WO2004025302A2 - Verfahren zur identifizierung von nierenzellkarzinom spezifischen proteinen und deren verwendung - Google Patents

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WO2004025302A2
WO2004025302A2 PCT/EP2003/009637 EP0309637W WO2004025302A2 WO 2004025302 A2 WO2004025302 A2 WO 2004025302A2 EP 0309637 W EP0309637 W EP 0309637W WO 2004025302 A2 WO2004025302 A2 WO 2004025302A2
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Barbara Seliger
Thomas Halder
Alois Harder
Michael Kersten
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2550/00—Electrophoretic profiling, e.g. for proteome analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method for the characterization and / or identification of proteins which are used for the monitoring, diagnosis and prognosis of patients with primary renal cell carcinoma, for the selection of patients which respond to therapy with G250-specific antibodies, and as therapeutic Target structures can be used for the treatment of this disease.
  • the proteins or polypeptides or nucleic acids encoding them can also be used to identify pharmacologically active substances and / or even serve as immunogens for the stimulation of specific immune responses.
  • Human renal cell carcinoma is the most common neoplasia of the kidney. However, the molecular mechanisms that lead to initiation and progression in renal cell carcinoma are relatively unclear. Studies show that it is a complex multi-step process that is associated with the accumulation of various genetic alterations, including amplifications of the EGF receptor and / or mutations or loss of tumor suppressor genes, such as that of the Hippel-Lindau gene.
  • renal cell carcinoma is a refractory tumor and conventional therapies such as surgery, radiation and chemotherapy are relatively unsuccessful.
  • the high spontaneous regression rate, the existence of lymphocytic infiltrates and some objective remissions in clinical studies with various immunotherapeutic agents indicate that renal cell carcinoma is an attractive target for various immunotherapeutic strategies.
  • One of these strategies is the treatment of renal cell carcinoma with a monoclonal antibody (mAb) which is directed against G250, G250 being expressed to a high percentage on the cell surface of clear cell renal cell carcinomas (cf. WO 02/062972).
  • mAb monoclonal antibody
  • the identification of differently expressed tumor markers that are either induced or inhibited after antibody treatment is essential.
  • Protein modifications (ii) half-life of specific proteins or mRNAs, (iii) intracellular localization and (iv) molecular association of protein products.
  • Proteomics is to be seen as a complement to the mRNA expression analyzes.
  • this technology can also provide information about corresponding protein modifications.
  • Information about protein-protein interactions and the subcellular protein localization can also be obtained if the experiment is carried out appropriately
  • the proteome analysis is technically based on the combination of two-dimensional gel electrophoresis (2DE) for the separation and quantification of the proteins and analytical methods, such as mass spectrometry and N-terminal protein sequencing, which enable protein identification.
  • An object of the present invention was to provide tumor markers for the identification, monitoring and treatment of renal cell carcinomas. This object is achieved according to the invention by a method for characterizing and / or identifying proteins specific to renal cell carcinoma, which comprises the following steps:
  • the present invention relates to a method which is suitable for identifying, by means of a differential proteome analysis, renal cell carcinoma-specific tumor markers which can be used for an optimized diagnosis, prognosis and / or treatment of renal cell carcinoma patients.
  • Tables 2 and 4 show proteins which are expressed differentially in renal cell carcinoma cells compared to healthy kidney cells.
  • these proteins in particular at least 5, more preferably at least 10 of these genes, can be used to diagnose the condition of kidney cells.
  • the proteins shown in Table 2 or in Table 4 are particularly suitable as molecular markers for the diagnosis or prognosis of renal cell carcinoma.
  • the genes shown in Table 2 or in Table 4 are involved in the initiation or / and progression of renal cell carcinoma. They can therefore be used as markers for biological phenomena such as invasiveness or metastasis and are therefore of great importance for the diagnosis, prognosis and treatment of renal cell carcinoma.
  • the proteome analysis used according to the invention is based in particular on the combination of two-dimensional gel electrophoresis for the separation and quantification of proteins, coupled with analytical methods for protein identification, such as, for example, mass spectrometry and protein sequencing.
  • the proteins found here which are shown in Table 2 and in Table 4, can be used in particular as tumor markers or as a therapeutic target structure.
  • these tumor markers can be used in immunoassays, such as in protein chip production.
  • the coding nucleic acids can also be used for the production of DNA chips.
  • the tumor markers identified and shown in Table 2 essentially fall into the following subgroups: proteins involved in metabolism, proteins associated with proliferation / apoptosis, structure / cytoskeleton proteins, oncogene / tumor suppressor gene-associated proteins, substance transporters, adhesion proteins, protein processing / degradation proteins, Tumor antigens, stress proteins, putative tumor antigens and unknown proteins.
  • the tumor markers shown in Table 4 essentially fall into the following areas: annexins, antigen processing / presentation, cell cycle regulation, chemotherapy resistance genes, cytoskeleton, metabolic enzymes, growth factors, heat shock proteins, stress proteins, oncogenes, tumor suppressor genes, redox status and detoxification.
  • An object of the present invention is the identification of new tumor markers.
  • At least one of the proteins which are summarized in Tables 1, 2, 3 and 4, can be used as a general tumor marker or therapeutic target structure.
  • the tumor markers listed in the table can be used specifically for renal cell carcinoma.
  • the proteins in Tables 1 to 4 can be used in particular as a diagnostic or therapeutic target. Another possibility is to use these tumor markers in immunoassays and in protein and DNA chip production, which can then be used again to monitor a large patient base.
  • Preferred tumor markers are enolase, moesin, nibrin, nucleophosmin and d E-FABP (fatty acid binding protein), particularly preferred Nibrin and nucleophosmin.
  • HSP27 heat shock protein 27
  • HSP 60 stress proteins
  • ubiquitin carboxyhydrolase 1 The preferred heat shock protein (HSP) 27 is expressed ubiquitously and induced under external stress. It plays a role in stress resistance, cell growth and cell differentiation. Overexpression of HSP27 was found in human tumors. HSP27 is associated with tumor aggressiveness and patient survival.
  • Vimentin member of the intermediate filament in mesenchymal cells
  • CKs cytokeratins
  • a co-explosion of vimentin and CKs in tumor cells are often associated with D differentiation and increased invasiveness / migration / metastasis formation.
  • Stathmin is also a cytoskeletal protein that is involved in the regulation of the microtubule system. Vimentin and CK8 expression is a preferred diagnostic marker for RCC subtypes.
  • Fatty acid binding proteins belong to a cytoplastic family of proteins that mediate the transport and use of lipids. These proteins bind to different groups of fatty acids and are involved in the control of cell proliferation and aroptosis. Overexpression of a FABP subtype results in loss of tumor genicity, growth arrest and induction of apoptosis.
  • the terminal ubiquitin carboxyhydrolase is a member of the large, highly conserved family of ubiquitin or ubiquitin-like proteins and is involved in de-ubiquination (participation in regulatory cell processes).
  • the invention also enables discrimination between primary tumors and metastases, with the markers catepsin D, CK8, keratin 10, pyruvate kinase and tumor rejection antigen 1 preferably being used individually or in combination.
  • Another object of the invention is the identification of tumor markers in renal cell carcinoma, the expression of which is influenced by treatment with antibodies which are directed against G250.
  • a prerequisite is the frequency analysis of G250 surface expression on renal cell carcinoma cell lines and normal renal epithelial cells.
  • Flow cytometric analysis of 35 renal cell carcinoma cell lines showed that approx. 50% of the analyzed clear cell renal cell carcinoma cell lines, but not autologous normal renal epithelia, expressed G250 antigen on the cell surface.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • corresponding "low”, “medium” and “high” G250-expressing cell lines were treated with antibodies against G250 for different times and the protein expression pattern of untreated tumor cells compared with that of antibodies against G250-treated tumor cells.
  • the differentially expressed proteins have been identified using 2DE and mass spectrometry as methods. The identified proteins are summarized in Table 1 and can be used as tumor markers in immunoassays and for protein and DNA chip production, the use of which is then a preselection of a large patient base with respect to a putative In response to an antibody-based therapy, these markers can be used in particular in a method for demonstrating the effectiveness of treatment with G250 antibodies be used. At least one, more preferably at least 2 and in particular at least 5 of the proteins is preferably used.
  • the proteins shown in Table 1 can be used in particular to monitor the success of a treatment with antibodies against G250. In addition, they can be used to provide combination products for the treatment of renal cell carcinoma. In addition to the antibody against G250, such combination preparations preferably contain a further active ingredient which is the major vault protein, a protein selected from Table 3a or 3b, or a protein selected from Vimentin, Moesin, Heat shock 27 kD Protein 1, Heat shock 90 kD Protein 1 beta or aldehyde reductase.
  • a further active ingredient which is the major vault protein, a protein selected from Table 3a or 3b, or a protein selected from Vimentin, Moesin, Heat shock 27 kD Protein 1, Heat shock 90 kD Protein 1 beta or aldehyde reductase.
  • Figure 1 shows the G250 expression in different renal cell carcinoma cell lines.
  • Figure 2 shows FACS diagrams of two different G250 phenotypes in renal cell carcinoma.
  • Table 1 shows proteins which are expressed differentially in untreated renal cell carcinoma cell lines in kidney cell carcinoma cell lines treated with an antibody G250.
  • Table 2 shows differentially expressed proteins in renal cell carcinoma lesions compared to healthy renal epithelium.
  • Table 3 shows significant subgroups of G250 regulated proteins.
  • Table 4 shows differentially expressed proteins in renal cell carcinomas compared to healthy kidney cells, in particular upregulated proteins.
  • G250-expressing renal cell carcinoma cell lines For the subsequent proteome analyzes, 4 different G250-expressing renal cell carcinoma cell lines have been selected: one “low”, one “medium” and two “high” expressors. These cells were grown in the presence or absence of G250 (5 ⁇ g / ml ) incubated for 24 or 48 hours and 21 days before protein extracts were prepared.
  • Treated or untreated serve as sample material
  • Renal carcinoma cell lines e.g. MZ 1846RC.
  • 5 2D gel replicates are made from each sample, which are then evaluated by computer densitometry.
  • the cell pellet is finely ground in liquid nitrogen using a mortar. 3 mg are dissolved in 200 ⁇ lysis buffer. The suspension is treated with an ultrasonic wand while cooling in an ice water bath (10x 0.5 s). Now dilute with 800 ⁇ ⁇ lysis buffer and shake for 30 minutes at room temperature. Finally, 10 minutes at 20 C and ⁇ is centrifuged 14000, the supernatant is removed and portioned frozen at -80 C ⁇ . The protein concentration is determined using the Bradford method.
  • Kidney tissue from six patients is compared, three of whom were negative and three of which were negative.
  • five proteome exhibits are made from each sample, which are then evaluated by computer densitometry.
  • kidney tissue is finely ground in liquid nitrogen using a mortar. 3 mg are dissolved in 200 ⁇ L lysis buffer.
  • the suspension is treated with an ultrasonic wand while cooling with an ice water bath
  • the cooling of the focusing apparatus is set to 20 ⁇ C. After swelling, the strips rehydrated overnight are briefly immersed in double-distilled water and placed on a damp electrode paper, which in turn lies on a dry filter paper. Now place another damp filter paper and a dry filter paper on the strip. Now apply light pressure to remove the excess moisture from the strip. After placing the focusing strips in the focusing chamber, the sample is applied to the gel. The sample solutions are colored with bromophenol blue to check the tightness of the application cups. The focus runs overnight and is finished after 38.7 kVh. Focus program for pH 4-7:
  • the 1, 5 I gel solution for the gel casting is prepared and degassed the day before.
  • the solution is cooled overnight in a refrigerator to approx. 4 "C.
  • the reservoir of the casting chamber is closed with a funnel and a glycerine solution (500 ml) is poured into it.
  • the prepared gel solution 3 is removed from the Taken refrigerator and 72 ⁇ ⁇ TEMED or 7.2 ml of APS solution and filled this solution through a funnel into the casting chamber. If all the gel solution is in the chamber, remove the funnel and let the glycerol solution run in from the reservoir.
  • the tank buffer (20 l) is mixed in the Hoefer Dalt chamber and cooled to approx. 13 ° C.
  • the gels are overlaid in their cassettes with bidistilled water until use.
  • a small strip of filter paper with 5 ⁇ L of a protein standard solution is inserted on the top of each gel (marker).
  • the frozen focus strips are first equilibrated in a test tube with 10 ml (for two strips in a test tube) of a fresh DTT solution for 10 minutes.
  • the solution is then exchanged for 10 ml of a fresh bromophenol blue-colored iodoacetamide solution and shaken again for 10 minutes.
  • the water in the cast cassettes is poured off, the focused IPG strips are briefly immersed in the tank buffer, and applied horizontally to the gel.
  • Markers and IPG strips are now overlaid with a hot agarose solution.
  • the gels can be installed in their cassettes in the Hoefer Dalt chamber. Excess tank buffer is removed and the electrophoresis program started.
  • the running-in phase (step 1) runs 50 Vh.
  • the main phase (step 2) continues until the bromophenol blue front has reached the lower end of the gel.
  • the gels are now removed from the cassettes and drawn through double-distilled water.
  • Each gel is colored in its own bowl. First it is fixed with 330 ml of an ethanol / acetic acid mixture for 30 minutes. The SyproRuby solution (330 ⁇ l) is then stained for three hours with the light closed. The background is then decolorized with 330 ml of the ethanol / acetic acid mixture for 30 minutes with the exclusion of light. Before scanning with the fluorescence scanner, the gel is drawn twice through double-distilled water to remove the last residues of the dye. After scanning, the gel is shaken in a colloidal Coomassie staining solution overnight. The next day, the stained gels are shaken in bidistilled water. Once the background has been decolorized, the gel can be scanned with the visual scanner.
  • the gels are evaluated using the PD Quest image evaluation software (version 6.2.1, Bio Rad). For this, 5 2D gels per group are matched against each other. The resolution of the Tiff files of the gels (16bit) is 254 dpi. Such spots are considered significant if they meet the following criteria:
  • the target proteins detected by computer densitometry are now cut out of the polyacrylamide gel and digested with trypsin.
  • the peptides obtained are eluted from the gel with acetonitrile / 0.1% TFA and then desalted using a C18 ZipTip column.
  • These extracts are now cocrystallized with 2,5-dihydroxybenzoic acid and pipetted onto a MALDI-MS target plate.

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Proteinen, die für das Monitoren, die Diagnose und Prognose von Patienten mit primärem Nierenzellkarzinom, für die Selektion von Patienten, die auf Therapie mit G250 spezifischen Antikörpern ansprechen, sowie als therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. Die Proteine oder Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um pharmakologisch aktive Substanzen zu identifizieren oder/und selbst als Immunogene für die Stimulierung spezifischer Immunantworten dienen.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen und deren Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Proteinen, die für das Monitoren, die Diagnose und Prognose von Patienten mit primärem Nierenzellkarzinom, für die Selektion von Patienten, die auf Therapie mit G250 spezifischen Antikörpern ansprechen, sowie als therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. Die Proteine oder Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um pharmakologisch aktive Substanzen zu identifizieren oder/und selbst als Immunogene für die Stimulierung spezifischer Immunantworten dienen.
Das humane Nierenzellkarzinom stellt die häufigste Neoplasie der Niere dar. Jedoch sind die molekularen Mechanismen, die zur Initiation sowie Progression beim Nierenzellkarzinom führen, relativ wenig geklärt. Untersuchungen zeigen, dass es sich um einen komplexen Mehrschrittprozess handelt, der mit der Akkumulation verschiedener genetischer Alterationen, unter anderem Amplifikationen des EGF-Rezeptors und/ oder Mutationen bzw. Verlust von Tumorsupressorgenen, wie dem von Hippel-Lindau-Gen, einhergeht.
Nur das Tumorstadium, das durch die Tumorverbreitung, Beteiligung von regionalen Lymphknoten und das Vorhandensein von Fernmetastasen charakterisiert wird, wird heute von den Pathologen und Urologen als Indikator für die Patientenprognose breitflächig akzeptiert. Bisher ist wenig über die Funktion molekularer Regulation und Interaktion der genetischen Alterationen in der Entwicklung des Nierenzellkarzinoms sowie in der Metastasierung bekannt. Aus diesem Grund existieren bisher zur Zeit weder valide molekulare Marker, die für die Diagnose, Prognose und das Monitoren auf Therapieansprechen eingesetzt werden können. Solche Tumormarker sind von essentieller Bedeutung und führen langfristig zu einer effizienteren Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Viele der Gene/Proteine, die bei der Initiierung und Progression des Nierenzellkarzinoms involviert sind, sind ebenfalls nicht bekannt. Die Identifizierung solcher differenziell exprimierter Gene im Nierenzellkarzinom liefert die Basis zur Identifizierung von Markern für die biologischen Phänomene, wie Invasivität oder Metastasierung. Diese sind wiederum von großer klinischer Bedeutung, insbesondere für die Diagnose, Prognose und Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Generell ist das Nierenzellkarzinom ein therapierefraktärer Tumor und konventionelle Therapien, wie Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie, sind relativ erfolglos. Die hohe spontane Regressionsrate, die Existenz von lymphozytären Infiltraten und einige objektive Remissionen bei klinischen Studien mit verschiedenen Immuntherapeutika weisen daraufhin, dass das Nierenzellkarzinom ein attraktives Ziel für verschiedene immuntherapeutische Strategien darstellt. Eine dieser Strategien ist die Behandlung des Nierenzellkarzinoms mit einem monoklonalen Antikörper (mAb), der gegen G250 gerichtet ist, wobei G250 zu einem hohen Prozentsatz auf der Zelloberfläche von klarzelligen Nierenzellkarzinomen exprimiert wird (vgl. WO 02/062972). Um Patienten, die auf eine Therapie mit einem mAb, der gegen G250 gerichtet ist, ansprechen, zu präselektionieren, ist die Identifizierung von differenziell exprimierten Tumormarkern, die nach Antikörper-Behandlung entweder induziert oder inhibiert werden, wesentlich.
Um Expressionsunterschiede zwischen normalen Zellen und Krebszellen sowie zwischen unbehandelten und behandelten Krebszellen zu evaluieren, werden verschiedene mRNA-, oder Protein-basierende Methoden eingesetzt. Zu diesen zählen neben der differenziellen Display-PCR, cDNA Microarrays und DNA-Chip Technologie die serielle Analyse der Genexpression (SAGE). Diese Methoden werden erfolgreich für die Erstellung von globalen und quantitativen mRNA-Expressionsprofilen von Zellen und Geweben verwendet. Nachteil dieser Analysen sind die fehlende Detektion posttranskriptioneller Mechanismen, wie z.B. (i)
Proteinmodifikationen, (ii) Halbwertszeit spezifischer Proteine oder mRNAs, (iii) intrazelluläre Lokalisation und (iv) molekulare Assoziation von Proteinprodukten. Aus diesem Grunde ist komplementär zu den mRNA- Expressionsanalysen „Proteomics" zu sehen. Diese Technologie kann neben den quantitativen Proteinexpressionsprofilen außerdem Informationen über entsprechende Proteinmodifikationen liefern. Auch über Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie die subzelluläre Protein- Lokalisation können bei geeigneter Versuchsdurchführung Informationen erhalten werden. Die Proteomanalyse basiert dabei technisch auf der Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) für die Separierung und Quantifizierung der Proteine und analytischen Methoden, wie Massenspektrometrie und N-terminale Proteinsequenzierung, die die Proteinidentifikation ermöglichen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Tumormarker zur Identifizierung, zum Monitoring und zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen bereitzustellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen, welches folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Extrakts, umfassend lösliche Proteine, worin zumindest der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird,
(b) Auftrennen des ersten und zweiten Extrakts mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese, wobei ein erstes und zweites Proteommuster, jeweils bestehend aus einer Vielzahl von Proteinspezies erhalten wird,
(c) Vergleichen des ersten und zweiten Proteommusters und
(d) Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, welches geeignet ist, mittels einer differenziellen Proteomanalyse Nierenzellkarzinom spezifische Tumormarker zu identifizieren, die für eine optimierte Diagnose, Prognose oder/und Behandlung von Nierenzellkarzinompatienten eingesetzt werden können.
In den Tabellen 2 und 4 sind Proteine dargestellt, die in Nierenzellkarzinomzellen im Vergleich zu gesunden Nierenzellen diffentiell exprimiert sind. Eines oder mehrere dieser Proteine, insbesondere mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 10 dieser Gene, können zur Diagnose des Zustandes von Nierenzellen verwendet werden. Die in Tabelle 2 oder in Tabelle 4 dargestellten Proteine eignen sich insbesondere als molekulare Marker für die Diagnose bzw. Prognose eines Nierenzellkarzinoms. Insbesondere sind die in Tabelle 2 oder in Tabelle 4 dargestellten Gene bei der Initiierung oder/und Progression des Nierenzellkarzinoms involviert. Sie können deshalb als Marker für biologische Phänomene, wie beispielsweise Invasivität oder Metastasierung, verwendet werden und sind deshalb von großer Bedeutung für die Diagnose, Prognose bzw. Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Die erfindungsgemäß angewendete Proteomanalyse basiert insbesondere auf der Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese für die Separierung und Quantifizierung von Proteinen, gekoppelt mit analytischen Methoden für die Proteinindentifikation, wie beispielsweise Massenspektrometrie und Proteinsequenzierung. Die dabei aufgefundenen Proteine, welche in Tabelle 2 sowie in Tabelle 4 dargestellt sind, können insbesondere als Tumormarker oder als therapeutische Zielstruktur Verwendung finden. Darüber hinaus können diese Tumormarker in Immunoassays, wie bei der Protein-Chipherstellung, Verwendung finden. Zusätzlich können auch die kodierenden Nukleinsäuren zur DNA-Chip-Herstellung Verwendung finden.
Die identifizierten und in Tabelle 2 dargestellten Tumormarker fallen im Wesentlichen in folgende Untergruppen: am Metabolismus beteiligte Proteine, mit Proliferation/Apoptose assoziierte Proteine, Struktur/Zytoskelettproteine, Onkogen/Tumorsupressorgen-assoziierte Proteine, Transporter von Substanzen, Adhäsionsproteine, Proteinprozessierungs/Abbau-Proteine, Tumorantigene, Stressproteine, putative Tumorantigene und unbekannte Proteine. Die in Tabelle 4 dargestellten Tumormarker fallen im Wesentlichen in folgende Bereiche: Annexine, Antigen-Prozessierung/Präsentation, Zellzyklusregulation, Chemotherapieresistenzgene, Cytoskelett, Stoffwechselenzyme, Wachstumsfaktoren, Heat Shock-Proteine, Stressproteine, Oncogene, Tumorsuppressorgene, Redoxstatus und Detoxifizierung.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von neuen Tumormarkern. Dabei kann mindestens eines der Proteine, die in Tabelle 1 , 2, 3 und 4 zusammengefasst sind, als genereller Tumormarker oder therapeutische Zielstruktur eingesetzt werden. Dabei können die in der Tabelle aufgeführten Tumormarker spezifisch beim Nierenzellkarzinom eingesetzt werden. Die Proteine der Tabellen 1 bis 4 können insbesondere als diagnostisches oder therapeutisches Target eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung dieser Tumormarker in Immunoassays sowie in Protein- und DNA-Chip-Herstellung, welche dann wieder zum Monitoren eines großen Patientenstammes eingesetzt werden kann. Bveorzugte Tumormarker sind Enolase, Moesin, Nibrin, Nucleophosmin und d E-FABP (Fettsäurebindeprotein), besonders bevorzugt Nibrin und Nucleophosmin. Weitere bevorzugte Marker sind Vimentin sowie CK8 (Cytoskelettproteine), FABPL/I, UCTH und Calbindin sowie HSP27 (Heat shock protein 27) und HSP 60 (Stressproteine) oder/und terminale Ubiquitincarboxyhydrolase 1 . Das bevorzugte Heat shock Protein (HSP) 27 wird ubiquitär exprimiert und bei äußerem Stress induziert. Es spielt eine Rolle bei der Stressresistenz, beim Zellwachstum und bei der Zelldifferenzierung. In humanen Tumoren wurde eine Überexpression von HSP27 festgestellt. HSP27 wird mit der Aggressivität des Tumors und der Überlebenschancen eines Patienten in Verbindung gebracht.
Bei Vimentin (Mitglied des intermediären Filaments in mesenchymalen Zellen) und in Cytokeratinen (CKs) (Mitglieder der intermediären Filamente in Epithelzellen) handelt es sich um Cytoskelettproteine. Eine Koexplosion von Vimentin und CKs in Tumorzellen sind oftmals mit einer D- Differenzierung und einer erhöhten Invasivität/Migration/Metastasenbildung assoziiert. Stathmin ist ebenfalls ein Cytoskelettprotein, welches in die Regulierung des Mikrotubulussystems involviert ist. Die Vimentin- und CK8- Expression stellt einen bevorzugten diagnostischen Marker für RCC- Subtypen dar.
Fettsäurebindeproteine gehören zu einer cytoplastischen Proteinfamilie, welche den Transport und die Verwendung von Lipiden vermittelt. Diese Proteine binden an verschiedene Gruppen von Fettsäuren und sind in die Kontrolle von Zeilproliferation und Aroptose involviert. Durch Überexpression eines FABP-Subtyps entsteht ein Verlust an Tumorgenizität, ein Wachstumsstopp und eine Induktion von Apoptose.
Die terminale Ubiquitincarboxyhydrolase ist ein Mitglied der großen, hochkonservierten Familie von Ubiquitin oder Ubiquitin-artigen Proteinen und ist in die De-Ubiquinierung involviert (Teilnahme an regulatorischen Zellprozessen). Die Erfindung ermöglicht auch eine Diskriminierung zwischen Primärtumoren und Metastasen, wobei hier bevorzugt die Marker Catepsin D, CK8, Keratin 10, Pyruvatkinase und Tumorrejektionsantigen 1 einzeln oder in Kombination eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Identifizierung von Tumormarkern beim Nierenzellkarzinom, deren Expression durch Behandlung mit Antikörpern, die gegen G250 gerichtet sind, beeinflusst wird. Eine Voraussetzung stellt die Frequenzanalyse von G250-Oberflächenexpression auf Nierenzellkarzinomzelllinien und normalen Nierenepithelzellen dar. Durchflusszytometrische Analyse von 35 Nierenzellkarzinomzelllinien ergab, dass ca. 50 % der analysierten klarzelligen Nierenzellkarzinomzelllinien, nicht aber autologe normale Nierenepithelien G250-Antigen auf der Zelloberfläche exprimierten. Die G250-Expression variierte mit einer spezifischen mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von 2,6-33,2 jedoch stark zwischen den einzelnen Nierenzellkarzinomzelllinien. Dies führte zur Klassifizierung von „low", „medium" und „high /-G250-„Expressors".
Im weiteren Schritt wurden entsprechende „low", „medium" und „high" G250-exprimierende Zelllinien für unterschiedliche Zeitpunkte mit Antikörpern gegen G250 behandelt und das Protein-Expressionsmuster von unbehandelten mit dem von Antikörpern gegen G250-behandelten Tumorzellen verglichen. Die differenziell exprimierten Proteine wurden identifiziert, wobei die 2DE und Massenspektrometrie als Methoden eingesetzt wurden. Die identifizierten Proteine sind in Tabelle 1 zusammengefasst und können als Tumormarker in Immunoassays sowie für die Protein- und DNA-Chip-Herstellung, deren Einsatz dann eine Vorselektion eines großen Patientenstammes bezüglich eines putativen Ansprechens auf eine Antikörper-basierende Therapie ermöglicht, verwendet werden. Diese Marker können insbesondere in einem Verfahren zum Nachweis der Effektivität einer Behandlung mit G250-Antikörpern eingesetzt werden. Bevorzugt wird mindestens eines, mehr bevorzugt mindetens 2 und insbesondere mindestens 5 der Proteine eingesetzt.
Bei den bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten und charakterisierten Proteine handelt es sich im wesentlichen um
Strukturproteine
Chaperone
Signaltransduktionsproteine am Metabolismus beteiligte Proteine - am Proteinabbau/Prozessierung beteiligte Proteine an Apoptose/Zellzyklus beteiligte Proteine
Transporterproteine
Tumorantigene
Immunophiline - unbekannte Proteine.
Hierbei wurden ausschließlich mindestens 1 ,5fach regulierte, sowohl in positiver als auch in negativer Richtung, statistisch signifikant differenziell regulierte Proteine berücksichtigt.
Die in Tabelle 1 dargestellten Proteine können insbesondere zum Monitoring des Behandlungserfolgs einer Behandlung mit Antikörpern gegen G250 eingesetzt werden. Darüber hinaus können sie herangezogen werden , um Kombinationspräparate zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen bereitzustellen. Solche Kombinationspräparate enthalten neben dem Antikörper gegen G250 bevorzugt einen weiteren Wirkstoff, welcher das Major vault Protein, ein Protein ausgewählt aus Tabelle 3a oder 3b, oder ein Protein ausgewählt aus Vimentin, Moesin, Heat shock 27 kD Protein 1 , Heat shock 90 kD Protein 1 beta oder Aldehydreduktase beeinflusst. Durch die gezielte Kombination, ausgehend von den gefundenen, differenziell exprimierten Proteinen, kann einerseits der Behandlungserfolg verstärkt, andererseits gegebenenfalls auch die Ausbildung unerwünschter Nebenwirkungen unterdrückt werden.
Zur weiteren Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung dienen folgende Beispiele, Abbildungen und Tabellen.
Abbildung 1 zeigt die G250-Expression in unterschiedlichen Nierenzellkarzinomzelllinien.
Abbildung 2 zeigt FACS-Diagramme von zwei unterschiedlichen G250- Phänotypen in Nierenzellkarzinomen.
Tabelle 1 zeigt Proteine, die in mit einem Antikörper G250 behandelten Nierenzel l ka rzinomzelllinen differenziell zu u nbehandelten Nierenzellkarzinomzelllinien exprimiert werden.
Tabelle 2 zeigt in Nierenzellkarzinomläsionen im Vergleich zu gesundem Nierenepithel differenziell exprimierte Proteine.
Tabelle 3 zeigt signifikante Subgruppen von G250-regulierten Proteinen.
Tabelle 4 zeigt in Nierenzellkarzinomen im Vergleich zu gesunden Nierenzellen differenziell exprimierte Proteine, und zwar insbesondere hochregulierte Proteine.
Beispiel 1 :
Expression von G250 auf der Oberfläche von Nierenzellkarzinomzelllinien zur Auswahl geeigneter Zelllinien zur Detektion von G250-regulierten Tumormarkern (Tabelle 1 , 3)
(i) FACS-Analyse
Es wurden insgesamt 35 humane Nierenzellkarzinomzelllinien, die von chirurgisch entferntem Nierentumorgewebe abstammen, sowie autologe Nierenzellepithelien auf G250-Oberflächenexpression analysiert. In 18 von 35 Nierenkarzinomzelllinien wurde mittels Durchflusszytometrie G250- Oberflächenexpression nachgewiesen, wobei die Expression zwischen den verschiedenen Zelllinien stark variierte (Abbildungen 1 und 2).
Für die nachfolgenden Proteomanalysen wurden bisher 4 verschiedene G250-exprimierende Nierenzellkarzinomzelllinien ausgewählt: eine „low,,-, eine „medium,,- und zwei „high"-Expressor. Diese Zellen wurden in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von G250 (5 μg/ml) für 24 bzw. 48 Stunden und 21 Tage inkubiert, bevor Proteinextrakte hergestellt wurden.
(ii) 24 Stunden-Behandlung der Nierenzellkarzinomzelllinien mit G250
Zellen ausplattieren, so dass ca. 50 % konfluent
1 Tag in Medium stehen lassen - Zugabe von neuem Medium, davon 5 T125-Flaschen unbehandelt, 5
T125 Flaschen mit G250 5,3 /vg/ml (entspricht 30 μ\ [5 mg/ml] auf
28 ml Medium) nach 24 Stunden Ernte der Zellen
2* waschen in PBS - Trypsinisieren
3* waschen in PBS
Überstand abnehmen trockenes Pellet in flüssigen Stickstoff, anschließend bei -80 β C lagern
(iü) 21 Tage-Behandlung der Nierenzellkarzinomzelllinien mit G250
Zellen werden nicht gesplittet, Medium-Wechsel nach folgendem Plan
Tag 1 : Zellaussaat, Medium + G250
Tag 4: Zugabe G250
Tag 8: Mediumwechsel + G250 Tag 1 1 : Zugabe von G250
Tag 14: Zugabe von G250
Tag 1 5: Mediumwechsel + G250
Tag 1 9: Zugabe von G250
Tag 22: Zugabe von G250 Tag 23: Ernte
G250: Zugabe von 30 μ\ einer 5 mg/ml Lösung auf 25 ml Medium in
T1 75-Flasche
Zellen werden gesplittet
Tag 1 : 5x106 Zellen/ T1 25 Flasche ± G250 Tag 4: Zugabe G250
Tag 8: Mediumwechsel + G250 / splitten
Tag 1 1 : Zugabe von G250
Tag 14: Zugabe von G250
Tag 1 5: Mediumwechsel + G250/ splitten Tag 1 9: Zugabe von G250
Tag 22: Zugabe von G250/ splitten
Tag 23: Ernte
G250: Zugabe von 30 μ\ einer 5 mg/ml Lösung auf 25 ml Medium in
T1 75-Flasche Probenmaterial
Als Probenmaterial dienen behandelte bzw unbehandelte
Nierenkazinomzelllinien, z.B. MZ 1846RC. Zur statistischen Absicherung werden von jeder Probe fünf 2D-Gel-Replikate angefertigt, welche anschließend computerdensitometrisch vergleichend ausgewertet werden.
Probenaufbereitung
Das Zellpellet wird in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser fein gemahlen. 3 mg werden hieraus in 200 μ Lysispuffer gelöst. Mit dem Ultraschallstab wird unter Eiswasserbadkühlung die Suspension behandelt (10x 0,5 s). Nun wird mit 800 μ\ Lysispuffer verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Schluss wird 10 Minuten bei 20 βC und 14000 xg zentrifugiert, der Überstand abgenommen und portioniert bei -80 βC eingefroren. Die Proteinkonzentration wird mittels der Bradfordmethode bestimmt.
Beispiel 2 (Tabelle 2):
Tumormarker des Nierenzellkarzinoms, welche in Nierenzellkarzinomzellen und normalen Nierenzellen differenziell exprimiert werden
Probenmaterial
Es wird Nierengewebe von sechs Patienten verglichen, von denen drei Nierentumor-negativ und drei Nierentumor-positiv waren. Für die statistische Absicherung werden von jeder Probe fünf Proteomexponate angefertigt, welche anschließend computerdensitometrisch vergleichend ausgewertet werden.
Probenaufbereitung
Das Nierengewebe wird in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser fein gemahlen. 3 mg werden hieraus in 200 μL Lysispuffer gelöst. Mit dem
Ultraschallstab wird unter Eiswasserbadkühlung die Suspension behandelt
(10x 0,5 s). Nun wird mit 800 μ\ Lysispufferl verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Schluss wird 10 Minuten bei 20 ° C und 14000 xg zentrifugiert, der Überstand abgenommen und portioniert bei -80 β C eingefroren. Die Proteinkonzentration wird mittels der Bradfordmethode bestimmt.
Beispiel 3 Proteomanalyse
Rehydration der Fokussierungsstreifen (Immobiline Dry Strips)
Die Fokussierungsstreifen (T = 4 %, C = 3 %, pH 4-7) werden im getrockneten und gefrorenen Zustand geliefert. Für den Gebrauch werden sie über Nacht in einem Reswelling Tray in Rehydratisierungspuffer gequollen. Für einen 18 cm lange Streifen verwendet man 400 μL Rehydratisierungspuffer.
Fokussierung (erste Dimension)
Die Kühlung der Fokussierungsapparatur wird auf 20 β C eingestellt. Die über Nacht rehydrierten Streifen werden nach der Quellung kurz in bidestilliertes Wasser getaucht und auf einem feuchten Elektrodenpapier abgelegt, das wiederum auf einem trockenen Filterpapier liegt. Auf den Streifen legt man nun ein weiteres feuchtes Filterpapier und ein trockenes Filterpapier. Nun übt man leichten Druck aus, um die überschüssige Feuchtigkeit aus dem Streifen zu entfernen. Nach dem Auflegen der Fokussierungsstreifen in die Fokussierungskammer wird die Probe auf das Gel appliziert. Die Probelösungen werden mit Bromphenolblau gefärbt, um die Dichtigkeit der Applikationscups zu kontrollieren. Die Fokussierung läuft über Nacht und ist nach 38,7 kVh beendet. Fokussierungsprogramm für pH 4-7:
Figure imgf000015_0001
Guss der Gele für die zweite Dimension
Die 1 ,5 I Gellösung für den Gelguss wird am Vortag hergestellt und entgast. In einer verschlossenen Flasche wird die Lösung über Nacht in einem Kühlschrank auf ca. 4 "C gekühlt. Das Reservoir der Gusskammer wird mit einem Trichter verschlossen und darin eine Glycerinlösung (500 ml) eingefüllt. Direkt vor dem Guss wird die vorbereitete Gellösung 3 aus dem Kühlschrank genommen und 72 μ\ TEMED bzw. 7,2 ml APS-Lösung eingerührt und diese Lösung durch einen Trichter in die Gusskammer gefüllt. Ist die gesamte Gellösung in der Kammer, nimmt man den Trichter weg und lässt die Glycerinlösung aus dem Reservoir einlaufen. Diese drückt die Gellösung aus den Einfüllschlauch und dem unteren Teil der Gusskammer, so dass sich die Gellösung nur noch in den Gusskassetten befindet. Möglichst schnell werden dann die Gele mit wassergesättigtem Butanol 7 überschichtet. Die Menge der Gellösung und der Glycerinlösung 6 richtet sich nach der Anzahl der eingesetzten Gusskassetten und ist auch abhängig vom Volumen der Gusskammer. Nach drei Stunden kann man die auspolymerisierten Gele aus der Kassette entnehmen. Zweite Dimension
In der Hoefer Dalt-Kammer wird der Tankpuffer (20 I) angerührt und auf ca. 13 °C gekühlt. Bis zum Gebrauch werden die Gele in ihren Kassetten mit bidestilliertem Wasser überschichtet. Auf die Oberseite eines jeden Gels wird ein kleiner Filterpapierstreifen mit 5 μL einer Proteinstandardlösung eingefügt (Marker). Die gefrorenen Fokussierungsstreifen werden zuerst in einem Reagenzglas mit 10 ml (für zwei Streifen in einem Reagenzglas) einer frischen DTT-Lösung 10 Minuten äquilibriert. Danach wird die Lösung gegen 10 ml einer frischen bromphenolblaugefärbten lodacetamidlösung ausgetauscht und wieder 10 Minuten geschüttelt.
Das Wasser in den Gusskassetten wird abgegossen, die fokussierten IPG Streifen kurz in den Tankpuffer getaucht, und horizontal auf das Gel appliziert.
Marker und IPG Streifen werden nun mit einer heißen Agaroselösung überschichtet. Sobald die Agarose fest geworden ist, können die Gele in ihren Kassetten in die Hoefer Dalt-Kammer eingebaut werden. Überschüssiger Tankpuffer wird entfernt und das Elektrophoreseprogramm gestartet. Die Einlaufphase (Schritt 1 ) läuft 50 Vh. Die Hauptphase (Schritt 2) läuft solange, bis die Bromphenolblaufront das untere Ende des Gels erreicht hat. Die Gele werden nun aus den Kassetten entnommen und durch bidestilliertes Wasser gezogen.
Elektrophoreseprogramm:
Figure imgf000016_0001
Färbung der Gele
Jedes Gel wird in einer eigenen Schale gefärbt. Zuerst wird mit 330 ml eines Ethanol/Essigsäure-Gemischs 30 Minuten fixiert. Danach wird drei Stunden der SyproRuby-Lösung (330 μl) unter Lichtabschluss gefärbt. Mit 330 ml des Ethanol/Essigsäure-Gemischa wird dann der Hintergrund 30 Minuten unter Lichtabschluss entfärbt. Vor dem Scannen mit dem Fluoreszenzscanner wird das Gel zweimal durch bidestilliertes Wasser gezogen, um letzte Reste des Farbstoffs zu entfernen. Nach dem Scannen wird das Gel in einer kolloidalen Coomassiefärbelösung über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag werden die gefärbten Gele in bidestilliertem Wasser geschüttelt. Ist der Hintergrund entsprechend entfärbt, kann das Gel mit dem visuellen Scanner aufgenommen werden.
Computerdensitometrie der 2D Gele
Die Evaluierung der Gele wird mit der Bildauswerte-Software PD Quest (Version 6.2.1 , Fa. Bio Rad) durchgeführt. Dafür werden jeweils 5 2D-Gele pro Gruppe gegeneinander gematched. Die Auflösung der Tiff-Files der Gele (16bit) beträgt 254 dpi. Es werden solche Spots als signifikant angesehen, die folgende Kriterien erfüllen:
Standardabweichung ein- und desselben Spots innerhalb einer
Gruppe ist ≤ 30 % parametrischer Signifikanztest (student T-Test) wird angewendet - die Spotveränderung zwischen 2 Gruppen weist einen „confidence level" von < 0,05 auf
Regulationsfaktor eines Spots zwischen 2 Gruppen ist > 1 ,5
Zusätzlich werden auch solche Spots als signifikant erachtet, die eine komplette Deregulierung zwischen 2 Gruppen aufweisen. Dabei werden innerhalb der Gruppe des vorhandenen Spots auch Standardabweichungen > 30 % zugelassen. MALDI - TOF-Massenspektrometrie (MS) der Targetproteine
Die computerdensitometrisch detektierten Targetproteine werden nun aus dem Polyacrylamidgel ausgestochen und mit Trypsin verdaut. Die erhaltenen Peptide werden mit Acetonitril/0, 1 % TFA aus dem Gel eluiert und sodann mit einer C18 ZipTip Säule entsaltzt. Diese Extrakte werden nun mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure cokristallisiert und auf eine MALDI-MS-Targetplatte pipettiert.
Diese kristallisierten Peptide werden ansch ließend im MALDI-TOF-Massenspektrometer (Voyager STR, Applied Biosystems) mit einem N2-Laser (337 nm) ionisiert. Die Ionen werden durch Spannungen von 20-25 kV beschleunigt und zugleich deren Flugzeit, welche massenspezifisch ist, gemessen. Nach Auswertung der entstehenden Spektren lassen sich durch Datenbankrecherchen die einzelnen Proteine identifizieren.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen, welches folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Extrakts, umfassend lösliche Proteine, worin zumindest der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird,
(b) Auftrennen des ersten und zweiten Extrakts mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese, wobei ein erstes und zweites Proteommuster, jeweils bestehend aus einer Vielzahl von Proteinspezies, erhalten wird, (c) Vergleichen des ersten und zweiten Proteommusters und
(d) Chara kterisierung oder/und I dentifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen, vorzugsweise aus Gewebebiopsien von Patienten, und der zweite Extrakt aus normalen Nierenzellen gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der erste Extrakt aus unbehandelten und der zweite Extrakt aus behandelten Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Behandlung der Nierenzellkarzinomzellen polyklonale oder/und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, single-chain, bispezifische, chimärisierte oder/und humanisierte Antikörper v e r w e n d et we r d e n , d i e m i n d e ste n s g e g e n e i n nierenzellkarzinomspezifisches Antigen gerichtet sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Antigen G250 ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Behandlung verwendeten Antikörper gegen das Antigen G250 gerichtet sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper der chimäre monoklonale Antikörper cG250 ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die zweidimensionale Gelelektrophorese folgende Schritte umfasst:
(a) Auftrennung der Extrakte in einer ersten Dimension entsprechend des isoelektrischen Punkts,
(b) gefolgt von einer Auftrennung in einer zweiten Dimension entsprechend der Größe.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin
Nierenzellkarzinom spezifische Proteinspezies ausgewählt werden, die (a) an verschiedenen Positionen auf den zweidimensionalen
Gelen, die von dem ersten bzw. zweiten Extrakt erhalten werden, lokalisiert sind oder/und (b) unterschiedliche Intensitäten auf den zweidimensionalen Gelen des ersten und zweiten Extrakts besitzen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinspezies durch Peptid-Fingerprinting charakterisiert werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinspezies durch Massenspektroskopie charakterisiert werden oder/und wenigstens teilweise sequenziert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, aus denen die Extrakte gewonnen werden, Säugerzellen sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zellen humane Zellen sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinspezies ausgewählt werden aus Serumproteinen , Stru ktu rproteinen ,
Signalübertragungsproteinen, Proteasom-Untereinheiten, Stressfaktoren, Tumorantigenen, Onkogenen, Apoptose- und Profliferations assoziierten Proteinen, Transporterproteinen, Adhäsionsproteinen oder/und Metabolismus- und Proteinprozessierungs assoziierten Proteinen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welches den zusätzlichen Schritt umfasst:
(e) Chara kterisierung oder/u nd Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen bei einem an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
16. Proteom einer Nierenzellkarzinomzelle, bestehend aus einem Muster von individuellen Proteinen, welches über ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhältlich ist.
17. Proteom nach Anspruch 16, enthaltend wenigstens einen Teil der in Tabelle 1 , 2, 3 oder 4 dargestellten Proteine, insbesondere mindestens 10 Proteine, mehr bevorzugt mindestens 20 Proteine davon.
18. Nierenzellkarzinom assoziierte Proteine oder/und modifizierte Proteine, ausgewählt aus der Gruppe Serumproteine, Strukturproteine, Signalübertragungsproteine, Proteasom- Untereinheiten, Stressfaktoren, Tumorantigene, Onkogene, Apopto se- u nd Prof l iferatio n s a sso zi ie rte Protei ne ,
Transporterproteine, Adhäsionsproteine oder/und Metabolismus- und Proteinprozessierungs assoziierte Proteine.
1 9. Nierenzellkarzinom assoziierte Proteine oder/und modifizierte Proteine, wie in Tabelle 1 , 2, 3 oder 4 angegeben oder proteolytische Fragmente davon.
20. Antikörper, gerichtet gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 18 oder 19.
21 . Verwendung eines Proteoms nach Anspruch 16 oder 17 oder/und eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und eines Antikörpers nach Anspruch 20 für die Diagnose, Prognose, Prävention oder Therapie von Nierenzellkarzinom.
22. Verwendung eines Proteoms von Anspruch 16 oder 17 oder/und eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und eines
Antikörpers nach Anspruch 20 für die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.
23. Verwendung der kodierenden Nukleinsäuresequenz oder/und einer Variante davon eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 für die Diagnose, Prognose, Prävention, Therapie von Nierenzellkarzinom oder/und die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.
24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA, ist.
25. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ihre antisense Sequenz aufweist.
26. Verwendung von mindestens einem der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und mindestens eines Antikörpers nach
Anspruch 20 zur Herstellung eines Protein-chip-assays für die
Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum Monitoren von Patienten.
27. Proteinchip, erhältlich nach Anspruch 26.
28. Verwendung von mindestens einer kodierenden Nukleinsäuresequenz oder/und einer Variante davon eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung eines Nukleinsäure-Chip- assays, insbesondere eines DNA-chip-assays, für die Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum
Monitoren von Patienten.
29. Nukleinsäure-Chip, erhältlich nach Anspruch 28.
30. Verwendung von Antikörpern gegen eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung eines Immunoassays für die Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum Monitoren von Patienten.
31 . Verwendung von Antikörpern gegen wenigstens eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Nierenzellkarzinom.
32. Verwendung von polyklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab ')2, Fab ' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit Zytokinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Interleukinen IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 1 2, 13, 14, und 1 5, Interferonen IFN-σ, IFN-ß und IFN- , Tumor nekrose Faktor TNF-σ, TNF-ß, nerve growth factor (NGF), Liganden von CD40, FAS, CD
27 und CD 30, Macropphage inhibiting protein (MIP), Rantes, aktive Fragmente hiervon oder/und pharmazeutisch geeignete Analoga und
Derivate sowie geeignete Kombinationen zur Behandlung von an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
33. Verwendung von Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab ')2, Fab ' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit niedermolekularen Wirkstoffen (Molekulargewicht < 2000 Da) zur Behandlung von an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
34. Verwendung von Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab ')2, Fab ' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Form von Konjugaten mit einer Markierungsgruppe und/oder cytotoxischen Gruppe vorliegen.
35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die cytotoxische Gruppe ausgewählt wird aus Radionukliden und Toxinen.
36. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente umfasst:
(a) einen Antikörper, monoklonalen Antikörper, F(ab ' )2, Fab ' oder Fab Antikörperfragment, single-chain (Einzelketten-) Antikörper, bispezifischen Antikörper, chimärisierten Antikörper oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörper, der gegen das Antigen G250 gerichtet ist und (b) zusätzlich einen Wirkstoff, insbesondere einen weiteren Antikörper oder/und einen niedermolekularen Wirkstoff, der wenigstens ein Protein aus Tabelle 1 derart beeinflusst, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die therapeutische Wirkung eines ersten Antikörpers oder Derivats davon alleine, positiv beeinflusst (verstärkt).
37. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Antikörper cG250 ist.
38. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, durch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff das Major vault protein (MVP) beeinflusst.
39. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff Proteine, ausgewählt aus Tabelle 3a oder 3b, beeinflusst.
40. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff wenigstens eines der Proteine Major vault protein (MVP, Vimentin (NCBI 340219), Moesin (NCBI 4505257), Heat shock 27 kD Protein 1 (NCBI 4504517), Heat shock 90kD Protein 1 beta (NCBI 6680307) oder Aldehyde Reductase (NCBI 1 633300) beeinflusst.
41 . Verfahren zum Auffinden von niedermolekularen Wirkstoffen, welche Nierenzellkarzinomzellen beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Bestimmung der niedermolekularen Wirkstoffe ein Proteom nach Anspruch 1 6 oder 1 7 oder/und ein Protein nach einem der Ansprüche 1 8 oder 1 9 oder/und einen Antikörper nach Anspruch 20 verwendet.
42. Synthetische DNA, kodierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 18 oder 19.
43. Protein nach Anspruch 1 8 oder 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein rekombinant hergestelltes Protein handelt.
44. Verwendung nach eines Proteins nach Anspruch 1 8 oder 1 9 oder eines rekombinanten Peptids nach Anspruch 43 zur Herstellung von gegen diese Proteine gerichteten Antikörpern.
45. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 44 zur Herstellung eines diagnostischen oder/und therapeutischen Mittels zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen.
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