DE102005035568A1

DE102005035568A1 - Frizzled 9 als Biomarker für Substrukturen des humanen Gehirns

Info

Publication number: DE102005035568A1
Application number: DE102005035568A
Authority: DE
Inventors: Hermann Prof. Schlüsener; Hans-Jörg BÜHRING; Brigitte Hojak; Ingrid Dr. Albert
Original assignee: M Phasys GmbH
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2005-07-25
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2007-02-01
Also published as: US20080267955A1; EP1906999A1; WO2007012449A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Frizzled 9 (FZD 9) zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Frizzled 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns, wie neoplastischen Veränderungen des Gehirns oder der Angiogenese.

Der Nachweis der gewebetypischen Expression eines sog. Biomarkers oder Markerproteins ermöglicht es einem Histologen bestimmte Gewebe oder Organe eines Organismus zu identifizieren. Darüber hinaus lässt ein anormales Expressionsmuster eines Biomarkers häufig Rückschlüsse auf eine pathologische Veränderung des betroffenen Gewebes oder Organs oder aber auf eine Erkrankung des gesamten Organismus zu. So kann bspw. aufgrund der Überexpression eines proliferationsaktivierenden Faktors, z.B. bestimmter cyclinabhängiger Kinasen, auf eine neoplastische Transformation der davon betroffenen Zellen geschlossen werden. Gleiches gilt für die Unterexpression oder den vollständigen Ausfall der Synthese von Tumorsupressorproteinen, wie beispielsweise dem p53-Protein.

Eine umfassende Kenntnis über solche Biomarker und deren Expressionsmuster ermöglicht deshalb nicht nur die Entwicklung von Diagnoseverfahren, sondern auch von zellulär zielgerichteten Diagnostika oder Therapeutika.

Die Zuordnung definierter Biomarker zu bestimmten Geweben ermöglicht aber auch ein besseres Verständnis über die Regulation von physiologischen Prozessen. So deutet beispielsweise die Expression eines Schlüsselproteins der Signaltransduktion in proliferierendem Endothel auf eine Rolle des Letzteren in der Regulation der Angiogenese hin.

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Biomarker zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns bereitzustellen. Insbesondere soll das Expressionsmuster eines solchen Biomarkers für Gewebe des humanen Gehirns und ggf. Informationen über eine pathologische Relevanz des Biomarkers bereitgestellt werden.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Frizzled 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns gelöst.

Die Eignung von Frizzled 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns war deshalb so überraschend, da Frizzled-Proteine allgemein im Stand der Technik bislang in anderem Zusammenhang beschrieben werden.

Die Proteine der Frizzled (FZD) Familie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die sieben Transmembranabschnitte aufweisen. Die FZD-Proteine werden durch sog. Wnt-Faktoren aktiviert, die eine Familie von extrazellulär sekretierten Signalmolekülen bilden. Die N-terminale extrazelluläre cysteinreiche Domäne von FZD wurde dabei als Wnt-Bindedomäne identifiziert.

Wnt/FZD-Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung von Metazoen. Sie regulieren verschiedenste Entwicklungsprozesse, wie die Spezifizierung, Proliferation, Migration und Polarität der Zelle. Gepaart mit den „low-density lipoprotein like"-Rezeptoren 5 und 6 vermitteln FZD-Proteine zumindest drei Wnt/FZD-Signalwege. In einen dieser Signalwege ist das Protein β-Catenin involviert. Dieser sog. β-Catenin-Signalweg induziert die Regulation der Transkription verschiedener Zielgene, einschließlich c-Myc, Cyclin D1, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Immunglobulintranskriptionsfaktor 2 (ITF-2). Der die planare Zellpolarität regulierende Signalweg wird durch Wnt-Bindung via GTPase und Aktivierung der c-Junaminoterminalen Kinase (JNK) induziert, was zur Steuerung der morphogenetischen Zellbewegung führt. Der Ca²⁺-Signalweg aktiviert die Phospholipase Cβ und erhöht den intrazellulären Ca²⁺-Spiegel, was in der Aktivierung der Proteinkinase C, der Ca²⁺-calmodulinabhängigen Proteinkinase II und von Calcineurin resultiert, wodurch das zelluläre Schicksal und den Adhäsionspro zess beeinflusst wird. Eine Übersicht über die Wnt/FZD-Signalwege findet sich in Huang HC, Klein PS, „The Frizzled family: receptors for multiple signal transduction pathways", Genome Biol. 2004; 5:234-241 und in der 1.

Das humane FZD 9-Gen, ursprünglich als FZD 3 bezeichnet, liegt in der genetisch definierten 1,4 Mb-Region auf dem Chromosom 7q11.23. Das humane FZD 9-Protein besteht aus 591 Aminosäuren.

Kürzlich veröffentlichte Experimente, in denen Mäuse mit einer FZD 9-Knock-Out-Mutation hergestellt wurden, deuten auf eine Rolle von FZD 9 im blutbildenden System hin; vgl. Ranheim EA et al., „Frizzled 9 knock-out mice have abnormal B-cell development", Blood. 2005; 105:2487-2494.

Wang et al. beschreiben in "A novel human homologue of the Drosophila frizzled wnt receptor gene binds wingless protein and is in the Williams syndrome deletion at 7q11.23", Hum. Mol. Genet. 1997; 6:465-472, hingegen, dass FZD 9 in einer Vielzahl von verschiedensten humanen Geweben exprimiert wird, wie beispielsweise im Gehirn, aber auch im Skelettmuskel, in den Nieren, den Augen und den Hoden.

Ferner beschreiben Zhao C und Pleasure J, „Frizzled-9 promoter drives expression of transgenes in the medial wall of the cortex and its chief derivative the hippocampus", Genesis 2004; 40:32-39, die weit über das Gehirn verbreitete Expression von FZD 9, bspw. in der medialen Wand des Cortex, dem Telencephalon, dem Hippocampus und weiteren Bereichen des Mausgehirns.

In der nicht-veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10 204 059 620 werden Daten präsentiert, nach denen FZD 9 von verschiedensten unterschiedlichen Zelltypen exprimiert wird, wie bspw. Leukämiezellen, Retinoblastomzellen oder embryonalen Karzinomzellen.

Es wurde deshalb bislang angenommen, dass es sich bei FZD 9 um ein ubiquitäres Protein handelt, das als Biomarker, und erst recht als ein solcher zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen von Organen gänzlich ungeeignet ist.

Vor diesem Hintergrund war insbesondere nicht zu erwarten, dass FZD 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns geeignet ist.

Substrukturen des humanen Gehirns bezeichnen erfindungsgemäß mehr oder weniger abgrenzbare Regionen oder Bereiche des Encephalons ggf. mit organerhaltenden Funktionen, bspw. Blutgefäße oder mit der Angiogenese assoziierte Gewebebereiche, wie Mikrogefäße, aber auch veränderte/transformierte Zellen, entzündliche Läsionen und degenerative Veränderungen sowie differenzierte Zellen oder bestimmte Zelltypen, Zellverbände, Gefäßstrukturen, etc. des humanen Gehirns.

Erfindungsgemäß erfolgt die Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung der Substrukturen des humanen Gehirns durch bzw. über die Verwendung von FZD 9. Dazu kann erfindungsgemäß sowohl das FZD 9-Protein, ein FZD 9-Teilprotein, ein FZD 9-abgeleitetes Peptid oder auch ein antigenes Epitop des FZD 9-Proteins verwendet werden, solange dies von einem gegen FZD 9- gerichteten Antikörper, Aptamer etc. erkannt wird. Die Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns kann aber auch über die Verwendung des FZD 9-Genes, eines Teils des Letzteren, bspw. eines oder mehrerer Exone des FZD 9-Gens, der FZD 9-mRNA sowie Teilen hiervon erfolgen. Auch können die Substrukturen des humanen Gehirns durch indirekte Verwendung von FZD 9 identifiziert und/oder therapeutisch behandelt werden. So können nämlich bspw. mit FZD-9 wechselwirkende Faktoren, wie das Wnt-Protein oder andere Faktoren der Wnt-Signalkette (Dsh, Frodo, β-Arr1, PLC, PKC, JNK etc.; vgl. 1) verwendet werden, um die Substrukturen des humanen Gehirns zu identifizieren und/oder therapeutisch zu behandeln.

Unter der Identifizierung wird erfindungsgemäß der Nachweis oder die Detektion der Substrukturen verstanden. Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie immunologischer, histologischer, bildgebender oder mikroskopischer Verfahren. Unter der therapeutischen Behandlung wird erfindungsgemäß die gezielte Einwirkung auf die Substrukturen verstanden, beispielsweise über die Verabreichung eines therapeutischen Wirkstoffes in oder in die Nähe der Substrukturen bzw. in das humane Gehirn.

Die Erfinder haben erstmals erkannt, dass es sich bei FZD 9 um einen Biomarker zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns handelt.

Vor diesem Hintergrund ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Isolierung von Substrukturen des humanen Gehirns in einer bio logischen Probe, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen der biologischen Probe; (2) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Agens, das selektiv und/oder spezifisch an FZD 9 bindet; (3) Feststellung, ob eine selektive/spezifische Bindung des Agens an die biologische Probe stattgefunden hat, und (4) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung von Substrukturen des humanen Gehirns, oder/und (5) Isolierung der Substrukturen des humanen Gehirns bei einer positiven Feststellung in Schritt (3).

Auch mit diesem Gegenstand wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe vollkommen gelöst.

Unter einem solchen Agens werden erfindungsgemäß jegliche Mittel verstanden, die mit FZD 9 direkt oder aber indirekt über wiederum mit FZD 9 wechselwirkenden Faktoren, wie dem Wnt-Protein etc. (s.o. und in 1), selektiv bzw. spezifisch wechselwirken können. Unter ein solches Agens fallen im Sinne der Erfindung deshalb Bindeproteine, wie mono- oder polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Lectine oder sonstige Bindeproteine. Unter ein solches Agens fallen erfindungsgemäß aber auch Nukleinsäuremoleküle, die direkt oder indirekt und selektiv bzw. spezifisch an FZD 9 oder die genannten Faktoren binden können, wie beispielsweise Aptamere.

Das untersuchte biologische Material kann dabei Gewebe oder Zellen aus humanem Gehirn aufweisen. Über die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dann auf vorteilhafte, einfache und schnelle Art und Weise feststellbar, ob die oben definierten Substrukturen vorhanden sind, bspw. ob eine krankhafte Veränderung wie ein Gehirntumor vorliegt. Die Substrukturen können, sofern gewünscht, auch isoliert werden. Das biologische Material kann aber auch aus nicht näher bekanntem Gewebe oder Zellen, Zellverbänden, Substrukturen etc. bestehen, so dass über die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens feststellbar ist, ob das biologische Material überhaupt humanens Gehirn bzw. entsprechende Substrukturen des Letzteren aufweisen kann.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die Substrukturen proliferierende Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, höchst vorzugsweise Astrozytomzellen aufweisen.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass proliferierende Zellen, d.h. solche, die durch mitotische Teilungen Nachkommenzellen produzieren und dadurch zur Gewebsvermehrung beitragen, verstärkt FZD 9 exprimieren. Insbesondere in Tumorzellen des humanen Gehirns, d.h. neoplastisch transformierten Zellen, konnte eine verstärkte Expression von FZD 9 festgestellt werden. Die Erfinder haben ferner überraschenderweise festgestellt, dass über die erfindungsgemäße Verwendung von FZD 9 humane Astrozytome identifiziert und/oder therapeutisch behandelt werden können. Bei einem Astrozytom handelt es sich um einen Tumor des Gehirns, der seinen Ursprung in den zu den Gliazellen gehörenden Astrozyten hat. Die malignen Formen der Astrozytome werden je nach Schweregrad gemäß der WHO-Klassifizierung in die Klassen I-IV eingeordnet. Die Erfinder konnten sogar nachweisen, dass die FZD 9-Expression signifikant positiv mit der WHO-Klassifizierung der Astrozytome korreliert. Je stärker die Expression von FZD 9 in dem Hirngewebe war, desto maligner war das untersuchte Astrozytom. Über die erfindungsgemäße Verwendung und das Verfahren lässt sich deshalb nicht nur ein Tumor in einem humanen Gehirn identifizieren und/oder therapeutisch behandeln, sondern es ist auch auf besonders vorteilhafte Art und Weise eine Aussage über die Schwere der Malignität des Tumors möglich.

Dabei ist es bevorzugt, wenn über die Substrukturen die Angiogenese, vorzugsweise die Tumorangiogenese, nachgewiesen und/oder therapeutisch behandelt wird.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass über die erfindungsgemäße Verwendung und das Verfahren die Angiogenese nachgewiesen und therapeutisch beeinflusst werden kann. So konnten sie zeigen, dass in mit der Angiogenese assoziierten Geweben, bspw. Endothelzellen von Mikrogefäßen gesunder oder tumoröser Gewebe, verstärkt FZD 9 exprimiert wird. Die Erfinder haben diese Erkenntnisse anhand von Experimenten verifiziert, bei denen Endothelzellen aus dem humanen Gehirn mit Cobaltchlorid inkubiert wurden. Dadurch wurde in den Zellen Hypoxie simuliert. Hypoxie ist ein Hauptauslöser der Angiogenese. Derart behandelte Endothelzellen zeigten ebenfalls eine signifikant erhöhte FZD 9-Expression. Erfindungsgemäß kann aufgrund dieser Erkenntnis auf vorteilhafte Art und Weise die Tumorangiogenese und dadurch das Tumorwachstum therapeutisch gehemmt werden. Ferner kann in nicht-tumorösen Geweben die Angiogenese gezielt stimuliert und so bspw. Durchblutungsstörungen entgegengewirkt werden.

In der erfindungsgemäßen Verwendung und dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es besonders bevorzugt, wenn die Identifizierung und/oder therapeutische Behandlung der Substrukturen mittels eines polyklonalen oder eines monoklonalen Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes erfolgt, wobei besonders bevorzugt ein solcher Antikörper verwendet wird, der von der Hybridomzelllinie W3C4E11 produziert wird, die nach dem Budapester Vertrag bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegt wurde.

Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass ein Agens Verwendung findet, das hochspezifisch an FZD 9 bindet und die Identifizierung der genannten Substrukturen des humanen Gehirns dann bspw. durch wohl etablierte immunologische Techniken erfolgt. Die Erfinder haben nämlich erstmals erkannt, dass der aus der nicht-veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10 204 050 620 grundsätzlich bekannte monoklonale α-FZD 9-Antikörper als ein solches Agens geeignet ist. Dies war insbesondere deshalb nicht zu erwarten, da in dieser Patentanmeldung Daten präsentiert werden, nach denen dieser Antikörper an unterschiedlichste Zelltypen bindet, wie bspw. an Leukämiezellen aber auch an andere immortalisierte Zelltypen.

Die Erfinder haben ferner festgestellt, dass der von den hinterlegten Hybridomzellen W3C4E11 produzierte monoklonale Antikörper nicht nur an natives Gewebe des humanen Gehirns, sondern unerwarteterweise auch an gefrorenes, d.h. sogenanntes Kryogewebe, binden kann. Dieser monoklonale Antikörper ist überraschenderweise ferner nicht nur zur Identifizierung der genannten Substrukturen geeignet, sondern kann auch einen direkten Effekt auf die Substrukturen, bspw. auf die Astrozytome, ausüben und weist deshalb auch therapeutisches Potential auf.

Zur Identifizierung der Substrukturen ist erfindungsgemäß auch ein polyklonaler Antikörper gegen humanes FZD 9 geeignet. Beispielhaft wird der polyklonale α-FZD 9-Antikörper der Firma Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland (Katalognummer SP4153P) erwähnt, der in der Immunfärbung vorzugsweise in einer Verdünnung von 1:500 eingesetzt wird.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper handelt.

Bei humanisierten Antikörpern, auch als rekombinante Antikörper oder im englischen als „CDR-grafted antibodies" bezeichnet, handelt es sich um solche Antikörper, bei denen die Sequenzen für die hypervariablen Regionen (CDR) in menschlichen Immunglobulin-Genen gegen die CDR von Immunglobulin-Genen anderer Organismen, bspw. der Maus, ausgetauscht sind. Durch diese Humanisierung wird die Antigenspezifität eines Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers der Maus auf einen humanen Antikörper übertragen, wodurch – im Empfängerorganismus – eine vollständige Toleranz gegenüber diesen Molekülen erzeugt und eine sogenannte HAMA-Antwort (Humane-Anti-Maus-Antikörper-Antwort), durch die ein reiner Mausantikörper im Menschen durch die Immunantwort neutralisiert würde, auch nach mehrmaliger Applikation vermieden wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung der Substrukturen statt eines gesamten Antikörpers auch ein Fragment desselben verwendet werden. Unter einem solchen Fragment wird dabei jeder Abschnitt des Antikörpers verstanden, der die Antigen- Bindungsfunktion des Antikörpers aufweist. Solche Fragmente sind beispielsweise F_ab, F_(ab')2, F_v und andere Fragmente, wie z.B. CDR ("complementary determining region", hypervariable Region)-Fragmente. Die genannten Fragmente weisen ebenfalls die Bindungsspezifität des Antikörpers auf und können auch beispielsweise mit bekannten Verfahren als rekombinante Proteine hergestellt werden.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, wenn das Agens bzw. der Antikörper oder das Antikörperfragment an einen Marker oder/und einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.

Erfindungsgemäß wird unter einem Marker eine jegliche Verbindung verstanden, mittels der eine Lokalisierung und Identifizierung der Substrukturen des humanen Gehirns in vitro, in vivo oder in situ möglich ist. Hierzu zählen Farbindikatoren, wie Farbstoffe, mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³⁵I, ¹⁴C, ³H, nicht radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Digoxigenin, alkalische Phophatase, Meerrettich-Peroxidase etc. Der Nachweis solch markierter Antikörper erfolgt dann über im Stand der Technik bekannte bildgebende Verfahren, wie Autoradiographie, Blotting-, Hybridisierungs- oder Mikroskopietechniken.

Durch diese Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise die erfindungsgemäße Verwendung und das Verfahren derart weitergebildet, dass ein Nachweis bzw. eine Diagnose von Substrukturen des humanen Gehirns noch zuverlässiger und vereinfacht möglich wird.

Als therapeutischer Wirkstoff kommt ein jeder Wirkstoff in Frage, der in einem Organismus oder einer biologischen Zelle eine spezifische biologische Reaktion induziert. Beispiele für therapeutischen Wirkstoffe sind Arzneimittel oder Toxine, wie Radiotherapeutika, Chemotherapeutika oder Aktivatoren des Komplementsystems oder der Apoptose. Ein solch gekoppelter Antikörper kann auf vorteilhafte Art und Weise den Wirkstoff zielgerichtet beispielsweise in einen Tumor, wie ein Astrozytom, bzw. in dessen blutversorgendes System transportieren und dort die Zerstörung des Tumors oder der pathologischen Blutgefäße induzieren. Auch können über einen solchen Antikörper Psychopharmaka über den Hippocampus in das Limbische System transportiert werden und dort eine zielgerichtete Wirkung von Psychopharmaka vermitteln. Nebenwirkungen von therapeutischen Wirkstoffen, die selektiv im humanen Gehirn wirken sollen, werden so reduziert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels oder zur Behandlung oder Diagnose eines Tumors, vorzugsweise eines Gehirntumors, höchst vorzugsweise eines Astrozytoms, mit den Schritten: (1) Bereitstellung eines gegen FZD 9 gerichteten Agens, vorzugsweise eines Antikörpers, und (2) Formulierung des Agens in einen diagnostischen oder pharmazeutisch akzeptablen Träger mit ggf. weiteren Zusätzen.

Das Agens kann auch gegen das Wnt-Protein oder andere Faktoren der Wnt/FZD-Signalkette (vgl. 1 und weiter oben) und damit indirekt gegen FZD 9 gerichtet sein.

Diagnostisch und pharmazeutisch akzeptable Träger mit gegebenenfalls weiteren Zusätzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden beispielsweise in der Abhandlung von Kibbe A., „Handbook of Pharmaceutical Excipients", Third Edition, American Pharmaceutical Assoc. and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen erfindungsgemäß jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für eine diagnostische oder therapeutische Verwendung des Mittels vorteilhaft ist, worunter Salze, Bindemittel, aber auch weitere Wirkstoffe fallen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor, vorzugsweise einen Gehirntumor, höchst vorzugsweise ein Astrozytom aufweist, mit den Schritten: (1) Verabreichen eines Mittels in das Lebewesen, (2) gegebenenfalls mehrfaches Wiederholen des Schrittes (1), wobei als Mittel ein Agens, das gegen FZD 9 gerichtet ist, vorzugsweise ein Antikörper, höchst vorzugsweise ein solcher Antikörper, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle B3C4E11 produziert wird, verwendet wird. Bei dem Antikörper kann es sich erfindungsgemäß um einen humanisierten Antikörper handeln.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, oder eines entsprechenden Antikörperfragmentes, zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Hippocampusgewebe, vorzugsweise des humanen Gehirns.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass FZD 9 verstärkt im Pes Hippocampi, bzw. den hippocampalen Neuronen des gesunden, insbesondere humanen Gehirns exprimiert wird und dass der hinterlegte monoklonale Antikörper über FZD 9 zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Hippocampusgewebe geeignet ist. Mit dieser Maßnahme wird deshalb eine Verwendung und ein Verfahren bereitgestellt, die eine einfache und zuverlässige Identifizierung, Behandlung sowie ggf. Isolierung von humanem Hippocampusgewebe ermöglichen. Diese Maßnahme hat ferner den Vorteil, dass die Erfinder erstmals Informationen über das Expressionsmuster von FZD 9 im insbesondere humanen adulten Gehirn bereitstellen und damit wichtige Informationen über mögliche Signalmechanismen im Hippocampus offenbaren. Die Erfinder liefern deshalb nicht nur für den Kliniker sondern auch für den Zellbiologen und Grundlagenforscher ein wichtiges Werkzeug zur Identifizierung dieses Bereichs der Großhirnrinde.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein beispielhaften Charakter haben und die Tragweite der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Dabei wird auf die beiliegenden Figuren Bezug genommen, in denen zu sehen ist:

1 Wnt/FZD-Signalweg

2 Herstellung des spezifisch gegen humanes FZD 9 gerichteten und aus den Hybridomzellen W3C4E1 stammenden Antikörpers. A: Diagramm, das schematisch das Plasmid pIRES zeigt, welches das humane FZD 9-Gen und am N-Terminus einen Flag-Tag aufweist. B: FACS-Analyse der Spezifität des aus den Zellen W3C4E11 stammenden Antikörpers. Der aus den Zellen W3C4E11 stammende monoklonale Antikörper (rechte Teilabbildung) und sein unspezifischer IgM-Isotyp (linke Teilabbildung) wurden mit HEK-293 Zellen inkubiert, die mit dem in (A) dargestellten pIRES-Plasmid transfiziert wurden. Nach dem Waschen wurde die zelluläre Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie analysiert.

3 Immunhistochemie für FZD 9 in humanen normalen Gehirnen (A, B) und in humanen Astrozytomen des WHO-Grades II (C), Grad III (D) und Grad IV (E-H). In normalen Gehirnen war FZD 9 hauptsächlich in den Neuronen des Hippocampus lokalisiert (A+B). Die FZD 9-Immunfärbung konnte eindeutig in den Mikrogefäßen und den Tumorzellen der Astrozytome mit dem WHO-Grad II (C), Grad III (D) und Grad IV (E) detektiert werden. In den Mikrogefäßen wurde FZD 9 in den Endothelzellen exprimiert (F). In den Glioblastomen konnten die vielschichtigen Mikrogefäßproliferate ('Glomeroid tufts') (G) und Nekrosen mit Pseudopalisaden ('Pseudopalisading Necrosis') (H), bei denen es sich um histopathologische Kennzeichen von Glioblastomen handelt, stark auf FZD 9 angefärbt werden. Originale Vergrößerungen: x40 (A); x400 (B-E, G); x1000 (F); X200 (H).

4 Statistische Analyse (Pearson's Korrelationskoeffizientenanalyse) der Korrelation zwischen der Immunreaktivität FZD 9 mit der Astrozytomklassifizierung, Mikrogefäßdichte und dem Astrozytom-Ki67-Markierungsindex. Die Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen korrelierte positiv mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung (A) und der Astrozytom-MVD (B) in humanen Astrozytomen. Die gesamte FZD 9-Immunfärbungsintenstität korrelierte stark mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung (C) und dem KI67-Markierungsindex (D) in humanen Astrozytomen.

5 Veränderungen in der FZD 9-mRNA-Expression nach Cobaltchloridbehandlung in HCEC-Zellen. Die Zellen wurden mit Cobaltchlorid (100 μmol) für die angegebenen Zeiträume inkubiert. Die FZD 9-Expression wurde unter Verwendung von Echtzeit-PCR quantifiziert. Die FZD 9-Expression war 15 Stunden nach der Inkubation mit Cobaltchlorid erhöht und 24 Stunden nach der Inkubation deutlich erhöht.

1. Der Wnt/FZD-Signalweg
1 zeigt schematisch den Wnt/FZD-Signalweg entsprechend der Publikation von Huelsken J. und Behrens J., „The Wnt signalling pathway", Journal of Cell Science 2002; 115: 3977-3978. Der Inhalt dieser Publikation ist durch in Bezugnahme ausdrücklicher Bestandteil der vorliegenden Anmeldungsunterlagen. Dargestellt sind die drei Zweige des Wnt/FZD-Signalweges, nämlich der β-Catenin-Signalweg („β-catenin pathway"; mittlerer Zweig), der Ca²⁺-Signalweg („Ca²⁺ pathway"; rechter Zweig) und der die planare Zellpolarität regulierende Signalweg („planar cell polarity"; linker Zweig). Neben dem oben in der schematischen Zellmembran dargestellte Frizzled Rezeptor können indirekt die einzelnen Faktoren der drei Signalwege, die schematisch als kreis- oder ovalförmige Symbole dargestellt werden, bspw. Dsh, Frodo, β-Arr1, PLC, PKC, JNK etc., sowie das Wnt-Protein zur Identifizierung der Substrukturen des humanen Gehirns dienen.
2. Material und Methoden
2.1 Patienten
Es wurden 25 Erwachsene untersucht, einschließlich zehn Kontrollen mit normalem Gehirn, 7 WHO-Grad-II-Astrozytome, 9 WHO-Grad-III-Astrozytome, und 9 WHO-Grad-IV-Astrozytome. Details dieser Pathologien sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Die histologische Diagnose und Klassifizierung wurden durch zwei erfahrene Neuropathologen gemäß des WHO-Klassifizierungssystems durchgeführt. Die Gewebebeschaffung erfolgte gemäß der ethischen Richtlinien der Universität Tübingen.
2.2 Antikörperherstellung
Der gegen humanes FZD 9 gerichtete spezifische monoklonale Antikörper, der von den Hybridomzellen W3C4E11 hergestellt wird, wurde durch die Immunisierung von vier bis acht Wo chen alten männlichen Balb/c-Mäusen mit einer FZD 9-exprimierenden Retinoblastoma-Zelllinie WERI-RB-1 (bezogen von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Deutschland) erhalten, die in RPMI1640-Medium versetzt mit 10%-igem fötalem Kälberserum kultiviert wurde. Den Mäusen wurden in 2-Wochen-Intervallen fünfmal intraperitoneal 10⁷-Zellen injiziert. Vier Tage nach dem letzten Boost wurde die Milz zur Fusion mit der SP2-0-Myelomzelllinie entfernt. Die resultierenden Hybridome wurden in RPMI1640-Medium (GIBCO) enthaltend 10% fötales Kälberserum und Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HT; Sigma-Aldrich, München, Deutschland) gehalten. Kulturüberstände, die positiv für WERI-RB-1-Zellen waren, wurden auf peripherem Blut (B) und Knochenmarks(BM)-Zellen gescreent. Hybridomzellen, die Antikörper sekretierten, die für diese Zellen nicht-reaktiv waren, wurden selektiert, zweimal durch limitierte Verdünnung kloniert und in Gegenwart von Hypoxanthin-Thymidin (HT; Sigma) kultiviert. Der Klon W3C4E11 erfüllte diese Kriterien und wurde selektiert. Der InM-Isotyp des resultierenden monoklonalen Antikörpers der Zelllinie W3C4E11 wurde durch ELISA bestimmt (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). Die Spezifität von W3C4E11-Antikörpern für humanes FZD 9 wurde durch die selektive Erkennung von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK-293) bestätigt, die mit dem gesamten humanen FZD 9-Gen transfiziert wurden. W3C4E11 erkennt nicht-transfizierte HEK-293 Zellen oder HEK-293 Zellen, die mit FZD 1, 2, 4, 5, 7 oder 10 transformiert wurden.
Die W3C4E11-Zelllinie wurde am 15. Juli 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Nummer ACC 2668, hinterlegt.
2.3 Immunhistochemie
Es wurden Gehirnproben chirurgisch entfernt, unmittelbar in gepuffertem Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Zur Immunfärbung wurden repräsentative serielle Schnitte von 3 μm angefertigt. Nach Deparafinisierung wurden die Schnitte in einem 600 Watt Mikrowellenherd für 15 min. in Citratpuffer (2,1 g Natriumzitrat pro Liter, pH 6) gekocht. Die endogene Peroxidase wurde mit 1% H₂O₂ in Methanol für 15 min. inhibiert. Die Schnitte wurden in 10%igem normalem Schweineserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung der Immunglobuline zu blockieren, und wurden dann mit dem primären Antikörper inkubiert. Zur FZD 9-Färbung wurde der oben beschriebene aus W3C4E11 stammende monoklonale Antikörper verwendet. Ferner wurde ein weiterer polyklonaler Kaninchenantikörper gegen humanes FZD 9 verwendet (Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland; 1:500 verdünnt). Mikrogefäßendothelzellen wurden mit Anti-CD34-monoklonalem Antikörper (1:50 verdünnt, Biomedicals, Augst, Schweiz) gefärbt und Ki67 wurden mit MIB-1 gefärbt, um die Zellproliferation zu zeigen (1:100, DAKO, Hamburg, Deutschland).
Die Antikörperbindung an die Gewebeschnitte wurde mit einem biotinylierten Schwein-Anti-Kaninchen-(DAKO, Hamburg, Deutschland) oder Kaninchen-Anti-Maus-IgG-F(ab)₂-Antikörperfragment visualisiert. Anschließend wurden die Schnitte mit einem Streptavidin-Avidin-Biotin-Komplex (DAKO, Hamburg, Deutschland) inkubiert, gefolgt von einer Entwicklung mit 3,3'-Diaminobenzidin(DAB) als Chromogen(Fluka, Neu-Ulm, Deutschland). Schließlich wurden die Schnitte mit Hematoxylin gegengefärbt.
Nach der Immunfärbung wurde das Expressionsniveau von FZD 9 durch zwei Verfahren quantifiziert. Die gesamte Immunreaktivität von FZD 9 einer jeden Probe wurde unter Verwendung einer semi-quantitativen Bewertung graduiert, die von "Sinicrope FA et al., „Bc1-2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis". Cancer Res. 1995; 55:237-241, eingeführt wurde. Kurz gesagt, es wurden vier Kategorien wie folgt definiert: 0, vollständig negativ; 1, schwach positiv; 2, moderat positiv; und 3, stark positiv. Die Dichte der FZD 9⁺-Mikrogefäße wurde unter dem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Verfahrens untersucht, das durch Weidner N. et al., "Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma". N. Engl. J. Med. 1991; 324:1-8, eingeführt wurde. Kurz gesagt, der gesamte Schnitt wurde bei 40-facher Vergrößerung auf die Bereiche der höchsten FZD 9⁺-vaskulären Dichte (hot spot) gescannt, gefolgt durch eine Zählung der Anzahl von FZD 9⁺-Gefäßen innerhalb eines einzigen Feldes bei 200-facher Vergrößerung (high power field, HPF) in jedem hot spot. Drei hot spots wurden gezählt und der Mittelwert berechnet. Die Endergebnisse werden als arithmetische Mittel der FZD 9⁺-positiven Gefäße pro HPF mit Standardfehler der Mittelwerte (SEM) ausgedrückt. Die Intensität der FZD 9-Expression und die Dichte der FZD 9⁺-Mikrogefäße wurden sorgfältig durch unabhängige Personen ermittelt.
Mikrogefäßdichte(MVD)-Zählungen wurden durch Ermittlung der mittleren Anzahl der Hohllumengefäße, angefärbt durch CD34 in 3 HPF, mit dem gleichen Verfahren bestimmt, das zur Zählung der Dichte der FZD 9⁺-Mikrogefäße angewandt wurde. Die Dichte der Ki67⁺-Mikrogefäße wurde mit dem gleichen Verfahren bestimmt, das zur Zählung der Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen verwendet wurde.
2.4 Zellkultur und Behandlung
Humane cerebromikrovaskulare Endothelzellen (HCEC), die freundlicherweise von Prof. A. Muruganandam bereitgestellt wurden, sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. Muruganandam A. et al., „Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier". FASEB J. 1997; 11:1187-1197. Diese HCEC-Zellen wurden in RPMI-1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) mit Penicillin und Streptomycin bei 100 U/ml (Gibco Grand Island, NY) bei 37°C in 5% Co₂ kultiviert. In den Cobaltchloridexperimenten, wurden HCEC-Zellen, die etwa 80% Konfluenz erreicht hatten, an CoCl₂ (100 μmol) für die angegebenen Zeiträume exponiert; vgl. Cho J, et al., „Cobalt chloride-induced estrogen receptor alpha down-regulation involves hypoxia-inducible factor-lalpha in MCF-7 human breast cancer cells". Mol. Endocrinol. 2005; 19:1191-1199. Das Medium wurde 24 Stunden vor der Exposition an CoCl₂ erneuert. Für jeden Zeitpunkt wurden parallel Proben in dreifacher Ausfertigung präpariert.
2.5 Echtzeit-Reverse-Transkriptions-PCR
Gesamt RNA aus kultivierten Zellen wurde unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland), gemäß der Angaben des Herstellers präpariert. 2 μg RNA wurde in cDNA unter Verwendung von randomisierten Primern revers transkribiert. Anschließend wurde die mRNA-Expression von FZD 9 durch HCEC-Zellen unter Verwendung einer Echtzeit-PCR quantifiziert, bei der SYBR-Grün als Detektionsreagenz und 18 S-ribosomale RNA als Zwischenreferenzstandard verwendet wurde. Nachfolgende Primer wurden verwendet: Humane 18S ribosomale RNA (Sinn, CGGCTACCACATCCAAGGRA; Gegensinn, GCTGGAATTACCGCGGCT), und humanes FZD 9 (Sinn, GCAGTAGTTTCCTCCTGACCG; Gegensinn, TCTCTGTGTTGGTGCCGCC). Die PCR wurde in einem Echzeit-iCycler (Biorad, München, Deutschland) durchgeführt. Sämtliche Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 15 μl durchgeführt, das zweimal SYBR^®-Grün-PCR-Mastermix und optimierte Primerkonzentrationen aufwies. Das Cycling wurde bei 95°C für 15 Minuten gestartet, anschließend folgten 35 Zyklen von: 94°C für 45 sek., 52°C für 30 sek. und 72°C für 45 sek. mit einer Fluoreszenzdetektion bei 72°C. Die Schmelzkurvenanalyse wurde zwischen 50 und 100°C mit 0,5°C Intervallen durchgeführt. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung gemessen und die arithmetischen Mittel wurden berechnet.
2.6 Evaluierung und Statistik
Die Anzahl von FZD 9⁺-Mikrogefäßen/HPF, MVD und Ki67⁺-Mikrogefäßen/HPF sind als arithmetische Mittel mit Standardfehlern der Mittelwerte (SEM) angegeben. Die statistische Analyse der quantitativen FZD 9-Expression wurde durch Einweg-ANOVA gefolgt durch Dunnett's Multiple Comparison Tests (Grap Pad Prism 4.0 Software) durchgeführt. Die Korrekturanalyse wurde durch Kontrolle der Pearson's Korrelationskoeffizienz evaluiert. Für sämtliche statistischen Analysen wurden signifikante Level auf p<0,05 gesetzt.
3. Ergebnisse
3.1 Herstellung des gegen humanes FZD 9 gerichteten aus W3C4E11-Zellen stammenden spezifischen monoklonalen Antikörpers
Um die humane FZD 9-Proteinexpression zu analysieren, wurde ein monoklonaler Antikörper gegen membrangebundenes FZD 9 durch Immunisierung einer Maus mit der FZD 9-exprimierenden Zelllinie WERI-RB-1 gewonnen. Um potentielle FZD 9-reaktive Antikörper zu selektieren, wurde eine transfizierte Zelle hergestellt. Dazu wurden HEK-293 Zellen mit einem pIRES-Plasmid transfiziert, der das humane FZD 9-Gen und ein Flag-Tag an dem N-Terminus enthielt (2A „start of transcription" – Transkriptionsstart, „signal sequence" = Signalsequenz). Nach drei Runden der Selektion von Zellen mit einem Zellsorter, die mit einem Anti-Flag-Antikörper anfärbbar waren, exprimierten die meisten Zellen stabil den Flag-Tag auf der Zelloberfläche. 2B zeigt, dass der W3C4E11-Antikörper mit der transfizierten Zelle reagiert, während Wildtyp-HEK-293 Zellen nicht-reaktiv waren (nicht gezeigt).
3.2 Expression von FZD 9 in neuropathologisch normalen adulten humanen Gehirnen
Obwohl beschrieben wurde, dass FZD 9 im Gehirn exprimiert wird, ist dessen Expressionsmuster im adulten humanen Gehirn bis heute unbekannt. Es wurden deshalb an zehn Schnitten von Paraffin eingebetteten adulten normalen humanen Gehirnen immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt, um das Expressionsniveau und die Lokalisierung von FZD 9 zu bestimmen. In den meisten Schnitten war die FZD 9-Expression niedrig (Tabelle 1) und es wurden nur gelegentlich einige FZD 9⁺-Neuronen oder -Glia beobachtet. Allerdings wurde in Schnitten, die Hippocampusgewebe enthielten, eine starke FZD 9-Expression in den hippocampalen Neuronen beobachtet (3A und B).
In einigen Fällen wurde FZD 9 auf den Endothelzellen der großen Gefäße exprimiert, die in der Leptomeninx außerhalb des Hirnparenchyms lokalisiert sind. In normalen Gehirnen wurden wenige FZD 9⁺-Mikrogefäße beobachtet (Tabelle 1).
Tabelle 1: Klinische und histologische Daten aus Kontrollpatienten mit normalem Gehirn

^a: Die Farbintensität wurde in vier Kategorien unterteilt: 0, vollständig negativ; 1 schwach ositiv; 2 moderat ositiv; und 3 stark ositiv; ^b: HPF = high power field; ^c: MVD = Mikrogefäßdichte; ^d: F = weiblich; ^e: M = männlich.

3.3 Expression von FZD 9 in humanen Astrozytomen
Ferner wurde unter Verwendung der gleichen immunhistochemischen Verfahren die FZD 9-Expression in humanen Astrozytomen mit WHO-Grad II bis IV untersucht. Die FZD 9-Expression wurde sowohl in Mikrogefäß-Endothelzellen als auch in neoplastischen Zellen beobachtet (3C-E).
Die Expression von FZD 9 in Mikrogefäß-Endothelzellen wurde in humanen Astrozytomen beobachtet (3C-F). Die Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen war hoch in malignen Astrozytomen (40,1 ± 21,3 für WHO-Grad III und 91,37 ± 17,79 für WHO-Grad IV) und niedrig in niedergradigen Astrozytomen (2,1 ± 1,0 für WHO-Grad II) (Tabelle 2). Die Dichte der FZD 9⁺-Mikrogefäßen in Glioblastomen war signifikant höher als in WHO-Grad II Astrozytomen (p<0,001) und in normalen Gehirnen (p<0,001) (4A und Tabelle 2; „microvessels" – Mikrogefäße; „Normal brain" – normales Gehirn; „Grade" – Grad; „grading" – Graduierung; „astrocytomas" – Astrozytome). Mehrschichtige Mikrogefäßproliferate ('glomeroid tufts') von proliferierenden Kapillaren sind ein charakteristisches Merkmal der Mikrogefäßstruktur von Glioblastomen. Diese Mikrogefäßproliferate enthalten vaskuläre Kanäle, die aus Schichten von Endothelzellen gebildet sind und durch unvollständige Schichten von Perizyten getrennt werden; vgl. Kleinhues P. et al., „The WHO classification of tumors of the nervous system". J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2002; 61:215-225. Die vielschichtigen Mikrogefäßproliferate zeigten ebenfalls eine starke Expression von FZD 9 (3G).
Die FZD 9-Expression in Tumorzellen wurde bei WHO-Grad-II-Astrozytomen in einem von sieben, in WHO-Grad-III-Astrozytomen in fünf von neun, und in WHO-Grad-IV-Astrozytomen in neun von neun Proben beobachtet, woraus sich schlussfolgern lässt, dass FZD 9 in Tumorzellen maligner Astrozytome wesentlich stärker exprimiert wird, als in solcher von niedergradigen Astrozytomen. Das Gesamtniveau der FZD 9-Immunreaktivität wurde semiquantifiziert. Die FZD 9-Expression war hoch in WHO-Grad-III- (p<0,01, verglichen mit normalen Gehirnen) und WHO-Grad-IV-Astrozytomen (p<0,001, verglichen mit normalen Gehirnen) und niedrig in WHO-Grad-II-Astrozytomen (p>0,05, verglichen mit normalen Gehirnen) (4A und Tabelle 2). FZD 9 wurde in humanen Glioblastomen stark heterogen exprimiert. Ein weiteres histopathologisches Charakteristikum von Glioblastomen ist das Vorhandensein von Nekrosen mit Pseudopalisaden ('pseudopalisading necroses'), d.h. einer zentralen Nekrose mit perinekrotischen Astrozytomzellen, die häufig ein Pseudopalisadenmuster einnehmen; vgl. Kleinhues P. et al., (a.a.O). In den vorliegenden Untersuchungen wurde in den Astrozytomzellen in Nekrosen mit Pseudopalisaden eine starke Expression von FZD 9 beobachtet (3H).
Tabelle 2 Klinische und histopathologische Daten aus Astrozytompatienten

^a: Die Farbintensität wurde in vier Kategorien unterteilt: 0, vollständig negativ; 1, schwach positiv; 2, moderat positiv; und 3, stark positiv; ^b: HPF = high power field; ^c: MVD = Mikrogefäßdichte; ^d: F = weiblich; ^e: M = männlich; ^f: Ast = Astrozytom; ^g: GB = Glioblastom.

3.4 Korrelation zwischen der Immunreaktivität von FZD 9 mit dem Astrozytomgrad, der Mikrogefäßdichte und der Zellproliferation
Da die Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen hoch in malignen Astrozytomen und niedrig in niedergradigen Astrozytomen war, wurde die Korrelation der Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung und der Astrozytom-Mikrogefäßdichte (MVD) als Gradmesser der Angiogenese analysiert. Wie in 3A gezeigt, korreliert die Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen positiv mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung (p = 0,03, r = 0,98). Die Korrelationen zwischen der Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen mit der MVD in Astrozytomen wurde unter Verwendung des Pearson's Korrelationskoeffizienten evaluiert. Die MVD wurde mit einer allgemein verwendeten Methode unter Verwendung der CD34 Immunfärbung gemessen. In humanen Astrozytomen wurde eine enge Korrelation zwischen der Dichte von FZD 9⁺-Mikrogefäßen und der MVD beobachtet (4B; p<0,0001, r = 0,84).
Ferner wurde die Gesamt-FZD 9-Immunreaktivität mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung und der Astrozytomproliferationsaktivität analysiert. Die FZD 9-Farbintensität korrelierte positiv mit der Astrozytom-WHO-Klassifizierung mit statistischer Differenz (4C, p = 0,005, r = 0,98; „staining intensity" – Farbintensität). Eines des Hauptcharakteristiken von Neoplasmen ist ein hohes Niveau von Zellproliferation. Bei Ki67 handelt es sich um das am häufigsten verwendete Antigen, um mittels Immunfärbung die Zellproliferation zu evaluieren. Ki67 ist ein Kernprotein, das in allen nicht-GO-Phasen des Zellzyklus vorhanden ist. In den vorliegenden Untersuchungen wurde der Ki67-Markierungsindex, der prozentuale Anteil von Zellen in einer Gewebefärbung auf Ki67, angewendet, um die Astrozytomproliferation zu untersuchen. In humanen Astrozytomen wurden signifikante Korrelationen zwischen dem Ki67-Markierungsindex und der Intensität der FZD 9-Immunfärbung festgestellt (4D; p<0,0001, r = 0,69; „labelling index" – Markierungsindex).
3.5 Hochregulation der FZD 9-Expression in Cobaltchlorid behandelten HCEC-Zellen
Während der immunhistochemischen Untersuchungen wurde die FZD 9-Expression in Mikrogefäßendothelzellen beobachtet, wobei die Dichte der FZD 9⁺-Mikrogefäße positiv mit dem Astrozytomgrad und der MVD korrelierte. Die Erfinder haben dadurch erkannt, dass FZD 9 eine Rolle in der Astrozytomangiogenese spielt. Hypoxie ist ein Hauptinduktor der Angiogenese. Die Erfinder postulieren, dass eine hypoxische Stimulation die FZD 9-Expression in Endothelzellen stimuliert. Um diese Effekte von Hypoxie auf die FZD 9-Expression zu verifizieren, wurden HCEC-Gehirnendothelzellen mit Cobaltchlorid inkubiert, das bekanntermaßen als Hypoxie-Imitator in Zellkulturen verwendet wird und für das bekannt ist, dass es den hypoxischen Signalweg durch Stabilisierung des hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktors 1α aktiviert; vgl. Vengellur A., LaPres J.J. „The role of hypoxia inducible factor lalpha in cobalt chloride induced cell death in mouse embryonic fibroblasts". Toxicol. Sci. 2004; 82:638-646. Nach der Inkubation wurde die FZD 9-Expression unter Verwendung von Echtzeit-PCR mit Primern gemessen, die spezifisch für FZD 9 waren. Die FZD 9-Expression wurde 15 Stunden nach der Inkubation mit Cobaltchlorid verstärkt (5, zweifach höher als bei unbehandelten Zellen; „Relative level of human FZD 9 in RNA expression" – relativer Spiegel der Expression der humanen FZD 9-mRNA"; „incubation time/hours" – Inkubationszeit (Stunden)) und war 24 Stunden nach der Inkubation stark erhöht (5; dreifach höher als in unbehandelten Zellen, p<0,05). Diese Ergebnisse verifizieren die von den Erfindern zuvor an Gewebeschnitten gewonnenen Erkenntnisse, dass FZD 9 ein wichtiger Faktor der (Tumor-)Angiogenese ist.
3. Fazit
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass über FZD 9 Substrukturen des humanen Gehirns, wie beispielsweise Tumorzellen oder auch die Angiogenese, identifiziert werden können. Sie stellen damit wertvolle diagnostische als auch therapeutische Verwendungen bzw. Verfahren bereit.

Claims

Verwendung von Frizzled 9 (FZD 9) zur Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung von Substrukturen des humanen Gehirns.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrukturen proliferierende Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, höchst vorzugsweise Astrozytomzellen aufweisen.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass über die Identifizierung und/oder therapeutischen Behandlung der Substrukturen die Angiogenese, vorzugsweise die Tumorangiogenese, nachgewiesen und/oder therapeutisch behandelt wird.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung und/oder therapeutische Behandlung mittels eines Antikörpers, vorzugsweise mittels eines monoklonalen, höchst vorzugsweise mittels eines solchen, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, oder mittels eines entsprechenden Antikörperfragmentes erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment an einen Marker oder/und einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.
Verfahren zur Identifizierung oder/und Isolierung von Substrukturen des humanen Gehirns in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen der biologischen Probe; (2) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Agens, das selektiv oder/und spezifisch an FZD 9 bindet; (3) Feststellung, ob eine selektive/spezifische Bindung des Agens an die Substruktur stattgefunden hat, und (4) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung von Substrukturen des humanen Gehirns, oder/und (5) Isolierung der Substrukturen des humanen Gehirns bei einer positiven Feststellung in Schritt (3).
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrukturen des humanen Gehirns proliferierende Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, höchst vorzugsweise Astrozytomzellen aufweist.
Verfahren zur Identifizierung der Angiogenese, vorzugsweise der Tumorangiogenese, in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen der biologischen Probe, vorzugsweise aufweisend Tumorzellen; (2) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Agens, das selektiv oder/und spezifisch an FZD 9 bindet, (3) Feststellung, ob eine selektive/spezifische Bindung des Agens an die biologische Probe stattgefunden hat, und (4) Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt (3) mit der Identifizierung der Angiogenese in der biologischen Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler, höchst vorzugsweise ein solcher, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, oder ein entsprechendes Antikörperfragment ist.
Verwendung eines gegen FZD 9 gerichteten Agens, vorzugsweise eines Antikörpers, zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Diagnose eines Tumors, vorzugsweise eine Gehirntumors, höchst vorzugsweise eines Astrozytoms.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper ein solcher verwendet wird, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird.
Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zur Behandlung oder Diagnose eines Tumors, vorzugsweise eine Gehirntumors, höchst vorzugsweise eines Astrozytoms, mit den Schritten: (1) Bereitstellung eines gegen FZD 9 gerichteten Agens, vorzugsweise eines Antikörpers, (2) Formulierung des Agens in einen diagnostischen oder pharmazeutisch akzeptablen Träger mit ggf. weiteren Zusätzen.
Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Lebewesens, das einen Tumor, vorzugsweise einen Gehirntumor, höchst vorzugsweise ein Astrozytom aufweist, mit den Schritten: (1) Verabreichen eines Mittels in das Lebewesen, (2) ggf. mehrfaches Wiederholen des Schrittes (1), wobei als Mittel ein Agens, das gegen FZD 9 gerichtet ist, vorzugsweise ein Antikörper, höchst vorzugsweise ein solcher Antikörper, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, verwendet wird.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der von der nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2668 hinterlegten Hybridomzelle W3C4E11 produziert wird, oder eines entsprechenden Antikörperfragmentes, zur Identifizierung von Hippocampusgewebe, vorzugsweise des humanen Gehirns.