WO2007012449A1 - Frizzled 9 als tumormarker - Google Patents

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WO2007012449A1
WO2007012449A1 PCT/EP2006/007284 EP2006007284W WO2007012449A1 WO 2007012449 A1 WO2007012449 A1 WO 2007012449A1 EP 2006007284 W EP2006007284 W EP 2006007284W WO 2007012449 A1 WO2007012449 A1 WO 2007012449A1
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tumors
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PCT/EP2006/007284
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Hermann Schluesener
Hans-Joerg Buehring
Sigrid Hojak
Ingrid Albert
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinicum
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate

Definitions

  • Frizzled 9 as a tumor marker
  • the present invention relates to the use of a Frizzled 9 binding agent for the manufacture of a therapeutic or diagnostic agent for the treatment or identification of a tumor, a method for the preparation of a therapeutic or diagnostic agent for the treatment or identification of a tumor, methods for the identification of tumors and a method for the treatment of a human or animal animal having a tumor.
  • tissue-specific expression of a so-called biomarker or marker protein allows a histologist to identify specific tissues or organs of an organism.
  • an abnormal expression pattern of a biomarker often allows conclusions about a pathological change in the affected tissue or organ or on a disease of the entire organism.
  • a proliferation-activating factor for example certain cyclin-dependent kinases
  • a neoplastic transformation of the cells affected by it or, for example, a corresponding predisposition for this can be concluded.
  • a sub-expression or the complete failure of the synthesis of tumor suppressor proteins, such as the p53 protein are examples of tumor suppressor proteins, such as the p53 protein.
  • biomarkers especially in the field of diagnostics and therapy of tumor diseases, play a decisive role.
  • the tumor By means of a qualitative or quantitative analysis of such biomarkers, which are also referred to as tumor markers in this context, the tumor can often be identified and classified with regard to its origin or its occurrence.
  • the object of the present invention is to provide a biomarker or tumor marker by means of which, in particular, neuro tumors / CNS tumors, prostate carcinomas and hemangiomas can be identified and optionally treated therapeutically.
  • an agent is to be provided which binds to such a biomarker and is useful as an effective component of a therapeutic or diagnostic agent.
  • Frizzled 9 FZD9 binding agent for the preparation of a therapeutic or diagnostic agent for the treatment and / or identification of a tumor, wherein the tumor is selected from the group consisting of: neurotumor (CNS tumor), Prostate cancer and breast cancer.
  • CNS tumor neurotumor
  • Frizzled 9 for the identification and / or therapeutic treatment of these tumors was therefore surprising, since the Frizzled proteins are generally described in the prior art in a different context so far.
  • the proteins of the Frizzled (FZD) family belong to a group of receptors that have seven transmembrane sections.
  • the FZD proteins are activated by so-called Wnt factors, which form a family of extracellularly secreted signaling molecules.
  • Wnt factors which form a family of extracellularly secreted signaling molecules.
  • the N-terminal extracellular cysteine-rich domain of FZD was identified as a Wnt binding domain.
  • Wnt / FZD proteins play an important role in the embryonic development of metazoans. They regulate various development processes, such as the specification, proliferation, migration and polarity of the cell. Coupled with the low-density lipoprotein Ike receptors 5 and 6, FZD proteins mediate at least three Wnt / FZD signaling pathways, one of which is the protein ⁇ -catenin, the so-called ß-catenin signaling pathway induces the regulation of transcription of various target genes, including c-myc, cyclin D1, matrix metalloproteinase-7 (MMP-7), immunoglobulin transcription factor 2 (ITF-2) .
  • the planar cell polarity regulatory signaling pathway is characterized by Wnt binding via GTPase and activation c-Jun amino-terminal kinase QNK), which leads to the control of morphogenetic cell movement
  • the Ca 2+ signaling pathway activates the Cß phospholipase and increases the intracellular Ca 2+ level, resulting
  • the human FZD 9 gene originally designated FZD 3, resides in the genetically defined 1.4 Mb region on chromosome 7qll.23.
  • the human FZD 9 protein consists of 591 amino acids.
  • Zhao C and Pleasure J, Genesis 2004; 40: 32-39 describe the expression widely distributed over the brain, "Frizzled-9 promoter drives expression of transgenes in the medial wall of the cortex and its chief derivative of the hippocampus" of FZD 9, for example in the medial wall of the cortex, the telencephalon, the hippocampus and other areas of the mouse brain.
  • FZD 9 is a ubiquitous protein that is wholly unsuitable as a biomarker and, in particular, as a tumor marker for the identification and / or therapeutic treatment of neurotumor / CNS tumors, prostate carcinomas and breast cancers.
  • Neurotumor / CNS tumors are subdivided according to the invention into (1) primary brain brain tumors, (2) spinally growing tumors, and (3) tumors of peripheral nerves.
  • the primary brain brain tumors in turn include the neuroepithelial tumors such as gliomas including astrocytomas, the embryonic tumors including medulloblastomas, cranial nerve tumors including schwannomas, and meningitis tumors including meningiomas.
  • the spinally growing tumors can be differentiated into intramedullary and extra-medial tumors, and among the extramedullary tumors, those which simultaneously represent primary brain tumors, such as the meningiomas or schwannomas, may also fall.
  • the extramedullary tumors also include hemangioblastoma, a benign tumor of the brain consisting of numerous smaller vessels (capillaries) and an intermediate soft tissue (stroma).
  • hemangioblastoma is associated with Hippel-Lindau syndrome (VHL) and can also occur multiple times in the cerebellum and in the retina of the eye (here referred to as retinoblastoma).
  • VHL Hippel-Lindau syndrome
  • retinoblastoma To the tumors of the peripheral nerves can also be counted those already mentioned in connection with the two classes described above, such as schwannomas.
  • Tumors of the peripheral nerves also include neurofibromatoses.
  • Prostate carcinoma according to the invention is understood to mean a tumorous degeneration of the prostate.
  • Breast cancer is synonymous with breast cancer.
  • FZD 9 is a biomarker or tumor marker by means of which the identification and / or therapeutic treatment of neurotumor / CNS tumors, prostate carcinomas and breast cancer is possible.
  • an agent binding to FZD 9 is understood as meaning any agent which can selectively or specifically interact with FZD 9. This interaction may preferably be direct, although indirect interaction with, in turn, those factors which interact with FZD 9, such as the Wnt protein etc. (see above and FIG. 1) is possible.
  • a binding agent to FZD 9 therefore includes binding proteins, such as polyclonal or monoclonal antibodies and antibody fragments which have the binding properties of the antibodies.
  • antibody fragments include so-called Fab fragments and so-called scFv fragments.
  • a Fab fragment contains the heavy and light chain variable domain and the contiguous constant domains CHI and CL linked by a disulfide bridge that naturally binds these two chains together.
  • An scFv fragment consists of an Fv fragment, ie the smallest antibody domain which is responsible for the affinity of the whole antibody for the antigen, and a stabilizing linker polypeptide.
  • the specificities and selectivities of such Fab and scFv fragments are identical to those of the entire antibody.
  • antibody fragments can be prepared much simpler and thus more cost-effectively, for example in microbial expression systems.
  • a nucleic acid molecule binding to FZD 9 can also be a nucleic acid molecule which can bind directly or indirectly and selectively or specifically to FZD 9 or to the factors mentioned, for example an aptamer.
  • a monoclonal antibody which is produced by the hybridoma cell W3C4E11 deposited under the number DSMZ under the number DSMZ under the number DSMZ under the number DSMZ on 15 July 2004 under the number DSM ACC2668 is used as an agent binding to FZD 9.
  • This measure has the particular advantage that an agent is used which binds highly specifically to FZD 9, the identification or therapeutic treatment of said tumors then being carried out via established immunological or molecular techniques.
  • the inventors have recognized for the first time that the monoclonal ⁇ -FZD9 antibody, which is fundamentally known from the unpublished German patent application DE 10 2004 050 620, is suitable as such an agent with which the tumors in question can be identified and optionally treated. This suitability was not to be expected in particular, since the patent application presented data that binds this antibody to a variety of cell types.
  • the isotype IgM monoclonal antibody produced by the deposited hybridoma cells W3C4E11 not only binds to native tissue, for example, of the human brain, but unexpectedly also to frozen, i. so-called cryo tissue. Furthermore, this monoclonal antibody is surprisingly not only suitable for the identification of said tumors, but can exert a direct effect on the tumors, for example on the astocytomas, for example, or inhibit their growth. The deposited monoclonal antibody therefore also has therapeutic potential.
  • the neurotumor / CNS tumor is selected from the group consisting of glioblastornen including astrocytomas, medulloblastomas including Primitive Neuroectodermal Tumors (PNET), schwannomas, hemangioblastomas, meningiomas and neurofibromatomas.
  • glioblastornen including astrocytomas, medulloblastomas including Primitive Neuroectodermal Tumors (PNET), schwannomas, hemangioblastomas, meningiomas and neurofibromatomas.
  • PNET Primitive Neuroectodermal Tumors
  • PNET for example, is a tumor of embryonic origin, which usually arises in the cerebellum as a medulloblastoma and is one of the most frequently occurring malignant tumors in children.
  • the antibody is a humanized antibody or a humanized antibody fragment.
  • Humanized antibodies also referred to as recombinant antibodies or in the English-speaking world referred to as "CDR grafted antibodies” are those antibodies in which the sequences for the hypervariable regions (CDRs) in the human immunoglobulin genes against the CDRs of im- munglobolin genes of other organisms, eg. The mouse, are replaced.
  • CDR grafted antibodies the antigen specificity of an antibody, preferably a mouse monoclonal antibody, is transferred to a human antibody, thereby producing - in the recipient organism - complete tolerance to these molecules and a so-called HAMA response (human anti-mouse antibody antibody). Answer) by which a pure mouse antibody would be neutralized in humans due to the immune response is avoided even after repeated administration.
  • the agent or the antibody or the antibody fragment is coupled to a detectable marker and / or a therapeutic agent.
  • a marker means any compound by means of which a localization and identification of the substructures of the human brain in vitro, in vivo or in situ is possible.
  • color indicators such as dyes with fluorescent, phosphorescent or chemiluminescent properties, AMPPD, CSPD, radioactive indicators, such as 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, 14 C, 3 H, non-radioactive indicators, such as biotin or digoxigenin, alkaline Phophatase, horseradish peroxidase, etc.
  • non-radioactive indicators such as biotin or digoxigenin, alkaline Phophatase, horseradish peroxidase, etc.
  • the detection of such labeled antibodies then takes place using imaging techniques known in the art, such as autoradiography, blotting, hybridization or microscopy techniques.
  • the use according to the invention is advantageously developed in such a way that treatment or identification of the tumor becomes even more reliable and simplified.
  • any active substance which induces a specific biological reaction in an organism or in a biological cell is considered a therapeutic agent.
  • particularly suitable therapeutic agents are drugs or toxins which inhibit the growth of the tumors, such as therapeutics, chemotherapeutic agents or activators of the complement system or apoptosis.
  • a coupled antibody can advantageously transport the active ingredient in a targeted manner into a tumor, such as an astrocytoma, or in its blood-supplying system and there induce the destruction of the tumor or the pathological blood vessels.
  • psychotropic drugs via the hippocampus into the limbic system via such an antibody and to mediate there a targeted effect of psychotropic drugs. Side effects of therapeutic agents that are supposed to act selectively in the human brain are thus reduced.
  • another aspect of the present invention relates to a method for the preparation of a therapeutic and / or diagnostic agent for the treatment or identification of a tumor comprising the steps of: (1) providing an agent that binds to FZ.D 9, (2) formulating the Agent in a diagnostically or pharmaceutically acceptable carrier with optionally further additives, wherein the tumor is selected from the group consisting of: neurotumor / CNS tumor, prostate cancer and breast cancer.
  • a further subject matter of the present invention relates to a method for the identification of tumors in a living being, comprising the following steps: (1) providing a biological sample originating from the subject to be examined; (2) determination of expression level of FZD 9 in the biological sample; (3) comparing the expression level of FZD 9 found in step (2) with the level of expression in a biological sample from a healthy animal; and (4) identifying a tumor if it is determined in step (3) that the expression level of FZD 9 in the biological sample of the subject to be examined is higher than the expression level of FZD 9 in the biological sample of the healthy animal.
  • the identification is understood to be the detection or the detection as well as possibly the classification of the tumors.
  • the expression level of FZD 9 in a biological sample originating from the potentially tumorous area of the living being is compared with the level of expression of FZD 9 in a reference sample derived from the corresponding area of a healthy animal.
  • methods known in the art such as immunological, histological, imaging or microscopic procedures, it is determined to what extent FZD 9 is synthesized in the biological sample.
  • the expression level of FZD 9 in tissues of a neuroturn / CNS tumor, prostate carcinoma or mammary carcinoma is significantly increased compared to the level of expression of FZD 9 in corresponding non-tumorous tissues of a healthy animal, such as healthy Brain / nerve tissue, healthy prostate tissue, healthy breast tissue etc.
  • such biological cells may be cells or tissues which are to be examined for the presence of a tumor. If the presence of a neuroturn / CNS tumor is to be investigated, then a biological sample is provided which comprises neurons, glial cells, meninges, or in general neuronal tissue or brain tissue. Should be on the presence of a Prostate carcinoma are examined, so a biological sample is provided, the prostate tissue or cells thereof. When examining for the presence of breast cancer, a biological sample comprising breast tissue or cells thereof is provided. The reference sample used is in each case one such sample which originates from corresponding anatomical regions of a healthy animal.
  • the level of expression can be determined both at the level of the FZD 9-encoding mRNA and at the level of the FZD 9 protein.
  • the determination of the expression level at mRNA level by means known in the art, such as, for example, the Northern Blot technique.
  • the expression level is preferably determined by immunological techniques, for example using the FZD 9 binding agent described above in connection with the use according to the invention, for example a polyclonal or monoclonal antibody or a corresponding antibody fragment which binds to FZD 9.
  • Another object of the present invention relates to methods of identifying tumors in a subject comprising the steps of: (1) administering an agent comprising an FZD 9 binding agent having a detectable marker into which animals, and (2 ) Representation of the accumulation of the agent in the subject by means of suitable methods, wherein the tumor is selected from the group consisting of: neurotumor / CNS tumors, prostate carcinoma and breast carcinoma.
  • detectable markers come the above mentioned detectable marker, which is preferably realized by a radioactive marker and the method in step (2) is 3D preferably radiography.
  • the tumor can be displayed in three dimensions, which helps the surgeon in an advantageous manner in its removal.
  • a further subject of the present invention relates to a method of treating a human or animal having a tumor comprising the steps of: (1) administering an agent to the subject containing an FZD 9 binding agent, and (2) optionally Repeating step (1) several times, wherein the tumor is selected from the group consisting of: neurotomy / CNS tumor, prostate carcinoma and breast carcinoma.
  • FZD 9 can be used to identify and / or therapeutically treat substructures of the human brain, preferably the substructures are proliferating cells, tumor cells, and astrocytoma cells, respectively.
  • angiogenesis more preferably tumor angiogenesis
  • the identification and / or therapeutic treatment of the substructures is preferably carried out by means of an antibody, preferably a monoclonal antibody, most preferably by means of one produced by the hybridoma cell W3C4E11 deposited under DSMZ under DSMZ under DSMZ under the number DSM ACC2668, or by means of a corresponding antibody fragment.
  • the antibody may preferably be a humanized antibody.
  • the antibody or antibody fragment is preferably coupled to a marker or / and a therapeutic agent.
  • the inventors have further developed a method for identifying and / or isolating substructures of the human brain in a biological sample, comprising the steps of: (1) providing the biological sample; (2) In-contact Bringing the biological sample with an agent that binds selectively or / and specifically to FZD 9; (3) determining whether selective / specific binding of the agent to the substructure has occurred; and (4) correlating a positive determination in step (3) with the identification of human brain substructures and / or (5) isolating the human substructures Brain on a positive finding in step (3).
  • the substructures of the human brain are preferably proliferating cells, tumor cells, most preferably astrocytoma cells.
  • the inventors have further developed a method of identifying angiogenesis, preferably tumor angiogenesis, in a biological sample comprising the steps of: (1) providing the biological sample, preferably having tumor cells, (2) contacting the biological Sample with an agent that selectively or / and specifically binds to FZD 9, (3) determining if selective / specific binding of the agent to the biological sample has occurred, and (4) correlating a positive determination in step (3) with the identification of angiogenesis in the biological sample.
  • an agent preferably tumor angiogenesis
  • an agent directed against FZD 9 is useful for the preparation of a therapeutic or diagnostic agent for the treatment or diagnosis of a tumor, preferably a brain tumor, most preferably an astrocytoma.
  • FZD 9 is expressed more strongly in the pes hippocampi or the hippocampal neurons of the healthy, in particular human, brain and that the deposited monoclonal antibody via FZD 9 is suitable for the identification and / or therapeutic treatment of hippocampus tissue .
  • This measure therefore provides a use and a method which can provide a simple and reliable identification of allow, treatment and possibly isolation of human hippocampal tissue.
  • This measure also has the advantage that the inventors for the first time provide information about the expression pattern of FZD 9, in particular in the human adult brain, and thus reveal important information about possible signaling mechanisms in the hippocampus. The inventors therefore provide an important tool for the identification of this area of the cerebral cortex not only for the clinician but also for the cell biologist and basic researcher.
  • FIG. 2 Preparation of specifically directed against human FZD 9 and derived from the hybridoma W3C4E1 antibody.
  • A Diagram schematically showing the plasmid pIRES which has the human FZD 9 gene and at the N-terminus a flag tag.
  • B FACS analysis of the specificity of the antibody derived from cells W3C4E11. The monoclonal antibody (right partial image) derived from the cells W3C4E11 and its non-specific IgM isotype (left partial image) were incubated with HEK-293 cells which were transfected with the pIRES plasmid shown in (A). After washing, the cellular fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry.
  • Fig. 1 Diagram schematically showing the plasmid pIRES which has the human FZD 9 gene and at the N-terminus a flag tag.
  • B FACS analysis of the specificity of the antibody derived from cells W3C4E11. The monoclonal antibody (right partial image)
  • the multilayered microvessel proliferates ('Glomeroid tufts') (G) and necroses with pseudopalisades ('Pseudopalisading Necrosis') (H), which are histopathological hallmarks of glioblastomas, were strongly stained for FZD 9.
  • FZD 9 Correlation between immunoreactivity FZD 9 with astrocyte classification, microvessel density, and astrocytoma Ki67 labeling index.
  • the density of FZD 9 + microvessels correlated positively with the astrocytoma WHO classification (A) and the astrocytoma MVD (B) in human astrocytomas.
  • Total FZD 9 immunostaining intensity correlated strongly with the astrocytoma WHO classification (C) and the KI67 labeling index (D) in human astrocytomas.
  • FIG. 6 Intensity of immunohistochemical staining for FZD 9 in 23 samples of medulloblastomas compared to 10 samples of neuropathologically normal human brains.
  • Tissue samples representing FZD 9 mRNA expression in medulloblastomas compared to normal brain samples Values are expressed in terms of relative expression to 18S rRNA, which was used as the internal reference standard.
  • FIG. 11 Intensity of immunohistochemical staining for FZD 9 in one
  • Fig. 1 shows schematically the Wnt / FZD signaling pathway according to the publication by Huelsken J. and Behrens J., "The Wnt Signaling Pathway", Journal of Cell Science 2002; 115: 3977-3978 The content of this publication is by reference
  • the three branches of the Wnt / FZD signaling pathway namely the ⁇ -catenin pathway ("middle branch"), the Ca 2+ signaling pathway ("Ca 2+ pathway "right branch) and the planar cell polarity regulating signal path (" left cell branch ").
  • Frizzled receptor shown above in the schematic cell membrane, indirectly the individual factors of the three signal paths, which are represented schematically as circular or oval-shaped symbols, for example Dsh, Frodo, ⁇ -Arrl, PLC, PKC, JNK, etc., as well as the Wnt protein to identify the substructures of the human brain.
  • the resulting hybridomas were maintained in RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% fetal calf serum and hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HT, Sigma-Aldrich, Kunststoff, Germany). Culture supernatants positive for WERI-RB-I cells were screened on peripheral blood (B) and bone marrow (BM) cells. Hybridoma cells that secrete antibodies that are responsible for these cells were non-reactive, were selected, cloned twice by limiting dilution, and cultured in the presence of hypoxanthine-thymidine (HT, Sigma). Clone W3C4E11 met these criteria and was selected.
  • the InM isotype of the resulting monoclonal antibody of cell line W3C4E11 was determined by ELISA (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). The specificity of W3C4E11 antibodies to human FZD 9 was confirmed by the selective recognition of human embryonic kidney cells (HEK-293) transfected with the entire human FZD 9 gene. W3C4E11 recognizes untransfected HEK-293 cells or HEK-293 cells transformed with FZD 1, 2, 4, 5, 7 or 10.
  • the W3C4E11 cell line was deposited on June 15, 2004 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Mascheroer Weg Ib, 38124 Braunschweig under the number ACC2668.
  • Antibody binding to the tissue sections was visualized with a biotinylated porcine anti-rabbit (DAKO, Hamburg, Germany) or rabbit anti-mouse IgG F (ab) 2 antibody fragment. Subsequently, the sections were incubated with a streptavidin-avidin-biotin complex (DAKO, Hamburg, Germany), followed by development with 3,3'-diaminobenzidine (DAB) as chromogen (Fluka, Neu-Ulm, Germany). Finally, the sections were counterstained with hematoxylin.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • FZD 9 The expression level of FZD 9 was quantitated by two methods. The total immunoreactivity of FZD 9 of each The sample was graded using a semi-quantitative evaluation reported by Sinicrope FA et al., "Bcl-2 and p53 oncoprotein expression during coral tumorigenesis". Cancer Res. 1995; 55: 237-241, was introduced. In short, four categories have been defined as follows: 0, completely negative; 1, slightly positive; 2, moderately positive; and 3, strong positive. The density of FZD 9 + microvessels was examined under light microscopy using a procedure described by Weidner N. et al., "Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma". N. Engl. J. Med.
  • Microvessel density (MVD) counts were determined by determining the mean number of vesicular vessels stained by CD34 in 3 HPF by the same method used to count the density of the FZD 9 + microvessels.
  • the density of the Ki67 + microvessels was determined by the same method used to count the density of FZD 9 + microvessels.
  • Antibody binding to the tissue sections was visualized with a biotinylated anti-rabbit porcine antibody (DAKO, Hamburg, Germany) followed by incubation with a streptavidin-avidin-biotin complex (DACO, Hamburg, Germany).
  • the chromogen used was 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Fluka, Neu-Ulm, Germany).
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • Immunohistochemical tissue staining for MIB-I was performed on 4 ⁇ m thick, formalin-fixed and paraffin-embedded samples using the Benchmark Immunohistochemistry System (Ventana, Tasken, AZ, USA).
  • the automated protocol is based on an indirect biotin-avidin system.
  • Optimization of the MIB-1 antibody (1: 100, DAKO, Hamburg, Germany) included pretreatment for cell conditioning for 6 minutes.
  • an avidin and a biotin blocker was added for 4 minutes, followed by a non-specific biotinylated immunoglobulin secondary antibody and a diaminobenzidine substrate for visualization.
  • the sections were then washed, counterstained with hematoxylin and embedded.
  • HCEC Human cerebral microvascular endothelial cells
  • HCEC cells were identified in RPMI-1640 Medium with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) cultured with penicillin and streptomycin at 100 U / ml (Gibco Grand Island, NY) at 37 ° C in 5% CO 2
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • HCEC cells were approximately 80% confluent CoJ 2 (100 ⁇ mol) exposed for the indicated time periods, see Cho J, et al., "Cobalt chloride-induced estrogen receptor alpha down-regulation involves hypoxia-inducible factor-lalpha in MCF-7 human breast cancer cells ". Mol. Endocrinol. 2005; 19: 1191 to 1199.
  • the medium was renewed 24 hours before exposure to CoCl 2 . For each time parallel samples were prepared in triplicate.
  • FCS heat-inactivated fetal serum
  • RNA from cultured cells was prepared using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. 2 ⁇ g of RNA was reverse transcribed into cDNA using randomized primers. Subsequently, mRNA expression of FZD 9 was quantified by HCEC cells using a real-time PCR using SYBR-Green as detection reagent and 18 S-iibosornal RNA as intermediate reference standard.
  • RNA was reverse transcribed into cDNA using randomized primers.
  • Real-time PCR was used to quantify mRNA expression of FZD 9 in DAOY cells.
  • SYBR® green was used for detection.
  • Human ribosomal 18S RNA served as internal reference standard (forward: CGGCTACCACATCCAAGGAA; reverse: GCTGGAATTACCGCGGCT). The following primer pair was used for FZD 9: forward: GCAGTAGTTTCCTCCTGACCG; backwards: TCTCTGTGTTGGTGCCGCC.
  • FZD 9 + microvessels / HPF, MVD and Ki67 + microvessels / HPF are given as arithmetic means with standard errors of means (SEM).
  • SEM standard errors of means
  • the MIB-1 / Ki67 labeling index as the percentage of cells in a tissue stained for Ki67, was evaluated by averaging the percentage of Ki67 + cores counted in three "high power fields.” For these Averaging, spots were selected after counting the entire sample, counted and the mean value determined All the studies were performed independently of two persons
  • the FZD 9 staining value and the Ki67 labeling index are given as arithmetic mean with standard deviations (SEM) Quantitative FZD 9 expression was analyzed by one-way ANOVA followed by Dunnett's Multiple Comparison Test (Grap Päd Prism 4.0 software) The correction analysis was evaluated by controlling the Pearson's correlation coefficient and for all statistical analyzes the significance levels were p ⁇ 0.05 set.
  • FZD 9 is expressed in the brain, its pattern of expression in the adult human brain is still unknown. Immunohistochemical studies were therefore performed on ten sections of paraffin-embedded adult normal human brains to determine the level of expression and localization of FZD9. In most sections, FZD 9 expression was low (Table 1) and only occasional FZD 9 + neurons or glia were observed. However, in sections containing hippocampal tissue, strong FZD 9 expression was observed in the hippocampal neurons ( Figures 3A and B).
  • FZD 9 has been expressed on the endothelial cells of the large vessels located in the leptomeninx outside the brain parenchyma. In normal brains few FZD 9 + microvessels were observed (Table 1). Case GeNeuropathological FZD9 Ki67- FZD9 + - MVD poor / Age Diagnosis / Pathology Mark- Microbial Diagnosis Index of Infec- tion Index / HPF B sity 3 (%)
  • FZD 9 expression in WHO grade II to IV astrocytomas was studied. FZD 9 expression was observed in both microvascular endothelial cells and neoplastic cells ( Figures 3C-E).
  • FZD 9 expression of FZD 9 in microvessel endothelial cells was observed in human astrocytomas ( Figures 3C-F).
  • the density of FZD 9 + microvessels was high in malignant astrocytomas (40.1 ⁇ 21.3 for WHO Grade III and 91.37 ⁇ 17.79 for WHO Grade IV) and low in low grade astrocytomas (2.1 ⁇ 1.0 for WHO grade II) (Table 2).
  • FZD 9 expression in tumor cells was found to be one in seven in WHO grade II astrocytes, five out of nine in WHO grade III astrocytomas, and nine out of nine in WHO grade IV astrocytomas observed, indicating that FZD 9 is significantly more expressed in tumor cells of malignant astrocytomas than in those of low-grade astrocytomas.
  • the overall level of FZD 9 immunoreactivity was semiquantified.
  • FZD 9 expression was high in WHO grade III (p ⁇ 0.01, compared to normal brains) and WHO grade IV astrocytomas (p ⁇ 0.001, compared to normal brains) and low in WHO grade II astrocytomas (p> 0.05, compared to normal brains) ( Figure 4 A and Table 2).
  • FZD 9 was strongly heterogeneously expressed in human glioblastomas.
  • Another histopathological characteristic of the presence of glioblastomas necrosis with pseudo-palisades 'pseudopalisading necroses 1
  • 'pseudopalisading necroses 1 ie tomzellen a central necrosis with perinekrotician Astrozy-, often occupy a pseudo palisades pattern; see. Kleinhues P. et al., (Supra).
  • FZD 9 was strongly heterogeneously expressed in human glioblastomas.
  • Another histopathological characteristic of the presence of glioblastomas necrosis with pseudo-palisades ie tomzellen a central necrosis with perinekrotician Astrozy-, often occupy a pseudo palisades pattern; see. Kleinhues P. et al., (Supra).
  • FZD 9 was strong expression of FZ
  • FZD 9 expression was also detected on the cell membrane, which was often indistinguishable from the small cytoplasm. In comparison with the normal brain, the FZD was 9-staining intensity, i. the FZD 9 expression pattern, significantly higher ( Figure 6, p ⁇ 0.01).
  • the MIB-1 / Ki67 index is a common size to evaluate cell proliferation in tumors.
  • MIB-1 / Ki67 is present in all non-GO phases of the cell cycle.
  • An average Ki67 index of 93.6 was observed, ranging from 42.7 to 8.8 in the 29 patients studied (Table 3). Controls from the normal brain showed few proliferating cells.
  • Table 3 Results for the value of FZD 9 staining intensity and MIB-1 (Ki67) labeling index.
  • FZD 9 mRNA expression was analyzed using real-time PCR in selected native tissue samples of medulloblastomas (Table 3). These results were compared to samples from normal human brain. As in Figure 8, the average expression of FZD 9 in classical medulloblastomas was 2-fold higher than in normal brains. In addition, FZD 9 mRNA expression was analyzed in a known medulloblastoma cell line, in DAOY cells. In the DAOY cells cultured under normal conditions, relative FZD 9 mRNA expression was up to seven-fold increased compared to the internal reference standard.
  • FZD 9 expression in microvascular endothelial cells was observed, with the density of FZD 9 + microvessels positively correlating with astrocytoma grade and MVD.
  • the inventors have recognized that FZD 9 plays a role in astrocytoma angiogenesis. Hypoxia is a major inducer of angiogenesis. The inventors postulate that hypoxic stimulation stimulates FZD 9 expression in endothelial cells.
  • the inventors have surprisingly found that FZD 9 different tumors can be identified and possibly treated. They thus provide valuable diagnostic and therapeutic uses or procedures.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines an Frizzled 9 bindenden Agens zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Identifizierung eines Tumors, ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Identifizierung eines Tumors, Verfahren zur Identifizierung von Tumoren sowie ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor aufweist.

Description

Frizzled 9 als Tumormarker
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines an Frizzled 9 bindenden Agens zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Identifizierung eines Tumors, ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Identifizierung eines Tumors, Verfahren zur Identifizierung von Tumoren sowie ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor aufweist.
Der Nachweis der gewebetypischen Expression eines sog. Biomarkers oder Markerproteins ermöglicht es einem Histologen bestimmte Gewebe oder Organe eines Organismus zu identifizieren. Darüber hinaus lässt ein anormales Expressionsmuster eines Biomarkers häufig Rückschlüsse auf eine pathologische Veränderung des betroffenen Gewebes oder Organs oder aber auf eine Erkrankung des gesamten Organismus zu. So kann bspw. aufgrund der Überexpression eines proliferationsaktivierenden Faktors, z.B. bestimmter cyclinabhängiger Kinasen, auf eine neoplastische Transformation der davon betroffenen Zellen oder etwa auf eine entsprechende Veranlagung hierfür geschlossen werden. Gleiches gilt bei einer Unterexpression oder dem vollständigen Ausfall der Synthese von Tumorsupressorproteinen, wie beispielsweise dem p53- Protein. So kommt Biomarkern insbesondere im Bereich der Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen eine entscheidende Rolle zu. Über eine qualitative oder quantitative Analyse solcher Biomarker, die in diesem Zusammenhang auch als Tumormarker bezeichnet werden, lässt sich der Tumor häufig hinsichtlich seiner Herkunft bzw. seines Vorkommens identifizieren und klassifizieren.
Eine umfassende Kenntnis über solche Biomarker bzw. Tumormarker und deren Expressionsmuster ermöglicht nicht nur die Entwicklung von Diagnoseverfahren, sondern auch die von zellulär zielgerichteten Diagnostika oder Therapeutika.
Die Zuordnung definierter Biomarker zu bestimmten Geweben ermöglicht aber auch ein besseres Verständnis über die Regulation von physiologischen Prozessen. So deutet beispielsweise die Expression eines Schlüsselproteins der Signaltransduktion in proliferierendem Endothel auf eine Rolle des Letzteren in der Regulation der Angio- genese hin.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Biomarker bzw. Tumormarker bereitzustellen, über den insbesondere Neuro- tumoren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinome und Hämangiome identifiziert und ggf. therapeutisch behandelt werden können. Insbesondere soll ein Agens bereitgestellt werden, das an einen solchen Biomarker bindet und als wirksamer Bestandteil eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels geeignet ist.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines an Frizzled 9 (FZD9) bindenden Agens zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung und/oder Identifizierung eines Tumors gelöst, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumor (ZNS-Tumor), Prostatakarzinom und Mammakarzinom . Die Eignung von Frizzled 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung dieser Tumore war deshalb so überraschend, da die Frizzled-Proteine allgemein im Stand der Technik bislang in einem anderen Zusammenhang beschrieben werden.
Die Proteine der Frizzled(FZD)-Familie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die sieben Transmembranabschnitte aufweisen. Die FZD-Proteine werden durch sog. Wnt-Faktoren aktiviert, die eine Familie von extrazellulär sekretierten Signalmolekülen bilden. Die N-terminale extrazelluläre cysteinreiche Domäne von FZD wurde dabei als Wnt-Bindedomäne identifiziert.
Wnt/FZD-Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung von Metazoen. Sie regulieren verschiedenste Entwicklungsprozesse, wie die Spezifizierung, Proliferation, Migration und Polarität der Zelle. Gepaart mit den „low-density Ii- poprotein !ike"-Rezeptoren 5 und 6 vermitteln FZD-Proteine zumindest drei Wnt/FZD-Signalwege. In einen dieser Signalwege ist das Protein ß-Catenin involviert. Dieser sog. ß-Catenin-Signalweg induziert die Regulation der Transkription verschiedener Zielgene, einschließlich c-Myc, Cyclin Dl, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP- 7), Immunglobulintranskriptionsfaktor 2 (ITF-2). Der die planare Zellpolarität regulierende Signalweg wird durch Wnt-Bindung via GTPase und Aktivierung der c-Jun-aminoterminalen Kinase QNK) induziert, was zur Steuerung der morphogeneti- schen Zellbewegung führt. Der Ca2+-Signalweg aktiviert die Phospholipase Cß und erhöht den intrazellulären Ca2+-Spiegel, was in der Aktivierung der Proteinkinase C, der Ca2+-calmodulinabhängigen Proteinkinase II und von Calcineurin resultiert, wodurch das zelluläre Schicksal und den Adhäsionsprozess beeinflusst wird. Eine Übersicht über die Wnt/FZD-Signalwege findet sich in Huang HC, Klein PS, „The Frizzled family: receptors for multiple Signal transduction pathways", Genome Biol. 2004; 5:234-241 und in der Fig. 1.
Das humane FZD 9-Gen, ursprünglich als FZD 3 bezeichnet, liegt in der genetisch definierten 1,4 Mb-Region auf dem Chromosom 7qll.23. Das humane FZD 9-Protein besteht aus 591 Aminosäuren. Kürzlich veröffentlichte Experimente, in denen Mäuse mit einer FZD 9-Knock-Out- Mutation hergestellt wurden, deuten auf eine Rolle von FZD 9 im blutbildenden System hin; vgl. Ranheim EA et al., „Frizzled 9 knock-out mice have abnormal B-cell development", Blood. 2005; 105:2487-2494.
Wang et al. beschreiben in "A novel human homologue of the Drosophila frizzled wnt receptor gene binds wingless protein and is in the Williams Syndrome deletion at 7qll.23", Hum. Mol. Genet. 1997; 6:465-472, hingegen, dass FZD 9 in einer Vielzahl von verschiedensten humanen Geweben exprimiert wird, wie beispielsweise im Gehirn, aber auch im Skelettmuskel, in den Nieren, den Augen und den Hoden.
Ferner beschreiben Zhao C und Pleasure J, „Frizzled-9 promoter drives expression of transgenes in the medial wall of the cortex and its chief derivative the hippocam- pus", Genesis 2004; 40:32-39, die weit über das Gehirn verbreitete Expression von FZD 9, bspw. in der medialen Wand des Cortex, dem Telencephalon, dem Hippo- campus und weiteren Bereichen des Mausgehirns.
In der nicht-veröff entlichten deutschen Patentanmeldung DE 10 204 059 620 werden Daten präsentiert, nach denen FZD 9 von verschiedensten unterschiedlichen Zelltypen exprimiert wird, wie bspw. Leukämiezellen, Retinoblastomzellen oder embryonalen Karzinomzellen.
Es wurde deshalb bislang angenommen, dass es sich bei FZD 9 um ein ubiquitäres Protein handelt, das als Biomarker und insbesondere als Tumormarker zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Neurotumoren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinomen und Mammakarzinomen gänzlich ungeeignet ist.
Neurotumoren/ZNS-Tumoren werden erfindungsgemäß unterteilt in (1.) primäre hirneigene Hirntumoren, (2.) spinal wachsende Tumoren sowie in (3.) Tumoren peripherer Nerven. Zu den primären hirneigenen Hirntumoren wiederum zählen die neuroepithelialen Tumoren wie bspw. Gliome einschließlich Astrozytome, die embryonalen Tumoren einschließlich Medulloblastome, die Tumoren von Hirnnerven einschließlich Schwannome sowie die Tumoren der Meningiden einschließlich Meningeome. Die spinal wachsenden Tumoren können in intrameduläre und extra- meduläre Tumoren unterschieden werden, wobei unter die extramedulären Tumoren auch solche fallen können, die gleichzeitig primäre Hirntumoren darstellen, wie die Meningeome oder Schwannome. Zu den extramedullären Tumoren zählt auch das Hämangioblastom, ein gutartiger Tumor des Gehirns bestehend aus zahlreichen kleineren Gefäßen (Kapillaren) und einem dazwischen liegendem Weichteilgewebe (Stroma). In 25% der Fälle ist das Hämangioblastom mit dem Hippel-Lindau- Syndrom (VHL) assoziiert und kann auch mehrfach im Kleinhirn als auch in der Retina des Auge (hier als sog. Retinoblastom) auftreten. Zu den Tumoren der peripheren Nerven können ebenfalls solche gezählt werden, die bereits im Zusammenhang mit den beiden vorstehend beschriebenen Klassen genannt wurden, wie bspw. Schwannome. Unter Tumoren der peripheren Nerven fallen aber auch Neurofibromatosen.
Unter Prostatakarzinom wird erfindungsgemäß eine tumoröse Entartung der Prostata verstanden. Das Mammakarzinom steht als Synonym für Brustkrebs.
Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass es sich bei FZD 9 um einen Biomarker bzw. Tumormarker handelt, mittels dem die Identifizierung und/oder therapeutische Behandlung von Neurotumoren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinomen und Mammakarzinom möglich ist.
Unter einem an FZD 9 bindenden Agens werden erfindungsgemäß jegliche Mittel verstanden, die mit FZD 9 selektiv bzw. spezifisch wechselwirken können. Diese Wechselwirkung kann vorzugsweise direkt erfolgen, obgleich eine indirekte Wechselwirkung mit wiederum solchen Faktoren möglich ist, die mit FZD 9 wechselwirken, wie bspw. das Wnt-Protein etc. (s.o. und Fig. 1). Unter ein an FZD 9 bindenden Agens fallen im Sinne der Erfindung deshalb Bindeproteine, wie polyklonale oder monoklonale Antikörper sowie Antikörperfragmente, die die Bindeeigenschaften der Antikörper aufweisen. Unter solche Antikörperfragmente fallen sog. Fab-Fragmente und sog. scFv-Fragmente. Ein Fab-Fragment enthält die variable Domäne der schweren und leichten Kette und die angrenzenden konstanten Domänen CHI und CL, verbunden durch eine Disulfidbrücke, die natürlicherweise diese beiden Ketten zusammenhält. Ein scFv-Fragment besteht aus einem Fv-Fragment, d.h. der kleinsten Antikörperdomäne, die für die Affinität des gesamten Antikörpers für das Antigen (mit-)verantwortlich ist, und aus einem stabilisierenden Linker-Polypeptid. Die Spezifitäten und Selektivitäten von solchen Fab- und scFv-Fragmenten sind identisch mit jenen des gesamten Antikörpers. Allerdings können Antikörperfragmente wesentlich einfacher und damit kostengünstiger, bspw. in mikrobiellen Expressionssystemen, hergestellt werden.
Ein geeigneter polyklonaler Antikörper gegen humanes FZD 9, der in der Immunfärbung vorzugsweise in einer Verdünnung von 1:500 eingesetzt wird, wird bspw. von Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland, (Katalog Nr. SP4153P) vertrieben. Als ein an FZD 9 bindendes Agens kommt erfindungsgemäß aber auch ein Nucleinsäuremolekül in Frage, das direkt oder indirekt und selektiv bzw. spezifisch an FZD 9 oder an die genannten Faktoren binden kann, wie bspw. ein Aptamer.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es besonders bevorzugt, wenn als ein an FZD 9 bindendes Agens ein solcher monoklonaler Antikörper verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.
Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass ein Agens Verwendung findet, das hochspezifisch an FZD 9 bindet, wobei die Identifizierung bzw. therapeutische Behandlung der genannten Tumoren dann über etablierte immunologische bzw. molekulare Techniken erfolgt. Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass der aus der nicht-veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10 2004 050 620 grundsätzlich bekannte monoklonale α-FZD9-Antikörper als ein solches Agens geeignet ist, mit dem die in Rede stehenden Tumoren identifiziert und ggf. therapiert werden können. Diese Eignung war insbesondere deshalb nicht zu erwarten, da in der Patentanmel- dung Daten präsentiert werden, nach denen dieser Antikörper an unterschiedlichste Zelltypen bindet.
Die Erfinder haben ferner festgestellt, dass der von den hinterlegten Hybridomzellen W3C4E11 produzierte monoklonale Antikörper vom Isotyp IgM nicht nur an natives Gewebe bspw. des humanen Gehirns bindet, sondern unerwarteterweise auch an gefrorenes, d.h. sog. Kryogewebe. Ferner ist dieser monoklonale Antikörper überraschenderweise nicht nur zur Identifizierung der genannten Tumoren geeignet, sondern kann auf die Tumoren, bspw. auf die Astozytome, einen direkten Effekt ausüben, bspw. deren Wachstum inhibieren. Der hinterlegte monoklonale Antikörper weist deshalb auch therapeutischen Potenzial auf.
Dabei ist es bevorzugt, wenn der Neurotumor/ZNS-Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glioblastornen einschließlich Astrozytomen, Medulloblasto- men einschließlich Primitive Neuroectodermale Tumoren (PNET), Schwannomen, Hämangioblastomen, Meningeomen und Neurofibromatomen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Agens zur Identifizierung oder therapeutischen Behandlung von besonders wichtigen Tumoren bereitgestellt wird. So handelt es sich bspw. bei PNET um einen Tumor embryonalen Ursprungs, der meist im Cerebellum als Medulloblastom entsteht und zu den am häufigsten auftretenden bösartigen Tumoren bei Kindern zählt.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment handelt.
Bei humanisierten Antikörpern, die auch als rekombinante Antikörper oder im englischen Sprachraum als „CDR-grafted antibodies" bezeichnet werden, handelt es sich um solche Antikörper, bei denen die Sequenzen für die hypervariablen Regionen (CDRs) in den menschlichen Immunglobolin-Genen gegen die CDRs von Im- munglobolin-Genen anderer Organismen, bspw. der Maus, ausgetauscht sind. Durch diese Humanisierung wird die Antigenspezifität eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers der Maus, auf einen humanen Antikörper übertragen, wodurch - im Empfängerorganismus - eine vollständige Toleranz gegenüber diesen Molekülen erzeugt und eine sog. HAMA-Antwort (Humane-Anti-Maus-Antikörper- Antwort), durch die ein reiner Mausantikörper im Menschen aufgrund der Immunantwort neutralisiert werden würde, auch nach mehrmaliger Applikation vermieden wird.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung ist es bevorzugt, wenn das Agens bzw. der Antikörper oder das Antikörperfragment an einen detektierbaren Marker und/oder einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.
Erfindungsgemäß wird unter einem Marker eine jegliche Verbindung verstanden, mittels der eine Lokalisierung und Identifizierung der Substrukturen des humanen Gehirns in vitro, in vivo oder in situ möglich ist. Hierzu zählen Farbindikatoren, wie Farbstoffe mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie 32P, 35S, 125I, 131I, 14C, 3H, nicht radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Digoxigenin, alkalische Phophatase, Meerrettich-Peroxidase etc. Der Nachweis solch markierter Antikörper erfolgt dann über im Stand der Technik bekannte bildgebende Verfahren, wie Autoradiographie, Blotting-, Hybridisierungs- oder Mikroskopietechniken.
Durch diese Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise die erfindungsgemäße Verwendung derart weitergebildet, dass eine Behandlung oder Identifizierung des Tumors noch zuverlässiger und vereinfacht möglich wird.
Als therapeutischer Wirkstoff kommt grundsätzlich ein jeder Wirkstoff in Frage, der in einem Organismus oder in einer biologischen Zelle eine spezifische biologische Reaktion induziert. Beispiele für besonders geeignete therapeutische Wirkstoffe sind Arzneimittel oder Toxine, die das Wachstum der Tumoren inhibieren, wie Radiothe- rapeutika, Chemotherapeutika oder Aktivatoren des Komplementsystems oder der Apoptose. Ein solch gekoppelter Antikörper kann auf vorteilhafte Art und Weise den Wirkstoff zielgerichtet in einen Tumor, wie ein Astrozytom, bzw. in dessen blutversorgendes System transportieren und dort die Zerstörung des Tumors oder der pathologischen Blutgefäße induzieren. Auch können über einen solchen Antikörper Psychopharmaka über den Hippocampus in das Limbische System transportiert werden und dort eine zielgerichtete Wirkung von Psychopharmaka vermitteln. Nebenwirkungen von therapeutischen Wirkstoffen, die selektiv im humanen Gehirn wirken sollen, werden so reduziert.
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen und/oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Identifizierung eines Tumors, mit den Schritten: (1) Bereitstellung eines an FZ.D 9 bindenden Agens, (2) Formulierung des Agens in einen diagnostisch oder pharmazeutisch akzeptablen Träger mit ggf. weiteren Zusätzen, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumor/ZNS-Tumor, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
Für das vorstehend genannte Verfahren gelten im Hinblick auf das an FZD 9 bindende Agens sämtliche Merkmale, die zuvor für die erfindungsgemäße Verwendung des Letzteren beschrieben wurden. Für die Tumoren gelten ebenfalls die Ausführungen, die zuvor für die erfindungsgemäße Verwendung dargelegt wurden.
Diagnostisch und pharmazeutisch akzeptable Träger mit gegebenenfalls weiteren Zusätzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden beispielsweise in der Abhandlung von Kibbe A., „Handbook of Pharmaceutical Excipients", Third Edition, American Pharmaceutical Assoc. and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen erfindungsgemäß jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für eine diagnostische oder therapeutische Verwendung des Mittels vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, aber auch weitere Wirkstoffe fallen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Tumoren bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen einer von dem zu untersuchenden Lebewesen stammenden biologischen Probe; (2) Feststellung des Expressionsniveaus von FZD 9 in der biologischen Probe; (3) Vergleich des in Schritt (2) festgestellten Expressionsniveaus von FZD 9 mit dem Expressionsniveau in einer biologischen Probe von einem gesunden Lebewesen, und (4) Identifizierung eines Tumors, wenn in Schritt (3) festgestellt wird, dass das Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens höher ist als das Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des gesunden Lebewesens.
Unter der Identifizierung wird erfindungsgemäß der Nachweis oder die Detektion sowie ggf. die Klassifizierung der Tumoren verstanden. Dazu wird das Expressionsniveau von FZD 9 in einer biologischen Probe, die aus dem möglicherweise tumorösen Bereich des Lebewesens stammt, mit dem Expressionsniveau von FZD 9 in einer Referenzprobe verglichen, die aus dem entsprechenden Bereich eines gesunden Lebewesens stammt. Mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie immunologische, histologische, bildgebende oder mikroskopische Verfahren, wird festgestellt, in welchem Maße FZD 9 in der biologischen Probe synthetisiert wird.
Wie die Erfinder überraschenderweise feststellen konnten, ist das Expressionsniveau von FZD 9 in Geweben eines Neurotumors/ZNS-Tumors, Prostatakarzinoms oder Mammakarzinoms deutlich erhöht im Vergleich zu dem Expressionsniveau von FZD 9 in entsprechenden nicht-tumorösen Geweben eines gesunden Lebewesens, wie bspw. in gesundem Hirn-/Nervengewebe, gesundem Prostatagewebe, gesundem Brustgewebe etc.
Folglich kommen erfindungsgemäß als biologische Probe solche Zellen oder Gewebe in Frage, die auf das Vorhandensein eines Tumors untersucht werden sollen. Soll auf das Vorhandensein eines Neurotumors/ZNS-Tumors untersucht werden, so wird eine biologische Probe bereitgestellt, die Neurone, Gliazellen, Meningen, bzw. allgemein neuronales Gewebe oder Gehirngewebe aufweist. Soll auf das Vorhandensein eines Prostatakarzinoms untersucht werden, so wird eine biologischen Probe bereitgestellt, die Prostatagewebe oder Zellen hiervon aufweist. Soll auf das Vorhandensein von Mammakarzinom untersucht werden, wird eine biologische Probe bereitgestellt, die Brustgewebe oder Zellen hiervon aufweist. Als Referenzprobe dient jeweils eine solche Probe, die aus entsprechenden anatomischen Bereichen eines gesunden Lebewesens stammt.
Ob die Erhöhung des Expressionsniveaus in der biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens signifikant erhöht ist, lässt sich mittels dem Fachmann bekannter statistischer Methoden ohne weiteres feststellen. So kann von einer signifikanten Erhöhung bereits dann ausgegangen werden, wenn das Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens um 5 %, vorzugsweise 10 %, weiter bevorzugt um 50 % gegenüber dem Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des gesunden Lebewesens erhöht ist.
Das Expressionsniveau kann sowohl auf der Ebene der für FZD 9 kodierenden mRNA als auch auf der Ebene des FZD 9-Proteins festgestellt werden. Dabei erfolgt die Feststellung des Expressionsniveaus auf mRNA-Ebene mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie bspw. der Northern Blot-Technik. Auf Proteinebene wird das Expressionsniveau vorzugsweise mittels immunologischer Techniken festgestellt, bspw. unter Verwendung des oben im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung beschriebenen, an FZD 9 bindenden Agens, bspw. eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers oder eines entsprechenden Antikörperfragmentes, die an FZD 9 binden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Tumoren bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Verabreichen eines Mittels, das ein an FZD 9 bindenden Agens aufweist, das einen detektierbaren Marker aufweist, in das Lebewesen, und (2) Darstellung der Anreicherung des Agens in dem Lebewesen mittels geeigneter Verfahren, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumoren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinom und Mammakarzinom. Als detektierbarer Marker kommen die oben erwähnten detektierbaren Marker in Frage, wobei dieser vorzugsweise durch einen radioaktiven Marker realisiert wird und das Verfahren in Schritt (2) 3D-vorzugsweise Radiographie ist.
Durch dieses Imagingverfahren kann der Tumor dreidimensional dargestellt werden, was dem Operateur auf vorteilhafte Weise bei dessen Entfernung hilft.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor aufweist, mit den Schritten: (1) Verabreichen eines Mittels in das Lebewesen, das ein an FZD 9 bindendes Agens enthält, und (2) ggf. mehrfaches Wiederholen des Schrittes (1), wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotu- mor/ZNS-Tumor, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
Die Erfinder konnten ferner feststellen, dass FZD 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns verwendet werden kann, wobei es sich vorzugsweise bei den Substrukturen um proliferierende Zellen, Tumorzellen, bzw. Astrozytomzellen handelt. Vorzugsweise wird über die Identifizierung und/oder therapeutische Behandlung der Substrukturen die Angioge- nese, weiter bevorzugt die Tumor-Angiogenese, nachgewiesen und/oder therapeutisch behandelt. Die Identifizierung und/oder therapeutische Behandlung der Substrukturen erfolgt bevorzugt mittels eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers, höchst vorzugsweise mittels eines solchen, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, oder mittels eines entsprechenden Antikörperfragmentes. Bei dem Antikörper kann es sich bevorzugt um einen humanisierten Antikörper handeln. Der Antikörper oder das Antikörperfragment ist bevorzugt an einen Marker oder/und einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt.
Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Identifizierung und/oder zur Isolierung von Substrukturen des humanen Gehirns in einer biologischen Probe entwickelt, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen der biologischen Probe; (2) In-Kontakt- Bringen der biologischen Probe mit einem Agens, das selektiv oder/und spezifisch an FZD 9 bindet; (3) Feststellung, ob eine selektive/spezifische Bindung des Agens an die Substruktur stattgefunden hat und (4) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung von Substrukturen des humanen Gehirns oder/und (5) Isolierung der Substrukturen des humanen Gehirns bei einer positiven Feststellung in Schritt (3). Bei den Substrukturen des humanen Gehirns handelt es sich vorzugsweise um proliferierende Zellen, Tumorzellen, höchst vorzugsweise um Astrozytomzellen.
Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Identifizierung der Angiogenese, vorzugsweise der Tumor-Angiogenese, in einer biologischen Probe entwickelt, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen der biologischen Probe, vorzugsweise aufweisend Tumorzellen, (2) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Agens, das selektiv oder/und spezifisch an FZD 9 bindet, (3) Feststellung, ob eine selektiver/spezifische Bindung des Agens an die biologische Probe stattgefunden hat, und (4) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung der Angiogenese in der biologischen Probe. Für das Agens gilt das oben für das an FZD 9 bindende Agens im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung Ausgeführte entsprechend.
Die Erfinder haben ferner erkannt, dass ein gegen FZD 9 gerichtetes Agens, vorzugsweise ein Antikörper, zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Diagnose eines Tumors, vorzugsweise eines Gehirntumors, höchst vorzugsweise eines Astrozytoms, geeignet ist.
Die Erfinder haben ferner überraschenderweise festgestellt, dass FZD 9 verstärkt im Pes Hippocampi, bzw. den hippocampalen Neuronen des gesunden, insbesondere humanen Gehirns exprimiert wird und dass der hinterlegte monoklonale Antikörper über FZD 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Hippo- campusgewebe geeignet ist. Mit dieser Maßnahme wird deshalb eine Verwendung und ein Verfahren bereitgestellt, das bzw. die eine einfache und zuverlässige Identifi- zierung, Behandlung sowie ggf. Isolierung von humanem Hippocampusgewebe ermöglichen. Diese Maßnahme hat ferner den Vorteil, dass die Erfinder erstmals Informationen über das Expressionsmuster von FZD 9 insbesondere im humanen adulten Gehirn bereitstellen und damit wichtige Informationen über mögliche Signalmechanismen im Hippocampus offenbaren. Die Erfinder liefern deshalb nicht nur für den Kliniker sondern auch für den Zellbiologen und Grundlagenforscher ein wichtiges Werkzeug zur Identifizierung dieses Bereichs der Großhirnrinde.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert, die rein beispielhaften Charakter haben und die Tragweite der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Dabei wird auf die beiliegenden Figuren Bezug genommen, in denen zu sehen ist:
Fig. 1 Wnt/FZD-Signalweg
Fig. 2 Herstellung des spezifisch gegen humanes FZD 9 gerichteten und aus den Hybridomzellen W3C4E1 stammenden Antikörpers. A: Diagramm, das schematisch das Plasmid pIRES zeigt, welches das humane FZD 9- Gen und am N-Terminus einen Flag-Tag aufweist. B: FACS-Analyse der Spezifität des aus den Zellen W3C4E11 stammenden Antikörpers. Der aus den Zellen W3C4E11 stammende monoklonale Antikörper (rechte Teilabbildung) und sein unspezifischer IgM-Isotyp (linke Teilabbildung) wurden mit HEK-293 Zellen inkubiert, die mit dem in (A) dargestellten pIRES-Plasmid transfiziert wurden. Nach dem Waschen wurde die zelluläre Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie analysiert. Fig. 3 Immunhistochemie für FZD 9 in humanen normalen Gehirnen (A, B) und in humanen Astrozytomen des WHO-Grades II (C), Grad III (D) und Grad IV (E-H). In normalen Gehirnen war FZD 9 hauptsächlich in den Neuronen des Hippocampus lokalisiert (A+B). Die FZD 9- Immunfärbung konnte eindeutig in den Mikrogefäßen und den Tumorzellen der Astrozytome mit dem WHO-Grad II (C), Grad III (D) und Grad IV (E) detektiert werden. In den Mikrogefäßen wurde FZD 9 in den Endothelzellen exprimiert (F). In den Glioblastomen konnten die vielschichtigen Mikrogefäßproliferate ('Glomeroid tufts') (G) und Nekrosen mit Pseudopalisaden ('Pseudopalisading Necrosis') (H), bei denen es sich um histopathologische Kennzeichen von Glioblastomen handelt, stark auf FZD 9 angefärbt werden. Originale Vergrößerungen: x40 (A); x400 (B-E, G); xlOOO (F); X200 (H).
Fig. 4 Statistische Analyse (Pearson's Korrelationskoeffizientenanalyse) der
Korrelation zwischen der Immunreaktivität FZD 9 mit der Astrozy- tomklassifizierung, Mikrogefäßdichte und dem Astrozytom-Ki67- Markierungsindex. Die Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen korrelierte positiv mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung (A) und der Astrozytom- MVD (B) in humanen Astrozytomen. Die gesamte FZD 9- Immunfärbungsintensität korrelierte stark mit der Astrozytom-WHO- Klassifizierung (C) und dem KI67-Markierungsindex (D) in humanen Astrozytomen.
Fig. 5 Veränderungen in der FZD 9-mRNA-Expression nach
Cobaltchloridbehandlung in HCEC-Zellen. Die Zellen wurden mit Cobaltchlorid (100 μmol) für die angegebenen Zeiträume inkubiert. Die FZD 9-Expression wurde unter Verwendung von Echtzeit-PCR quantifiziert. Die FZD 9-Expression war 15 Stunden nach der Inkubation mit Cobaltchlorid erhöht und 24 Stunden nach der Inkubation deutlich erhöht. Fig. 6 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in 23 Proben von Medulloblastomen im Vergleich zu 10 Proben von neuropatholo- gisch normalen humanen Gehirnen.
Fig. 7 Korrelation der Intensität der FZD 9-Färbung mit dem MIB-l-(Ki67)-
Markierungsindex.
Fig. 8 Kombinierte Echtzeit-Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse an vier
Gewebeproben, die die FZD 9-mRNA-Expression in Medulloblastomen im Vergleich zu normalen Gehirnproben wiedergeben. Die Werte werden in Form der relativen Expression gegenüber 18S-rRNA angegeben, die als interner Referenzstandard verwendet wurde.
Fig. 9 Immunhistochemische Expression von FZD 9. Die cerebeiiare Expression beschränkt sich auf das Endothel weniger Gefäße (a, lOOfache Vergrößerung). In dem Telencephalon ist FZD 9 hauptsächlich in den hip- pocampalen Neuronen lokalisiert (d, 200fache Vergrößerung). Die FZD 9-Expression in den Tumorgefäßen ist mit Pfeilen gekennzeichnet (c, 400fache Vergrößerung). Exemplarisch dargestellt ist die starke Expression (Intensitätswert = 3) in einem Medulloblastom (d, lOOfache Vergrößerung) und in supratentorialen PNETs (e, 400fache Vergrößerung). Schwache (Wert = 1) Färbung (f, lOOfache Vergrößerung) und moderate (Wert = 2) Färbung (g, 400fache Vergrößerung) in Medulloblastomen. Ein Überblick über den gleichen wie dem in Teilabbildung g gezeigten Tumor, verdeutlicht ein ungleiches Verteilungsmuster der FZD 9- Expression (h, lOOfache Vergrößerung).
Fig. 10 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Schwannom-Probe. Fig. 11 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Meningeom-Probe.
Fig. 12 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Neurofibromatom-Probe.
Fig. 13 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Prostata-Karzinom-Probe.
Fig. 14 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Mammakarzinom-Probe.
Fig. 15 Intensität der immunhistochemische Färbung auf FZD 9 in einer
Hämangioblastom-Probe.
Ausführungsbeispiel
1. Der Wnt/FZD-Signalweg
Fig. 1 zeigt schematisch den Wnt/FZD-Signalweg entsprechend der Publikation von Huelsken J. und Behrens J. , „The Wnt signalling pathway", Journal of Cell Science 2002; 115: 3977-3978. Der Inhalt dieser Publikation ist durch in Bezugnahme ausdrücklicher Bestandteil der vorliegenden Anmeldungsunterlagen. Dargestellt sind die drei Zweige des Wnt/FZD-Signalweges, nämlich der ß-Catenin-Signalweg („ß-catenin pathway"; mittlerer Zweig), der Ca2+-Signalweg (,,Ca2+ pathway"; rechter Zweig) und der die planare Zellpolarität regulierende Signalweg („planar cell polarity"; linker Zweig). Neben dem oben in der schematischen Zellmembran dargestellte Frizzled Rezeptor können indirekt die einzelnen Faktoren der drei Signalwege, die schematisch als kreis- oder ovalförmige Symbole dargestellt werden, bspw. Dsh, Frodo, ß-Arrl, PLC, PKC, JNK etc., sowie das Wnt-Protein zur Identifizierung der Substrukturen des humanen Gehirns dienen.
2±_ Material und Methoden
2.1 Patienten
(a) Astrozytome
Es wurden 25 Erwachsene untersucht, einschließlich zehn Kontrollen mit normalem Gehirn, 7 WHO-Grad-II-Astrozytome, 9 WHO-Grad-III- Astrozytome, und 9 WHO-Grad-IV-Astrozytome. Details dieser Pathologien sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Die histologische Diagnose und Klassifizierung wurden durch zwei erfahrene Neuropathologen gemäß des WHO- Klassifizierungssystems durchgeführt. Die Gewebebeschaffung erfolgte gemäß der ethischen Richtlinien der Universität Tübingen.
(b) Weitere Hirntumore
Für die Untersuchung der weiteren Hirntumoren wurden von dem Institut für Hirnforschung (Tübingen) und dem Pathologischen Institut (Katharinen- hospital Stuttgart) 29 Proben bezogen. Die Proben enthielten 23 klassische Medulloblastome, drei desmoplastische Medulloblastome, zwei supratentoriale PNETs und ein Medullomyoblastom (17 männliche und 12 weibliche Patienten in einem Altersbereich von 2 bis 64 Jahren, mittleres Alter 15,3 Jahre). Die histologische Diagnose und Klassifizierung erfolgte gemäß des WHO- Klassifizierungssystems. Weitere Proben enthielten Meningeome, Schwanno- me, Hämangioblastome und Neurofibromatome. Die Durchsicht der klinischen Daten zeigte in sechs Patienten ein Wiederauftreten des Tumors nach chirurgischem Eingriff (Tabelle 3). Es wurden keine Fälle von Turcot- oder Gorlins-Syndromen erfasst. Proben von zehn normalen Gehirnen dienten als Kontrolle. Die interessierenden Regionen umfassten den frontalen Lobus, den motorischen Cortex, den Hippocampus, den okzipitalen Lobus und das Cere- bellum. Für die PCR wurde gefrorenes Gewebe aus dem frontalen Lobus und den cerebellaren Hemisphären präpariert. Die Gewebebeschaffung erfolgte gemäß den ethischen Richtlinien der Universität Tübingen.
(c) Nicht-Hirntumoren
Für die Untersuchung der Prostatakarzinome und Mammakarzinome wurden Proben von Instituten des Universitätsklinikums Tübingen gemäß den ethischen Richtlinien der Universität Tübingen beschafft.
2.2 α-FZD 9-Antikörper
2.2.1 Monoklonaler α-FZD 9-Antikörper
Der gegen humanes FZD 9 gerichtete spezifische monoklonale Antikörper, der von den Hybridomzellen W3C4E11 hergestellt wird, wurde durch die Immunisierung von vier bis acht Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen mit einer FZD 9-exprimierenden Retinoblastoma- Zelllinie WERI-RB-I (bezogen von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Deutschland) erhalten, die in RPMI1640-Medium versetzt mit 10%-igem fötalem Kälberserum kultiviert wurde. Den Mäusen wurden in 2-Wochen- Intervallen fünfmal intraperitoneal 107-Zellen injiziert. Vier Tage nach dem letzten Boost wurde die Milz zur Fusion mit der SP2-0- Myelomzelllinie entfernt. Die resultierenden Hybridome wurden in RPMI1640-Medium (GIBCO) enthaltend 10% fötales Kälberserum und Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HT; Sigma-Aldrich, München, Deutschland) gehalten. Kulturüberstände, die positiv für WERI-RB-I- Zellen waren, wurden auf peripherem Blut (B) und Knochenmarks(BM)- Zellen gescreent. Hybridomzellen, die Antikörper sekretierten, die für diese Zellen nicht-reaktiv waren, wurden selektiert, zweimal durch limitierte Verdünnung kloniert und in Gegenwart von Hypoxanthin- Thymidin (HT; Sigma) kultiviert. Der Klon W3C4E11 erfüllte diese Kriterien und wurde selektiert. Der InM-Isotyp des resultierenden monoklonalen Antikörpers der Zelllinie W3C4E11 wurde durch ELISA bestimmt (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). Die Spezifität von W3C4E11 -Antikörpern für humanes FZD 9 wurde durch die selektive Erkennung von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) bestätigt, die mit dem gesamten humanen FZD 9-Gen transfiziert wurden. W3C4E11 erkennt nicht-transfizierte HEK-293 Zellen oder HEK- 293 Zellen, die mit FZD 1, 2, 4, 5, 7 oder 10 transformiert wurden.
Die W3C4E11-Zelllinie wurde am 15. JuIi 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Maschero- der Weg Ib, 38124 Braunschweig unter der Nummer ACC2668, hinterlegt.
2.2.2 Polyklonaler α-FZD 9-Antikörper
Für die Untersuchung der weiteren Hirntumoren (Nicht-Astrozytome) und der Nicht-Hirntumoren wurde ein polyklonaler Kaninchenantikörper gegen humanes FZD 9 (Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland, Verdünnung 1:500) verwendet. Der kommerziell erhältliche Antikörperklon SP4153P ist gegen die erste extrazelluläre Schleife von humanem FZD 9 gerichtet. 2.3 Immunhistochemie
(a) Astrozytome
Es wurden Gehirnproben chirurgisch entfernt, unmittelbar in gepuffertem Pa- raformaldehyd fixiert und in Parafin eingebettet. Zur Immunfärbung wurden repräsentative serielle Schnitte von 3 μm angefertigt. Nach Deparaffinisierung wurden die Schnitte in einem 600 Watt Mikrowellenherd für 15 min. in Cit- ratpuffer (2,1 g Natriumzitrat pro Liter, pH 6) gekocht. Die endogene Peroxi- dase wurde mit 1% H2O2 in Methanol für 15 min. inhibiert. Die Schnitte wurden in 10%igem normalem Schweineserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung der Immunglobuline zu blockieren, und wurden dann mit dem primären Antikörper inkubiert. Zur FZD 9- Färbung wurde der oben beschriebene aus W3C4E11 stammende monoklonale Antikörper verwendet. Ferner wurde ein weiterer polyklonaler Kaninchenantikörper gegen humanes FZD 9 verwendet (Acris Antibodies GmbH, a.a.O.; 1:500 verdünnt). Mikrogefäßendothelzellen wurden mit Anti-CD34- monoklonalem Antikörper (1:50 verdünnt, Biomedicals, Äugst, Schweiz) gefärbt und Ki67 wurden mit MIB-I gefärbt, um die Zellproliferation zu zeigen (1:100, DAKO, Hamburg, Deutschland).
Die Antikörperbindung an die Gewebeschnitte wurde mit einem biotinylierten Schwein-Anti-Kaninchen- (DAKO, Hamburg, Deutschland) oder Kaninchen- Anti-Maus-IgG-F(ab)2-Antikörperfragment visualisiert. Anschließend wurden die Schnitte mit einem Streptavidin-Avidin-Biotin-Komplex (DAKO, Hamburg, Deutschland) inkubiert, gefolgt von einer Entwicklung mit 3,3'- Diaminobenzidin (DAB) als Chromogen (Fluka, Neu-Ulm, Deutschland). Schließlich wurden die Schnitte mit Hematoxylin gegengefärbt.
Nach der Immunfärbung wurde das Expressionsniveau von FZD 9 durch zwei Verfahren quantifiziert. Die gesamte Immunreaktivität von FZD 9 einer jeden Probe wurde unter Verwendung einer semi-quantitativen Bewertung graduiert, die von "Sinicrope FA et al., „Bcl-2 and p53 oncoprotein expression during co- lorectal tumorigenesis". Cancer Res. 1995; 55:237-241, eingeführt wurde. Kurz gesagt, es wurden vier Kategorien wie folgt definiert: 0, vollständig negativ; 1, schwach positiv; 2, moderat positiv; und 3, stark positiv. Die Dichte der FZD 9+-Mikrogefäße wurde unter dem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Verfahrens untersucht, das durch Weidner N. et al., "Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast Carcinoma". N. Engl. J. Med. 1991; 324:1-8, eingeführt wurde. Kurz gesagt, der gesamte Schnitt wurde bei 40-facher Vergrößerung auf die Bereiche der höchsten FZD 9+-vaskulären Dichte (hot spot) gescannt, gefolgt durch eine Zählung der Anzahl von FZD 9+- Gefäßen innerhalb eines einzigen Feldes bei 200-facher Vergrößerung (high power field, HPF) in jedem hot spot. Drei hot spots wurden gezählt und der Mittelwert berechnet. Die Endergebnisse werden als arithmetische Mittel der FZD 9+-positiven Gefäße pro HPF mit Standardfehler der Mittelwerte (SEM) ausgedrückt. Die Intensität der FZD 9-Expression und die Dichte der FZD 9+- Mikrogefäße wurden sorgfältig durch unabhängige Personen ermittelt.
Mikrogefäßdichte(MVD)-Zählungen wurden durch Ermittlung der mittleren Anzahl der Hohllumengefäße, angefärbt durch CD34 in 3 HPF, mit dem gleichen Verfahren bestimmt, das zur Zählung der Dichte der FZD 9+-Mikrogefäße angewandt wurde. Die Dichte der Ki67+-Mikrogefäße wurde mit dem gleichen Verfahren bestimmt, das zur Zählung der Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen verwendet wurde.
(b) Weitere Hirntumore
Für die Detektion von FZD 9 in der Immunhistochemie wurde eine Optimierung des polyklonalen Kaninchenantikörpers sowohl auf Kryostat- als auch auf Paraffinschnitten mit identischen Ergebnissen durchgeführt. Folglich wurden sämtliche weiteren Studien auf in Paraffin eingebetteten Gewebeproben durchgeführt. Nach der Deparaffinisierung wurden die Schnitte in einem 600 Watt Mikrowellenherd für 15 Minuten in Citratpuffer (s.o.) gekocht. Die endogene Peroxidase wurde mit 1% H2O2 in Methanol für 15 Minuten inhibiert. Die Schnitte wurden in 10%igem normalem Schweineserum (s.o.) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung der Immunglobuline zu blockieren. Für die FZD 9-Färbung wurde der polyklonale Kaninchenantikörper gegen humanes FZD 9 (Acris Antibodies GmbH, a.a.O., Verdünnung 1:500) verwendet. Die Antikörperbindung an die Gewebeschnitte wurde mit einem biotinylierten AntiKaninchen-Schweineantikörper (DAKO, Hamburg, Deutschland), gefolgt von einer Inkubation mit einem Streptavidin-Avidin-Biotin-Komplex (DACO, Hamburg, Deutschland) visualisiert. Als Chromogen wurde 3,3'- Diaminobenzidin (DAB) verwendet (Fluka, Neu-Ulm, Deutschland). Schließlich wurden die Schnitte mit Hematoxylin gegengefärbt und eingebettet. Bei den Kontrollen wurde der primäre Antikörper weggelassen.
Die immunhistochemische Gewebefärbung für MIB-I wurde auf 4 μm dicken, formalinfixierten und paraffineingebetteten Proben unter Verwendung des Benchmark Immunohistochemistry Systems (Ventana, Tasken, AZ, USA) durchgeführt. Das automatisierte Protokoll basiert auf einem indirekten Bio- tin-Avidin-System. Die Optimierung des MIB-1-Antikörpers (1:100. DAKO, Hamburg, Deutschland) umfasste eine Vorbehandlung zur Zellkonditionie- rung für 6 Minuten. Nach der Inkubation des primären Antikörpers für 2 Minuten wurde für 4 Minuten ein Avidin- und ein Biotin-Blocker zugegeben, gefolgt von einem unspezifisch biotinylierten Immunglobulin- Sekundärantikörper und einem Diaminobenzidinsubstrat zur Visualisierung. Die Schnitte wurden dann gewaschen, mit Hematoxilin gegengefärbt und eingebettet. Die negativen Kontrollschnitte wurden mit jedem Batch der Färbung parallel verarbeitet. Sämtliche histologischen Untersuchungen und Fotodokumentationen erfolgten unter Verwendung eines Olympus AX 70- Mikroskops; die Fotografien wurden digitalisiert und hinsichtlich Helligkeit und Kontrast im Druck optimiert. (c) Nicht-Gehirntumoren
Die immunhistochemische Detektion der Nicht-Gehirntumoren erfolgte, ausgehend von Paraffinschnitten, wie in (b) beschrieben.
2.4 Zellkultur und Behandlung
(a) Astrozytome
Humane cerebromikrovaskulare Endothelzellen (HCEC), die freundlicherweise von Prof. A. Muruganandam bereitgestellt wurden, sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. Muruganandam A. et al., „Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier". FASEB j. 1997; 11:1187-1197. Diese HCEC-Zellen wurden in RPMI-1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) mit Penicillin und Streptomycin bei 100 U/ml (Gibco Grand Island, NY) bei 37°C in 5% C02 kultiviert. In den Cobaltchloridexperimenten, wurden HCEC-Zellen, die etwa 80% Konfluenz erreicht hatten, an CoCl2 (100 μmol) für die angegebenen Zeiträume exponiert; vgl. Cho J, et al., „Cobalt chloride- induced estrogen receptor alpha down-regulation involves hypoxia-inducible factor-lalpha in MCF-7 human breast Cancer cells". Mol. Endocrinol. 2005; 19:1191-1199. Das Medium wurde 24 Stunden vor der Exposition an CoCl2 erneuert. Für jeden Zeitpunkt wurden parallel Proben in dreifacher Ausfertigung präpariert.
(b) Weitere Hirntumore
Eine repräsentative humane Medulloblastomzelllinie, DAOY, die die Expression von neuronalen und glialen Elementen zeigt, vgl. Karasawa et al. (2002), J. Biol. Chem. 277; Seiten 37479-37486, wurde freundlicherweise von Dr. Mittelbronn zur Verfügung gestellt. Diese Zellen wurden in minimalem essentiel- lern Medium (Eagle) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Serum (FCS) mit Penicillin und Streptomycin bei 100 U/ml (Gibco, Grand Island, NY) bei 37°C in 5% CO2 kultiviert. Die Ernte erfolgte bei etwa 80% Konfluenz.
2.5 Echtzeit-Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse
(a) Astrozytome
Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen wurde unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland), gemäß der Angaben des Herstellers präpariert. 2 μg RNA wurde in cDNA unter Verwendung von randomi- sierten Primern revers transkribiert. Anschließend wurde die mRNA-Expression von FZD 9 durch HCEC-Zellen unter Verwendung einer Echtzeit-PCR quantifiziert, bei der SYBR-Grün als Detektionsreagenz und 18 S-iibosornale RNA als Zwischenreferenzstandard verwendet wurde. Nachfolgende Primer wurden verwendet: Humane 18S ribosomale RNA (Sinn, CGGCTACCACATCCAA- GGAA; Gegensinn, GCTGGAATTACCGCGGCT), und humanes FZD 9 (Sinn, GCAGTAGTTTCCTCCTGACCG; Gegensinn, TCTCTGTGTTGGTGCCGCC). Die PCR wurde in einem Echtzeit-iCycler (Biorad, München, Deutschland) durchgeführt. Sämtliche Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 15 μl durchgeführt, das zweimal SYBR®-Grün-PCR-Mastermix und optimierte Primerkonzentrationen aufwies. Das Cycling wurde bei 95°C für 15 Minuten gestartet, anschließend folgten 35 Zyklen von: 94°C für 45 sek., 52°C für 30 sek. und 720C für 45 sek. mit einer Fluoreszenzdetektion bei 72°C. Die Schmelzkurvenanalyse wurde zwischen 50 und 1000C mit 0,5°C-Intervallen durchgeführt. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung gemessen und die arithmetischen Mittel wurden berechnet. (b) Weitere Hirntumore
Unter Verwendung des peqGold-TriFastKit (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) wurd Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen und gefrorenen Gewebeproben wurde der Angaben des Herstellers präpariert. Für jede Probe wurden 2 μg RNA unter Verwendung von randomisierten Primern in cDNA revers transkribiert. Echtzeit-PCR wurde dazu verwendet, um die mRNA- Expression von FZD 9 in DAOY-Zellen zu quantifizieren. SYBR®-Grün wurde zur Detektion verwendet. Humane ribosomale 18S-RNA diente als interner Referenzstandard (vorwärts: CGGCTACCACATCCAAGGAA; rückwärts: GCTGGAATTACCGCGGCT). Das folgende Primerpaar wurde für FZD 9 verwendet: vorwärts: GCAGTAGTTTCCTCCTGACCG; rückwärts: TCTCTGTGTTGGTGCCGCC. Sämtliche Reaktionen wurden in einem Echt- zeit-iCycler (Biorad, München, Deutschland) unter Verwendung eines SYBR®- Grün-PCR-Mastermix und eines optimierten Zyklusprotokolls verwendet: 95°C für 15 Minuten, dann 35 Zyklen von: 94°C für 45 Sekunden, 52°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden mit einer Fluoreszenzdetektion bei 72°C. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte zwischen 50 und 1000C mit 0,50C- Intervallen.
2.6 Evaluierung und Statistik
(a) Astrozytome
Die Anzahl von FZD 9+-Mikrogefäßen/HPF, MVD und Ki67+- Mikrogefäßen/HPF sind als arithmetische Mittel mit Standardfehlern der Mittelwerte (SEM) angegeben. Die statistische Analyse der quantitativen FZD 9- Expression wurde durch Einweg-ANOVA gefolgt durch Dunnett's Multiple Comparison Tests (Grap Päd Prism 4.0 Software) durchgeführt. Die Korrekturanalyse wurde durch Kontrolle der Pearson's Korrelationskoeffizienz evaluiert. Für sämtliche statistischen Analysen wurden signifikante Level auf p<0,05 gesetzt.
(b) Weitere Hirntumore
Die gesamte Immunreaktivität für FZD 9 einer jeden Probe wurde unter Verwendung einer semiquantitativen Wertung eingestuft, die von Sinicrop eingeführt wurde; vgl. Sinicrop et al. (1995), Cancer Res. 55, Seiten 237-241. Die vier Kategorien wurden wie folgt definiert: 0 vollständig negativ; 1 schwach positiv; 2 moderat positiv; und 3 stark positiv. Der MIB-1/Ki67- Markierungsindex als der prozentuale Anteil von Zellen in einem Gewebe, das auf Ki67 gefärbt wurde, wurde evaluiert durch Mittelung des prozentualen Anteils von Ki67+-Kernen, die in drei „high power fields" gezählt wurden. Für diese Mittelung wurden Spots nach dem Scannen der gesamten Probe ausgewählt, gezählt und der mittlere Wert bestimmt. Sämtliche Untersuchungen wurden unabhängig von zwei Personen durchgeführt. Der FZD 9- Anfärbungswert und der Ki67-Markierungsindex sind als arithmetische Mittel mit Standardabweichungen (SEM) angegeben. Die statistische Analyse der quantitativen FZD 9-Expression erfolgte durch Einweg-ANOVA, gefolgt durch Dunnett's Multiple Comparison Test (Grap Päd Prism 4.0 Software). Die Korrekturanalyse wurde durch Kontrolle des Pearson's Korrelationskoeffizienten evaluiert. Für sämtliche statistischen Analysen wurden die Signifikanzlevel auf p<0,05 gesetzt.
3. Ergebnisse
3.1 Herstellung des gegen humanes FZD 9 gerichteten aus W3C4E11-Zellen stammenden spezifischen monoklonalen Antikörpers
Um die humane FZD 9-Proteinexpression zu analysieren, wurde ein monoklonaler Antikörper gegen membrangebundenes FZD 9 durch Immunisierung ei- ner Maus mit der FZD 9-exprimierenden Zelllinie WERI-RB-I gewonnen. Um potentielle FZD 9-reaktive Antikörper zu selektieren, wurde eine transfizierte Zelle hergestellt. Dazu wurden HEK-293 Zellen mit einem pIRES-Plasmid trans- fiziert, der das humane FZD 9-Gen und ein Flag-Tag an dem N-Terminus enthielt (Fig. 2A „start of transcription" ≤ Transkriptionsstart, „Signal sequence" = Signalsequenz). Nach drei Runden der Selektion von Zellen mit einem Zellsor- ter, die mit einem Anti-Flag-Antikörper anfärbbar waren, exprimierten die meisten Zellen stabil den Flag-Tag auf der Zelloberfläche. Fig. 2B zeigt, dass der W3C4E11-Antikörper mit der transfizierten Zelle reagiert, während Wildtyp- HEK-293 Zellen nicht-reaktiv waren (nicht gezeigt).
3.2 Expression von FZD 9 in neuropathologisch normalen adulten humanen Gehirnen
3.2.1 Obwohl beschrieben wurde, dass FZD 9 im Gehirn exprimiert wird, ist dessen Expressionsmuster im adulten humanen Gehirn bis heute unbekannt. Es wurden deshalb an zehn Schnitten von Parafin eingebetteten adulten normalen humanen Gehirnen immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt, um das Expressionsniveau und die Lokalisierung von FZD 9 zu bestimmen. In den meisten Schnitten war die FZD 9-Expression niedrig (Tabelle 1) und es wurden nur gelegentlich einige FZD 9+-Neuronen oder -Glia beobachtet. Allerdings wurde in Schnitten, die Hippocampusgewebe enthielten, eine starke FZD 9- Expression in den hippocampalen Neuronen beobachtet (Fig. 3A und B).
In einigen Fällen wurde FZD 9 auf den Endothelzellen der großen Gefäße exprimiert, die in der Leptomeninx außerhalb des Hirnparen- chyms lokalisiert sind. In normalen Gehirnen wurden wenige FZD 9+- Mikrogefäße beobachtet (Tabelle 1). Fall GeNeuropathologlsche FZD9 Ki67- FZD9+- MVD schlecht/ Alter Diagnose/ PathologiFarb- Markie- Mikroge- sche Diagnosis inten- rungsindex fäße/HPF b sität3 (%)
F d/82 Normales Gehirn/ <0.01 4 ±0.6 5± 1.5
Intrabdominale Blutung, Bypass M 773 Normales Gehirn <0.01 0.7 ± 0.3 l±0
/Pulmonare
Embolie M/21 Normales Gehirn <0.01 1 ±0 l±0
/Schlüsselbeinbruch F/49 Normales Gehirn mit 0 <0.01 0.7 ±0.3 l±0
Zeichen von
Arteriosklerose/
Cyst Niere, cyst Leber
F/92 Normales Gehirn <0.01 1 ±0 1.3 ±0.3
/Fulminante Colitis F/75 Beginnendes Ödem <0.01 1.7 ±0.3 8.3 ±3 des Gehirns/ Leberzirrhose
F/39 Normales Gehirn <0.01 l±0 13 ± 1
/Pulmonare
Embolie M/25 Normales Gehirn <0.01 l±0 1.3 ±0.3
/Aortaruptur
M/51 Normales Gehirn <0.01 l±0 1.7 ±0.3
/Stenose der femoralen
Arterien
10 F/36 Normales Gehirn mit <0.01 4.3 ±0.3 19.3 ±2.4 Zeichen der Anämie/ Carcinomder Pleurahöhle Tabelle 1: Klinische und histologische Daten aus Kontrollpatienten mit normalem
Gehirn a: Die Farbintensität wurde in vier Kategorien unterteilt: 0, vollständig negativ; 1, schwach positiv; 2, moderat positiv; und 3, stark positiv; b: HPF = high power field; c: MVD = Mikroge- fäßdichte; d: F = weiblich; e: M = männlich.
3.2.2 Proben aus verschiedenen Bereichen von 10 adulten normalen humanen Gehirnen wurden in einem weiteren Ansatz angefärbt, ebenfalls um die Expressionsniveaus für FZD 9 und die Lokalisierung von FZD 9 zu bestimmen. In den meisten Bereichen war die FZD 9-Expression niedrig; gelegentlich wurden wenige FZD 9+-Neuronen oder Glia beobachtet. Die FZD 9-Expression in dem Cerebellum war auf die Endo- thelzellen der Mikrogefäße beschränkt (Fig. 9A).
Im Gegensatz hierzu wurde eine starke FZD 9-Expression in den Pyramidenschichten der hippocampälen Neuronen beobachtet (Fig. 9B). In den Leptomeningiden wurde FZD 9 auf den Endothelzellen der großen Gefäße exprimiert. Sämtliche Negativkontrollen zeigten keine Färbung.
3.3 Expression von FZD 9 in humanen Tumoren
3.3.1 Astrozytome
Parallel zu der Untersuchung der normalen bzw. gesunden Gehirne wurde die FZD 9-Expression in humanen Astrozytomen mit WHO-Grad II bis IV untersucht. Die FZD 9-Expression wurde sowohl in Mikroge- fäß-Endothelzellen als auch in neoplastischen Zellen beobachtet (Fig. 3C-E).
Die Expression von FZD 9 in Mikrogefäß-Endothelzellen wurde in humanen Astrozytomen beobachtet (Fig. 3C-F). Die Dichte von FZD 9+- Mikrogefäßen war hoch in malignen Astrozytomen (40,1 ± 21,3 für WHO-Grad III und 91,37 ± 17,79 für WHO-Grad IV) und niedrig in niedergradigen Astrozytomen (2,1 ± 1,0 für WHO-Grad II) (Tabelle 2). Die Dichte der FZD 9+-Mikrogefäßen in Glioblastomen war signifikant höher als in WHO-Grad II Astrozytomen (p<0,001) und in normalen Gehirnen (p<0,001) (Fig. 4A und Tabelle 2; „microvessels" £ Mikrogefä- ße; „Normal brain" & normales Gehirn; „Grade" & Grad; „grading" & Graduierung; „astrocytomas" * Astrozytome). Mehrschichtige Mikroge- fäßproliferate ('glomeroid tufts') von proliferierenden Kapillaren sind ein charakteristisches Merkmal der Mikrogefäßstruktur von Glioblastomen. Diese Mikrogefäßproliferate enthalten vaskuläre Kanäle, die aus Schichten von Endothelzellen gebildet sind und durch unvollständige Schichten von Perizyten getrennt werden; vgl. Kleinhues P. et al., „The WHO Classification of tumors of the nervous System". J. Neu- ropathol. Exp. Neurol. 2002 ; 61 :215-225. Die vielschichtigen Mikrogefäßproliferate zeigten ebenfalls eine starke Expression von FZD 9 (Fig. 3G).
Die FZD 9-Expression in Tumorzellen wurde bei WHO-Grad-II-Astro- zytomen in einem von sieben, in WHO-Grad-III-Astrozytomen in fünf von neun, und in WHO-Grad-IV-Astrozytomen in neun von neun Proben beobachtet, woraus sich schlussfolgern lässt, dass FZD 9 in Tumorzellen maligner Astrozytome wesentlich stärker exprimiert wird, als in solcher von niedergradigen Astrozytomen. Das Gesamtniveau der FZD 9-Immunreaktivität wurde semiquantifiziert. Die FZD 9-Expression war hoch in WHO-Grad-III- (p<0,01, verglichen mit normalen Gehirnen) und WHO-Grad-IV-Astrozytomen (p<0,001, verglichen mit normalen Gehirnen) und niedrig in WHO-Grad-II-Astrozytomen (p>0,05, verglichen mit normalen Gehirnen) (Fig. 4 A und Tabelle 2). FZD 9 wurde in humanen Glioblastomen stark heterogen exprimiert. Ein weiteres histopathologisches Charakteristikum von Glioblastomen ist das Vorhandensein von Nekrosen mit Pseudopalisaden ('pseudopalisading necroses1), d.h. einer zentralen Nekrose mit perinekrotischen Astrozy- tomzellen, die häufig ein Pseudopalisadenmuster einnehmen; vgl. Kleinhues P. et al., (a.a.O). In den vorliegenden Untersuchungen wurde in den Astrozytomzellen in Nekrosen mit Pseudopalisaden eine starke Expression von FZD 9 beobachtet (Fig. 3H).
Fall GeDiagnose FZD9 Ki67- FZD9+-Mikro- MVD c schlecht/ Alter - Markie- gefäße/HPF b
Farb- rungsindex in- (%) tensi- täf
11 Fd/49 Ast f Grad II 1 1 l±0 33.3 ±3.3
12 M 765 Ast Grad II O 1 l±0 4 ±0.6
13 F/25 Ast Grad II O 4 O 18.7 ±0.9
14 M/43 Ast Grad II 2 3 8± 1.2 53.5 ± 24.5
15 M/39 Ast Grad II 1 1 0.3 ±0.3 22.3 ± 3.4
16 F/36 Ast Grad II 2 2 3.3 ±0.3 32 ±7.1
17 M/37 Ast Grad II 1 1 1.3 ±0.3 6.5 ±0.5
18 M/49 Ast Grad III 3 4 121.7 ±5.8 151 ± 11.5
19 M/67 Ast Grad III i 5 5.7 ± 1.8 16 ± 1.5
20 F/49 Ast Grad III 2 20 14.67 ± 2.3 46 ±8.6
21 F/23 Ast Grad III 2 20 15 ± 1.7 74.7 ±9.3
22 M/48 Ast Grad III 2 10 7.5 ± 0.5 15.7 ± 1.2
23 F/44 Ast Grad III 1 2 1.3 ±0.3 40.7 ± 4.9
24 F/69 Ast Grad III 1 7 3 ±0.6 34.7 ±2.6
25 F/40 Ast Grad III 1 5 11 ±0.6 46.3 ±8.1
26 M/58 Ast Grad III 3 15 181 ±8.1 315 ± 13.2
27 M/50 GB « Grad IV 3 20 125.7 ±8.1 133.7 ±5.4
28 M/58 GB Grad IV 3 8 80.67 ± 1.4 181.7 ±38.3
29 F/68 GB Grad IV 2 8 32 ± 2.6 44.3 ± 2.8
30 F/93 GB Grad IV 2 10 15 ±3 192 ±9.2
31 F/61 GB Grad IV 3 20 49.3 ± 1.4 65 ± 2.9
32 M/68 GB Grad IV 3 5 107 ±4 131 ±6.4
33 F/49 GB Grad IV 3 10 147 ±3.2 215.3 ±3.4
34 F/51 GB Grad IV 3 15 90.3 ± 5.8 112 ± 19.6
35 M/52 GB Grad IV 3 8 175 ±5.1 187.3 ±5.6
Tabelle 2 Klinische und histopathologische Daten aus Astrozytompatienten a: Die Farbintensität wurde in vier Kategorien unterteilt: 0, vollständig negativ; 1, schwach positiv; 2, moderat positiv; und 3, stark positiv; b: HPF = high power field; c: MVD = Mikroge- fäßdichte; d: F = weiblich; e: M = männlich; f: Ast = Astrozytom; «: GB = Glioblastom. 3.3.2 Korrelation zwischen der Immunreaktivität von FZD 9 mit dem Astro- zytomgrad, der Mikrogefäßdichte und der Zellproliferation
Da die Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen in malignen Astrozytomen hoch und in niedergradigen Astrozytomen niedrig war, wurde die Korrelation der Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen mit der Astrozytom- WHO-Klassifizierung und der Astrozytom-Mikrogefäßdichte (MVD) als Gradmesser der Angiogenese analysiert. Wie in Fig. 3A gezeigt, korreliert die Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen positiv mit der Astrozytom- WHO-Klassifizierung (p = 0,03, r = 0,98). Die Korrelationen zwischen der Dichte von FZD 9+-Mikrogefäßen mit der MVD in Astrozytomen wurde unter Verwendung des Pearson's Korrelationskoeffizienten evalu- iert. Die MVD wurde mit einer allgemein verwendeten Methode unter Verwendung der CD34 Immunfärbung gemessen. In humanen Astrozytomen wurde eine enge Korrelation zwischen der Dichte von FZD 9+- Mikrogefäßen und der MVD beobachtet (Fig. 4B; p<0,0001, r = 0,84).
Ferner wurde die Gesamt-FZD 9-Immunreaktivität mit der Astrozytom- WHO-Klassifizierung und der Astrozytomproliferationsaktivität analysiert. Die FZD 9-Farbintensität korrelierte positiv mit der Astrozytom- WHO-Klassifizierung mit statistischer Differenz (Fig. 4C, p = 0,005, r = 0,98; „staining intensity" & Farbintensität). Eines des Hauptcharakteristiken von Neoplasmen ist ein hohes Niveau von Zellproliferation. Bei Ki67 handelt es sich um das am häufigsten verwendete Antigen, um mittels Immunfärbung die Zellproliferation zu evaluieren. Ki67 ist ein Kernprotein, das in allen nicht-GO-Phasen des Zellzyklus vorhanden ist. In den vorliegenden Untersuchungen wurde der Ki67-Markie- ungsindex, der prozentuale Anteil von Zellen in einer Gewebefärbung auf Ki67, angewendet, um die Astrozytomproliferation zu untersuchen. In humanen Astrozytomen wurden signifikante Korrelationen zwischen dem Ki67-Markierungsindex und der Intensität der FZD 9- Immunfärbung festgestellt (Fig. 4D; p<0,0001, r = 0,69; „labelling index" Ä Markierungsindex).
3.3.3 Expression von FZD 9 in Medulloblastomen, Primitiven Neuroectoder- malen Tumoren (PNETs) und Medullomyoblastomen
Die FZD 9-Expression in dem Endothelium vom Tumormikrogefäßen und großen Gefäßen wurde in 21 (72,4 %) der 29 untersuchten Hirntumoren beobachtet (Fig. 9C, die Gefäße sind mit Pfeilen markiert). Aus der Evaluierung der zytoplasmatischen Expression unter Verwendung einer semiquantitativen Wertung ergaben sich 5 stark (Wert 3), 15 moderat (Wert 2) und 10 schwach positive Tumoren (Wert 1, Spuren 9D bis G).
In 26 (89,6 %) Gehirntumoren wurde ein diffuses Expressionsmuster über die gesamte Gewebeprobe ohne „hot spots" beobachtet. In vier Tumoren wurde ein ungleiches Verteilungsmuster beobachtet, das eine stärkere FZD 9-Expression in einigen Bereichen mit hoher Zelldichte zeigte (Fig. 9H). Keine Tumorprobe verblieb unmarkiert (Wert 0).
Konsistent mit dessen Funktion als Transmembranprotein wurde die FZD 9-Expression auch an der Zellmembran festgestellt, die häufig nicht von dem kleinen Zytoplasma zu unterscheiden war. Im Vergleich mit dem normalen Gehirn war die FZD 9-Färbeintensität, d.h. das FZD 9-Expressionsmuster, signifikant höher (Fig. 6, p<0,01).
Die Einweganalyse der Varianz der Mittelwerte zwischen den klassischen desmoplastischen und supratentorialen Varianten zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Expression. Die gewerteten Expressionsniveaus waren ebenfalls unabhängig von einem Tumorwiederauftre- ten, dem Alter oder dem Geschlecht des Patienten (p<0,05, Daten nicht gezeigt).
Bei dem MIB-1/Ki67-Index handelt es sich um eine übliche Größe, um die Zeilproliferation in Tumoren zu evaluieren. Als ein Kernprotein ist MIB-1/Ki67 in sämtlichen nicht-GO-Phasen des Zellzyklus vorhanden. Es wurde ein durchschnittlicher Ki67-Index von 93,6 beobachtet, der zwischen 42,7 und 8,8 in den 29 untersuchten Patienten liegt (Tabelle 3). Die Kontrollen aus dem normalen Gehirn zeigten lediglich wenige proliferierende Zellen. Eine vergleichende Analyse der Ki67- und FZD 9- Ergebnisse ergab eine signifikante Korrelation zwischen dem FZD 9- Immunfärbungswert und dem Ki67-Markierungsindex in Medul- loblastomen (Fig. 7, p<0,0001, R=0,61)
Ll Diagnose GeAlter WiederMIB-I (%) FZD 9- schlecht kehr Färbe- intensität c
1* klassisch W 2 28,6 1
2 klassisch W 4 20,4 3
3 klassisch M 5 18,8 1
4 klassisch W 5 19,1 2
5 klassisch M 6 21,6 2
6 klassisch M 7 21,4 2
7 klassisch M 8 22,4 2
8 klassisch M 8 33,2 2
9 klassisch W 9 9,7 2
10 klassisch W 90 8,8 1
11 klassisch M 11 12,2 2
12 klassisch M 12 Ja 32,7 1
13 klassisch M 13 26,3 2
14 klassisch M 15 27,7 2
15 klassisch M 15 20,7 2
16 klassisch W 20 17,5 1 17 klassisch W 20 27,7 3
18 klassisch W 20 20,2 2
19 klassisch W 20 Ja 38,3 3
20 klassisch M 33 Ja 29,6 2
21 klassisch M 37 Ja 28,3 3
22 klassisch M 64 42,7 1
23 klassisch W 39 Ja 11,8 1
24 desmoplastisch M 20 15,1 2
25 desmoplastisch W 20 22,4 1
26 desmoplastisch M 33 Ja 31,0 1
27 Medullo- M 3 40,3 2 myoblastom
28 PNET M 4 31,0 1
29 PNET W 6 9,9 3
Tabelle 3: Ergebnisse für den Wert der FZD 9-Färbeintensität und den MIB-l(Ki67)- Markierungsindex. Die mit einem Stern markierten Tumoren wurden für Echtzeit-PCR ausgesucht. W = weiblich, M = männlich
- Echtzeit-PCR
Um die immunhistochemischen Ergebnisse zu bestätigen, wurde die FZD 9- mRNA-Expression unter Verwendung der Echtzeit-PCR in ausgewählten nati- ven Gewebeproben von Medulloblastomen analysiert (Tabelle 3). Diese Ergebnisse wurden mit Proben aus normalem humanem Gehirn verglichen. Wie in Fig. 8, war die durchschnittliche FZD 9-Expression in klassischen Medulloblastomen 2,lfach höher als in normalen Gehirnen. Zusätzlich wurde die FZD 9-mRNA-Expression in einer bekannten Medulloblastomzelllinie, in DAOY-Zellen, analysiert. In den DAOY-Zellen, die unter normalen Bedingungen kultiviert wurden, war die relative FZD 9-mRNA-Expression im Vergleich zu dem internen Referenzstandard bis zu siebenfach erhöht.
3.5 Expression von FZD 9 in Schwannomen, Hämangioblastomen, Meningeomen, Neurofibromatomen, Prostatakarzinomen und Mammakarzinomen
Bei den genannten Tumoren konnte durchweg eine signifikant stärkere im- munhistochemische Färbung auf FZD 9 als in Kontrllschnitten mit gesundem Gewebe festgestellt werden. Daraus wird geschlossen, dass auch bei diesen Tumoren FZD 9 deutlich überexprimiert ist.
3.6 Hochregulation der FZD 9-Expression in Cobaltchlorid behandelten HCEC- Zellen
Während der immunhistochemischen Untersuchungen wurde die FZD 9- Expression in Mikrogefäßendothelzellen beobachtet, wobei die Dichte der FZD 9+-Mikrogefäße positiv mit dem Astrozytomgrad und der MVD korrelierte. Die Erfinder haben dadurch erkannt, dass FZD 9 eine Rolle in der Astro- zytomangiogenese spielt. Hypoxie ist ein Hauptinduktor der Angiogenese. Die Erfinder postulieren, dass eine hypoxische Stimulation die FZD 9-Expression in Endothelzellen stimuliert. Um diese Effekte von Hypoxie auf die FZD 9- Expression zu verifizieren, wurden HCEC-Gehirnendothelzellen mit Cobaltch- lorid inkubiert, das bekanntermaßen als Hypoxie-Imitator in Zellkulturen verwendet wird und für das bekannt ist, dass es den hypoxischen Signalweg durch Stabilisierung des hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors lα aktiviert; vgl. Vengellur A., LaPres JJ. „The role of hypoxia inducible factor lalpha in cobalt Chloride induced cell death in mouse embryonic fibroblasts". Toxi- col. Sei. 2004; 82:638-646. Nach der Inkubation wurde die FZD 9-Expression unter Verwendung von Echtzeit-PCR mit Primern gemessen, die spezifisch für FZD 9 waren. Die FZD 9-Expression wurde 15 Stunden nach der Inkubation mit Cobaltchlorid verstärkt (Fig. 5, zweifach höher als bei unbehandelten Zellen; „Relative level of human FZD 9 in RNA expression" £ relativer Spiegel der Expression der humanen FZD 9-mRNA"; „ineubation time/hours" £ Inkubationszeit (Stunden)) und war 24 Stunden nach der Inkubation stark erhöht (Fig. 5: dreifach höher als in unbehandelten Zellen. p<0,.05). Diese Ergebnisse verifizieren die von den Erfindern zuvor an Gewebeschnitten gewonnenen Erkenntnisse, dass FZD 9 ein wichtiger Faktor der (Tumor-)Angiogenese ist.
3. Fazit
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass über FZD 9 verschiedenste Tumoren identifiziert und ggf. behandelt werden können. Sie stellen damit wertvolle diagnostische und therapeutische Verwendungen bzw. Verfahren bereit.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines an Frizzled 9 (FZD 9) bindenden Agens zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung und/oder Identifizierung eines Tumors, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumor/ZNS-Tumor, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Neurotumor/ZNS-Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glioblastomen einschließlich Astrozytomen, Medulloblastomen einschließlich Primitive Neu- roectodermale Tumoren (PNET), Schwannomen, Hämangioblastomen, Meningeomen und Neurofibromatomen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Agens ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper oder ein solches Antikörperfragment verwendet wird, das die Bindeeigenschaften des Antikörpers aufweist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein solcher monoklonaler Antikörper verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Antikörper oder dem Antikörperfragment um einen humanisierten Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment handelt.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment an einen detektierbaren Marker oder an einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.
7. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Wirkstoff ein Anti-Tumor- Wirkstoff ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung und/oder Identifizierung eines Tumors, mit den Schritten:
(1) Bereitstellung eines an FZD 9 bindenden Agens, und
(2) Formulierung des Agens in einen diagnostisch und/oder pharmazeutisch akzeptablen Träger mit ggf. weiteren Zusätzen, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumor/ZNS-Tumor, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
9. Verfahren zur Identifizierung von Tumoren bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(1) Bereitstellen einer von dem zu untersuchenden Lebewesen stammenden biologischen Probe;
(2) Feststellung des Expressionsniveaus von FZD 9 in der biologischen Probe;
(3) Vergleich des in Schritt (2) festgestellten Expressionsniveaus von FZD 9 mit dem Expressionsniveau von FZD 9 in einer biologischen Probe von einem gesunden Lebewesen, und
(4) Identifizierung eines Tumors, wenn in Schritt (3) festgestellt wird, dass das Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des zu untersuchenden Lebewesens signifikant höher ist, als das Expressionsniveau von FZD 9 in der biologischen Probe des gesunden Lebewesens.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumoren Neurotumoren/ZNS-Tumoren sind, und dass die biologischen Proben neuronales Gewebe aufweisen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Neurotumo- ren/ZNS-Tumoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Glioblasto- men einschließlich Astrozytomen, Medulloblastomen einschließlich Primitive Neuroectodermale Tumoren (PNET), Schwannomen, Hämangioblastomen, Meningeomen und Neurofibromatomen.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Prostatakarzinomen und Mammakarzinomen; und dass die biologischen Proben ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Prostatagewebe und Mammagewebe.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsniveau auf der Ebene der für FZD 9-kodierenden mRNA festgestellt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsniveau auf der Ebene des FZD 9-Proteins festgestellt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Feststellung des Expressionsniveaus ein an FZD 9-bindender polyklonaler oder monoklonaler Antikörper oder ein solches Antikörperfragment hiervon verwendet wird, das die Bindeeigenschaften des Antikörpers aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper der monoklonale Antikörper verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag am 15. Juli 2004 bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an einen detektierbaren Marker gekoppelt ist.
18. Verfahren zur Identifizierung von Tumoren bei einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(1) Verabreichen eines Mittels, das ein an FZD 9 bindenden Agens aufweist, das einen detektierbaren Marker aufweist, in das Lebewesen, und
(2) Darstellung der Anreicherung des Agens in dem Lebewesen mittels geeigneter Verfahren,
wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumo- ren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der detektierbare Marker ein radioaktiver Marker ist und das Verfahren in Schritt (2) 3D- Radiographie ist.
20. Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor aufweist, mit den Schritten:
(1) Verabreichen eines Mittels, das ein an FZD 9-bindendes Agens enthält, in das Lebewesen, und
(2) ggf. mehrfaches Wiederholen des Schrittes (1), wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neurotumo- ren/ZNS-Tumoren, Prostatakarzinom und Mammakarzinom.
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