DE69533439T2

DE69533439T2 - Thymidinkinase tk1, peptide, die korrespondierenden antikörper und ihre verwendung zur bestimmung der tumorproliferation

Info

Publication number: DE69533439T2
Application number: DE69533439T
Authority: DE
Inventors: Staffan Eriksson; Sven Skog; Bernhard Tribukait
Original assignee: Tribukait Bernhard Dr
Current assignee: Tribukait Bernhard Dr
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2015-04-22
Also published as: US6083707A; AU2355095A; WO1995029192A1; EP0753011A1; SE9401380D0; DE69533439D1; EP0753011B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid mit einem Bezug zum Zellwachstum und dessen Verwendung. Konkreter dient die Erfindung als Marker für die Zellproliferation und dieser Marker ist eine spezifische Peptidsequenz, welche ein Teil des zellulären Enzyms Thymidinkinase ist. Dieses Peptid kann als Immunogen für die Antikörperproduktion eingesetzt werden oder bei anderen Verfahren eingesetzt werden, um Moleküle zu erhalten, die mit dem Peptid reagieren. Die Antikörper oder die reaktiven Moleküle können zur Bestimmung des Proliferationsgrades von Tumoren oder anderen Geweben von Menschen und Tieren eingesetzt werden.
HINTERGRUND
Bei klinischen Forschungen wurde der Anteil von DNA-synthetisierenden Zellen (S-Phase-Zellen) in Tumoren als Maß für ihre Proliferationsrate verwendet. Die DNA-synthetisierenden Zellen wurden früher mit Hilfe von radioaktiv markiertem Thymidin (Autoradiographie) bestimmt. In jüngerer Zeit wurde sogar die Inkorporation von Halogen-Analoga von Thymidin (BrdU) und Antikörper gegen diese und, in großem Umfang, quantitative Durchflusszytometrie-DNA-Messungen eingesetzt. Der Nachteil bei der Verwendung von isotopenmarkiertem Thymidin und BrdU ist die Tatsache, dass nur lebende Zellen gemessen werden können. Deswegen wurden diese Verfahren nur bei ausgewählten Patienten und in einer begrenzten Anzahl von Studien (1) angewandt. Durchflusszytometrie, eine Technik, die mit fixierten nicht-lebenden Zellen arbeitet, jedoch auch mit gelagertem Zellmaterial, hat eine hohe Kapazität, ist jedoch nicht in der Lage, zwischen proliferierenden und nicht- proliferierenden S-Phase-Zellen zu unterscheiden. Die Bestimmung von S-Phase-Zellen ist noch komplizierter bei Tumoren, die sowohl normale als auch maligne Zellen enthalten, welche sich in ihren DNA-Gehalt nicht von gutartigen Zellen unterscheiden (2).
Andere Verfahren zur Bestimmung von Markern mit einem speziellen Bezug zu proliferierenden Zellen sind bekannt, beispielsweise Ki-67 und PCNA (3). Ki-67 ist ein monoklonaler Antikörper gegen eine Substanz im Zellkern. Die exakte Natur von Ki-67 ist noch unbekannt. Ki-67 wird in allen Stadien des Zellzyklus, außer in G₀ und frühem G₁, mit einem Maximum in G₂ und in der Mitose, exprimiert. Ein Antikörpertyp, der kommerziell erhältlich ist, kann nur bei frischen Geweben eingesetzt werden, ein neuerer Typ auch in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben.
PCNA ist ein Kernprotein (36 kD), identisch mit demjenigen der DNA-Polymerase-Untereinheit Delta. Abhängig von der Zellproliferationsrate wird PCNA in allen Stadien des Zellzyklus exprimiert. PCNA ist nicht so sensitiv für verschiedene Fixierungstechniken wie Ki-67 (3).
Ein Problem mit Ki-67 und PCNA besteht darin, dass diese Substanzen in allen Stadien des Zellzyklus exprimiert werden und somit nur bis zu einem gewissen Grad den Anteil von S-Phase-Zellen reflektieren.
Thymidinkinasen treten in zwei verschiedenen Formen auf, einer zytoplasmatischen Form (TK1) (4) und einer mitochondrialen Form (TK2) (5) mit unterschiedlichem genetischen Ursprung. TK1, welche in unterschiedliche Varianten untergliedert werden kann (6), steht in engem Bezug zur Zellproliferation und beginnt am Übergang von G₁/S synthetisiert zu werden (7). TK1 wird in Verbindung mit der Mitose abgebaut (8). Somit ist TK1 ein spezifischer Marker für S- und G₂-Zellen.
Es gab mehrere Versuche, TK1-spezifische Antikörper mit dem intakten Protein und verschiedenen rekombinanten Formen herzustellen. Jedoch wurden aufgrund der Tatsache, dass die Primärstruktur von TK1 bei unterschiedlichen Spezies hochkonserviert ist, nur über sehr wenige Antikörper berichtet und die hergestellten Antikörper zeigen eine umfangreiche Kreuzreaktion mit anderen Proteinen (8, 9).
EP-A1 255 431 beschreibt eine fötale Form von Thymidinkinase (TK-F), von der behauptet wird, dass sie eine überlegene enzymatische Aktivität im Vergleich zur bisher bekannten TK-F besitzt. Ferner beschreibt die Anmelderin ein Reinigungsverfahren und die Verwendung von TK-F zur Herstellung von Antikörpern. Von diesen Antikörpern wird gesagt, dass sie eine überraschende Wirkung bei Patienten mit hormonabhängigem Krebs aufweisen, insbesondere Prostata- bzw. Brustkrebs. Der diagnostische Einsatz dieser Antikörper wird nur erwähnt und die Anmeldung macht keine weiteren Angaben in dieser Hinsicht.
EP-A2 137 492 beschreibt ein Verfahren zur Frühdiagnose von malignen Tumoren mit Antikörpern, welche gegen verschiedene Blutformen von Nukleosid-Nukleotid-Phosphotransferasen gerichtet sind. Hier wird nicht nur Thymidinkinase bestimmt, sondern auch mehrere andere Phosphotransferasen, was bedeutet, dass das Verfahren nicht spezifisch für Thymidinkinase ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, den Anteil von proliferierenden S- und G₂-Zellen abzuschätzen durch Bestimmung der zellulären Konzentration der zytosolischen Thymidinkina se. Diese Bestimmung wird ermöglicht durch die Verwendung von Antikörpern gegen einen definierten Teil von TK1, nämlich ein Peptid mit 15 Aminosäureresten. Die Antikörper gemäß der Erfindung ergeben keinerlei Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen.
Die erfindungsgemäße Peptidsequenz repräsentiert eine einzigartige Struktur am C-terminalen Ende des Proteins, welche höchstwahrscheinlich Teil eines externen Schleifenbereichs des Proteins ist. Es ist auch bekannt, dass C-terminale Sequenzen an dem Zellzyklus-spezifischen Abbau von TK1 beteiligt sind (8). Deshalb ist diese Aminosäuresequenz höchstwahrscheinlich spezifisch immunogen und das entsprechende Epitop von TK1 wird nur in intakter TK1 exponiert und liegt nur dort vor.
Messungen der TK1-Aktivität im Serum von Patienten mit malignen Tumoren wurden umfangreich als Krankheitsmarker eingesetzt (10). Jedoch sind die Bestimmungen der TK1-Aktivität durch einen Assay mit radioaktivem Substrat relativ komplex. Deshalb besteht ein Bedarf für vereinfachte quantitative Assays für TK1, welche bei Zellextrakten, Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten eingesetzt werden könnten.
Dieser Bedarf wird erfindungsgemäß gestillt durch Antikörper, welche einzigartig sind und als spezifische Marker für proliferierende Zellen dienen können, da das Antigen nur in S- und G₂-Zellen exprimiert wird. Diese Antikörper können zur Bestimmung des Proliferationsgrades in irgendeinem Tumor verwendet werden und die Antikörper wurde sowohl mit frischem als auch mit gelagertem, in Paraffin eingebettetem Zellmaterial verwendet. Die Antikörper können mit TK1 auch nach verschiedenen Arten der Fixierung reagieren.
Die Erfindung wird nun detailliert unter Bezugnahme auf die 1–4 beschrieben werden.
1 zeigt Western-Immunoblots mit Extrakten unter Verwendung von TK1-Antikörpern;
2 zeigt die Inhibierung der TK1-Aktivität in Zellextrakten nach Immunpräzipitation mit dem Peptid-Antikörper;
3A zeigt Beispiele eines immungefärbten, Formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Embryonalkarzinoms bzw. Prostatakarzinoms;
3B zeigt ein immungefärbtes Teratokarzinom von einem Patienten; intestinalartige Komponente bzw. osteale Komponente; und
4 zeigt eine Immunfärbung von HeLa-Zellen (ABC-AP).
HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES POLYKLONALEN TR1-ANTISERUMS
Zur Herstellung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums mit Spezifität für TK1 wurden Kaninchen immunisiert und Booster-Impfungen mit dem folgenden synthetischen 15-Aminosäuren-Peptid der Erfindung vom C-terminalen Teil von TK1 unterworfen (11).
Acetyl-Lys-Pro-Gly-Glu-Ala-Val-Ala-Ala-Arg-Lys-Leu-Phe-Ala-Pro-Gln
Aminosäuren 210 bis 224 vom C-terminalen Teil der TK1-cDNA-Sequenz (Ref. 4).
Es wird angenommen, dass diese Sequenz von TK1 auf der Oberfläche des TK1-Proteins lokalisiert ist, und sie zeigt keinerlei Sequenzhomologie mit anderen bekannten Proteinen. Das Peptid wurde mit einem Trägerprotein verknüpft, um eine stärkere Immunreaktivität im Kaninchen hervorzurufen. Den Kaninchen wurden 100–200 μg des Peptids ein bis drei Mal pro Woche injiziert und das Serum wurde dann nach zwei bis vier Wochen gewonnen. Das Antiserum wurde mit 40%igem Ammoniumsulfat präzipitiert. Die Antikörper wurden durch Entsalzen auf einer Sephadex G-25-Säule, gefolgt von Affinitätschromatographie auf einer Peptid-Sephadex-Säule, gereinigt und als Ergebnis konnten etwa 5 mg gereinigter Antikörper aus etwa 50 ml Serum erhalten werden. Die Spezifität der Antikörper wurde mit gereinigter TK1, Zellextrakt von humanen lymphatischen Tumorzellen, stimulierten humanen Lymphozyten, Maus-Ascites-Tumorzellen und Mauslymphom-Tumorzellen mittels ELISA- und Western-Immunoblot-Techniken getestet. Als negative Kontrollen wurden humane lymphatische Tumorzellen verwendet, denen Thymidinkinase 1 fehlte, humane periphere unstimulierte Lymphozyten und gereinigtes Thymidinkinase 2-Peptid aus humaner Leber. Zur Identifizierung von TK1 in Western-Immunoblots wurde ein humanes TK1-Peptid, erhalten aus transfizierten E. coli, verwendet. Nach Reinigung der Antikörper wurde keine Immunreaktivität mit den negativen Kontrollen beobachtet (1). Darüber hinaus wurde keine Immunreaktivität gegenüber Desoxycytidinkinase (dCK) gefunden, ein Enzym, das ähnlich wie TK1 an der DNA-Synthese beteiligt ist. Die Immunreaktion der TK1-Antikörper wurde darüber hinaus im Zellextrakt durch Immunpräzipitation bestimmt. Nach der Immunpräzipitation wurde die Enzymaktivität sowohl im Überstand als auch in den Pellet-Fraktionen bestimmt (2). Die Ergebnisse zeigen eine spezifische Bindung der Antikörper an TK1, jedoch auch, dass die Bindung der TK1-Aktivität nicht inhibierte. Die Antikörper wurden auch für eine Immunfärbung von intakten fixierten CEM- und EAT-Zellen (Peroxidase, Fluoreszenz) verwendet. Als negative Kontrollen wurden unstimulierte humane Lymphozyten und TK-negative CEM-Zellen verwendet. Diese Zellen zeigten keine Anfärbung (1). Die Ergebnisse demonstrierten, dass das Zytoplasma, jedoch nicht der Zellkern, immungefärbt wurde, was dafür spricht, dass TK1 nur im Zytoplasma der Zelle produziert wird. Zusammenfassend, die Peptid-Antikörper reagieren spezifisch mit TK1 in Extrakten oder in Zellen und können deshalb als Reagenzien zur Bestimmung der Zellproliferation verwendet werden. Neben der Produktion polyklonaler Antikörper umfasst die vorliegende Erfindung auch die Produktion monoklonaler Antikörper gegen dasselbe synthetische 15-Aminosäuren-Peptid oder kann bei anderen bekannten molekulargenetischen Verfahren eingesetzt werden, wie z. B. der Phagentechnik, um reaktive Moleküle mit spezifischer Bindung an dasselbe Peptid zu erhalten.
Nachdem die Antikörper spezifisch mit TK1 in einem Extrakt von proliferierenden Zellen reagieren, können sie zur Feststellung der TK1-Niveaus durch verschiedene Immuntechniken in Geweben, Zellen und Körperflüssigkeiten eingesetzt werden. Zur Verwendung in Immunoassays können die erfindungsgemäßen Antikörper intakt sein oder in Form von Fragmenten vorliegen, wie im Stand der Technik üblich.
KORRELATION ZWISCHEN DER ZELLULÄREN KONZENTRATION VON TK1 IN ZELLEN, ZELLEXTRAKTEN UND DEREN ENZYMATISCHER AKTIVITÄT
Zur Feststellung der Beziehung zwischen der zellulären Konzentration von TK1 in Extrakten und deren Aktivität, um somit in der Lage zu sein, die TK1-Antikörper zur Bestimmung des Proliferationsgrads in Tumoren zu verwenden, wurde eine Reihe von Experimenten mit humanen CEM-Zellen und HeLa-Zellen und Maus-EAT-Zellen durchgeführt, die von verschiedenen Abschnit ten des Zellzyklus isoliert worden waren (G₁, S und G₂/M). Die TK-Aktivität ist niedrig in G₁, nimmt in der S-Phase zu und bleibt in G₂ hoch oder nimmt ab. Zellen aus den verschiedenen Abschnitten des Zellzyklus wurden durch Elutriationszentrifugation erhalten. Die zelluläre Konzentration von TK1 in Extrakten wurde mittels Western-Immunoblots und ELISA bestimmt, sowie mittels Immunfärbung dieser Zellen. Es wurde eine enge Korrelation zwischen der TK-Aktivität und dem Ausmaß der Immunreaktivität in Extrakten von allen drei Zelllinien gefunden. Die Immunfärbung der intakten Zellen korreliert eng mit der TK1-Aktivität. Derselbe Typ von Ergebnissen wurde mit aktivierten peripheren Blut-Lymphozyten von HIV-positiven und -negativen Individuen bei Verwendung derselben Antikörper erhalten (12).
Als Schlussfolgerung, die erfindungsgemäßen TK1-Antikörper reagierten mit S- und G₂-Zellen und können somit als Reagenzien zur Bestimmung der Zellproliferation eingesetzt werden.
PROLIFERATIONSGRAD VON TUMOREN, WIE DURCH TK1-ANTIKÖRPER BESTIMMT
Die Einsetzbarkeit der TK1-Antikörper wurde weiter bei verschiedenen Arten von Tumoren (Teratokarzinom, Embryokarzinom, Adenokarzinom der Prostata) untersucht. Tumorzellen, fixiert in Formalin und eingebettet in Paraffin nach normalen Verfahren, wurden mit Peptid-Antikörpern gefärbt und mit Hilfe sekundärer Antikörper mit ABC-HRP, ABC-AP oder Avidinmarkiertem Texasrot sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Tumorzellen positiv waren, während das umgebende Gewebe aus normalen Zellen negativ war (3–4). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Proben von humaner Leukämie erhalten.
Studien mit humanen Tumorzellen (HeLa-Zellen) zeigen eine Anfärbung des Zytoplasmas, jedoch nicht des Zellkerns (5).
Zur Bestimmung des Verhältnisses zwischen dem Anteil positiver Zellen und dem Anteil von S + G₂-Zellen wurden die Immunreaktivität und die Position im Zellzyklus in individuellen Zellen mit Hilfe von Einzelzell-Bildgebung und Durchflusszytometrie bei vier verschiedenen Zelltypen bestimmt (Tabelle 1). Eine enge Korrelation zwischen dem Anteil positiver Zellen und Zellen in S + G₂ wurde gefunden, wie in der Tabelle gezeigt.
TABELLE 1
Zur weiteren Untersuchung der Korrelation zwischen TK1-positiven Zellen und dem Anteil von S + G₂-Zellen wurden humane Tumorzellen (CEM, HeLa) von verschiedenen Abschnitten des Zellzyklus durch Elutriation isoliert. Fraktionen von Zellen mit einem unterschiedlichen Prozentsatz an S + G₂-Zellen wurden erhalten. Es wurde eine enge Korrelation (0,91) zwischen TK1-positiven Zellen und dem Anteil an S + G₂ gefunden.
Die Immunreaktion des TK1-Antiserums mit normalen proliferierenden Zellen und die unspezifische Bindung der Antikörper an nicht-proliferierende differenzierte Zellen wurde in verschiedenen Mausgeweben untersucht (Tabelle 2). Solche Unter suchungen sind von Bedeutung, um festzustellen, ob das Antiserum für klinische Studien brauchbar ist.
TABELLE 2
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass nur proliferierende Zellen, wie z. B. sekundäre Spermatozyten und Drüsenzellen, TK1-positiv sind, während differenzierte Zellen negativ sind.
PROLIFERATION STIMULIERTER LYMPHOZYTEN VON HIV-INFIZIERTEN PATIENTEN, WIE MITTELS TK1-ANTIKÖRPER BESTIMMT
Azidothymidin (AZT) ist ein Arzneiwirkstoff, der zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten verwendet wird. AZT blockiert das Enzym Reverse Transkriptase des HIV-Virus. AZT wird in infizierten Zellen durch TK1 zu AZT-Monophosphat aktiviert. In einer Studie mit 49 HIV-infizierten Patienten wurde die TK1-Aktivität in Mitogen-stimulierten Lymphozyten von diesen Patienten bestimmt (12). Als Kontrollen wurden Lymphozyten von 20 gesunden Freiwilligen verwendet. Die Kenntnis über die TK-Aktivität in solchen Patienten ist wichtig, um das Ergebnis einer chemotherapeutischen Behandlung zu beurteilen. Um auszuschließen, dass die Variationen der TK-Aktivität auf methodische Probleme zurückzuführen waren, wurde die zelluläre Konzentration von TK1 in Extrakten durch Western-Immunoblots unter Verwendung des polyklonalen TK1-Antikörpers gemäß der Erfindung bestimmt. Eine enge Korrelation zwischen der TK1-Aktivität und der zellulären Konzentration von TK1 wurde erhalten (12). Somit reflektierte in diesem Zellsystem die zelluläre Konzentration von TK1 in einem hohen Ausmaß die Proliferation dieser Zellen.
ANALYTISCHE VERWENDUNG VON TR1-ANTIKÖRPERN GEMÄSS DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft auch Antikörper in Kits, um 1-Stellen- oder 2-Stellen-Immunoassays durchzuführen.
Kits für 2-Stellen-Immunoassays umfassen neben dem oben beschriebenen TK1-Antikörper vorzugsweise auch einen Antikörper mit einer anderen Spezifität. Beispielsweise ist der andere Antikörper einer, der gegen das gesamte TK1-Protein oder Teile davon gebildet wurde.
REFERENZEN

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Claims

Peptid, das einen definierten Teil des Thymidinkinaseproteins 1 ausmacht, und zwar das Peptid der folgenden Aminosäurereste: Lys-Pro-Gly-Glu-Ala-Val-Ala-Ala-Arg-Lys-Leu-Phe-Ala-Pro-Gln.
Spezifischer Antikörper, erzeugt gegen das Peptid gemäß Anspruch 1.
Reaktives Fragment eines Antikörpers, erzeugt gegen das Peptid gemäß Anspruch 1.
In vitro-Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 2 oder ein Fragment eines Antikörpers gemäß Anspruch 3 zur Bestimmung der Thymidinkinaseaktivität von Zellen.
In vitro-Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 2 zur Bestimmung des Proliferationsgrades von Tumoren.
Verwendung gemäß Ansprüchen 4 oder 5, worin die Bestimmung an Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten durchgeführt wird.
Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 2 oder eines Fragments eines Antikörpers gemäß Anspruch 3 zur Bestimmung des Resultats der chemotherapeutischen Behandlung von HIV-Patienten mit Azidothymidin (AZT).
Kit, umfassend einen Antikörper gemäß Anspruch 2 oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 3 zur Bestimmung des Proliferationsgrades von Tumoren.
Kit gemäß Anspruch 8, umfassend eines zweiten Antikörper mit einer anderen Spezifität als der Antikörper oder des Fragments eines Antikörpers gemäß Ansprüche 2 bzw. 3.
Kit gemäß Anspruch 9, worin der zweite Antikörper gegen das gesamte Thymidinkinase 1 Protein gerichtet ist.