cont ra - teñida li con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 9 muestra la tinción inmunohistoquímica de carcinomas de pulmón de células pequeñas con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra- teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 10 muestra que la clorotoxina conjugada con biotina no tiñe en forma inmunohistoquímica el tejido de pulmón normal. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra- teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina . La figura 11 muestra la tinción inmunohistoquímica de un tumor tipo meduloblastoma con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, contra- teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina . La figura 12 muestra que el cáncer de t ej i do ós eo de origen neuroectodérmico, raro, el sarcoma de Ewing, también presenta tinción inmunohistoquímica positiva con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra- teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 13 muestra los resultados negativos obtenidos en la tinción inmunohistoquímica de tejido de estómago normal con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, contra-teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 14 muestra la falta de tinción inmunohistoquímica de tejido hepático normal con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, contra-teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y eosina. La figura 15 demuestra que el tejido de bazo normal no se tiñe en forma inmunohistoquímica con clorotoxina conjugada con biotina. TM-601: teñida con clorotoxina conjugada con biotina, cont ra - teñida con verde de metilo; Control: solo verde de metilo; y tinción H&E: hematoxilina y e o s ma DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención se podrían utilizar técnicas de biología molecular, microbiología y de DNA recombinante convencionales dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en detalle en la literatura. Véase por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)"; "DNA Cloning: A Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985) ; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridi zat ion" [B.D. Hames & S.J.

Higgins eds. (1985)]; "Transcript ion and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)] ; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)] ; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)] ; B. Perball, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984) . Por lo tanto, si aparecen en la presente invención, los siguientes términos deberán tener las definiciones indicadas a continuación. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "ADNc" se refiere a la copia de ADN del transcripto de ARNm de un gen. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de aminoácidos derivada" deberá significar la secuencia de aminoácidos determinada mediante lectura de la secuencia de triplete de bases de nucleótido en el ADNc . Tal como se utiliza en la presente invención, el término "seleccionando una genoteca" se deberá referir al procedimiento de utilizar una sonda marcada para verificar si existe o no, bajo las condiciones apropiadas, una secuencia complementaria a la sonda presente en una genoteca de ADN particular. Además, "seleccionando una genoteca" se podría realizar mediante PCR. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "PCR" se refiere a la reacción de polimerasa en cadena la cual es el tema de las patentes E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202 para Mullís, así como a otras mejoras conocidas ya en la técnica . Se prefiere que los aminoácidos descritos en la presente invención estén en la forma i soméri ca "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" pueden sustituir a cualquiera de los residuos de L-aminoácidos, en tanto que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxi terminal de un polipéptido. Respecto a la nomenclatura normal de polipéptido, J Bi ol . Chem . , 243:3552-59 (1969) , las abreviaciones para los residuos de aminoácidos son conocidas en la técnica . Deberá indicarse que todas las secuencias de residuos de aminoácidos están representados en la presente invención mediante fórmulas cuya orientación a la izquierda y a la derecha está en la orientación convencional del extremo amino terminal hacia el extremo carboxi terminal. Además, cabe mencionar que un guión al inicio o al final de la secuencia de residuos de aminoácidos indica u péptido unido a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, vi ru s ) que funcione como una unidad autónoma de replicación de ADN in vi vo ; es decir, que pueda replicarse bajo su propio control. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual se podría unir otro segmento de ADN de modo que se pueda efectuar la replicación del segmento ligado. Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de una sola cadena o de hélice de doble cadena.

Este término se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no lo limita a cualquiera de las formas terciarias particulares. Por lo tanto, este término incluye el ADN de doble cadena encontrado, entre otras, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción) , virus, plásmidos y cromosomas. La estructura de la presente invención se analiza de conformidad con la convención normal de dar la secuencia únicamente en la dirección 5' a 3' junto con la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa a la del ARNm) . Un "origen de replicación" se refiere a aque l l a s secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN. Una "secuencia que codifica para" ADN es una secuencia de ADN de doble cadena la cual se transcribe y se traduce en un polipéptido i n vi vo cuando se coloca bajo control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora quedan determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y por un codón de detención de transcripción en el extremo 3' (carboxilo) . Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a secuencias procarióticas, ADNc proveniente de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico provenientes de ADN eucariótico (por ejemplo de origen mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción estarán ubicadas por lo general en el extremo 3' con respecto a la secuencia codificadora. Las secuencias de control de transcripción y de traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, aumentadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que aseguren la expresión de una secuencia codificadora en una célula hospedera.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que puede unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora hacia el extremo 3' (dirección 3' ) . Para propósitos de definición en la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' mediante el sitio de inicio de transcripción y se extiende hacia el extremo 5' (dirección 5') para incluir el número de bases o de elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles que puedan ser detectados por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de transcripción, así como dominios de unión a proteínas (secuencia de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Con frecuencia, pero no siempre, los promotores eucarióticos contienen cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias de tipo Shine -Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35. Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora está "bajo el con t rol " de secuencias de control de transcripción y de traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, el cual se traduce después en la proteína codificada por la secuencia codificadora. Una "secuencia de señal" puede estar incluida cerca de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica para un péptido de señal, en el extremo N-terminal al polipéptido, que se comunica a la célula hospedera para dirigir el polipéptido hacia la superficie de la célula o para secretar el polipéptido hacia el medio, y este péptido de señal es recortado por la célula hospedera antes que la proteína abandone la célula. Se pueden encontrar secuencias de señal asociadas con una variedad de proteínas originales para los procariotes y eucariotes . El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente invención en referencia a la sonda de la presente invención, se define como una molécula constituida por dos o más ribonucleót idos , de preferencia más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores los cuales, a su vez, dependen de la función y uso final del oligonucleótido. El término "iniciador" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un oligonucleótido, ya sea que esté presente en la Naturaleza tal como en un material digerido por restricción purificado o que sea producido en forma sintética, el cual puede actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de iniciador, el cual es complementario para una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y de un agente de inducción tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH apropiados. El iniciador podría ser de cadena sencilla o de doble cadena y debe tener una longitud suficiente para iniciar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del iniciador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del iniciador y uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el iniciador de oligonucleótido típicamente contiene 15-25 o más oligonucleótidos, aunque podría contener menos nucleótidos. Los iniciadores de la presente invención se seleccionan para que sean "sustancialmente complementarios" para cadenas diferentes de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los iniciadores deben tener complementariedad suficiente para que se hibriden con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia de iniciador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, se puede unir un fragmento de nucleótido no complementario al extremo 5' del iniciador, siendo el remanente de la secuencia de iniciador complementario a la cadena. En forma alternativa, se pueden esparcir bases o secuencias más largas no complementarias en el iniciador, con la condición que la secuencia de iniciador tenga suficiente complementariedad con la secuencia o se hibride con la misma y forme de esta manera la plantilla para la síntesis del producto de extensión. Tal como se utilizan en la presente invención, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas, cada una de las cuales cortan el ADN de cadena doble en o cerca de una secuencia específica de nucleótidos. Una célula se ha "transformado" mediante ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante podría estar o no integrado (ligado en forma covalente) en el genoma de la célula. En células de procariotes, de levaduras y de humanos, por ejemplo, Se podría mantener el ADN transformante sobre un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada en forma estable es una en la cual el ADN transformante ha quedado integrado en un cromosoma de modo tal que es heredado a las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad queda demostrada por la capacidad de la célula eucarióta para establecer líneas celulares o clones comprendidos por una población de células hijas que contienen al ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o precursor mediante mitósis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que puede crecer en forma estable i n vi tro durante muchas generaciones. Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento que puede ser identificado dentro de una molécula ADN más grande que no está asociada con la molécula más grande en la Na t ura l e z a . Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica para un gen mamífero, el gen por lo general estará flanqueado por ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, la secuencia codificadora es una construcción en la cual la secuencia codificadora por sí misma no se encuentra en la Naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el cual la secuencia codificadora genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen original) . Las variaciones alélicas o eventos de mutación que se presentan en forma natural no dan origen a la región heteróloga del ADN como la descrita en la presente invención. Los marcadores utilizados más comúnmente para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, compuestos químicos que presenten fluorescencia cuando se exponen a luz ultravioleta, y otros. Se conoce un número de materiales que se pueden utilizar como marcadores. Estos incluyen por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y Amarillo Lucifer. Un material particular para detección es el ant i - ant icuerpo de conejo preparado en cabras y conjugado con f l uore s c e í na mediante un enlace de tipo isotiocianato . Las proteínas también pueden estar marcadas con un elemento radioactivo o con una enzima. El marcador radioactivo puede ser detectado mediante cualquiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isótopo preferido se podría seleccionar a partir de 3H, 14C, 32P, 35S, 3SC1, 51Cr, "Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re . Los marcadores basados en enzima son también útiles, y se pueden detectar mediante cualquiera de las técnicas colorimét ricas , espectrofotomét ricas , f1uoroespectrofotornétricas , amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la partícula seleccionada mediante reacción con moléculas formadoras de puentes tales como las carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Se conocen y se pueden utilizar muchas enzimas que pueden ser utilizadas en estos procedimientos. Las enzimas preferidas son peroxidasa, ß-glucuronidasa, ß -D-glucos idasa , ß-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Se hace referencia a las patentes E.U.A. Nos. 3,654,090, 3,850,752 y 4,016,043 a manera de ejemplo, respecto a su descripción de materiales y métodos de marcado alternativos. Un sistema de prueba particular desarrollado y utilizado en la técnica es conocido como una prueba de receptor. En una prueba de receptor, el material que se va a evaluar se marca en forma apropiada y después se inoculan ciertas colonias celulares de prueba con una cantidad de ambas marcas después de lo cual se conducen estudios de unión para determinar el grado hasta el cual el material marcado se une a los receptores celulares. De esta manera se pueden establecer diferencias en la afinidad entre los materiales. Una prueba útil en la técnica es la conocida como prueba "cis/trans". En forma resumida, esta prueba utiliza dos construcciones genéticas, una de las cuales es típicamente un plásmido que expresa en forma continua un receptor particular de interés cuando se transfecta en una línea celular apropiada, y la segunda es un plásmido que expresa un reportador tal como luciferasa bajo el control de un complejo receptor/ 1 igando . De esta manera, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando para un receptor particular, uno de los plásmidos será una cons t ruc c i ón que dé como resultado la expresión del receptor en la línea celular elegida, mientras que el segundo plásmido tendrá un promotor ligado al gen de luciferasa en el cual se inserta el elemento de respuesta para el receptor particular. Si el compuesto bajo prueba es un agonista para el receptor, el ligando formará un complejo con el receptor, y el complejo resultante se unirá al elemento de respuesta e iniciará la transcripción del gen de luciferasa. Después se mide la quimiolumini scencia resultante mediante fotometría, y se obtienen curvas dosi s - respuesta que se comparan con aquellas de ligandos conocidos. El protocolo anterior se describe con mayor detalle en la patente E.U.A. No. 4,981,784. La presente invención está dirigida a un método para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos con un ligando específico para tumor neuroectodérmico fusionado a una porción citotóxica. Los posibles objetivos de tumor neuroectodérmico incluyen gliomas, meningiomas, epéndimomas, meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, f eocromoc i tomas , melanomas, tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos (PRET) , carcinoma de célula pequeña de pulmón, sarcoma de Ewi ng y tumores metastáticos en el cerebro. De preferencia, el ligando específico de tumor neuroectodérmico es clorotoxina fusionada a una porción citotóxica. Los ejemplos de posibles porciones citotóxicas incluyen gelonina, ricina, saponina, exotoxina de Pseudomona s , proteína antiviral de fitolacácea, toxina de difteria y proteínas de complemento. La presente invención también está dirigida a un agente terapéutico específico para tumor neuroectodérmico en el cual el ligando específico para tumor neuroectodérmico es un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina, que se cree es un canal de cloruro de 72 kDa. El anticuerpo podría estar fusionado a gelonina, ricina, saponina, exotoxina de Ps eudomona s , proteína antiviral de fitolacácea, toxina de difteria y proteínas del complemento. La presente invención también está dirigida a un método para diferenciar el tejido de tumor neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico del tejido no neoplásico incubando el tejido de interés con clorotoxina marcada y midiendo la unión de la clorotoxina marcada con relación al tejido normal en los casos en que esté disponible. La c l oro t oxi na podría estar marcada ya sea con una porción fluorescente o podría estar marcada con radioactividad utilizando marcadores radioactivos tales como 131? o 125I. Se pueden utilizar porciones fluorescentes para la detección medíante microscopía fluorescente o mediante clasificación de célula activada fluorescente. La clorotoxina marcada con radioactividad se puede detectar mediante barrido tomográfico de emisión de pos i t roñes . Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar las diversas modalidades de la invención y no significa que limiten la presente invención en forma alguna.

EJEMPLOl Resumen de los resultados de clorotoxina provenientes de experimentos con glioma Los estudios recientes han demostrado que la vasta mayoría de las células de glioma expresan un antígeno común. Este antígeno es seleccionado como blanco mediante clorotoxina (Ctx o TM-601) , un péptido de 36 aminoácidos aislado originalmente a partir del veneno del escorpión Lei uru s quinqués tri a t u s . La clorotoxina se une en forma selectiva a la membrana de las células del glioma permitiendo que estas células se puedan seleccionar como blanco en forma selectiva dentro del SNC (18) . El antígeno seleccionado como blanco mediante este péptido parece ser un canal de ion cloruro, aunque el antígeno aún no se identifica en forma inequívoca a nivel molecular. Hasta este momento, los datos indican que la clorotoxina se une a una proteína de membrana, con peso molecular de 76 kDa, que se expresa en forma diferencial en la membrana ci toplasmát ica de la célula del glioma. La unión del péptido incrementa la proliferación celular del glioma (19) e inhibe la capacidad de migración de las células en la prueba de Transwell, una prueba in vi tro para evaluar la capacidad de invasión del tumor (20) . Parece ser que la clorotoxina ejerce este efecto reduciendo la permeabilidad de la membrana a los iones Cl" con lo cual se evitan los cambios de volumen celular que son necesarios para permitir que las células invadan el tejido sano (20) . Por lo tanto, la acción más probable de la clorotoxina es sobre un canal de cloruro del glioma caracterizado previamente en forma exhaustiva (19) .

EJEMPLO 2 Tinción inmunohistoquímica de gliomas con clorotoxina Se tiñeron alrededor de 250 secciones congeladas o con parafina de tejidos de biopsia de humano mediante inmunohistoquímica con una forma sintetizada químicamente de clorotoxina que contiene una cantidad detectable de grupo biotina unido químicamente al extremo N-terminal (TM-601) . La unión de la molécula TM-601 se observó sobre células selectivas asociadas esencialmente con todos los tumores tipo glioma que tienen hasta 95% de células positivas por tumor. Tomando como base estos estudios, se ha propuesto utilizar clorotoxina como un marcador específico para glioma y como una herramienta terapéutica potencial para seleccionar como blanco los tumores tipo glioma. Para tales propósitos, se puede utilizar la unión mediada por clorotoxina de moléculas radioactivas o de porciones citotóxicas.

EJEMPLO 3 Manipulación de ADN recombinante de clorotoxina Se pueden preparar proteínas recombinantes diseñadas específicamente mediante ingeniería genética para que imiten la unión y acción de la toxina original, utilizando técnicas bien conocidas en el campo. La actividad biológica de la clorotoxina sintética es tan efectiva para el bloqueo del canal de ion cloruro como la toxina original del veneno. Se utilizan técnicas recombinantes para sintetizar clorotoxina en E col i empleando un sistema de vector PGEX modificado y la proteína se puede ligar a diversas proteínas de fusión utilizando sitios de restricción comunes. Después de la síntesis de la clorotoxina recombinante, ésta podría ligarse a diversas proteínas de fusión citotóxicas incluyendo glutat ion- S - trans ferasa (GST) , gelonina, ricina, toxina de difteria, proteínas del complemento y radiol igandos y otras de tales proteínas como las que son bien conocidas en la técnica de inmunotoxinas .

EJEMPLO 4 Anticuerpos contra el canal de ion cloruro que une a clorotoxina Se pueden preparar anticuerpos para los canales de ion cloruro en tumores derivados de la glía en la siguiente manera. Se generan antisueros policlonales inyectando proteínas de fusión creadas entre la glutat ion- S - transferasa y el inserto de clorotoxina en ratones o en conejos. Los ratones se inmunizan con 0.5 ml de una suspensión 1:1 de 1 mg/ml de proteína de fusión purificada en adyuvante completo de Freund y posteriormente con dos inyecciones adicionales después de 14 y de 28 días en adyuvante incompleto de Freund. Los anticuerpos de conejo y de ratón se purifican a partir de los antisueros utilizando la proteína de fusión de GST inmovilizada sobre filtros de nitrocelulosa. Los anticuerpos se examinan después respecto al carácter específico de unión en diversos tejidos.

EJEMPLO 5 Razonamiento para la evaluación de tumores de origen neuroectodérmico respecto a la unión de clorotoxina Dadas las similitudes que pueden ser compartidas entre los gliomas y otras células de origen neuroectodérmico, y los argumentos desarrollados que proponen propensiones similares de las células neuroectodérmicas para migrar, se realizó una investigación minuciosa para examinar los tumores de origen neuroectodérmico respecto a la expresión de sitios de unión para clorotoxina.

EJEMPLO 6 Preparación de secciones provenientes de biopsias de humano congeladas o incrustadas en parafina La mayoría de las muestras de tejido humano, de ambos sexos, de todas las edades y razas se obtuvieron a través de la Organización de Cooperación en Materia de Tejidos Humanos, Procuramiento de Tejidos en UAB, los hospitales de UAB y el Banco de Te ido de Cerebro de Humano en Londres , Canadá. Se rebanaron tejidos congelados en forma instantánea y tejido fresco incrustado en un gel para congelamiento a un espesor de 8 mieras y se recogieron en portaobjetos con carga positiva. Las secciones se fijaron después en paraformaldehído al 4% o en "milloniqs" de conformidad con el protocolo de tinción. Se tomaron secciones de bloques de parafina y se prepararon de conformidad con los procedimientos estándar.

EJEMPLO 7 Evaluación de muestras de biopsias respecto a la unión a clorotoxina Se bloquearon secciones de biopsia durante 1 hora en suero de cabra normal al 10% en PBS y se trataron con una dilución de clorotoxina conjugada con biotina durante toda la noche a 4°C. Después de lavados minuciosos, las tinciones se desarrollaron mediante la técnica del complejo de avidina -biot ina (ABC por sus siglas en inglés) (Estuche Vectastain Élite ABC de Vector Laboratories, Burlington Canadá) y se visualizaron mediante la reacción colorimét rica de DAB ( 3 ' 3 ' -diaminobencidina ; Vector Laboratories) con el complejo ABC. La s secciones de biopsía se cont r - t iñeron con verde de metilo, un colorante para núcleo, para visualizar más fácilmente las células no teñidas. El marcador de fondo no específico puede variar de experimento a experimento debido a cambios en las concentraciones efectivas del marcador, la condición del tejido o la duración de la reacción. Por lo tanto se tiñó un control en forma idéntica con verde de metilo, pero sin la clorotoxina conjugada con biotina. La tinción de células positivas se identificó mediante marcado de clorotoxina por encima del fondo cuando se comparó con su control individual de la siguiente rebanada. Las células que contienen cantidades altas de peroxidasa endógena presentan tinción de fondo oscura en los controles debido a la reacción de DAB con las peroxidasas. Por último, se tiñó una tercera sección adyacente tanto con hematoxilina, un colorante específico para los núcleos celulares, como con eosina, un colorante ci toplasmát ico . Por lo tanto, se tiñeron tres secciones adyacentes por cada tejido analizado. Estas se muestran en las microfotograf í as que proveen evidencia del carácter específico de la unión de clorotoxina TM-601 a los tumores de origen neuroectodérmico en comparación con los controles. En las microfotograf í as las secciones adyacentes se identifican como sigue: TM-601: clorotoxina conjugada con biotina detectada mediante un producto de reacción de color café de DAB con la biotina y contra- teñido después con verde de metilo; Control: la sección de control teñida únicamente con verde de metilo; y H&E: la sección teñida con hematoxilina y eosina.

EJEMPLO 8 Tumores tipo glioblastoma multiforme (GBM) Se tiñó glioblastoma multiforme (GBM) con la clorotoxina conjugada con biotina (TM-601) . Estos tumores son reactivos en grado extremo a la clorotoxina conjugada con biotina debido a que 25 de las 25 muestras de pacientes fueron positivas como se puede observar en la figura 1. Este glioblastoma multiforme puede ser comparado con la tinción de tejido normal de cerebro de humano con clorotoxina conjugada con biotina (18/23 negativo) . La figura 2 muestra una tinción representativa. El tejido normal de cerebro demuestra la falta de tinción con TM-601. Esto es consistente con la evidencia inicial del carácter específico de la unión de clorotoxina a los gliomas EJEMPLO 9 Tinción de GFAP en tejido normal de cerebro La sección de biopsia se bloqueó durante 1 hora en suero normal de cabra al 10% en PBS y después se tiñó con anticuerpos contra la proteína acida fibrilar de la glía (GFAP; DAKO Corporation, Carpintería, CA) durante toda la noche. Se aplicó el anticuerpo secundario conjugado con la peroxidasa al tejido enjuagado durante 2 horas, se enjuagó de nuevo antes de visualizar la tinción con DAB. En la figura 2 se muestra una tinción típica de la proteína acida fibrilar de la glía de cerebro normal. El cerebro normal fue positivo para la tinción de proteína acida fibrilar de la glía en la cual se tiñeron los astrocitos presentes típicamente en el tejido normal.

EJEMPLO 10 Neuroblastomas Los neuroblastomas son un tipo de tumor que se encuentra principalmente en niños con una incidencia elevada en las adrenales. El neuroblastoma muestra reactividad hacia TM-601 superior a la tinción de control como se observa en la figura 3. Seis de siete de los neuroblastomas fueron positivos para la unión de clorotoxina.

EJEMPLLO 11 Feocromoci tomas Los feocromoci tomas son células cromafínicas neoplásicas de las glándulas adrenales . Este tumor también presenta un grado elevado de tinción como se observa en la figura 4. Cinco de seis feocromoc i tomas fueron positivos respecto a la tinción con clorotoxina conjugada con biotina, especialmente en comparación con la tinción TM-601 de las glándulas adrenales normales (3/3 negativo) observada en la figura 5.

EJEMPLO 12 Melanomas La figura 6 muestra la tinción con clorotoxina conjugada con biotina de un melanoma metastat i zado hacia el cerebro. Siete de siete melanomas que presentan metástasis hacia el cerebro fueron positivos para TM-601. Además, se analizó melanoma metastat i zado hacia el pulmón como se observa en la figura 7. Sin embargo, la piel normal no es reactiva a TM-601 (6/6 negativo) (figura 8) aunque existe cierta cantidad de tinción de fondo en los melanocitos incluso en los controles.

EJEMPLO 13 Carcinomas de pulmón de célula pequeña Los carcinomas de célula pequeña de pulmón son reactivos a TM-601. Existe un buen contraste entre las células que se tiñen y las que no (figura 9) . Las células positivas para TM-601 en el control (panel medio) son eritrocitos que presentan niveles elevados de tinción de peroxidasa de fondo. Este carácter específico para TM-601 se puede también demos t ra r comparando la tinción con TM-601 de carcinoma de célula pequeña (2/3 positivo) y el pulmón normal (3/3 negativo) (figura 10) .

EJEMPLO 14 Meduloblastomas Los meduloblastomas son otro tipo de tumor de origen neuroectodérmico. Estos presentan reactividad específica a TM-601 como se observa en la figura 11 (4/4 positivo) .

EJEMPLO 15 Sarcoma de Ewing El sarcoma de Ewing, un cáncer raro del tejido óseo que algunas veces se encuentra en tejido blando, es positivo (2/2) a TM-601 (figura 12) .

EJEMPLO 16 Evaluación de los sitios potenciales de administración de clorotoxina respecto a efectos secundarios Para ayudar en el diseño de terapia con fármacos con este producto, se tiñeron diversos tejidos normales con TM-601 para determinar los sitios posibles en los cuales se puedan presentar efectos secundarios. La evidencia preliminar indica que algunos de los blancos más comunes para los efectos secundarios tales como el estómago y el hígado, son negativos a TM-601 (2/2 muestras negativas para ambos tejidos, hasta el momento) (figuras 13 y 14 respectivamente) . La tinción de tejido de bazo también se muestra en la figura 15 (3/3 negativo) . La tinción con TM-601 de otros tejidos normales de humano se muestra en resumen en el cuadro 1.

CUADRO 1 Tumor o tipo de tejido # de Unión a casos clorotoxina Tumores primarios de cerebro: Gl iomas : WHO grado IV: gl iobl as toma s multiforme 25 Pos i iva WHO grado III: astrocito a anaplásico 2 Pos i iva WHO grado II: grado bajo 2 Pos iva WHO grado I: astrocitoma pliocítico 11 Pos i t iva 01 igodendrogl iomas 6 Pos i t iva Otros gliomas 3 Pos i t iva Gangl iomas 3 Positiva Meningiomas 18 Pos i t iva Epéndimomas 3 Pos i t iva Otros tumores primarios de cerebro: Quistes epidermoides en cerebro 3 2/3 Positiva Tumores de cerebro-patología desconocida 15 14/15 Pos i t iva Glándula pituitaria de pacientes con GBM 2 Pos i t iva Tumores secundarios de cerebro: Tumores metastáticos hacia el cerebro 14 12/14 Pos i t iva Comparación de tejidos de cerebro Cerebros con Alzheimer 8 Negativa Cerebro, normal o no implicado 24 18/24 negat iva Epi leps ia/gl ios i s / apoplejía 6 Pos i t iva Cerebro no implicado de GBM 3 Negativa ( autops ia ) Tumores de origen neuroectodérmico Meduloblastoma 4 Pos i iva Neuroblastoma 7 6/7 Positiva Ganglioneuroma 4 Pos i iva CUADRO 1 (continuación) Tumor o tipo de tejido # de Unión a casos c lorot oxina Me 1 anomas 7 Pos i t iva Feocromocitoma 6 5/6 Pos i t iva PPNET 1 Negat iva Carcinoma de célula pequeña de pulmón 3 2/3 Positiva Sarcoma de Ewing 2 Pos i t iva Otros tejidos de humano Colon 3 Negativa Endometrio/miometrio 2 Negat iva Corazón 2 Negativa Corteza es Riñon 2 pos i t iva /médula es negat iva Glándula adrenal 3 Negat iva Hígado 3 Negat iva Pulmón 3 Negativa Pulmón, carcinoma de célula pequeña 1 Pos i iva Meninges 3 Nega iva Músculo, esquelético 2 Negativa Páncreas, fibrosis 1 Negat iva La mayoría negat ivas /unas Ovario 2 cuantas células son pos i t ivas Piel, de muslo, abdomen o mama 6 Negat iva Bazo 3 Negat iva Estómago 2 Negativa La mayoría negat ivas /unas Test í culos 2 cuantas células son pos i t ivas Tiroides 1 negat iva EJEMPLO 17 Resumen de los tumores y tejidos evaluados Como se resume en el cuadro 1, la vasta mayoría de tumores de origen neuroectodérmico unen la clorotoxina, lo que indica que la clorotoxina tiene una utilidad más amplia para seleccionar como blanco a tumores de origen neuroectodérmico. En forma específica, se evaluaron tumores neuroectodérmicos primitivos de 34 pacientes, de los cuales 31 presentaron carácter específico hacia clorotoxina en el material de tumor como se observa en el cuadro 1. Esta tinción se comparó con la tinción con clorotoxina de otros tipos de tumores del SNC y del SNP así como la comparación con diversos tejidos normales de humano. TM-601 se asocia en forma específica con tumores de origen neuroectodérmico incluyendo meduloblastomas, neuroblastomas, gangl ioneuromas , melanomas, feocromoci tomas , carcinomas de célula pequeña de pulmón y sarcomas de Ewing. Por lo tanto, se pueden utilizar moléculas derivadas de clorotoxina para seleccionar como blanco en forma específica, para propósitos de terapia o de diagnóstico, los tumores de origen neuroec odérmico antes identificados. De igual manera, estos tumores también se pueden seleccionar como blanco utilizando otras moléculas tales como anticuerpos que se unan al receptor de clorotoxina, que se cree es el canal de ion cloruro de 72 kD . En la presente invención se citaron las siguientes referencias: 1.- Hemizygous or homozygous deletion of the chromosomal región containing the pl6INK4a gene associated with amplification of the EGF receptor gene in gl ioblastomas . Hegi ME, Hausen AZ , Ruedi D, Malin G and Kleihues P. (1997) Int. J. Cáncer 73:57-63. 2.- Ras activation in astrocytomas and neurof ibromas . Guha A. (1998) Can J. Neurol. Sci. 25:267-281. 3.- Tumor antigens in astrocytic gliomas. Kurpad SN, Zhao XG , Wikstrand CJ, Batra SK, McLendon RE, and Bigner DD . (1995) Glía 15:244-256. 4.- Iodine - 131 - labeled ant i - 1 enascin monoclonal antibody 81C6 treatment of patients with recurrent malignant gliomas: phase 1 trial results. 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Cualquiera de las patentes o publicaciones mencionadas en esta descripción son indicadores de los niveles de los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Por lo tanto dichas patentes y publicaciones quedan incorporadas en su totalidad en la presente invención para referencia en el mismo grado que si cada una de ellas se indicara en forma individual y específica para que se incorpore para referencia. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetivos y obtener los resultados y ventajas finales mencionadas, así como aquellas inherentes a la misma. Los ejemplos presentes junto con los métodos, procedimientos, t ra t ami ent os , moléculas y compuestos específicos descritos en la presente invención son representativos de las modalidades preferidas, sirven como ejemplificación y no se pretende que sean limitaciones al campo de la invención. Los cambios en la misma y otros usos que se presenten a los expertos en la técnica quedan abarcados dentro del alcance de la invención tal como se define mediante el campo de las reivindicaciones.

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un método para tratar a un individuo que tenga un tumor neuroectodérmico, que comprende el paso de: administrar una composición farmacéutica que comprenda una dosis farmacéuticamente efectiva de un ligando específico para tumor neuroectodérmico fusionado a una porción citotóxica y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el tumor neuroectodérmico es un tumor tipo tratado que se selecciona del grupo que consiste de epéndimomas, meduloblastomas, neuroblastomas, gangliomas, feocromoc i tomas , melanomas, tumores neuroe'ctodérmicos primitivos periféricos, carcinoma de célula pequeña de pulmón, sarcoma de Ewing y tumores metastáticos en el cerebro.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ligando específico para tumor neuroectodérmico es clorotoxina .

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha clorotoxina se selecciona del grupo que consiste de clorotoxina original, clorotoxina sintética y clorotoxina recombinante.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dichas porciones citotóxicas se seleccionan del grupo que consiste de gelonina, ricina, saponina, exotoxina de Pseudomonas , proteína antiviral de fitolacácea, toxina de difteria y proteínas de complemento.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ligando específico para tumor neuroectodérmico es un anticuerpo contra el receptor de clorotoxina. 1 . - Un método para diferenciar tejido de tumor neoplásico derivado de tumor neuroectodérmico del tejido no neoplásico, que comprende los pasos de : poner en contacto un tej ido de interés con clorotoxina marcada que se una en forma específica a l tejido de tumor neoplásico del tumor neuroectodérmico; y medir la unión de la clorotoxina marcada, caracterizado porque un nivel elevado de unión, con relación al tejido normal, indica que el tejido es neoplásico. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicha clorotoxina está marcada con una porción que se puede detectar. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha porción que puede ser detectada se selecciona del grupo que consiste de un fluorocromo, biotina, un agente colorimétrico ligado a un substrato de enzima . 10 El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha unión de clorotoxina marcada se determina mediante un método que se selecciona del grupo que consiste de microscopía fluorescente, ELIZA y clasificación de célula activada fluorescente. 11 El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicha clorotoxina marcada es marcada con radioactividad. 12 El método de conformidad con la re i vi ndi ca c i ón 11, caracterizado además porque dicha clorotoxina radiomarcada se selecciona del grupo que consiste de 131 I -clorotoxina 125 - y clorotoxina 13 El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el nivel de afinidad de unión de clorotoxina radiomarcada que indica la presencia de tejido neoplásico es desde aproximadamente 5 nanomolar hasta aproximadamente 5 micromolar. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha unión de clorotoxina radiomarcada se determina utilizando barrido tomográfico de emisión de positrones .