DE112013006579T5 - Verfahren zum Isolieren zirkulierender Tumorzellen - Google Patents

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Abstract

Zur Verfügung gestellt werden Verfahren zum Nachweis oder Isolieren zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in einem Individuum. Die Verfahren können den Nachweis der Expression von wenigstens einem Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) umfassen. Weiterhin werden Kits zum Nachweis oder Isolieren von CTCs zur Verfügung gestellt. Die Kits können Antikörper gegen wenigstens einen EMT Biomarker enthalten. Weiterhin werden Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums auf ein Krebsmedikament, Verfahren zum spezifischen Verabreichen eines Krebsmedikamentes in einem Individuum, Verfahren zum Bereitstellen einer Krebsprognose für ein Individuum und Verfahren zum Beobachten des Fortgangs einer Krebserkrankung in einem Individuum zur Verfügung gestellt.

Description

  • VERWEIS AUF ZUGEHÖRIGE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 61/760,042, eingereicht am 2. Februar 2013, sowie der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 61/806,358, eingereicht am 28. März 2013, die durch Verweis in ihrer Gänze Bestandteil dieser Anmeldung sind.
  • ANGABE BETREFFEND STAATLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG
  • Diese Erfindung wurde mit Hilfe staatlicher Förderung gemacht, unter der staatlichen Förderungsnummer W81XWH-10-1-0483, verliehen vom Verteidigungsministerium, und unter der staatlichen Förderungsnummer 5R01-CA127727-03, verliehen vom NIH. Die US-Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Das Sequenzprotokoll wird zusammen mit der Anmeldung nur in elektronischer Form eingereicht und ist durch Verweis Bestandteil dieser Anmeldung. Die Textdatei des Sequenzprotokolls „WO00_ASFILED_SequenceListing-Text“ wurde am 31. Mai 2013 erzeugt und hat eine Größe von 131.252 Bytes.
  • FACHGEBIET
  • Die Offenbarung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis und zur Prognose von Krebs. Darüberhinaus stellt die Offenbarung Verfahren zum Erfassen und Isolieren zirkulierender Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) zur Verfügung, welche die Identifikation, den Nachweis und optional die Zählung der CTCs umfasst, die in den Verfahren im Zusammenhang mit einer Prognose, Diagnose oder der Behandlung einer Krebserkrankung in einem Individuum verwendet werden können.
  • HINTERGRUND
  • Die meisten Zellen von Metazoen können entweder als epithelial oder mesenchymal eingeordnet werden, basierend auf Morphologie, Verhalten und molekularer Signatur. Epitheliale Tumorzellen können zu mesenchymalen Zellen werden und umgekehrt, über phänotypische Transitionen, einem Vorgang, der als epitheliale Plastizität bekannt ist. Epitheiale Zellen sind im Allgemeinen polar in der apicobasalen Richtung, an benachbarte Zellen anhaftend, in der Ebene senkrecht zur Polarität und nicht frei beweglich in der polaren Richtung. Mesenchymalen Zellen dagegen fehlt die Polarität, sie bilden keine festen Verbindungen mit benachbarten Zellen und sind frei beweglich. In erwachsenen Tieren bleiben epitheliale Zellen in dem einen oder anderen Zustand stabil; d. h., eine epitheliale Zelle verändert ihre Eigenschaften nicht und wird nicht mesenchymal. Während der Entwicklung dagegen, bilden epitheliale Zellen des frühen Embryos alle drei embryonalen Schichten (Entoderm, Mesoderm und Ektoderm), die mesenchymale Zellen enthalten (Hay, E. D., et al. Am. J. Kidney Dis. 1995, 26, 678–690). Diese frühembryonalen Zellen haben folglich die Fähigkeit zur Transition zwischen epithelialen und mesenchymalen Zuständen. Es wurde gezeigt, dass Embryos sowohl epithelial-mesenchymale Transitionen (EMTs), als auch mesenchymal-epitheliale Transitionen (METs) durchmachen (Acloque, H., et al. J. Clin. Invest. 2009, 119, 1438–1449).
  • Epitheliale Plastizität (EP) bezeichnet den reversiblen Verlust des epithelial-zellulären Phänotyps, ein Vorgang, von dem bekannt ist, dass er während der Krebsmetastasierung auftritt. Diese EP-Biologie wurde in mehreren Studien mit dem Risiko der Krebsmetastasierung und dem Erwerb mesenchymaler und/oder Stammzelleneigenschaften durch den EMT-Vorgang in Verbindung gebracht. EMT wurde in mehreren präklinischen Krebsmodellen in Zusammenhang mit Chemoresistenz, Invasion, Intravasation und Dissemination gebracht. Der MET-Vorgang, der zur Re-Expression des epithelialen Phänotyps führt, ist wahrscheinlich auch von großer Wichtigkeit bei der Entwicklung und der Metastasierung und wurde mit metastatischer Kolonisierung und dem Überleben von Tumorzellen in der metastatischen Nische in Zusammenhang gebracht. Zum Beispiel können bei Prostatakrebs mesenchymale Biomarker während der Androgendeprivation in Prostatakrebs-Zelllinien, Tiermodellen und in Tumorproben von Patienten hochreguliert sein. Darüberhinaus sind diese Biomarker plastisch, revertieren beim Ersatz von Testosteron und sind verbunden mit einer erhöhten Neigung zur Metastasierung und Chemoresistenz. Mesenchymal-ähnliche Tumorzellen könnten die lokale Tumorinvasion und Intravasation/Extravasation begünstigen, aber epitheliale Tumorzellen könnten nötig sein für das letztliche Überleben und die Proliferation in der metastatischen Nische, was die mögliche Relevanz der Doppelnatur der EP beim Herbeiführen des vollständigen Metastasierungsprozesses zeigt.
  • Zirkulierende Tumorzellen (CTCs), bei denen es sich um Zellen handelt, die sich vom Primärturmor losgelöst haben und im Blutstrom zirkulieren, haben potentielle prognostische, prädiktive und surrogate Implikationen in der Onkologie. CTCs können die Keime für das anschließende Wachstum zusätzlicher Tumore (Metastasierung) in verschiedenen Geweben bilden. Folglich kann der Nachweis von CTCs eine Diagnose und/oder Prognose für das Gesamtüberleben und therapeutische Implikationen in Individuen mit Krebserkrankungen, wie z. B. metastasiertem Prostata- und Brustkrebs, bereitstellen. Die Anzahl der CTCs in einer Patientenprobe (z. B. einer Blutprobe) kann sehr gering sein, was den Nachweis schwierig machen kann. Derzeitige Verfahren zum Nachweis von CTCs basieren auf dem Nachweis der Expression des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (epithelial cell adhesion molecule, EpCAM), welches ein Biomarker ist, der mit Epithelzellen assoziiert ist. Jedoch können zirkulierende Tumorzellen (CTCs) während des Metastasierungsvorgangs ihren epithelialen Phänotyp verlieren und einen mesenchymalen Phänotyp erwerben, der von den existierenden Epithelial-basierten CTC-Technologien nicht erfasst wird. Während der Metastasierung können Tumorzellen als ein Spektrum epithelialer und mesenchymaler Phänotypen vorhanden sein. CTCs können ihren epithelialen Phänotyp verlieren und einen mesenchymalen Phänotyp erwerben, der mit Hilfe existierender Epithelial-basierter CTC-Technologie nicht erfasst werden kann und daher zu einem verminderten Nachweis von CTCs in Fällen führen, in denen Zellen einer Verringerung oder einen Verlust der EpCAM Expression ausgesetzt sind, wie z. B. während biologischen Prozessen, einschließlich EMT. Aufgrund der Rolle, die CTCs bei der Diagnose, der Überwachung und der Prognose der Erkrankung in Patienten mit Krebs spielen können, müssen sämtliche Defizite in der Nachweistechnologie von dem Fachgebiet angesprochen werden.
  • Neuere Daten weisen darauf hin, dass CTCs mit einem mesenchymalen Phänotyp von CELLSEARCH® und anderen Epithelial-basierten Technologien nicht erfasst werden. Entsprechend gibt es einen Bedarf an Verfahren und Systemen zum Erfassen (Einfangen) von CTCs, die sich nicht auf existierende Erfassungsmethoden stützen, sowie Verfahren zum Korrelieren des CTC-Nachweis mit der Diagnose, der Überwachung und der Prognose der Erkrankung in Krebspatienten.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Nachweis einer zirkulierenden Tumorzelle (CTC) in einer biologischen Probe zur Verfügung, wobei das Verfahren den Nachweis von wenigstens einem Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) (EMT-Biomarker) in der biologischen Probe umfasst.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung einen Kit zum Nachweis einer zirkulierenden Tumorzelle (CTC) in einer biologischen Probe zur Verfügung, wobei der Kit einen Antikörper gegen wenigstens einen EMT-Biomarker sowie eine Gebrauchsanleitung umfasst.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums mit einer Krebserkrankung auf eine Krebsbehandlung zur Verfügung, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen des Expressionslevels oder des Vorhandenseins der Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker, um ein EMT-Biomarker-Profil zu erhalten und/oder optional ein Genexpressionsmuster für eine CTC; und Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit des Individuums auf das Krebsmedikament auf Grundlage des EMT-Biomarker-Profils und/oder optional des Genexpressionsmusters. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren: Bestimmen des Expressionslevels oder des Vorhandenseins der Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker in einer Probe eines Individuums, um ein Biomarker-Profil und optional ein Genexpressionsmuster in einer CTC für das Individuum zu erhalten; Identifizieren der Krebsart aufgrund des Biomarker-Profils und/oder optional des Genexpressionsmusters, und optional Charakterisieren des Krebsstadiums; und Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit des Individuums auf das Krebsmedikament, basierend auf einem der Folgenden: Biomarkermuster, optional Genexpressionsmuster, Krebsart oder Krebsstadium. Ausführungsformen dieses Aspekts können den Nachweis einer Reihe von Zellen umfassen, die aus einer Blutprobe erfasst und gezählt wurden, unter Verwendung von wenigstens einem EMT-Biomarker, der auf eine Probe des Individuums angewandt wird. Die Zellen, die den EMT-Biomarker exprimieren, werden dadurch unter Verwendung des EMT-Biomarkers erfasst und könnten anschließend verwendet werden, um ein Genexpressionsmuster in den CTCs für das Individuum zu erhalten; um die Ansprechempfindlichkeit des Individuums auf das Krebsmedikament basierend auf dem erhaltenen Genexpressionsmuster zu erhalten und für den Nachweis anderer Biomarker in diesen CTCs, um die Steuerung der Therapie dieses Individuums zu unterstützen. Diese Zellen könnten ebenfalls verwendet werden, um den Level des spezifischen EMT-Biomarkers oder anderer EMT-Biomarkern zu messen.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Feststellen der Anzahl von CTCs unter Verwendung sowohl der herkömmlichen EpCAM-basierten Erfassungsmethode (EpCAM-based capture methodology) als auch einer EMT-Marker-basierten Erfassungsmethode zur Verfügung. Diese EMT-basierte Erfassung kann existierende CTC-Erfassungstechnologien ersetzen oder ergänzen. Die weitere Erfassung, Auszählung und Charakterisierung dieser CTCs unter Verwendung einer EMT-Antigen-Erfassung kann ferner die Verabreichung eines Krebsmedikaments in einem Individuum mit einer Krebserkrankung gezielt machen, umfassend die Verabreichung eines Krebsmedikaments, das an einen Antikörper gebunden ist, der für wenigstens einen EMT-Biomarker spezifisch ist, an das Individuum, oder von spezifischen Arzneimitteln, basierend auf einem Genexpressionsprofil oder dem Vorhandensein dieses EMT-Biomarkers.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Abschätzung der Prognose eines Individuums mit einer Krebserkrankung zur Verfügung, ebenso wie zum Ermöglichen einer weiteren Charakterisierung von CTCs, die für eine therapeutische Ansprechempfindlichkeit prädiktiv sein können, wobei das Verfahren umfasst: Bestimmen des Expressionslevels oder des Vorhandenseins der Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker in einer Probe von dem Individuum, um die Anzahl von CTCs in dem Individuum zu bestimmen und ein Genexpressionsmuster für das Individuum zu erhalten; und Bereitstellen einer Prognose für das Individuum, basierend auf dem erhaltenen Genexpressions- oder Biomarkerprofilmuster.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Überwachen der Progression einer Krebserkrankung in einem Individuum in therapeutischer Behandlung zur Verfügung, wobei das Verfahren den Nachweis des Expressionslevels oder des Vorhandenseins der Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker umfasst, sowie die Quantifizierung der unter Verwendung dieses Verfahrens in Blutproben, die von dem Individuum zu einem ersten und einem zweiten Zeitpunkt entnommen wurden, erfassten CTCs; und Vergleichen des ersten und zweiten Expressionslevels; wobei ein nachgewiesener Unterschied im Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker in der ersten und zweiten Probe über die Zeit auf eine Änderung des Progressionsstatus der Krebserkrankung hinweist.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Nachweis einer Krebserkrankung in einem Individuum zur Verfügung, wobei das Verfahren das Bestimmen des Vorhandenseins von CTCs in einer Probe des Individuums, die wenigstens einen EMT-Biomarker exprimieren, im Vergleich zu einer normalen oder einer Kontrollprobe umfasst, wobei ein erhöhter Level von wenigstens einem EMT-Biomarker das Vorhandensein einer Krebsprogression oder einer metastatischen Ausbreitung in dem Individuum anzeigt.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung in einem Individuum zur Verfügung, umfassend die Verabreichung eines Krebsmedikaments, das an einen Antikörper gekoppelt ist, der spezifisch an wenigstens einen EMT-Biomarker bindet, umfasst.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Isolieren, Erfassen (Einfangen) oder Anreichern einer zirkulierenden Tumorzelle eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von dem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein (capture binding protein), wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der es dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex erlaubt, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; und Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren, Erfassen (Einfangen) oder Anreichern der zirkulierenden Tumorzelle. Das Verfahren kann weiterhin das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfassen. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle als solcher umfasst wenigstens eines der folgenden Verfahren: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann als solche bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Die zirkulierende Tumorzelle kann einen mesenchymalen Phänotyp aufweisen. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins (Fehlen) von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifischen genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (phosphatase and tensin homolog, PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe eines Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Nachweis oder Identifizieren einer zirkulierenden Tumorzelle in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gebunden ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; und Trennen des Feste Phase-Fänger-bindenden Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex von der Probe und ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Nachweisen oder Identifizieren der zirkulierenden Tumorzelle. Das Verfahren kann weiterhin das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfassen. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst wenigstens eines der folgenden Verfahren: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Die zirkulierende Tumorzelle kann einen mesenchymalen Phänotyp haben. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifisch genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe eines Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein. Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Isolieren oder Erfassen (Einfangen) einer intakten Zelle aus einem Patienten, wobei die Zelle β-Catenin positiv, DAPI positiv und CD45 negativ ist, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um den Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der intakten Zelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-intakte Zelle-Komplex zu bilden; und Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-intakte Zelle-Komplex von der Probe und ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf der Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle. Die intakte Zelle kann einen mesenchymalen Phänotyp aufweisen. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe von einem Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und Behandeln einer Krebserkrankung in einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um den Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen (CTC-Levels) in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; Vergleich des Anteils zirkulierender Tumorzellen mit einem Referenzwert (Referenzlevel) für zirkulierende Tumorzellen, Nachweis einer Krebserkrankung in dem Individuum, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzellen höher ist als der Referenzwert zirkulierender Tumorzellen, wird eine Krebserkrankung in dem Individuum nachgewiesen, und Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an den Patienten, der als an Krebs erkannt identifiziert wurde. Das Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex umfasst das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzellen. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst wenigstens eines der folgenden Verfahren: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifisch genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe eines Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Überwachen der Progression einer Krebserkrankung in einem Individuum, das sich einer therapeutischen Behandlung unterzieht, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einem EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindenden Protein-zirkulierenden Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindenden Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in den Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; Korrelieren des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit der Progression der Krebserkrankung in dem Individuum, wobei das Individuum als Individuum mit Krebsprogression identifiziert wird, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzellen höher ist im Vergleich zu dem Anteil zirkulierender Tumorzellen in einer früheren Probe des Individuums; und Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an das Individuum, das als Individuum mit Krebsprogression identifiziert wurde. Das Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierender Tumorzelle-Komplex umfasst das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst wenigstens eines der Folgenden: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifisch genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe von einem Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen einer Krebsprognose in einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einem EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende-Tumorzelle-Komplex zu bilden; und Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende-Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende-Tumorzelle-Komplex; Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit einem Referenzwert zirkulierender Tumorzellen, Bestimmen der Krebsprognose in dem Individuum, wobei das Individuum als an Krebs erkrankt identifiziert wird, wenn der Anteil zirkulierender Tumorzellen höher ist als der Referenzwert zirkulierender Tumorzellen, und Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an das Individuum, das als krebskrank identifiziert wurde. Das Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex umfasst das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst wenigstens eines der Folgenden: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifisch genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe aus einem Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums mit einer Krebserkrankung auf einen Behandlungsverlauf, wobei das Verfahren umfasst: Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einem EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierenden Tumorzelle-Komplex zu bilden; und Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; und Vergleichen des Anteils zirkulierender Tumorzellen mit einem Referenzwert zirkulierender Tumorzellen. Das Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierender Tumorzelle-Komplex umfasst das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle. Das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst wenigstens eines der Folgenden: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis. Die zirkulierende Tumorzelle kann bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist. Der EMT-Biomarker kann wenigstens einer der Folgenden sein: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Der Patient kann eine Krebserkrankung haben. Diese kann wenigstens eine der Folgenden umfassen: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs. Das Verfahren kann weiterhin das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifisch genomischen Ereignis umfassen. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus: Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon. Der Bestimmungsschritt kann mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt werden. Die biologische Probe kann eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe aus einem Organismus umfassen. Die biologische Probe kann Blut umfassen. Das Fänger-bindende Protein kann ein Antikörper sein. Die feste Phase kann ein Mikropartikel sein. Der Mikropartikel kann magnetisch oder paramagnetisch sein.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft einen Kit zum Isolieren oder Erfassen (Einfangen) einer zirkulierenden Tumorzelle in einer biologischen Probe, wobei der Kit einen Antikörper umfasst, der an einen magnetischen Partikel gekoppelt ist, wobei der Antikörper spezifisch an wenigstens einen EMT-Biomarker bindet, und wenigstens ein Färbereagenz. Der wenigstens eine EMT-Biomarker kann wenigstens einen der Folgenden umfassen: OB-Catherin, N-Catherin, Vimentin, E-Catherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133. Das wenigstens eine Färbereagenz kann wenigstens eines der Folgenden umfassen: Phycoerythrin-markierter Anti-β-Catenin Antikörper und Allophycocyanin-markierter Anti-CD45 Antikörper.
  • Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Offenbarung werden unter Berücksichtigung der detaillierten Beschreibung und den dazugehörigen Zeichnungen deutlich werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1.(A) zeigt eine schematische Darstellung der alternativ gespleißten Isoformen IIIb und IIIc von FGFR2. (B) ist eine schematische Darstellung des pRIIIcl2-Minigens und der Fluoreszenzanzeige. (C) ist eine RT-PCR-Analyse des Reporters (oberer Bereich) und endogenen FGFR2 (unterer Bereich). (D) sind Epifluoreszenz- und Phasenkontrastbilder der Klone AT3-M und AT3-T.
  • 2.(A) zeigt Beispiele von Clustern DsRED positiver Zellen, die von AT3-M Zellen bei der Behandlung mit konditioniertem Medium aus Klon AT3-T gebildet werden. (B) zeigt die Durchfluss-zytometrische Analyse desselben Experimentes.
  • 3.(A) zeigt die Wachstumskurven für die Klone AT3-T und AT3-M. (B) ist die grafische Darstellung des Wachstums von AT3-M, AT3-T und DT Zellen in Weichagar. (C) zeigt die Verlustkurve von Ratten, denen AT3-M oder AT3-T Zellen injiziert wurden. (D) zeigt einen Vergleich der Tumorvolumina, die aus der Injektion von AT3-T und AT3-M resultieren.
  • 4.(A) zeigt ein repräsentatives Beispiel für Zellen, die sowohl RFP als auch GFP exprimieren, an der Peripherie eines AT3-M Tumors, der stabil mit Gint und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurden. (B) ist ein repräsentatives Beispiel eines Schnittes von einem AT3-T Tumor, der stabil mit GFP und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurde.
  • 5 zeigt ein repräsentatives Beispiel für Zellen, die sowohl RFP als auch GFP an der Peripherie eines AT3-M Tumors exprimieren, der stabil mit Gint und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurde.
  • 6.(A) zeigt repräsentative Bilder von Zellen für das Scratch Wound Assay. (B) eine Quantifizierung der Migration. (C) ein Invasionsassay unter Verwendung von mit Matrigel beschichteten Membranen. (D) eine Quantifikation der Ergebnisse des Invasionsassays.
  • 7 sind metastatische Foki in Lungen von Tieren mit Tumoren, die entweder von AT3-T oder AT3-M Klonen stammen (die stabil transfiziert sind mit GFP und pRIIIcl2 Reportern). (A) (oberer Bereich) ist ein Beispiel eines Schnittes, der ein Muster für den Klon AT3-T (d. h., GFP+, DsRED+) in einem metastatischen Fokus zeigt und (unterer Bereich) ein Beispiel eines Schnittes, der ein plastisches Muster für den Klon AT3-T (d. h., GFP+, DsRED–) in einem metastatischen Fokus zeigt. (B) (oberer Bereich) ist ein Beispiel eines Schnittes, der ein Muster für den Klon AT3-M (d. h., GFP+, DsRED–) in einem metastatischen Fokus zeigt und (unterer Bereich) ein Beispiel eines Schnittes, der ein plastisches Muster für den Klon AT3-M (d. h., GFP+, DsRED+) in einem metastatischen Fokus zeigt.
  • 8A zeigt eine Membran mit seriellen Zweifach-Verdünnungen von Ganzzelllysaten, die halbiert und im Immunblot auf CD133 (oberer Bereich) oder β-Actin (unterer Bereich) getestet wurde. (B) eine Membran mit seriellen Zweifach-Verdünnungen von Ganzzelllysaten, die halbiert und im Immunblot auf CD44 (oberer Bereich) oder β-Actin (unterer Bereich) getestet wurde.
  • 9 zeigt ein Modell, welches den Stammzellen-ähnlichen Charakter und den epithelial-mesenchymalen Phänotyp vergleicht.
  • 10 zeigt CTCs aus Patienten mit Prostata-Adenokarzinom. (A) zeigt ein Beispiel eines Leukozyten aus einer Probe von humanen, mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PMBC): CD45(+), CK(–) und Vimentin (+). (B) zeigt ein Beispiel einer CD45(–)-, CK(+)- und Vimentin (–) Zelle eines Patienten mit metastasiertem Brustkrebs. (C) zeigt ein Beispiel einer CD45(–), CK(+) und Vimentin (+) Zelle eines Patienten mit metastasiertem Brustkrebs (mBC). (D) zeigt ein Beispiel einer CD45(–), CK(+) und Vimentin (+) Zelle eines Patienten mit metastasiertem, progressivem, Kastrat-resistentem Prostatakrebs (mCRPC).
  • 11 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 12 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 13 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 14 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 15 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 16 zeigt Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC.
  • 17 zeigt, dass nach der Anreicherung unter Verwendung von anti-N-Cadherin- oder anti-OB-Cadherin-Ferrofluid, mesenchymale CTCs aus Leukozyten differenziert sind, durch das Vorhandensein von β-Catenin Expression und Fehlen von CD45 Expression.
  • 18 zeigt Immunfluoreszenzbilder von Kontrollzellen (PC-3 Zellen, gemischt mit mononuklearen Zellen des peripheren Blutes) in den Reihen A und D, und von Patienten stammende, EpCAM-erfasste Zellen in den Reihen B, C und E. In den Zellen wurde CD45 und Cytokeratin gefärbt und die Zellen wurden weiterhin entweder durch β-Catenin- oder OB-Catherin Expression charakterisiert. Die Spalten repräsentieren phasenmikroskopische Aufnahmen mit 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), CD45 mit DAPI, Cytokeratin (CK) mit DAPI und entweder β-Catenin (beta-cat) oder OB-Catherin (OB-CAD) mit DAPI. Reihe A zeigt CD45 positive Kontrollzellen, denen β-Catenin fehlt und CK positive Kontrollzellen, die β-Catenin exprimieren. Reihe B zeigt eine CTC von einem Mann mit Prostatakrebs, mit sowohl CK- als auch β-Catenin Expression, während Reihe C eine CD45-negative, CK-negative Patientenzelle mit β-Catenin Expression zeigt. Reihe D zeigt CD45 positive Kontrollzellen, denen OB-Cadherin fehlt und CK positive Kontrollzellen, die OB-Cadherin exprimieren und Reihe E zeigt eine CTC sowohl mit CK als auch OB-Cadherin Expression.
  • 19 zeigt Beispiele für β-Catenin Expression in EpCAM-erfassten CTCs von einem Mann mit Kastrations-resistentem Prostatakrebs.
  • 20 zeigt (A) die Verteilung von OB-Cadherin-erfassten, β-Catenin positiven Ereignissen aus gesunden Freiwilligen, basierend auf dem CD31-Status. Sämtliche Proben, in denen CD31 analysiert wurden, waren CD31 positiv; und (B) Beispiele von CD31+-zellulären Ereignissen, die in gesunden Freiwilligen nachgewiesen wurden.
  • 21 zeigt Ereignisse, die unter Verwendung von N-Cadherin, OB-Cadherin oder EpCAM-Ferrofluid in gesunden Freiwilligen und CRPC-Patienten erfasst wurden.
  • 22 zeigt Beispiele von OB-Cadherin-erfassten, β-Catenin positiven zellulären Ereignissen aus Männern mit metastasiertem Kastrations-resistentem Prostatakrebs. Die oberen Reihen zeigen einzelne Zellen, die zumeist CD31 positiv sind und endotheliale Zellen darstellen könnten, während die untere Reihe Zellhaufen CD31-negativer Zellen zeigt, die mesenchymale Tumorzellen darstellen könnten.
  • 23 zeigt (A) Immunfluoreszenzbilder von PC-3 Zellen, in denen OB-Cadherin (grün) und DAPI/Nukleus (blau) angefärbt wurde, die zeigen, dass PC-3 Zellen etwas heterogen in der OB-Cadherin Expression sind; und (B) die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung von PC-3 Zellen, basierend auf der OB-Cadherin Expression zeigt, dass etwa 50% der Zellen OB-Cadherin exprimieren.
  • 24 zeigt die Ergebnisse für die Immunfärbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) für einen repräsentativen Patienten mit metastasiertem Kastrationsresistentem Prostatakrebs. Spalten A und B – Zirkulierende Zellen, die mit OB-Cadherin erfasst wurden und mit β-Catenin gefärbt wurden, zeigen dasselbe multigene FISH-Muster wie eine CTC, die mit EpCAM erfasst wurde und mit Cytokeratin gefärbt wurde, von demselben Patienten. Androgenrezeptor(AR)-FISH zeigt Extra-Kopien des Androgenrezeptor-Gens. Für den ERG break -FISH zeigen gelbe Pfeile die fehlenden 5‘ Erg-Signale an, was auf eine TMPRSS2:ERG-Fusion hinweist. Der PTEN-FISH zeigt eine homozygote Deletion des PTEN-Gens. Spalte C – Ein Leukozyt von demselben Patienten zeigt eine Cytokeratin-negative Zelle mit einem normalen FISH-Muster mit einem AR-Signal, keinem ERG-Rearrangement und zwei Kopien PTEN.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Bevor irgendwelche Ausführungsformen im Detail beschrieben werden, sollte Einverständnis darüber bestehen, dass die Ansprüche nicht auf die Konstruktion und die Zusammensetzung der in der folgenden Beschreibung dargestellten oder in den dazugehörigen Zeichnungen gezeigten Komponenten beschränkt sind.
  • Sofern nicht anders definiert, haben sämtliche hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie sie im Allgemeinen von einem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird. Im Falle eines Widerspruchs gilt das vorliegende Dokument, einschließlich der Definitionen. Bevorzugte Verfahren und Materialien werden weiter unten beschrieben, obwohl Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Durchführung oder Überprüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Sämtliche Publikationen, Patentanmeldungen, Patente oder andere hierin erwähnten Referenzen sind durch Verweis in ihrer Gänze Bestandteil dieser Anmeldung. Die hierin offenbarten Materialien, Verfahren und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen nicht beschränkend sein.
  • Die Begriffe „umfassen(umfasst)“, „beinhalten(beinhaltet)“, „haben“, „hat“, „kann“, „enthalten(enthält)“ und Varianten davon, die hierin verwendet werden, sollen offene Formulierungen, Begriffe oder Wörter sein, welche die Möglichkeit zusätzlicher Handlungen oder Strukturen nicht ausschließen. Die Singular-Formen „ein“, „und“ und „der/die/das“ umfassen Plural-Formen, sofern nicht der Zusammenhang eindeutig etwas anderes bestimmt. Die vorliegende Offenbarung sieht auch andere Ausführungsformen „umfassend“, „bestehend aus“ und „im Wesentlichen bestehend aus“ den hierin dargelegten Ausführungsformen und/oder Elementen vor, egal ob explizit dargestellt oder nicht.
  • Im allgemeinen Sinne stellt die Offenbarung Biomarker zur Verfügung, die als mit zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) assoziiert identifiziert wurden. Wie hierin beschrieben sind ein oder mehrere Biomarker der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) auf CTCs von Patienten detektierbar sind, die von häufigen epithelialen Malignitäten betroffen sind. Diese transitionalen Zellen weisen häufig Stammzell-ähnliche Eigenschaften (Stammzellartigkeit) und/oder Plastizität auf. Ferner stellt die Offenbarung die Beschreibung zur Verfügung, wonach die Neigung zur Metastasierung und Änderungen im epithelialten Phänotyp mit dem alternativen Spleißen des FGFR2 Gens korrelieren. Die Offenbarung sieht auch vor, wie in den nicht beschränkenden Beispielen veranschaulicht wird, dass transitionale Zellen in Krebspatienten vorkommen, in denen zahlreiche CTCs Biomarker koexprimierten, die mit epithelialten und mesenchymalen Zellen assoziiert sind.
  • Folglich kann, wie unten beschrieben, die Expression der EMT-Biomarker verwendet werden, um CTCs in einer biologischen Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Entsprechend können Verfahren, welche den Nachweis der EMT-Biomarker-Expression umfassen, oder den Nachweis von CTCs, oder Kombinationen davon, verwendet werden, um Krebsprognose, Tumorinvasivität und Risiko von Metastasierung zu beurteilen, oder das Tumorstadium zu ermitteln. Wie einem Fachmann auf die Gebiet klar sein wird, kann jedes geeignete Verfahren zum Bewerten der EMT-Biomarker-Expression verwendet werden, um die Expression eines EMT-Biomarkers in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren zu bewerten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den Nachweis mit Antikörpern, real time RT-PCR, Northern-Analyse, Western-Analyse und Durchflusszytometrie.
  • Die Offenbarung beschreibt weiterhin die Entwicklung eines CTC-Erfassungsverfahren, das auf der Biologie der epithelialen Plastizität beruht und Zellen auf Grundlage von mesenchymalen Markern, wie der Zelloberflächenexpression von N-Cadherin oder OB-Cadherin, isoliert. In Patienten mit fortgeschrittenem Brust- und Prostatakrebs können EP-Biomarker, einschließlich OB-Cadherin, N-Catherin und Vimentin, in CTCs nachgewiesen werden, die mittels EpCAM-basierter ferromagnetischer Erfassung (EpCAM-based ferromagnetic capture) isoliert werden und Cytokeratin koexprimieren, das in epithelialen Zellen exprimiert wird. In ähnlicher Weise wurden CTCs, welche die mesenchymalen Marker Twist und Vimentin exprimieren, selten in Patienten mit Brustkrebs im Frühstadium identifiziert, jedoch in der Mehrzahl der Patienten mit metastasiertem Brustkrebs, was nahelegt, dass die Transition zu einem mesenchymalen Phänotyp für die Metastasierung wichtig sein könnte. Darüberhinaus legen kürzliche serielle Untersuchungen von CTCs mit einem mesenchymalen Phänotyp, wie mittels RNA Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) definiert, nahe, dass es einen Zusammenhang zwischen mesenchymalen CTCs und dem der Krankheitsprogression in Frauen mit Brustkrebs geben könnte.
  • Wie hierin beschrieben, exprimierten CTCs, die unter Verwendung der ferromagnetischen Erfassung des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (EpCAM) isoliert wurden, in Patienten mit metastasiertem Kastrations-resistentem Prostatakrebs (CRPC) und Brustkrebs (BC) mesenchymale Marker, einschließlich N- und OB-Cadherin, was eine phänotypische Plastizität und das Vorhandensein von EMT nahelegt. Das hierin beschriebene CTC-Erfassungsverfahren schließt ein mesenchymal-basiertes Assay ein. Dieses Assay weist zelluläre OB-Cadherin-Ereignisse nach, die in Männern mit metastasiertem Prostatakrebs vorkommen, jedoch weniger häufig in gesunden Individuen waren. Dieses Verfahren kann existierende epithelial-basierte Verfahren ergänzen und den Patienten mit Knochenmetastasen potentiell nützlich sein.
  • Definitionen
  • „Antikörper“, wie hierin verwendet, bezeichnet monoklonale Antikörper, multispezifische Antikörper, humane Antikörper, humanisierte Antikörper (vollständig oder teilweise humanisiert), tierische Antikörper, wie zum Beispiel, jedoch nicht auf diese beschränkt, von einem Vogel (zum Beispiel einer Ente oder einer Gans), einem Hai, einem Wal und einem Säugetier, einschließlich einem Nicht-Primaten (zum Beispiel einer Kuh, einem Schwein, einem Kamel, einem Lama, einem Pferd, einer Ziege, einem Hasen, einem Schaf, einem Hamster, einem Meerschweinchen, einer Katze, einem Hund, einer Ratte, einer Maus, usw.) oder ein nicht-humaner Primat (zum Beispiel einem Affe, einem Schimpansen, usw.), rekombinante Antikörper, chimäre Antikörper, einzelkettige Fvs („scFv“), einzelsträngige Antikörper, Einzeldomänen-Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab‘)-Fragmente, F(ab‘)2-Fragmente, Disulfid-gekoppelte Fvs („sdFv“) und anti-idiotypische („anti-Id“) Antikörper, Dual Domain Antikörper, Dual Variable Domain (DVD) oder Triple Variable Domain (TVD)-Antikörper (Dual Variable Domain-Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung werden beschrieben in Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290–1297 (2007) und in der internationalen PCT-Anmeldung WO 2001/058956 , deren Inhalte durch Verweis Bestandteil dieser Anmeldung sind) und funktionell aktive Epitop-bindende Fragmente eines der oben Genannten. Insbesondere schliessen Antikörper Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Fragmente von Immunglobulinmolekülen ein, und zwar Moleküle, die eine Analyt-Bindestelle enthalten. Immunglobulinmoleküle können jeglicher Art sein (zum Beispiel IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), jeglicher Klasse (zum Beispiel IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2) oder Subklasse. Aus Gründen der Vereinfachung wird ein Antikörper gegen einen Analyten hierin häufig entweder als ein „Anti-Analyt-Antikörper“ oder lediglich als ein „Analyt-Antikörper“ bezeichnet.
  • „Antikörper-Fragment“, wie hierin verwendet, bezeichnet einen Teil eines intakten Antikörpers, welcher die Antigen-Bindungsstelle oder variable Region umfasst. Der Teil schließt die konstanten schwere Kette-Domänen (d. h., CH2, CH3 oder CH4, abhängig von dem Antikörper-Isotyp) der Fc-Region des intakten Antikörpers nicht ein. Beispiele für Antikörper-Fragmente schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Fab Fragmente, Fab‘ Fragmente, Fab‘-SH Fragmente, F(ab‘)2 Fragmente, Fd Fragmente, Fv Fragmente, Diabodies, einzelsträngige Fv (scFv) Moleküle, einzelsträngige Polypeptide, enthaltend nur eine variable Domäne der leichten Kette, einzelsträngige Polypeptide, enthaltend die drei CDRs der variablen Domäne der leichten Kette, einzelsträngige Polypeptide, enthaltend nur eine variable Region der schweren Kette und einzelsträngige Polypeptide, enthaltend die drei CDRs der variablen Region der schweren Kette. Der Begriff „Verabreichung“ oder „verabreichen“, wie hierin verwendet, bezeichnet die Bereitstellung, das In-Kontakt-bringen und/oder die Verabreichung einer Krebsbehandlung mittels jedem geeigneten Weg, um die gewünschte Wirkung zu erreichen. Die Krebsbehandlung kann einem Individuum auf zahlreichen Wegen verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die Folgenden: oral, okular, nasal, intravenös, topisch, als Aerosole, Suppositorium, usw. und kann in Kombination verwendet werden.
  • „Bindendes Protein“ wird hierin verwendet, um ein monomeres oder multimeres Protein zu bezeichnen, das an einen Bindungspartner bindet und einen Komplex mit ihm bildet, wie zum Beispiel ein Polypeptid, ein Antigen, eine chemische Verbindung oder ein anderes Molekül oder irgendein Substrat. Ein Bindungsprotein bindet spezifisch einen Bindungspartner. Bindeproteine umfassen Antikörper, ebenso wie Antigen-bindende Fragmente davon und verschiedene andere Formen und Derivate davon, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind und hierin weiter unten beschrieben werden, sowie andere Moleküle, die ein oder mehrere Antigen-bindende Domänen umfassen, die an ein Antigenmolekül oder eine bestimmte Stelle (Epitop) auf dem Antigenmolekül binden. Dem entsprechend umfasst ein bindendes Protein, ist jedoch nicht beschränkt auf, die Folgenden: ein Antikörper, ein tetrameres Immunglobulin, ein IgG-Molekül, ein monoklonaler Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein CDR-transplantierter (CDR-grafted) Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein Affinitäts-gereifter Antikörper sowie Fragmente von einem dieser Antikörper, welche die Fähigkeit zur Bindung an ein Antigen behalten.
  • Der Begriff „Biomarker“, wie hierin verwendet, bezeichnet jede quantifizierbare biologische Komponente, die für einen bestimmten physiologischen Zustand (z. B. Krebs) einzigartig ist. Ein Biomarker kann ein Gen sein, eine von diesem Gen transkribierte mRNA oder ein Protein, das von dieser mRNA translatiert wurde. Eine messbare Zunahme oder Abnahme des Biomarker-Levels im Vergleich zu einer Kontrolle, wie zum Beispiel einem Individuum, einer Gruppe von Individuen oder Populationen, oder alternativ im Vergleich zu Individuen mit einer Krebserkrankung, kann eine Diagnose für einen bestimmten physiologischen Zustand bereitstellen.
  • „Brustkrebs“, wie hierin verwendet, bezeichnet eine Krebsart, die von der Brust stammt oder sich in der Brust entwickelt.
  • „Krebs“/„Krebserkrankung“, wie hierin verwendet, bezeichnet das unkontrollierte und unregulierte Wachstum anormaler Zellen in dem Körper. Krebszellen werden auch maligne Zellen genannt. Krebs kann in nahe gelegene Teile des Körpers eindringen und kann sich über das lymphatische System oder den Blutstrom auch in weiter weg gelegene Teile des Körpers ausbreiten. Krebsarten schließen ein: Adrenocorticales Karzinom, Analkrebs, Blasenkrebs, Hirntumor, Brustkrebs, karzinoider Tumor, gastrointestinaler Krebs, Karzinom mit unbekanntem Ursprung, Zervixkrebs, Kolonkrebs, Endometriumkrebs, Ösophaguskrebs, extrahepatischer Gallengangkrebs, Familie der Erwings-Tumoren (PNET), extrakranieller Keimzelltumor, intraokularer Melanom-Augenkrebs, Gallenblasenkrebs, Magenkrebs, extragonadaler Keimzelltumor, gestationaler trophoblastischer Tumor, Kopf- und Halskrebs, hypopharyngealer Krebs, Inselzellkarzinom, Nierenkrebs (Nierenzellkrebs), Kehlkopfkrebs, akute lymphoblastische Leukämie, Leukämie, akute myeloische, chronische lymphozytische Leukämie, chronische-myeloische Leukämie, Harzellleukämie, Lippen- und Mundhöhlenkrebs, Leberkrebs, nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, kleinzelliges Bronchialkarzinom, AIDS-bedingtes Lymphom, primäres Lymphom des zentralen Nervensystems, kutanes T-Zelllymphom, Hodgkin-Lymphom, Non-Hodgkin-Lymphom, malignes Mesotheliom, Melanom, Merkel-Zell-Karzinom, metastasiertes Plattenepithelkarzinom des Halses mit unbekanntem Ursprung, multiples Myelom und andere Plasmazellen-Neoplasien, Mycosis fungoides, myelodyplastisches Syndrom, myeloproliferative Erkrankungen, Nasopharyngealkrebs, Euroblastom, Mundkrebs, Oropharyngealkrebs, Osteosarkom, epitheliales Ovarial-Karzinom, Ovarial-Keimzelltumor, Pankreaskrebs, exokriner Pankreaskrebs, Inselzellkarzinom, Paranasal-Sinus- und Nasalhöhlenkrebs, Nebenschilddrüsenkrebs, Peniskrebs, Hypophysenkrebs, Plasmazell-Neoplasie, Prostatakrebs, Rhabdomyosarkom, Rektumkrebs, Nierenzellkrebs (Krebs der Niere), Übergangszellkarzinom des Nierenbeckens und Harnleiters, Speicheldrüsenkrebs, Sezary-Syndrom, Hautkrebs, Dünndarmkrebs, Weichgewebesarkom, Hodenkrebs, malignes Thymom, Schilddrüsenkrebs, Harnröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, ungewöhnlicher Krebs im Kindesalter, Vaginalkrebs, Vulvakarzinom und Wilmstumor.
  • „Zirkulierende Tumorzellen“ („circulating tumor cells“), „CTC“ und „CTCs“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet Zellen, die von einem Primärturmor in die Blutgefäße abgegeben wurden und in der Blutbahn zirkulieren. CTCs werden als Keime für das anschließende Wachstum zusätzlicher Tumore (Metastasierung) in vitalen, entfernten Organen betrachtet, was einen Mechanismus auslöst, der für die große Mehrheit krebsbedingter Tode verantwortlich ist.
  • „Komponente“, „Komponenten“ oder „wenigstens eine Komponente“ bezeichnet im Allgemeinen einen Fänger-Antikörper, einen Nachweis oder Konjugat, einen Kalibrator, eine Kontrolle, ein Sensitivitätspanel, einen Behälter, einen Puffer, ein Verdünnungsmittel, ein Salz, ein Enzym, einen Co-Faktor für ein Enzym, ein Nachweisreagenz, ein Reagenz/Lösung zur Vorbehandlung, ein Substrat (z. B. als Lösung), eine Stop-Lösung und dergleichen, die enthalten sein können in einem Kit zur Untersuchung einer Testprobe, wie zum Beispiel Urin eines Patienten, eine Serum- oder Plasmaprobe, in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren und anderen auf dem Gebiet bekannten Verfahren. Einige Komponenten können in Lösung oder in lyophilisiertem Zustand zur Rekonstitution zur Verwendung in einem Assay sein.
  • Der Begriff „effektive Dosis“, wie hierin verwendet, bedeutet eine Dosis eines Arzneimittels, die in dem notwendigen Zeitraum effektiv ist, um das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erreichen. Eine effektive Dosis kann von einem Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden und kann abhängig von Faktoren wie dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums sowie der Fähigkeit des Arzneimittels, eine gewünschte Antwort in dem Individuum zu erzeugen, variieren.
  • „Epithelial“ und „epithelialer Phänotyp“, wie hierin verwendet, bezeichnet membranöses Gewebe, das aus ein oder mehreren Zellschichten zusammengesetzt ist, die durch sehr geringe intrazelluläre Substanz getrennt werden und die Außenhülle der meisten internen und externen Oberflächen des Körpers und seine Organe bildet.
  • „Markierung“ („Label“) und „nachweisbare Markierung“ („nachweisbares Label“), wie hierin verwendet, bezeichnet eine Komponente, die an einen Antikörper oder ein Analyt angeheftet ist, um die Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Analyt nachweisbar zu machen, und der so markierte Antikörper oder Analyt wird als „nachweisbar markiert“ bezeichnet. Eine Markierung kann ein Signal erzeugen, das durch visuelle Mittel oder Geräte nachweisbar ist. Verschiedene Markierungen schließen Signal-erzeugende Substanzen, wie zum Beispiel Chromogene, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Verbindungen und dergleichen ein. Repräsentative Beispiele für Markierungen schließen Komponenten ein, die Licht produzieren, z. B. Acridinium-Verbindungen sowie Komponenten, die Fluoreszenz erzeugen, z. B. Fluoreszein. Weitere Markierungen sind hierin beschrieben. In diesem Zusammenhang kann die Komponente selbst nicht nachweisbar sein, jedoch nach Reaktion mit einer weiteren Komponente nachweisbar werden. Die Verwendung des Begriffs „nachweisbare Markierung“ soll eine solche Markierung umfassen.
  • Jede geeignete, nachweisbare Markierung, die auf dem Gebiet bekannt ist, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann die nachweisbare Markierung eine radioaktive Markierung sein (wie zum Beispiel 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho und 153Sm), eine enzymatische Markierung (wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase, alkalische Peroxidase, Glukose-6-phosphat-dehydrogenase und dergleichen), eine chemilumineszente Markierung (wie zum Beispiel Acridiniumester, Thioester oder Sulfoamide; Luminol, Isoluminol, Phenanthridiniumester und dergleichen), eine fluoreszierende Markierung (wie zum Beispiel Fluorescein (5-Fluorescein, 6-Carboxyfluorescein, 3‘6-Carboxyfluorescein, 5(6)-Carboxyfluorescein, 6-Hexachlorfluorescein, 6-Tetrachlorfluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat und dergleichen)), Rhodamin, Phycobiliproteine, R-phycoerythrin, Quantenpunkte (quantum dots) (z. B. Zinksulfid-capped Cadmiumselenid), eine thermometrische Markierung oder eine Immun-Polymerasekettenreaktion-Markierung. Eine Einführung zu Markierungen, Markierungsverfahren und den Nachweis von Markierungen ist zu finden in Plak und Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), und in Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), welches ein kombiniertes Handbuch und Katalog ist, der von Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, publiziert wurde. Eine fluoreszierende Markierunbg kann in FPIA verwendet werden (siehe z. B. U.S. Patent Nummern 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093 und 5,352,803, die durch Verweis in ihrer Gänze Bestandteil dieser Anmeldung sind). Eine Acridinium-Verbindung kann als nachweisbare Markierung in einem homogenen Chemiluminescenz-Assay verwendet werden (siehe z. B. Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324–1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313–2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917–3921 (2004); und Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779–3782 (2003)).
  • „Mesenchymal“ oder „mesenchymaler Phänotyp“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet eine Art undifferenziertes, lockeres Bindegewebe, das sich in Gewebe des lymphatischen und zirkulatorischen Systems und Bindegewebe im ganzen Körper entwickeln kann, wie zum Beispiel Knochen und Knorpel. Mesenchymale Phänotypen können morphologisch charakterisiert werden durch eine prominente Grundsubstanz-Matrix, die ein lockeres Aggregat retikulärer Fasern und nicht spezialisierter Zellen enthält. Mesenchymale Zellen können leicht migrieren, im Gegensatz zu epithelialen Zellen, denen eine Mobilität fehlt und die in eng anhaftenden Schichten organisiert sind, eine polygonale Form aufweisen und in apikal-basaler Orientierung polarisiert sind.
  • „Mesenchymale phänotypische CTC“ und „mesenchymale CTC“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet eine CTC, die einen mesenchymalen Phänotyp hat.
  • Der Begriff „normale Kontrolle“ oder „gesunde Kontrolle“, wie hierin verwendet, bezeichnet eine Probe, die einem Individuum entnommen wurde, oder ein Individuum, das keine Krebserkrankung hat oder nicht gefährdet ist, eine Krebserkrankung zu entwickeln.
  • Der Begriff „normales Individuum“, wie hierin verwendet, bezeichnet ein gesundes Indiviuum, d. h. ein Individuum, das keine klinischen Anzeichen oder Symptome für eine Krebserkrankung aufweist. Das normale Individuum wird klinisch untersucht auf ansonsten unerkannte Zeichen oder Symptome für Krebs, wobei diese Untersuchung eine körperliche Routineuntersuchung und/oder Labortests umfassen kann.
  • Der Begriff „vorbestimmter Cutoff“ und „vorbestimmter Level“, wie hierin verwendet, bezeichnet den Grenzwert/Höchstwert (Cutoff) für ein Assay, der verwendet wird, um Ergebnisse zur diagnostischen, prognostischen oder therapeutischen Wirksamkeit zu bewerten, indem die Ergebnisse des Assays mit seinem vorbestimmten Cutoff/Level verglichen wird, wobei der vorbestimmte Cutoff/Level bereits mit verschiedenen klinischen Parametern (z. B. Vorhandensein der Erkrankung, Krankheitsstadium, schwere der Erkrankung, Progression, Nicht-Progression oder Verbesserung der Erkrankung usw.) in Verbindung gebracht oder assoziiert wurde. Die Offenbarung stellt beispielhafte, vorbestimmte Level bereit. Jedoch ist wohlbekannt, dass Cutoff-Werte abhängig von der Art des Immunassays (verwendete Antikörper, Reaktionsbedingungen, Reinheit der Probe, usw.) variieren können. Es liegt ferner im Bereich des durchschnittlichen Fachmanns auf dem Gebiet, die hierin enthaltene Offenbarung an andere Immunassays anzupassen, um Immunassay-spezifische Cutoff-Werte für diese anderen Immunassays, basierend auf der hierin zur Verfügung gestellten Beschreibung, zu erhalten. Während der genaue Wert eines vorbestimmten Cutoffs/Levels zwischen verschiedenen Assays variieren kann, sollte die hierin beschriebene Korrelation im Allgemeinen anwendbar sein.
  • „Reagenz zur Vorbehandlung“, z. B. Analyse-, Präzipitations- und/oder Lösungs-Reagenz, wie es in einem diagnostischen Assay verwendet wird, wie hierin beschrieben, ist eines, das sämtliche Zellen in einer Testprobe lysiert und/oder jedes Analyt, das in einer Testprobe vorhanden ist/sind, löst. Eine Vorbehandlung ist nicht für alle Proben nötig, wie hierin im Weiteren beschrieben wird. Ein Reagenz zur Vorbehandlung kann homogen sein (was keinen Trennungsschritt erfordert) oder heterogen (was einen Trennungsschritt erfordert). Mit der Verwendung eines heterogenen Reagenz zur Vorbehandlung geht die Entfernung von präzipitierten, Analyt-bindenden Proteinen aus der Testprobe einher, bevor mit dem nächsten Schritt des Assays fortgefahren wird. Das Reagenz zur Vorbehandlung kann optional umfassen: (a) ein oder mehrere Lösungsmittel und Salz, (b) ein oder mehrere Lösungsmittel, Salz und Detergenz, (c) Detergenz, (d) Detergenz und Salz, oder (e) jedes Reagenz oder Kombination von Reagenzien, die für die Zelllyse und/oder die Solubilisierung des Analyts geeignet ist/sind.
  • „Prostatakrebs“, wie hierin verwendet, bezeichnet eine Krebsart, die in der Prostata entsteht. Prostatakrebs kann langsam wachsen oder aggressiv sein, in letzterem Fall metastasieren die Krebszellen von der Prostata zu anderen Teilen des Körpers, insbesondere die Knochen und Lymphknoten. „Metastasierter Prostatakrebs“ bezeichnet einen Prostatakrebs, der außerhalb der Prostata in die Lymphknoten, Knochen oder andere Bereiche streut. „Kastrations-resistenter Prostatakrebs“ bezeichnet das Fortschreiten einer Prostatakrebserkrankung trotz einer Androgen-Entzugstherapie, was sich als kontinuierliche Zunahme der Serumlevel des Prostata-spezifischen Antigens, dem Fortschreiten einer bereits vorhandenen Erkrankung oder dem Auftreten neuer Metastasen, oder einer Kombination davon, zeigen kann.
  • „Reagenzien zur Qualitätskontrolle“ im Zusammenhang mit hierin beschriebenen Immunassays und Kits umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Kalibratoren, Kontrollen und Sensitivitätspanels. Ein „Kalibrator“ oder „Standard“ wird typischerweise verwendet (z. B. ein oder mehrere, wie auch eine Vielzahl), um Kalibrierungs-(Standard-)Kurven zur Interpolation der Konzentration eines Analyts, wie z. B. eines Antikörpers oder eines Analyts, zu erstellen. Alternativ kann ein einzelner Kalibrator, der in der Nähe eines vorbestimmten positiven/negativen Cutoffs liegt, verwendet werden. Mehrere Kalibratoren (d. h., mehr als ein Kalibrator oder verschiedene Mengen von Kalibratoren) können zusammen verwendet werden, um ein „Sensitivitätspanel“ zu bilden.
  • Der Begriff „Referenz-Aktivitätslevel“ oder „Referenz“, wie hierin verwendet, bezeichnet einen Aktivitätslevel des Biomarkers in einer Probengruppe, der als Referenz dient, gegen den das Aktivitätslevel eines Individuums oder einer Stichprobengruppe beurteilt wird.
  • Der Begriff „Risikoreserve“, „Risikoklassifizierung“, „Risikoidentifizierung“ oder „Risikostratifikation“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet die Bewertung von Faktoren einschließlich Biomarkern, um das Risiko für das Auftreten in der Zukunft liegender Ereignisse vorherzusagen, einschließlich Krankheitsbeginn oder Krankheitsprogression, so dass Entscheidungen bezüglich der Behandlung des Individuums auf einer fundierteren Basis getroffen werden können.
  • Der Begriff „Probe“, „Testprobe“, „biologische Probe“, „Probe von einem Individuum“ oder „Probe eines Individuums“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet eine Probe oder ein Isolat von Blut, Gewebe, Urin, Serum, Plasma, Fruchtwasser, cerebrospinalen Flüssigkeit, Plazentazellen oder -gewebe, Endothelzellen, Leukozyten oder Monozyten, und kann direkt verwendet werden, wie von einem Individuum erhalten, oder kann vorbehandelt werden, z. B. durch Filtration, Destillation, Extraktion, Konzentration, Zentrifugation, Inaktivierung störender Komponenten, Zugabe von Reagenzien und dergleichen, um die Eigenschaft der Probe auf irgendeine Art und Weise zu modifizieren, wie hierin dargelegt, oder auf andere Weise, wie auf dem Gebiet bekannt.
  • Der Begriff bezeichnet außerdem jedes biologische Material, das auf einen Analyten von Interesse hin getestet wird und/oder von dem vermutet wird, dass es einen solchen Analyten enthält. Die Probe kann jede Gewebeprobe sein, die dem Individuum entnommen wurde oder von dem Individuum stammt. In einigen Ausführungsformen kann die Probe des Individuums ein Protein enthalten. Jede Zellart, Gewebe oder Körperflüssigkeit kann verwendet werden, um eine Probe zu erhalten. Solche Zellarten, Gewebe und Flüssigkeiten können Gewebeschnitte enthalten, wie Biopsien oder Autopsieproben, gefrorene Schnitte, die zu histologischen Zwecken entnommen wurden, Blut (wie z. B. Vollblut), Plasma, Serum, Sputum, Stuhl, Tränen, Schleim, Speichel, Haar, Haut, rote Blutkörperchen, Blutplättchen, Interstitialflüssigkeit, Flüssigkeit aus der Augenlinse, Liquor (cerebrales Nervenwasser), Schweiß, nasale Flüssigkeit, synoviale Flüssigkeit, Menses, Fruchtwasser, Samen usw.. Zellarten und -gewebe können auch Lymphflüssigkeit, aszitische Flüssigkeit, gynäkologische Flüssigkeit, Urin, Peritonealflüssigkeit, Liquor (Cerebrospinalflüssigkeit), eine Flüssigkeit, die durch Scheidenspülung (vaginal rinsing oder vaginal flushing) gewonnen wurde. Ein Gewebe oder eine Zellart kann bereitgestellt werden, indem eine Zellprobe von einem Tier entnommen wird, kann jedoch auch durch Verwendung zurvor isolierter Zellen erreicht werden (wie z. B. die von einer anderen Person, zu einem anderen Zeitpunkt und/oder zu einem anderen Zweck isoliert wurden). Archiviertes Gewebe, wie z. B. solche Gewebe, für das eine Historie zur Behandlung oder zu dem Ausgang vorliegt, können ebenfalls verwendet werden. Die Isolierung von Protein oder Nukleotiden und/oder die Aufreinigung müssen nicht notwendig sein.
  • Auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren zum Entnehmen, Handhaben und Verarbeiten von Urin, Blut, Serum und Plasma und anderen Körperflüssigkeiten werden bei der praktischen Anwendung der vorliegenden Offenbarung verwendet. Die Testprobe kann weitere Komponenten zusätzlich zu dem Analyt von Interesse enthalten, wie z. B. Antikörper, Antigene, Haptene, Hormone, Arzneimittel, Enzyme, Rezeptoren, Proteine, Peptide, Polypeptide, Oligonukleotide oder Polynukleotide. Zum Beispiel kann die Probe eine Vollblutprobe sein, die einem Individuum entnommen wurde. Es kann nötig oder gewünscht sein, dass eine Testprobe, insbesondere Vollblut, vor dem Immunassay, wie hierin beschrieben, behandelt wird, z. B. mit einem Reagenz zur Vorbehandlung. Selbst in Fällen, in denen eine Vorbehandlung nicht notwendig ist (z. B. bei den meisten Urinproben, bei einer vorverarbeiteten, archivierten Probe usw.), ist die Vorbehandlung der Probe eine Option, die lediglich aus Gründen der Bequemlichkeit durchgeführt wird (z. B. als Teil eines Protokolls auf einer kommerziellen Plattform). Die Probe kann direkt, wie von dem Individuum erhalten, verwendet werden, oder nachdem eine Vorbehandlung durchgeführt wurde, um die Eigenschaft der Probe zu verändern. Die Vorbehandlung kann umfassen: Extraktion, Konzentration, Inaktivierung störender Komponenten und/oder die Zugabe von Reagenzien.
  • „Feste Phase“ bezeichnet jegliches Material, das unlöslich ist oder mittels anschließender Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit ausgewählt werden, ein Fänger-Agens anzuziehen und so immobilisieren. Alternativ kann an der festen Phase ein Kopplungsagens angeheftet werden, das die Fähigkeit hat, ein Fängeragens anzuziehen und zu immobilisieren. Zum Beispiel kann das Kopplungsagens eine geladene Substanz umfassen, die im Hinblick auf das Fängeragens selbst oder auf eine an das Fängeragens konjugierte, geladene Substanz eine entgegengesetzte Ladung aufweist. Im Allgemeinen kann das Kopplungsagens irgendein Bindungspartner (vorzugsweise spezifisch) sein, der auf der festen Phase immobilisiert ist (an diese gebunden ist) und die Fähigkeit hat, das Fängeragens über eine Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Kopplungsagens ermöglicht die indirekte Bindung des Fängeragens an ein Feste Phase-Material, bevor der Assay durchgeführt wird oder während der Assay durchgeführt wird. Zum Beispiel kann die feste Phase Plastik sein, derivatisiertes Plastik, magnetisches, paramagnetisches oder nicht-magnetisches Metall, Glas oder Silikon, einschließlich, z. B., eines Reagenzröhrchens, Partikel einer Mikrotiterplatte, Folie, Kugel (bead), Mikropartikel, Chip, und andere, den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Konfiguration.
  • „Spezifische Bindung“ oder „spezifisch binden“, wie hierin verwendet, kann sich auf die Interaktion eines Antikörpers, Proteins oder Peptids mit einer zweiten chemischen Spezies beziehen, wobei die Interaktion abhängig ist von dem Vorhandensein einer bestimmten Struktur (z. B. einer antigen Determinante oder Eptiop) auf der chemischen Spezies; z. B. erkennt und bindet ein Antikörper eher eine spezifische Proteinstruktur als Proteine im Allgemeinen. Wenn ein Antikörper spezifisch für ein Epitop „A“ ist, wird die Gegenwart eines Moleküls, das Epitop „A“ enthält (oder freies, nicht markiertes A) in einer Reaktion, enthaltend markiertes „A“ und den Antikörper, die Menge an markiertem A, das an den Antikörper gebunden ist, reduzieren.
  • Der Begriff „Individuum“, „Patient“ oder „Individuum in dem Verfahren“, wie hierin synonym verwendet, bezeichnet einen Vertebraten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, ein Säugetier (z. B. Kuh, Schwein, Kamel, Lama, Pferd, Ziege, Hase, Schaf, Hamster, Meerschweinchen, Katze, Hund, Ratte und Maus, einen nicht humanen Primaten (z. B. einen Affen, wie z. B. einen Cynomolgus oder Rhesusaffen, Schimpansen usw.) und einen Menschen. In einigen Ausführungsformen kann das Individuum human oder nicht human sein. In einigen Ausführungsformen kann das Individuum ein menschliches Individuum sein, welches ein Risiko zur Entwicklung einer Krebserkrankung aufweist oder bereits eine Krebserkrankung hat.
  • „Behandeln“ oder „Behandlung“ werden hierin jeweils synonym verwendet und beschreiben das Rückgängigmachen, Mildern oder Inhibieren des Fortschreitens einer Erkrankung, wie Krebs, oder von einem oder mehreren Symptomen einer solchen Erkrankung, auf die der Begriff anwendbar ist. Abhängig von dem Zustand des Individuums bezeichnet der Begriff auch das Vorbeugen einer Erkrankung und umfasst das Vorbeugen des Krankheitbeginns oder das Vorbeugen von mit einer Erkrankung assoziierten Symptomen. Eine Behandlung kann entweder akut oder chronisch durchgeführt werden. Der Begriff bezieht sich auch auf eine Reduzierung der Schwere einer Erkrankung oder mit einer solchen Erkrankung assoziierten Symptomen vor dem Leiden an der Krankheit. Derartige Schritte zur Vorbeugung oder Reduktion der Schwere einer Erkrankung vor dem Leiden bezieht sich auf die Verabreichung eines Antikörpers oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an ein Individuum, das zum Zeitpunkt der Verabreichung nicht an der Krankheit leidet. „Vorbeugen“ bezieht sich auch auf das Vorbeugen des Wiederauftretens einer Erkrankung oder einer oder mehrerer mit dieser Erkrankung assoziierten Symptome. „Behandlung“ und „therapeutisch“ bezeichnet den Vorgang des Behandelns, wie „Behandeln“ oben definiert ist.
  • Wie hierin beschrieben, ist die Fähigkeit einer Zelle, leicht zwischen den epithelial-ähnlichen und mesenchymal-ähnlichen Zuständen zu wechseln (phänotypische Plastizität) eine relevante Determinante für die maligne Fitness, mehr noch als die Eigenschaften der Endstadien. Während diese epithelialen Transitionen phänotypisch sind, kann die Neigung zur Transition (Plastizität) unter Karzinomzellen mittels des Genotyps bestimmt werden. Die Mehrzahl plastischer Zellen kann transitionale intermediäre Zustände mit Eigenschaften sowohl des Epitheliums als auch des Mesenchyms einnehmen, und diese transitionalen Zellen können besonders maligne sein. Derartige Zellen können nachgewiesen werden in: (1) Tumoren, in denen die Krebszellen eine gemischte Histologie aufweisen, was tatsächlich beobachtet wurde, und die als höchst aggressiv eingestuft wurden (z. B. klonales sarkomatöses Karzinom epithelialen Ursprungs, das ein extrem aggressives Verhalten zeigt, wie z. B. das sarkomatoide Nierenzellkarzinom und das Karzinosarkom der Prostata); und (2) Krebszellen, die epitheliale und mesenchymale Marker koexprimieren, wie hierin beschrieben.
  • Wie durch die nicht-beschränkenden Ausführungsformen in den Beispielen veranschaulicht wird, sieht die Offenbarung die Identifizierung von Zellen vor, die einen intermediären Phänotyp besitzen – epitheliale und mesenchymale Isoformen von FGFR2 exprimieren, eine Epithelial-ähnliche Morphologie und -Genexpressionsmuster aufweisen, während sie gleichzeitig Mesenchymalzell-ähnliche Migration, Tumorbildung und Metastasierung zeigen. In Ausführungsformen werden diese Zellen in Patienten mit fortgeschrittenem Krebs, metastasiertem Andenokarzinom und metastasierten Brust- und Prostatakarzinomen identifiziert. In einigen Ausführungsformen umfassen die Zellen CTCs. In einigen Ausführungsformen koexprimieren die CTCs Biomarker, einschließlich z. B. EpCAM, Cytokeratin und Vimentin, welche die Zellen als sowohl epithelial- als auch mesenchymal-ähnlich identifizieren. In einigen Ausführungsformen werden diese CTCs in intermediären phänotypischen Stadien mittels Nachweis von EMT-Biomarkern identifiziert und stellen eine Diagnose und/oder Prognose des Krebsstadiums und/oder dem Grad der Malignität eines Krebes zur Verfügung.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Nachweis von CTCs in einer biologischen Probe zur Verfügung, wobei das Verfahren den Nachweis von wenigstens einem EMT-Biomarker in der biologischen Probe umfasst. In einigen Ausführungsformen, wie sie in den Beispielen erläutert werden, sind die Biomarker für EMT auf den CTCs von Patienten mit häufigen epithelialen Malignitäten vorhanden. In einigen Ausführungsformen können Verfahren, welche den Nachweis und die Identifizierung alternativer Spleißvarianten des FGFR2 Gens umfassen, verwendet werden, um mit der Neigung zur Metastasierung und einem epithelialen Phänotyp in einer CTC zu korrelieren.
  • Folglich kann die Expression der EMT-Biomarker verwendet werden, um CTCs nachzuweisen. Die EMT-Biomarker Expression oder der Nachweis von CTCs, oder eine Kombination davon, kann verwendet werden, um die Krebsprognose, die Invasivität des Tumors, das Risiko der Metastasierung oder das Stadium des Tumors zu beurteilen. Wie oben erwähnt können die hierin beschriebenen Verfahren jedes geeignete Verfahren zur Bewertung der EMT-Biomarkerexpression umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den Nachweis mit Antikörpern, real time RT-PCR, Northern-Analyse, magnetische Partikel (z. B. Mikropartikel oder Nanopartikel), Western-Analyse und Methoden oder Systeme, die Durchflusszytometrie beinhalten. In einigen Ausführungsformen können die Verfahren und EMT-Biomarker in einem kommerziell erhältlichen System verwendet werden, wie z. B. einem System, das von der Aufsichtsbehörde (z. B. FDA) zugelassen wurde, einschließlich, z. B. der CELLSEARCH® Technologie (Veridex LLC). Folglich können die Verfahren Standardprotokolle, die auf dem Gebiet bekannt sind, einbeziehen. Zum Beispiel können Ausführungsformen, welche die CELLSEARCH® Technologie umfassen, den Nachweis des Vorhandenseins eines EMT-Biomarkers umfassen und mit der Quantifizierung der Anzahl zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in einer biologischen Probe korrelieren (z. B. Blut, das von Frauen gewonnen wurde, die ein neues Behandlungsschema für metastasierten Brustkrebs benötigen oder Männer, die eine Behandlung für mCRPC benötigen). Typische Protokolle können die Entnahme einer Blutprobe im Größenbereich von etwa 15 ml umfassen, die zu jedem spezifischen Zeitpunkt entnommen werden kann (zweckmäßigerweise wenn der Patient eine neue Therapie beginnt und dann wieder in drei oder vier Wochenintervallen). Die Anzahl von CTCs kann mit dem Ansprechen oder Fortschreiten der Erkrankung korreliert werden, wie mittels Standard-Radiologieuntersuchungen (z. B. CT-Scans) bestimmt wird, die alle neun bis 12 Wochen durchgeführt werden.
  • In einem Aspekt bezieht sich die Offenbarung auf ein Verfahren zum Nachweis einer zirkulierenden Tumorzelle (CTC) in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren den Nachweis von mindestens einem EMT-Biomarker in der biologischen Probe umfasst. Wie oben angemerkt, kann die biologische Probe von irgendeinem Gewebe oder irgendeiner Flüssigkeit aus einem Organismus stammen. In einigen Ausführungsformen stammt die biologische Probe aus einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe, das Teil des lymphatischen Systems oder des Kreislaufsystems des Organismus ist oder damit assoziiert ist. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei der biologischen Probe um eine Blutprobe.
  • Die Biomarker für EMT und zelluläre Plastizität, die in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, sind mit zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) assoziiert. Folglich umfassen verschiedene Ausführungsformen der Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins ein oder mehrerer EMT-Biomarker sowie das Korrelieren dieses Nachweises mit dem Vorhandensein einer CTC, optional die Quantifizierung der Anzahl von CTCs in der Probe. Wie hierin dargelegt, können die EMT-Biomarker jedes nachweisbare Biomolekül umfassen, das mit einer transitionalen Zelle assoziiert ist, die Eigenschaften (d. h., Phänotyp, Oberflächenantigen oder Genexpressionsprofile usw.) von Plastizität, Stammzell-ähnlichen Eigenschaften, Invasivität und/oder Chemoresistenz einer Zelle aufweist. In einigen nicht beschränkenden Ausführungsformen umfasst der EMT-Biomarker einen der Folgenden: Vimentin, N-Cadherin, O-Cadherin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen (wie zum Beispiel FGFR2, der entweder Exon IIIc oder Exon IIIb umfasst oder nicht umfasst) oder CD133, oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon. In einigen Ausführungsformen kann der EMT-Biomarker ein oder mehrere der Folgenden umfassen: Vimentin (Polypeptid SEQ ID NO: 14, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 13), N-Cadherin (Polypeptid SEQ ID NO: 2, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 1; Polypeptid SEQ ID NO: 16, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 15), O-Cadherin (Polypeptid SEQ ID NO: 4, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 3); Polypeptid SEQ ID NO: 18, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 17), E-Cadherin (Polypeptid SEQ ID NO: 12, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 11; Polypeptid SEQ ID NO: 24, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 23), FGFR2 (Polypeptid SEQ ID NO: 8, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 7; Polypeptid SEQ ID NO: 10, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 9; Polypeptid SEQ ID NO: 22, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 21) und CD133 (Polypeptid SEQ ID NO: 6, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 5; Polypeptid SEQ ID NO: 20, kodiert durch Polynukleotid SEQ ID NO: 19). In einigen Ausführungsformen kann der EMT-Biomarker ein oder mehrere der Folgenden umfassen: N-Cadherin, zum Beispiel humanes N-Cadherin (zum Beispiel SEQ ID NO: 16, CCDS ID No: CCDS11891.1); O-Cadherin, zum Beispiel humanes O-Cadherin (zum Beispiel SEQ ID NO: 18, CCDS ID No: CCDS10803.0); E-Cadherin, zum Beispiel humanes E-Cadherin (zum Beispiel SEQ ID NO: 24, CCDS ID No: CCDS10869.1); CD133, zum Beispiel humanes CD133 (zum Beispiel SEQ ID NO: 20, CCDS ID No: CCDS47029.1); FGFR2, zum Beispiel humanes FGFR2 (zum Beispiel SEQ ID NO: 22, CCDS ID No: CCDS31298.1); und Vimentin, zum Beispiel humanes Vimentin (zum Beispiel SEQ ID NO: 14, Zugangsnummer BC000163). Es wird von dem Fachmann auf dem Gebiet verstanden, dass wenn auf die oben genannten Ausführungsformen ebenso wie auf Ausführungsformen in der gesamten Beschreibung Bezug auf Polynukleotide genommen wird, die Polypeptide kodieren, das Polynukleotid entweder als RNA (z. B. mRNA) oder DNA (z. B. cDNA) offenbart sein kann.
  • Die EMT-Biomarker können mit jedem Organismus (ortholog) assoziiert sein, und in bestimmten Ausführungsformen sind die EMT-Biomarker mit einem Menschen assoziiert. Jeder Teil oder die Gesamtheit eines EMT-Biomarkers kann für den Nachweis in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie z. B. ein Epitop eines EMT-Biomarkerproteins, das an einen Antikörper bindet, oder eine Nukleinsäuresequenz eines EMT-Biomarkers, ein exprimiertes oder transkribiertes mRNA-Molekül, das komplementär zu einer Reporter-Nukleinsäureprobe oder -primer ist. In einigen Ausführungsformen sehen die Verfahren den Nachweis der Expression von wenigstens zwei EMT-Biomarkern vor. In bestimmten Ausführungsformen wird die Expression von Vimentin und E-Cadherin nachgewiesen. In bestimmten Ausführungsformen wird die Expression von N-Cadherin und O-Cadherin nachgewiesen. Diese Messung kann allein oder in Kombination mit anderen Verfahren verwendet werden, um CTCs nachzuweisen. In bestimmten Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Verfahren als ergänzendes Verfahren zusammen mit den CELLSEARCH® Circulating Tumor Cell Test (oben erwähnt) verwendet werden. Folglich sehen die Ausführungsformen ein Verfahren als Teil eines dualen oder komplementären Nachweissystems vor, das verwendet werden kann, um CTCs in einer Probe nachzuweisen und optional zu quantifizieren (z. B. umfassend den Nachweis von EpCAM und wenigstens einem EMT-Biomarker). Die Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um CTCs zu isolieren. Die Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um CTCs zu zählen, oder die relative Anzahl oder Menge von CTCs zur Verfügung zu stellen, unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens zum Zuordnen des Nachweises eines Biomarkers zu einer Zelle, wie z. B. einer CTC. CTCs können zum Zeitpunkt der Metastasierung, vor oder nach der Metastasierung nachgewiesen werden.
  • Krebserkrankunen können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf:, Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Hirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskrebs, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebserkrankungen. Folglich ist die Offenbarung im Allgemeinen anwendbar auf jede Art von Krebs, in welcher die Expression eines EMT-Biomarkers auftritt. In bestimmten Ausführungsformen ist der Krebs ein bösartiger, solider Tumor. In bestimmten Ausführungsformen ist der Krebs Brust-, Darm- oder Prostatakrebs.
  • Die Expression von wenigstens einem EMT-Biomarker kann durch Verwenden jedes geeigneten auf dem Gebiet bekannten Verfahren nachgewiesen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: das Binden mit Antikörpern oder Fragmenten davon, Antikörper, die an ein bildgebendes Agens gebunden oder damit assoziiert sind, Expressionsreporterplasmide, Durchflusszytometrie und jede geeignete Array-Scannertechnologie. Der Antikörper oder das Fragment davon kann in geeigneter Weise ein bestimmtes intrazelluläres Protein, eine Proteinisoform oder eine Proteinkonfiguration erkennen.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „bildgebendes Agens“ oder „Reportermolekül“ jede Einheit, welche die Visualisierung oder den Nachweis der Zelle, an die es verabreicht wird, verstärkt. Jede Art eines detektierbaren Reportermoleküls/bildgebenden Agens kann in den hierin offenbarten Verfahren zum Nachweis von einem oder mehreren EMT-Biomarkern verwendet werden. Derartige nachweisbare Moleküle sind auf dem Gebiet bekannt und umfassen, zum Beispiel: magnetische Kugeln (beads), Fluorophore, Radionuklide, Zellkernfärbemittel (z. B. DAPI). Zum Beispiel kann ein bildgebendes Agens eine Verbindung umfassen, die ein instabiles Isotop (d. h. ein Radionuklid) oder eine fluoreszierende Komponente, wie z. B. Cy-5, Alexa 647, Alexa 555, Alexa 488, Fluoreszein, Rhodamin und dergleichen, umfasst. Geeignete Radionuklide umfassen sowohl alpha- als auch beta-Strahler. In einigen Ausführungsformen ist das Targeting-Vehikel markiert. In anderen Ausführungsformen umfassen geeignete radioaktive Komponenten markierte Polynukleotide und Polypeptide, die an das Targeting-Vehikel gekoppelt werden können. In einigen Ausführungsformen umfasst das bildgebende Agens ein Radionuklid, wie z. B. ein Radionuklid, das niederenergetische Elektronen emittiert (z. B. solche, die Photonen mit so geringen Energien wie 20 keV emittieren). Solche Nukleide können die Zelle bestrahlen, an die sie verabreicht wurden, ohne umgebende Zellen oder Gewebe zu bestrahlen. Nicht beschränkende Beispiele für Radionuklide, die an Zellen geliefert werden können, umfassen 137Cs, 103Pd, 111In, 125I, 211At, 212Bi und 213Bi, neben anderen auf dem Gebiet bekannten. Weitere für die Verabreichung an Zellen geeignete bildgebende Agenzien in Übereinstimmung mit einigen Ausführungsformen umfassen paramagnetische Arten zur Verwendung in der MRI-Bildgebung, echogene Entitäten zur Verwendung in der Ultraschallbildgebung, fluoreszierende Entitäten zur Verwendung in der Fluoreszenzbildgebung (einschließlich Quantenpunkten/Quantendots) und lichtaktive Entitäten zur Verwendung in der optischen Bildgebung. Eine geeignete Art für die MRI-Bildgebung ist ein Gadoliniumkomplex der Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Für die Positions-Emissions-Tomographie (PET) kann 18F oder 11C verabreicht werden. Weitere nicht beschränkende Beispiele für Reportermoleküle werden in der gesamten Offenbarung erläutert.
  • In einem Aspekt stellt die Offenbarung ein Kit zum Nachweis von CTCs in einer Probe zur Verfügung. In Ausführungsformen umfasst der Kit einen Antikörper gegen wenigstens einen EMT-Biomarker. Der Antikörper in dem Kit kann mit einem bildgebenden Agens verbunden oder mit diesem assoziiert sein. In Ausführungsformen kann der Kit einen Antikörper gegen wenigstens einen EMT-Biomarker umfassen, wobei der Antikörper mit einer magnetischen Kugel (bead) assoziiert ist. Die magnetische Kugel kann zur ferromagnetischen Trennung und Anreicherung von CTCs verwendet werden.
  • Aspekte beziehen sich auch auf Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums auf ein Krebsmedikament. Die Verfahren können das Bestimmen des Expressionslevels von wenigstens einem EMT-Biomarker in einer Probe von dem Individuum umfassen. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um ein Genexpressionsmuster in CTCs für das Individuum zu erhalten. Die Verfahren können weiterhin das Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit des Individuums auf ein Krebsmedikament, basierend auf dem erhaltenen Genexpressionsmuster, umfassen. Die Genomvariation in CTCs des Individuums kann ebenfalls bestimmt werden.
  • Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zum Bereitstellen einer Krebsprognose für ein Individuum. Die Verfahren können das Bestimmen des Expressionslevels von wenigstens einem EMT-Biomarker in einer Probe des Individuums umfassen. Das Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um die Anzahl von CTCs in der Probe zu bestimmen. Die CTCs können unter Verwendung von wenigstens einem EMT-Biomarker erfasst (eingefangen) werden. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um ein Genexpressionsmuster in den CTCs für das Individuum zu bestimmen. Eine Prognose kann auf Grundlage des erhaltenen Genexpressionsmusters für das Individuum bereitgestellt werden.
  • Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zum Verfolgen des Fortschreitens einer Krebserkrankung in einem Individuum. Die Verfahren können das Bestimmen des Expressionslevels von wenigstens einem EMT-Biomarker in Proben von dem Individuum zu einem ersten und einem zweiten Zeitpunkt umfassen, sowie den Vergleich der Expressionslevel des ersten und zweiten Zeitpunkts. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker in der Probe kann über die Zeit bestimmt werden, wie nach dem Beginn einer neuen Krebstherapie. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker in der Probe kann verwendet werden, um die Anzahl oder Menge an CTCs zu bestimmen. Eine Zunahme zwischen dem ersten und zweiten Level kann auf ein Fortschreiten der Krebserkrankung hinweisen. Eine Abnahme zwischen dem ersten und zweiten Level kann auf eine Remission oder ein Ansprechen des Krebses auf die Therapie hinweisen. Kein Unterschied zwischen dem ersten und zweiten Level kann auf einen Stillstand oder eine Stabilität bei dem Fortschreiten der Krebserkrankung hinweisen.
  • Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zum Krebs-Screening in einem Individuum. Die Verfahren können das Bestimmen des Expressionslevels von wenigstens einem EMT-Biomarker in einer Probe des Individuums umfassen. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker kann verwendet werden, um die Menge oder Anzahl von CTCs in dem Individuum zu bestimmen. Der Expressionslevel von wenigstens einem EMT-Biomarker kann mit einer normalen Probe oder Kontrollprobe verglichen werden. Ein erhöhter Level von wenigstens einem EMT-Biomarker kann auf das Vorhandensein einer Krebserkrankung in dem Individuum hinweisen.
  • Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zum Stoppen des Zellwachstums oder zum Induzieren des Zelltods einer Krebszelle, die einen EMT-Biomarker exprimiert. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-bringen der Krebszelle mit einem Konjugat, das in der Lage ist, die intrazelluläre Lieferung eines Agens zu vermitteln, wie der hierin beschriebenen Antikörper gegen EMT-Marker. Das Agens ist fähig, das Wachstum der Zelle zu stoppen oder abzuschwächen oder den Zelltod zu induzieren, durch irgendeinen Mechanismus, nachdem das Agens internalisiert wurde. Die Krebszelle kann mit dem Konjugat in vitro, in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht werden. Diese Verfahren können nützlich sein bei der Behandlung einer Krebserkrankung durch direktes Targeting von Krebszellen, die einen EMT-Biomarker exprimieren, zur Verabreichung von Agenzien, die fähig sind, das Zellwachstum zu verringern oder zu stoppen oder den Zelltod zu induzieren.
  • Die Offenbarung sieht auch gezielte therapeutische Verfahren vor und Moleküle, die ein Antikrebsmittel umfassen, das mit einem bindenden Agens verbunden ist, das auf wenigstens ein EMT abzielt, wie hierin beschrieben. In einigen Ausführungsformen ist die Bindung zwischen dem Antikrebsmittel und dem bindenden Agens eine kovalente Bindung. In einigen Ausführungsformen wird die Bindung durch starke elektrostatische Interaktionen (Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophile/hydrophobe Interaktion oder entgegengesetzt geladene Komponenten und dergleichen) gebildet. Jedes Antikrebsmittel kann in solchen Molekülen und therapeutischen Verfahren verwendet werden und kann von dem Fachmann auf dem Gebiet auf Grundlage der zu behandelnden Krebsart, dem Fortschritt/Stadium des Krebses, möglichen unerwünschten Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln, Dosierungserfordernissen, Verabreichungsschemata und dergleichen, ausgewählt werden.
  • Verfahren zum Isolieren, Erfassen (Einfangen) oder Anreichern zirkulierender Tumorzellen
  • Bei der Bedeutung der EP bei der Metastasierung, identifiziert die Offenbarung CTCs, die ihren ephithelialen Phänotyp verloren haben, in Patienten, wie zum Beispiel Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, mittels eines mesenchymal-basierten Erfassungs-Verfahrens. Ein solches Verfahren kann vorhandene epithelial-basierte Ansätze ergänzen oder ersetzen, indem es Zellen, die eine verringerte oder gar keine EpCAM Expression aufweisen, erfasst (einfängt).
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Isolieren, Erfassen oder Anreichern von CTCs unter Verwendung eines EMT-Biomarkers, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isoleiren, Erfassen oder Anreichern der zirkulierenden Tumorzelle. Der EMT-Biomarker kann OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133 umfassen.
  • a) OB-Cadherin
  • OB-Cadherin, auch bekannt als Cadherin-11 und O-Cadherin, wird kodiert durch das CDH11 Gen und wurde zuerst in Osteoblasten der Maus identifiziert. OB-Cadherin ist ein homophiles Zelladhäsionsmolekül, das die Osteoblastenadhäsion während der Knochenentwicklung vermittelt. Eine abweichende OB-Cadherin Expression wurde in Brust-, Magen- und Prostatakrebserkrankungen erkannt. OB-Cadherin kann an der Metastasierung in Prostatakrebs beteiligt sein. OB-Cadherin Expression wurde in CTCs nachgewiesen (s. 1).
  • In humanem Prostatakrebs zeigte die Untersuchung mittels Immunhistochemie eine erhöhte Expression von OB-Cadherin in Knochenmetastasen im Vergleich mit dem Primärtumor. Obwohl der genaue Mechanismus, wie die OB-Cadherin Expression die Knochenmetastasierung ermöglicht unklar ist, ist von OB-Cadherin bekannt, dass es die Adhäsion zwischen PC Zellen und Osteoblasten vermittelt. Präklinisch betrachtet, entwickeln sich, wenn in PC-3 Zellen OB-Cadherin mittels shRNA ausgeschaltet (silenced) wird und die ausgeschalteten Zellen in Mäuse injiziert werden, weniger Knochenmetastasen, während die Metastasierung in anderen Organen nicht betroffen war. Zusätzlich wurde die Induktion der OB-Cadherin Expression mit einer EMT/EP-Biologie in anderen Modellsystemen in Zusammenhang gebracht. Darüber hinaus führt die Androgendepletion zu einer Hochregulierung von OB-Cadherin, was eine Rolle für OB-Cadherin bei der Kastrations-resistenten Krankheitsprogression nahelegt. Schließlich könnten angesichts der Tatsache, dass letaler metastasierter Prostatakrebs bei der überwiegenden Mehrheit von Männern ausnahmslos streut, OB-Cadherin positive CTCs in dem Blut von Männern mit metastasiertem CRPC nachweisbar sein.
  • Gegen OB-Cadherin gerichtete Antikörper wurden an Eisenpartikel angeheftet, um ein neuartiges Ferrofluid zu bilden, welches das EpCAM Ferrofluid in der von der FDA-zugelassenen CELLSEARCH® Technologie ersetzen könnte. Nachdem OB-Cadherin exprimierende Zellen immunmagnetisch aus Vollblut angereichert worden sind, folgen weitere Charakterisierungsschritte, um sicherzustellen, dass die erfassten Zellen die Zellen von Interesse sind, wie z. B. das Messen des Levels eines EMT-unabhängigen Charakterisierungsproteins, wie β-Catenin. Der Antikörper kann an die extrazelluläre Domäne von OB-Cadherin binden.
  • b) N-Cadherin
  • N-Cadherin, das auch als neurales Cadherin (NCAD) und Cadherin-2 (CDH2) bekannt ist, wird von dem CDH2 Gen kodiert. N-Cadherin ist häufig in Krebszellen vorhanden und stellt einen Mechanismus für die transendotheliale Migration zur Verfügung. Wenn sich eine Krebszelle an die Endothelzellen eines Blutgefäßes anheftet, reguliert sie den src-Kinase-Signalweg hoch, der beta-Catenine phosphoryliert, die sowohl an N-Cadherin als auch E-Cadherine angeheftet sind. Dies bewirkt, dass die interzelluläre Verbindung zwischen zwei benachbarten Endothelzellen versagt, und erlaubt der Krebszelle, durchzuschlüpfen. Der Antikörper kann an die extrazelluläre Domäne von N-Cadherin binden.
  • Verfahren zum Bestätigen zirkulärer Tumorzellen
  • Aufgrund der Tatsache, das CTCs im Vergleich zu anderen zirkulierenden Zellen außerordentlich selten sind, umfasst die Isolierung von CTCs die Identifikation und das Ausschließen von Zellen, welche den pan-Leukozytenmarker CD45 exprimieren. Zirkulierende CD45-negative Zellen stammen nicht notwendigerweise von einem Tumor ab, sondern können stattdessen normale Blutgefäßstellen oder Stromazellen, zirkulierende mesenchymale Zellen oder Stammzellen oder andere Wirtszellen, die in geringen Mengen in dem Blutkreislauf vorhanden sind, darstellen. Zirkulierende Endothelzellen resultieren aus dem Gefäßwand-Umsatz, und aus dem Knochenmark stammende endotheliale Vorläuferzellen können im Rahmen der Neovaskularisierung von ischämischem Gewebe und Tumorbildung zirkulieren. Diese Zellen sind alle CD45 negativ und CD31 positiv. Ebenfalls CD45 negativ aber CD31 negativ, sind mesenchymale Stromazellen (MSCs), eine verschiedenartigere Gruppe von Zellen, die aus dem Knochenmark, dem peripheren Blut oder dem Fett stammen können. MSCs sind multipotente Zellen, die in einer Vielzahl von Stromazellarten differenzieren können, in entzündlichen Erkrankungen zirkulieren und sind Gegenstand aktiver Untersuchung zur Verwendung in der regenerativen Medizin und anderen Leiden. Die Bedeutung zirkulierender MSCs in Krebserkrankungen bleibt unklar. Folglich umfasst ein jedes CTC-Nachweisverfahren die Unterscheidung von Tumorzellen von einer Reihe anderer, seltener Nicht-Tumorzellen im Kreislauf, die nicht-epitheliale Biomarker exprimieren können. Die Bestätigung von CTCs kann den Nachweis von β-Catenin, CD31, CD45, Cytokeratin und/oder PSA, die Färbung mit DAPI und/oder den Nachweis eines Prostatakrebs-spezifischen genomischen Ereignisses umfassen. Zum Beispiel kann eine CTC bestätigt werden, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und CD31 Expression negativ ist. Der Nachweis von β-Catenin, CD31, CD45, Cytokeratin und/oder PSA kann durch Verwendung von Antikörpern gegen β-Catenin, CD31, CD45, Cytokeratin und/oder PSA durchgeführt werden, wobei die Antikörper markiert sind.
  • a) β-Catenin
  • β-Catenin, das durch das CTNNB1 Gen kodiert wird, hat in Krebszellen verschiedene Funktionen, einschließlich der Cadherin-vermittelten Zelladhäsion und der Beteiligung an den Wnt Signalweg. Wenn Wnt-Liganden nicht vorhanden sind, wird β-Catenin phosphoryliert und degradiert. Wenn Wnt-Liganden vorhanden sind, bewegt sich β-Catenin in den Nukleus und aktiviert Zielgene, die in mehreren Krebserkrankungen im Zusammenhang mit EMT/Invasion, Proliferation und Überleben stehen. Besonders in Prostatakrebs kann β-Catenin als Cofaktor mit dem Androgenrezeptor wirken, und eine erhöhte Expression und Veränderung der Lokalisierung wurde bei fortgeschrittener Erkrankung beobachtet. Die β-Catenin Expression kann ein ständiges Untersuchungsergebnis sein, ungeachtet der epithelialen oder mesenchymalen phänotypischen Eigenschaft einer CTC. Bei der Verwendung der β-Catenin Expression zum Identifizieren einer CTC liegt nicht die epitheliale Verzerrung vor, wie sie mit der Verwendung von Cytokeratin verbunden ist. Ein Antikörper, der an β-Catenin bindet, kann verwendet werden, um β-Catenin nachzuweisen.
  • b) CD31
  • Cluster of differentiation 31 (CD31), auch bekannt als Thrombozyten-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1), wird durch das PECAM1 Gen kodiert und spielt eine Rolle bei der Beseitigung von gealteren Neutrophilen aus dem Körper. CD31 kommt auf der Oberfläche von Thrombozyten, Monozyten, Neutrophilen und einigen T-Zellarten vor und machten einen großen Teil der interzellulären Verbindung von Endothelzellen aus. CD31 kommt normalerweise auf Endothelzellen vor und wird in der Immunhistochemie verwendet, um das Vorhandensein von Endothelzellen in histologischen Gewebeschnitten zu zeigen. Ein Antikörper, der an CD31 bindet, kann verwendet werden, um CD31 nachzuweisen.
  • c) CD45
  • Cluster of differentiation 45 (CD45), auch bekannt als Protein-Tyrosinphosphatase, Rezeptortyp C und als allgemeines Leukozytenantigen (leukocyte common antigen), wird von dem PTPRC Gen kodiert. CD45 wird verwendet, um Leukozyten zu identifizieren. Ein Antikörper, der an CD45 bindet, kann verwendet werden, um CD45 nachzuweisen.
  • d) Cytokeratin
  • Cytokeratine sind Keratin-enthaltende intermediäre Filamente, die in dem intrazytoplasmischen Zytoskelett von epithelialem Gewebe vorkommen. Cytokeratinexprimierende Krebszellen verlieren ihre Cytokeratin Expression, nachdem sie die epithelialmesenchymale Transition durchlebt haben, wobei bis zu 20% der Zellen kein nachweisbares Cytokeratin haben. Ein anderes Protein als Cytokeratin kann eine rein mesenchymale CTC identifizieren.
  • e) PSA
  • Das Prostata-spezifische Antigen (PSA), auch bekannt als Gamma-Seminoprotein oder Kallikrein-3 (KLK3), ist ein Glycoproteinenzym, das bei Menschen von dem KLK3 Gen kodiert wird. PSA ist ein Mitglied der Kallikrein-verwandten Peptidase-Familie und wird von Epithelzellen der Prostatadrüse sezerniert. PSA ist im Serum von Männern mit einer gesunden Prostata in geringen Mengen vorhanden, ist jedoch beim Vorhandensein von Prostatakrebs oder anderen Prostataerkrankungen oft erhöht.
  • f) DAPI
  • DAPI, auch bekannt als 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol, ist ein fluoreszierender Farbstoff, der stark an A-T-reiche Regionen in der DNA bindet. Er findet ausgiebige Verwendung in der Fluoreszenzmikroskopie. DAPI kann eine intakte Zellmembran durchdringen und kann daher verwendet werden, um sowohl lebendige als auch fixierte Zellen zu färben.
  • g) Prostatakrebs-spezifisches genomisches Ereignis
  • Eine CTC kann bestätigt werden, indem das Vorhandensein oder das Fehlen von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifischen genomischen Ereignis nachgewiesen wird. Das wenigstens eine Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignis kann Androgenrezeptor Amplifikation, Verlust des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), Genfusion des Transmembrane Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS-related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon sein. Zum Beispiel kann der Nachweis des Vorhandenseins einer Androgenrezeptor-Amplifikation, des Verlustes des Phosphatase und Tensin Homologs (PTEN), der Genfusion des Gens der Transmembran Protease, Serin 2 (TMPRSS2) und des ETS-related (ETG) Gens darauf hinweisen und/oder bestätigen, dass die CTC eine Prostatakrebszelle ist. Der Nachweis eines Prostatakrebs-spezifischen genomisches Ereignisses kann unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung durchgeführt werden.
  • Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren zirkulierender Tumorzellen
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren von CTCs unter Verwendung von EMT-Biomarkern, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Nachweisen oder Identifizieren der zirkulierenden Tumorzelle.
  • Verfahren zum Isolieren oder Erfassen (Einfangen) einer intakten Zelle von einem Patienten
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Isolieren oder Erfassen einer intakten Zelle von einem Patienten, wobei die intakte Zelle β-Catenin positiv, DAPI positiv und CD45 negativ ist, unter Verwendung von EMT-Biomarkern, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle. Die intakte Zelle kann eine Zelle mit mesenchymalen Phänotyp sein, wie zum Beispiel eine mesenchymale CTC.
  • Verfahren zum Nachweisen einer Krebserkrankung in einem Individuum
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen einer Krebserkrankung in einem Individuum unter Verwendung von EMT-Biomarker, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit einem Referenzwert für zirkulierende Tumorzellen; und Nachweis der Krebserkrankung in dem Individuum, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzellen höher als der Referenzwert der zirkulierenden Tumorzellen ist, wird eine Krebserkrankung in dem Individuum nachgewiesen. Die Krebserkrankung kann wenigstens eine Krebserkrankung sein, wie oben beschrieben. Das Verfahren kann weiterhin die Verabreichung einer Therapie gegen Krebs umfassen, an das Individuum, von dem bestimmt wurde, dass es eine Krebserkrankung hat.
  • Verfahren zum Überwachen der Progression einer Krebserkrankung in einem Individuum, das sich einer therapeutischen Behandlung unterzieht
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Überwachen der Progression einer Krebserkrankung in einem Individuum, das sich einer therapeutischen Behandlung unterzieht, unter Verwendung von EMT Biomarkern, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontaktbringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; und Korrelieren des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit der Progression der Krebserkrankung in dem Individuum, wobei das Individuum als Individuum mit einer Progression der Krebserkrankung identifiziert wird, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzellen im Vergleich zu dem Anteil der zirkulierenden Tumorzellen in einer früheren biologischen Probe von dem Individuum erhöht ist. Das Verfahren kann ferner die Verabreichung einer Therapie gegen die Krebserkrankung an das Individuum, das als krebserkrankt identifiziert wurde, umfassen.
  • Verfahren zum Bestimmen einer Krebsprognose in einem Individuum
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Bestimmen einer Krebsprognose in einem Individuum unter Verwendung von EMT-Biomarkern, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um den Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit einem Referenzwert für zirkulierende Tumorzellen; und Bestimmen der Krebsprognose in dem Individuum, wobei das Individuum als Individuum mit einer Krebserkrankung identifiziert wird, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzellen höher ist als der Referenzwert der zirkulierenden Tumorzellen. Das Verfahren kann weiterhin die Verabreichung einer Therapie gegen die Krebserkrankung an das Individuum, das als krebserkrankt identifiziert wurde, umfassen.
  • Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums mit einer Krebserkrankung auf einen Behandlungsverlauf
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums mit einer Krebserkrankung auf einen Behandlungsverlauf unter Verwendung von EMT-Biomarkern, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst die Entnahme einer biologischen Probe von einem Patienten; das Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein mit einer festen Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um den Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen EMT-Biomarker auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen (Einfangen) der intakten Zelle; Bestimmen des Anteils zirkulierender Tumorzellen in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; und Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzellen mit einem Referenzwert für zirkulierende Tumorzellen.
  • Behandlung
  • Das Individuum, das in den oben beschriebenen Verfahren als Individuum identifiziert wurde, das einen Anteil an zirkulierenden Tumorzellen aufweist, der höher ist oder genauso hoch ist wie ein Referenzwert, wird als Krebspatient identifiziert. Das Individuum wird anschließend wegen der Krebserkrankung behandelt.
  • a) Prostatakrebs
  • Das Individuum, das in den oben beschriebenen Verfahren als Individuum identifiziert wurde, das Anteile zirkulierender Tumorzellen aufweist, die höher oder genauso hoch wie ein Referenzwert sind, wird als Patient mit Prostatakrebs identifiziert. Das Individuum wird anschließend wegen des Prostatakrebses behandelt. Behandlungen können umfassen: Beobachtendes Abwarten oder Aktive Beobachtung, Operation, Kryochirurgie, Intensiver fokussierter Ultraschall, Bestrahlung, Hormontherapie, Chemotherapie und gezielte Therapie. Beispiele für Operationen umfassen pelvine Lymphadenektomie, radikale Prostatektomie (retropubische Prostatektomie und perineale Prostatektomie), transurethrale Resektion der Prostata und laparoskopische Prostatektomie. Beispiele für Strahlentherapie umfassen hoch energetische Röntgenstrahlung (externe und interne Strahlentherapie), Protonenbestrahlung und Intensitätsmodulierte Strahlentherapie. Beispiele für eine Hormontherapie umfassen Luteinisierendes Hormon-Releasing Hormon-Agonisten, wie Leuprolid (Lupron, Eligard), Goserelin, Triptorelin (Trelstar), Histrelin (Vantas) und Buserelin, Antiandrogene, wie Flutamid, Bicalutamid (Casodex), und Nilutamid (Nilandron), Ketoconazol, Orchiektomie, Östrogen und Aminoglutethimid. Beispiele für chemotherapeutische Arzneimittel umfassen Abirateronacetat (Zytiga), Cabazitaxel, Degarelix, Docetaxel, Enzalutamid (Xtandi), Cabazitaxel (Jevtana), Leuprolidacetat (Lupron, Lupron Depot, Lupron Depot-3 Month, Lupron Depot-4 Month, Lupron Depot-Ped, Viadur), Prednison, Sipuleucel-T (Provenge), Estramustin (Emcyt), Mitoxantron (Novantrone), Vinorelbin (Navelbine), Paclitaxel (Taxol), Cyclophosphamid (Cytoxan), Etoposid (VP-16), G-1 (ein GPR30 Agonist/Stimulator) und Docetaxel (Taxotere).
  • b) Brustkrebs
  • Das Individuum, das in den oben beschriebenen Verfahren als Individuum identifiziert wurde, das Anteile zirkulierender Tumorzellen aufweist, die höher oder genauso hoch wie ein Referenzwert sind, wird als Patient mit Brustkrebs identifiziert. Das Individuum wird anschließend wegen Brustkrebs behandelt. Behandlungen können umfassen: Operation, Bestrahlungstherapie, Knochen-gerichtete Therapie, Chemotherapie, Hormontherapie und gezielte Therapie. Beispiele für Operationen umfassen Lumpektomie, Quadrantenektomie, Mastektomie, wie einfache Mastektomie, hautsparende Mastektomie, modifizierte radikale Mastektomie, prophylaktische Mastektomie und radikale Mastektomie, prophylaktische Entfernung des Ovars, Kryotherapie und Lymphknotenchirurgie, wie axilliäre Lymphknotendissektion und Wächter-Lymphknoten-Biopsie. Beispiele für Bestrahlungstherapie umfassen externe Bestrahlung, wie beschleunigte Brustbestrahlung und 3D-konformale Strahlentherapie und Brachytherapie (interne Bestrahlung), wie interstitielle Brachytherapie, intrakavitäre Brachytherapie und intraoperative Bestrahlung. Beispiele für Knochen-gerichtete Therapie umfassen Bisphosphonate und Denosumab. Beispiele für Chemotherapie umfassen Anthracycline, wie Doxorubicin (Adriamycin, Doxil), Epirubicin (Ellence), und Daunorubicin (Cerubidine, DaunoXome), Capecitabine (Xeloda), Carboplatin (Paraplatin), Cisplatin, Cyclophosphamid (Cytoxan), Eribulin (Halaven), Fluorouracil (auch 5-fluorouracil oder 5-FU genannt; Adrucil), Gemcitabin (Gemzar), Ixabepilon (Ixempra), Methotrexat (Amethopterin, Mexate, Folex), Mitoxantron (Novantrone), Mutamycin (Mitomycin), Taxane, wie Paclitaxel (Taxol, Abraxane), und Docetaxel (Taxotere), Thiotepa (Thioplex), Vincristin (Oncovin, Vincasar PES, Vincrex), und Vinorelbin (Navelbine). Beispiele für Hormontherapie umfassen Aromataseinhibitoren, wie Anastrozol (Arimidex), Exemestan (Aromasin), und Letrozol (Femara), selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERM), wie Tamoxifen (Nolvadex), Raloxifen (Evista) und Toremifen (Fareston) und Wirkstoffe, die den Östrogenrezeptor herunter regulieren, wie Fulvestrant (Faslodex). Beispiele für gezielte Therapie umfassen Trastuzumab (Herceptin), Lapatinib (Tykerb), Bevacizumab (Avastin), Pertuzumab (Perjeta) und Everolimus (Afinitor).
  • Kits
  • Hierin zur Verfügung gestellt wird ein Kit, der verwendet werden kann, um CTCs aus einer Probe zu isolieren, zu erfassen (einzufangen) oder anzureichern. Der Kit umfasst wenigstens eine Komponente zum Isolieren, Erfassen oder Anreichern von CTCs aus einer Probe und Anweisungen (eine Gebrauchsanweisung) zum Isolieren, Erfassen und Anreichern von CTCs aus einer Probe. Während es sich bei den Anweisungen üblicherweise um geschriebenes oder gedrucktes Material handelt, sind diese nicht darauf beschränkt. Jedes Medium, das im Stande ist, derartige Anweisungen zu speichern und sie dem Endverbraucher zu übermitteln, ist durch diese Offenbarung vorgesehen. Solche Medien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: elektronische Speichermedien (z. B. magentische Disketten, Bänder, Kassetten, Chips), optische Medien (z. B. CD ROM) und dergleichen. Wie hierin verwendet, kann der Begriff „Anweisungen“ („Gebrauchsanweisung“) die Adresse einer Internetseite umfassen, welche die Anweisungen zur Verfügung stellt.
  • Die wenigstens eine Komponente kann wenigstens einen Antikörper umfassen, der spezifisch an wenigstens einen EMT Biomarker bindet. Der Antikörper kann ein EMT Biomarker-Fänger-Antikörper sein. Der Antikörper kann einen Antikörper gegen OB-Cadherin oder N-Cadherin umfassen. Der Antikörper kann mit einen festen Trägermaterial verbunden sein. Das feste Trägermaterial kann eine magnetische Kugel (bead) sein. Die magnetische Kugel kann zur ferromagnetischen Trennung und Anreicherung von CTCs verwendet werden.
  • Der Kit kann auch wenigstens ein Färbereagenz umfassen. Das wenigstens eine Färbereagenz kann einen Antikörper umfassen, der mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist. Der Antikörper kann einen Antikörper gegen einen Biomarker umfassen, der verwendet wird, um die CTC zu bestätigen. Der Biomarker kann β-Catenin, CD45 oder CD31 sein. Das wenigstens eine Färbereagenz kann einen Phycoerythrin-markierten Anti-β-Catenin Antikörper und einen Allophycocyanin-markierten Anti-CD45 Antikörper umfassen.
  • Der Kit kann außerdem einen Kalibrator oder eine Kontrolle und/oder wenigstens einen Behälter zum Durchführen der Isolierung, Erfassung und Anreicherung von CTCs umfassen. Der Kit kann sämtliche Komponenten umfassen, d. h., Reagenzien, Standards, Puffer, Verdünnungsmittel, usw., die notwendig sind, um die Isolierung, Erfassung und Anreicherung von CTCs durchzuführen.
  • Sofern hierin nicht anders definiert, sollen die wissenschaftlichen und technischen Begriffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, die Bedeutungen haben, die üblicherweise von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden. Zum Beispiel handelt es sich bei jeglichen Nomenklaturen, die verwendet werden im Zusammenhang mit, und Methoden für, die hierin beschriebene Zell- und Gewebekultur, Molekularbiologie, Immunologie, Mikrobiologie, Genetik und Protein- und Nukleinsäure-Chemie und Hybridisierung, diejenigen sein, die auf dem Gebiet bekannt und gewöhnlich verwendet werden. Die Bedeutung und der Umfang der Begriffe sollte klar sein; im Falle jedoch irgendeiner latenten Uneindeutigkeit haben die hierin zur Verfügung gestellten Definitionen Vorrang vor irgendeiner Wörterbuch- oder externen Definition. Sofern der Inhalt nichts anderes erfordert, sollen ferner Begriffe in Singular Vielzahlen umfassen und Begriffe im Plural sollen den Singular umfassen.
  • Bei der Nennung nummerischer Bereiche hierin ist jede dazwischen liegende Zahl mit demselben Präzisionsgrad explizit vorgesehen. Zum Beispiel sind in dem Bereich von 6–9 die Zahlen 7 und 8 zusätzlich zu 6 und 9 vorgesehen, und für den Bereich 6,0–7,0 sind die Zahlen 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 und 7,0 explizit vorgesehen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1. Material und Methoden
  • Plasmide und Zellkulturen. Das verwendete Minigen (pRIIIcl2) wurde zuvor beschrieben (S. Oltean et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 14116, durch Verweis in Gänze Bestandteil dieser Anmeldung). Sämtliche Zelllinien wurden in Low Glucose DMEM (Invitrogen) mit 10% FBS und 15 IJg/ml Blasticidin kultiviert. Einzelzellnachkommen wurden mittels limitierter Verdünnung einer Population von AT3 Zellen, die stabil mit dem pRIIIcl2 Minigen transfiziert wurden, isoliert, um eine Konzentration von 1 Zelle/10 Vertiefungen (wells) herzustellen und auf 96-Well-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt, um eine Anfangskonzentration von 1 × 105 Zellen/ml zu erhalten. Durch eine Reihe schrittweiser Verdünnungen wurde eine Endkonzentration von 1 Zelle/ml erhalten und 100 IJI wurden in jede Vertiefung von drei 96-Well-Platten pipettiert. Sämtliche Vertiefungen wurden mittels Hellfeldmikroskopie kontrolliert. Diejenigen, die mehr als eine Zelle zu enthalten schienen, wurden ausgeschlossen und diejenigen, die einzelne Zellen enthielten, wurden in 25 ml-Flaschen weiter kultiviert. 16 von erwarteten 27 Klonen wurden unter Verwendung dieser Prozedur in der ersten Runde erhalten.
  • Um die Wachstumsrate der Zellpopulation in vitro zu messen, wurden die Zellen mit 50.000/Vertiefung in 6-Well-Platten ausplattiert. Lebende Zellen wurden unter Verwendung einer Färbung mit Trypan Blau nach 24, 48, 72 und 96 Std. gezählt.
  • Tiere und Tumorzellimplantation. Die Zellen wurden trypsiniert, gewaschen und in PBS mit einer Endkonzentration von 3 × 105 Zellen/ml resuspendiert und für weniger als 30 Minuten vor der Implantation auf Eis gehalten. Die Zellen (3 × 105) wurden subkutan in beide Flanken von Copenhagen 2331 Ratten (Harlan Labs, Indianapolis, IN; 75–90 g, 2 Monate alt) injiziert. Die Tiere wurden kontinuierlich auf Tumorwachstum kontrolliert. Sämtliche Tierprozeduren wurden von dem Duke University Institutional and Animal Care and Use Komitee genehmigt und folgten den NIH-Richtlinien. Die Verlustkurven wurden unter Verwendung eines Mantel Haenszel Logrank-Tests verglichen. Das Tumorvolumen wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Testes verglichen. Prism 4.0c für Macintosh (Graphpad, La Jolla, CA) wurde für die statistischen Analysen verwendet.
  • Histologische Schnitte und Analyse. Entnommene Tumore und Lungen wurden bei Raumtemperatur in PBS gewaschen. Abhängig von der Größe der Lungen wurden diese entweder zusammen oder getrennt eingefroren. Die Tumorschnitte und die Lungen wurden in Cryomold-Einbettschälchen gelegt, in Optimal-cutting-temperature Tissue Sectioning Medium (Sakura Finetek, Torrance, CA) eingebettet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 80°C gelagert. Die Objektträger für die Fluoreszenzbildgebung wurden wie folgt hergestellt: Das Gewebe wurde für 2–3 Std. bei –20°C inkubiert, um die Temperatur auszugleichen, und anschließend mit einem Mikrotom geschnitten. Die Schnitte (15 µm) wurden auf Glasobjektträger aufgebracht, in 4% (wt/vol) Paraformaldehyd für 30 Min. bei Raumtemperatur fixiert und bei Raumtemperatur in PBS gespült. Die Objektträger wurden mit Gel/Mount Media (Biomeda, Foster City, CA) eingedeckt. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Olympus (Melville, NY) IX 71 Epiluoreszenzmikroskops analysiert, und die Bilder wurden durch Verwenden einer Olympus DP70 Digitalkamera erfasst. Die Bildverarbeitung wurde mit Hilfe der DP Controller Software (Olympus) durchgeführt. Für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung nach der Fluoreszenzbildgebung wurden die Objektträger Wasser für 15–20 Minuten in warmem inkubiert, damit sich das Deckgläschen löst, die Objektträger wurden getrocknet, und die Färbung wurde gemäß einem Standardverfahren durchgeführt.
  • RNA-Extraktion aus Tumorschnitten. Die Schnitte wurden in 4% (wt/vol) Paraformaldehyd für 5 Minuten fixiert, in PBS gespült und abgebildet. DsRED+ und DsRED Bereiche der Schnitte wurden auf dem Objektträger markiert. Der Objektträger wurde für 5 Minuten in warmes Wasser getaucht, um die Deckgläschen zu entfernen, und die DsRED+ und DsRED-Bereiche abgeschabt. Die RNA-Isolierung wurde im Weiteren wie zuvor beschrieben durchgeführt (N. Masuda, T. Ohnishi, S. Kawamoto, M. Monden, K. Okubo, Nucleic Acids Res 1999, 27, 4436, durch Verweis in Gänze Bestandteil dieser Anmeldung). Kurz beschrieben, wurden die Proben mit Proteinase K in Verdauungspuffer enthaltend SDS behandelt, und die weitere Isolation der RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA) durchgeführt.
  • Immunblots. Zellen wurden durch Abschaben aus konfluenten 25 cm2 Gewebeflaschen gewonnen, in PBS gewaschen und in Probenpuffer lysiert. Die Gesamtzellenlysate wurden seriell in Probenpuffer verdünnt, über 7,5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF transferiert. Die Membranen wurden in Hälften geschnitten. Die untere Hälfte wurde mit anti-β-Actin mit 1:1.000 oder 1:5.000 (Santa Cruz Biotechnology, CA, 47778) als Probe getestet, als interne Beladungskontrolle, während die obere Hälfte mit anti-CD 133 (Santa Cruz Biotechnology, CA, 30219) mit 1:200 oder anti-CD44 (Santa Cruz Biuotechnology, CA, 7946) bei 1:200 als Probe untersucht wurde.
  • Genexpressionsanalyse. Dreifache Kulturen von AT3-M und AT3-T Zellen wurden bis –60% Konfluenz wachsen gelassen. Gesamt RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA) isoliert, und dreifache Proben wurden an die Duke Microarray Facility geschickt. Die Genexpressionsanalysen wurden unter Verwendung des R027K Rat Spotted Arrays 3.0 (Operon, Huntsville, AL) durchgeführt. Die bioinformatische Analyse der Expressionsunterschiede zwischen AT3-M und AT3-T Zellen wurden durchgeführt unter Verwendung der GeneSpring GX-Software Version 7.3.1 (Agilent Technologies, Durham, NC). Die Dateien (die Signale für 26.986 Genproben in allen sechs Datenpunkten, drei für AT3-M und drei für AT3-T repräsentieren) wurden normalisiert unter Verwendung des Merkmals: Pro Spot und Pro Chip-Intensitäts-abhängige (Iowess) Normalisierung. Die resultierende Genliste wurde verwendet, um die zwischen AT3-M und AT3-T signifikant unterschiedlich exprimierten Gene zu bestimmen, unter Verwendung des „Filtering on Volcano Plot“ Merkmals, mit den folgenden Eigenschaften: (1) Testart: parametrischer Test, nahm die Varianten nicht als gleich an; (2) Mehrfachprüfung-Korrektur: keine; (3) x-facher Unterschied: Zweifach oder größer und ein P-Wert Cutoff von 0,05.
  • Analyse der humanen zirkulierenden Tumorzellen. Patienten, die für die CTC-Biomarker-Protokolle geeignet waren, umfassten (1) Männer mit progressivem CRPC, mit metastasiertem Fortschreiten gemäß PSA (zwei aufeinander folgende Erhöhungen über dem Nadir im Absatnd von > 1 Woche) oder radiologische Kriterien (RECIST oder neue Knochenläsionen im Szintigramm), PSA ≥ 5, Alter ≥ 18 Jahre; oder (2) Frauen mit mBC mit einer Progression der Erkrankung oder mit Beginn einer neuen systemischen Therapie, die ein Alter von > 18 Jahre hatten und die wenigstens 7 Tage ohne Behandlung mit einem Anthrazyclin-enthaltenden Behandlungsschema waren. Denn Patienten wurde Blut (15 ml) entnommen und innerhalb von 48 Stunden im CTC-Labor der Duke University unter Verwendung des Cell Search System (Veridex, Raritan, NJ) verarbeitet. Veridex Profile Kits wurden verwendet, die EpCAM positive Zellen ohne zusätzliche Färbung isolieren. Die isolierten Zellen wurden entweder sofort verarbeitet oder über Nacht in 4% Paraformaldehyd gelagert und am nächsten Tag verarbeitet. Die Immunfärbung wurde auf mit Teflon beschichteten Objektträgern durchgeführt. Kurz beschrieben, wurden die Zellen in die Vertiefungen der Objektträger pipettiert und ~30 Minuten ruhen gelassen, gefolgt von Standard-Immunfärbeverfahren mit vorsichtiger Aspiration, um den Zellverlust zu minimieren. Ein erster ferromagnetischer Waschschritt unter Verwendung eines Benchtop-Magneten wurde durchgeführt, um CTCs weiter zu isolieren, wobei das Zellpellet nach dem Lösen des Magneten in 100 µl PBS resuspendiert wurde. Nach der Fixierung in 4% PFA und der Permeabilisierung mit PBT (PBS mit 2% Triton) und dem Blockieren mit 10% Ziegenserum für 30 Minuten, wurde eine dreifache Immunfärbung unter Verwendung des CD45-Antikörpers (AbCam #33533-50), markiert mit Alexa 647, Cytokeratin (AbD Serotec #MCA 1907HT), markiert mit Alexa 555 und Vimentin (BD Biosciences, San Jose, CA #550513), markiert mit Alexa 488, durchgeführt. Eine Zellkernfärbung mit 4‘,6-Diamidin-2phenylindol (DAPI) wurde mittels mikroskopischer Untersuchung definiert als eine intakte Zelle, die einen intakten Nukleus enthält und Cytokeratin exprimiert, jedoch keine CD45-Färbung aufweist, unter Verwendung geeigneter Kontrollen (siehe Tabelle 1 für Antikörper und Kontrollen). Humane, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die mittels Ficoll-Reinigung aus Buffy-Coats normaler Spender gewonnen wurden, wurden freundlicherweise von Micah Luftig (Duke University, Durham NC) zur Verfügung gestellt und als Kontrollzellen für die CD45 Expression verwendet. Lineare Regressionsanalyse wurde durchgeführt, um die CTC-Zählung (Standard Cellsearch-Verfahren) dem Anteil der CTCs, die Vimentin koexprimieren, vergleichend gegenüberzustellen. Die Anpassungsgüte (Goodness of fit) wurde durch Analyse der Varianz getestet. Tabelle 1. EMT/Stammzell-artige Antigene, die in CTCs festgestellt werden sollen.
    Antigen Produkt Positive Kontrolle Negative Kontrolle Leukocyt-Expression Verdünnung
    Vimentin BD Biosciences, Maus monoklonaler IgG1 PBMCs, PC-3, DUl45 T47D, LnCAP Ja 2:225
    N-Cadherin DAKO, Maus monoklonaler IgG1, 6G11 Sarkom, Rattenhirn, PC-3 DU145, T47D, Mock-Kontrolle Nein 4:225
    Cytokeratin (pan) AbD Serotec, Maus monoklonaler IgG1, MCAI907HT, Klon AEI/AE3 T47D, DUl45 PC-3, PBMCs Nein 2:45
    CD45 Invitrogen, Maus IgG1, HI30, MHCD4500 PBMC PC-3, DUl45 Ja 1:45
    CD133 Santa Cruz Maus monoklonaler IgG, sc-130127 CaCo-2 Kolonkrebszellen Mock-Kontrolle Variabel 4:225
  • Die Objektträger wurden mit Gel/Mount Media (Biomeda, Foster City, CA) eingedeckt. Die Objektträger wurden mit einem Olympus (Melville, NY) IX 71 Epiluoreszenzmikroskop analysiert, und die Bilder wurden unter Verwendung einer Olympus DP70 Digitalkamera erfasst. Die Bildverarbeitung wurde mit Hilfe der DP-Controller Software (Olympus) durchgeführt. Sämtliche Felder wurden analysiert, wobei jede Cytokeratin positive kernhaltige Zelle, die CD45 negativ war, als CTC gezählt wurde. Positive Kontrollzellen für jeden Antikörper umfassten PC-3 Zellen für Vimentin, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) für CD45 und T47D Brustkrebszelllinien für Cytokeratin. Eine ähnliche Menge einer Reaktionsmischung ohne Antikörper wurde für negative Kontrollen verwendet.
  • Mediumaustauschexperimente. Die Zellen der AT3-T oder AT3-M Klone wurden mit einer Konzentration von 150.000 Zellen/2 ml Medium in 6-Well-Platten ausplattiert und 24 Std. inkubieren gelassen. Das konditionierte Medium wurde anschließend unter Verwendung eines 0,22 µm Filters gefiltert und dann sofort mit Zellen des anderen Klons inkubieren gelassen, die mit derselben Konzentration ausplattiert wurden und deren Medium aspiriert wurde und die Zellen mit 2 ml PBS gewaschen wurden. Sämtliche Zellen mit ausgetauschtem Medium wurden 72 Std. inkubiert, und Phasen- und Epifluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die Zellphänotypen 24, 48 und 72 Std. nach der Behandlung zu überprüfen. Kontrollplatten, in denen das Medium konditioniert war, die Zellen mit PBS gewaschen wurden und Medium zurück zu denselben Zellen gegeben wurde, wurden ebenfalls verwendet.
  • Scratch Wound Assay. Zellen wurden aufplattiert und bis zu einer Konfluenz von fast 100% in 6-Well Platten wachsen gelassen. Eine Wunde wurde simuliert, indem die Zellen mit einer sterilen 200 IJI Pipettenspitze abgeschabt wurden. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und frisches Medium dazugegeben. Bilder wurden an derselben markierten Stelle nach 0, 24 und 48 Std. aufgenommen. Die prozentuale Migration wurde berechnet als (Weite nach 0 Std. – Weite nach 24 oder 48 Std.) l Weite nach 0 Std. x 100. Die relative Migration wurde verglichen, indem mittels Prism 4.0c für Macintosh (Graphpad, La Jolla, CA) eine Zweiwege-Analyse der Varianz verwendet wurde.
  • Matrigel Assay. Ein Matrigel Assay wurde gemäß den Angaben des Herstellers (BD Biosciences) durchgeführt. Kurz beschrieben, wurden 2 × 105 Zellen nach der Rehydrierung entweder in die Kontrolleinsätze oder in die mit Matrigel beschichteten Einsätze gegeben und für 22 Std. inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nicht-einwandernden Zellen aus dem oberen Teil der Einsätze durch Verwenden von Wattestäbchen entfernt. Die Zellen von dem unteren Teil der Membran wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, die Membranen wurden entfernt, auf einen Objektträger aufgebracht und unter dem Mikroskop beobachtet.
  • Innumhistochemische (IHC) Analyse von Metastasen. Gedeckt durch dieselbe informierte Einwilligungserklärung wie bei der Analyse der humanen zirkulierenden Tumorzellen oben beschrieben, haben Männer, die sich der CTC-Entnahme unterzogen haben, zusätzlich einer radiologisch gesteuerten Biopsie einer Metastase für die Analyse der Biomarker Expression mittels IHC zugestimmt. Proben wurden durch Stanzbiopsien während leichter Sedierung entnommen und sofort in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Für die Analysen wurden die Objektträger entparaffinisiert, rehydriert und die endogene Peroxidase für 30 Min. in 0,3% H2O2 (Wasserstoffperoxid) in Methanol inaktiviert. Spezifische Antigen-Wiederherstellungsschritte wurden für die einzelnen Antigene durchgeführt. Drei Marker wurden mittels IHC untersucht: Vimentin (M7020, Dako, 1:150; Antigen-Wiederherstellung mittels Pepsinbehandlung bei 37°C für 15 Minuten), Cytokeratin-Cocktail (18-0132, Invitrogen, 1:50 und 349205, BD Biosciences 1:50, Antigen-Wiederherstellung mittels Pepsinbehandlung bei 37°C für 15 Minuten) und CD45 (M0701, Dako, 1:200; Antigen-Wiederherstellung mit Hilfe von Natriumzitrat 10 mM, pH 6,0 bei 100°C für 30 Minuten). Der Primärantikörper wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Dako Envision Horseradish Peroxidase sekundäre Antikörper wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur verwendet, und das Signal wurde mit Hilfe des DAB-Reagenz (Vektor Kit SK 4100) detektiert. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt und durch einen geschulten Pathologen unter Verwendung geeigneter positiver (Microarray-Schnitte von lokalisiertem Prostatagewebe) und negativer Kontroller (Mock-Antikörper) für jeden Marker auf Expression hin untersucht.
  • Statistische Analysen. Um die in signifikanter Weise differenziell exprimierten Gene zwischen AT3-M und AT3-T zu bestimmen, wurde das GeneSpring GX „Filtering on Volcano Plot“-Merkmal mit den folgenden Eigenschaften verwendet: (1) Testart: parametrischer Test, Varianten nicht als gleich annehmen; (2) Mehrfachtest-Korrektur: keine; (3) x-facher Unterschied: zweifach oder größer und P-Wert Cutoff von 0,05. Um die CTC-Zählung (Standard CELLSEARCH®-Verfahren) dem Anteil von CTCs, die Vimentin, N-Cadherin oder CD133 koexprimieren, gegenüberzustellen, wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Die Anpassung (Goodness of fit) wurde durch Analyse der Varianz getestet.
  • Beispiel 2. Isolation einzelner AT3 Klone, die sich in einem intermediären phänotypischen Zustand befinden.
  • Das alternative Speißen von FGFR2 Transkripten, das in epithelialen bzw. mesenchymalen Zellen entweder FGFR2-IIIb oder -IIIc Varianten erzeugt, wird aufwändig reguliert (1A). 1A ist eine schematische Darstellung der IIIb und IIIc alternativ gespleißten Isoformen von FGFR2. FGFR2 enthält eine extrazelluläre Domäne (mit drei IgG-ähnlichen Domänen), eine Transmembrandomäne (TM) und zwei intrazelluläre Tyrosinkinase-Domänen. Die IIIb-Isoform ist in epithelialen Zellen zu finden, während die IIIc-Isoform in mesenchymalen Zellen zu finden ist. Die Exons IIIb und IIIc werden in koordinierter Weise reguliert, um für eine sich gegenseitig ausschließende Expression der beiden Isoformen zu sorgen, und Transkripte, die beide Exons enthalten, werden durch Nonsense-mediated Decay destabilisiert. Wir haben früher Reporter für FGFR2 alternatives Spleißing verwendet, insbesondere Konstrukte, welche das Epithelial-spezifische Auschalten (silencing) von Exon IIIc messen (z. B. pRIIIcl2 in 1B), um über den phänotypischen Zustand von Zellen in vitro und in vivo zu berichten. In 1B ist eine schematische Darstellung des pRIIIcl2 Minigens und der Fluoreszenzanzeige zu sehen. Das Minigen enthält den offenen Leserahmen von DsRED, unterbrochen durch Exon IIIc und flankierende Introns des FGFR2-Gens. In epithelialen Zellen wird das Exon IIIc übersprungen, der offene Leserahmen von DsRED wird gebildet und resultiert in einem Fluoreszenzsignal. In mesenchymalen Zellen wird das Exon IIIc eingeschlossen, und der offene Leserahmen von DsRED ist unterbrochen, was in einem geringen oder fast dem Hintergrund entsprechenden Fluoreszenzsignal resultiert. Der pRIIIcl2 Splicing Reporter, der eine Variante des Red Fluorescence Protein (DsRED) erzeugt, zeigte MET in Primärtumoren, die von AT3 Zellen stammten, die in die Schenkel von weißen Copenhagen Ratten implantiert wurden. Während die meisten Tumore MET Foki enthielten, hatte jeder Tumor sehr wenige Foki und diese waren nicht zufällig verteilt, sondern eher mit kollagenem Stroma assoziiert. Im Gegensatz zu der geringen Häufigkeit von MET in Primärtumoren wurde eine hohe Inzidenz von MET in Lungenmetastasen dieser Tiere beobachtet, was einen unerwarteten Zusammenhang zwischen dem eher epithelialen Phänotyp und aggressivem Verhalten nahelegt. Diese Studien konnten nicht einwandfrei feststellen, ob die Epithelial-ähnlichen AT3 Zellen, die in der Lunge vorhanden waren, die MET in den Primärtumoren oder während des Vorgangs der Metastasierung durchgemacht hatten.
  • In dem Bestreben, Post-MET-Zellen in vitro zu finden, wude limitierende Verdünnung verwendet, um Klone von den AT3 Zellen zu erhalten, die mit dem pRIIIcl2 Reporter stabil tranfiziert waren. Insgesamt 16 Klone von einem berechneten Maximum der Ausbeute von 27 wurden erhalten, was einer ~60%-igen Klonierungseffizienz entspricht. Elf dieser sechzehn Klone exprimierten pRIIIcl2 Transkripte (in Tabelle 2 kursiv gedruckt) und von diesen exprimierten acht DsRED (Tabelle 2). Einige der Klone hatten eine Epithelial-ähnliche Morphologie (Zellen mit Kopfsteinpflaster-Erscheinung und adhärent zueinander), während andere eine Mesenchymal-ähnliche Morphologie (spindelförmig) hatten, ebenso wie Klone, die einen gemischten Phänotyp zeigten. Es ist wichtig zu beachten, dass es angesichts der hohen Klonierungseffizienz und der großen Häufigkeit von DsRED+ Klonen sehr unwahrscheinlich ist, dass diese Epithelial-ähnlichen Klone aus einer sehr kleinen Population innerhalb der parentalen AT3 Zellen stammen. Eher hat der Vorgang der Subklonierung eine phänotyische Transition in einer signifikanten Anzahl von AT3 Zellen induziert. Tabelle 2. Eigenschaften von AT3 Klone.
    AT3 Klone Zelluläre Morphologie3 DsRED Expression2 Nachweis eines ausgelassenen Exon IIIc unter RIIIcI3- Transkripten1 Nachgewiese FGFR2-Transkripte3
    1 Epithelial hoch + IIIc
    2 Epithelial hoch + IIIc > IIIb
    3 Epithelial niedrig ND IIIc > IIIb
    4 Epithelial niedrig ND IIIc
    5 Epithelial hoch + IIIc > IIIb
    6 Mesenchymal niedrig ND IIIc
    7 Gemischt niedrig ND IIIc
    8 Gemischt hoch + IIIc
    9 Gemischt niedrig ND IIIc
    10 Gemischt hoch + IIIc
    11 Mesenchymal niedrig – IIIc
    12 Mesenchymal niedrig – IIIc
    13 Epithelial hoch –1 IIIc > IIIb
    14 Epithelial niedrig – IIIc
    15 Epithelial hoch + IIIc
    16 Gemischt hoch –2 IIIc
    1Siehe 1C. Ein “+” zeigt den Nachweis von RIIIcI2 Transkripten an, denen das Exon IIIc fehlt, ein “–” sämtliche RIIIcI2 Transkripte enthalten Exon IIIc, ND bedeutet, dass keine RIIIcI2 Transkripte nachgewiesen wurden.
    2Bestimmt mittels Epifluoreszenzmikroskopie (hoch ist definiert als Fluoreszenz über dem Hintergrund von naiven AT3 Zellen und niedrig ist nicht unterscheidbar von denselben Zellen).
    3Hierin weiter besprochen und dargestellt in 1C.
  • Sämtliche durch limitierende Verdünnung erhaltene Klone wurden analysiert, um den Speißing-Status von pRIIIcl2 und endogenem FGFR2 Transkripten zu bestimmen. Wir konnten kein Überspringen des Exons IIIc unter den pRIIIcl2 Transkripten oder irgendeinen Nachweis für die Einbeziehung von Exon IIIb unter endogenen FGFR2 Transkripten in Klonen mit einer Mesenchymal-ähnlichen Morphologie nachweisen (1C und Tabelle 2). 1C zeigt die RT-PCR-Analyse des Reporters (oberer Bereich) und des endogenen FGFR2 (unterer Bereich). Die für den Reporter verwendeten Primer sind in den DsRED-Regionen angeordnet, die das Exon IIIc flankieren. Die RT-PCR zeigt einen höheren prozentualen Anteil für das übersprungene Produkt in Klon AT3-T im Vergleich zu Klon AT3-M. Reaktionen, die keine RT enthielten(-RT), offenbarten ein kontaminierendes Produkt, das durch Anwesenheit eines echten cDNA-Templates übertroffen wird (AT3-M Spuren). Da sich die Exons IIIb und IIIc in ihrer Größe nur durch 3 Nukleotide unterscheiden, wurde die Analyse des Vorhandenseins der IIIb oder IIIc Exons im FGFR2-Gen durch Verwenden von Primern in den flankierenden Exons und spezifischem Restriktionsverdau der resultierenden RT-PCR Produkte durchgeführt. Exon IIIb wird mit AvaI (A) und IIIc mit HincII (H) verdaut. In dem Klon AT3-T ist ein höherer Prozentanteil des Exons IIIb vorhanden. Die RT-PCR sind Replikate von drei verschiedenen Kulturen der beiden Klone. Diese Klone exprimierten keine nachweisbaren Mengen an DsRED (1D und Tabelle 2). 1D zeigt Epifluoreszenz- und Phasenkontrast-Bilder der Klone AT3-M und AT3-T zeigt den Unterschied in der Fluoreszenzintensität und Morphologie zwischen den beiden Klonen. Epifluoreszenzbilder wurden mit derselben Exposition gemacht. Sämtliche Bilder wurden bei 200-facher Vergrößerung erhalten. Während das Überspringen von Exon IIIc bei pRIIIcl2 Transkripten von Epithelial-ähnlichen Klonen erwartet werden konnte, war die Beobachtung, dass alle diese Klone Exon IIIc sowohl übersprungen als auch eingeschlossen hatten, unerwartet (1C, Tabelle 2 und nicht gezeigte Daten). Die Analyse endogener FGFR2 Transkripte offenbarte, dass vier der Klone mit epithelialer Morphologie und DsRED Expression einen klaren Hinweis auf Koexpression von beiden IIIb- und IIIc-Isoformen aufwiesen (Tabelle 2 und 1C und 1D). Wie in 1 gezeigt, exprimierten AT3-T Zellen epitheliale und mesenchymale Isoformen von FGFR2. Die Expression von DsRED in allen diesen Zellen legte nahe, dass jede Zelle in der Kultur beide Isoformen exprimierten (1C).
  • Wir haben zwei Klone mit epithelialer Morphologie, hohen Mengen an DsRED und Koexpression von FGFR2-IIIb und IIIc Transkripten weiterverfolgt (Klon 2 und Klon 5 (Klon 5 hierin AT3-T)) und stellten fest, dass die oben beschriebenen phänotypischen Eigenschaften länger als sechs Monate stabil waren. In gleicher Weise haben wir Klon 11 (Klon 11 hierin AT3-M) und Klon 12 sechs Monate lang weiterverfolgt und festgestellt, dass die mesenchymale Morphologie, nicht nachgewiesene DsRED Expression und ausschließliche Produktion von FGFR2-IIIc ebenso stabil waren. Wir schlussfolgerten aus diesen Beobachtungen, dass AT3 Zellen plastisch waren und durch die Subklonierung dazu gebracht wurden, intermediäre phänotypische Zustände anzunehmen, mit Eigenschaften von epithelialen und mesenchymalen Zellen.
  • Ein Medium-Austausch-Experiment wurde verwendet, um zu untersuchen, ob das Speißen von RIIIcI2 Transkripten in den DsRED exprimierenden Klonen durch lösliche Faktoren reguliert wurde oder nicht. Medium, das durch DsRED exprimierende Klone (Klon 5 in Tabelle 2) konditioniert war, wurde gefiltert und zu DsRED nagativen Klonen (Klon 11 in Tabelle 2) gegeben. DsRED+ Zellen wurden unter den mit DsRED+ konditioniertem Medium inkubierten DsRED-Zellen beobachtet (2). 2A zeigt Beispiele von Clustern DsRED positiver Zellen, die von AT3-M Zellen nach Behandlung mit konditioniertem Medium von Klon AT3-T gebildet wurden. Das Medium wurde 24 Std. lang konditioniert, gefiltert und zu AT3-M Zellen gegeben. Bilder (erhalten bei 200-facher Vergrößerung) wurden 48 Std. nach dem Medienwechsel gemacht. 2B zeigt die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse desselben Experiments. Der linke obere Bereich zeigt Klon AT3-M, konditioniert mit Medium von demselben Klon, als negative Kontrolle. Der rechte obere Bereich zeigt Klon AT3-T, der DsRED positiv ist. Der untere Bereich zeigt Klon AT3-M, 48 Std. nachdem konditioniertes Medium von dem Klon AT3-T dazugegeben wurde. Verschiedene Chargen von fötalem Rinderserum verursachten Schwankungen dieses Effektes. Dieser Effekt wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert und diese Daten legen nahe, dass etwa die Hälfte der DsRED-Zellen induziert wurden, DsRED in Mengen zu exprimieren, die den in DsRED+ Zellen beobachteten entsprechen (2). Die beobachteten Änderungen waren nicht zurückzuführen auf eine verlängerte Kultur der Zellen in denselben Vertiefungen, da konditioniertes Medium von einer seperaten DsRED-Kultur die DsRED Expression nicht induzierte. Wie in 2 gezeigt, induzierte AT3-T konditioniertes Medium AT3-M Zellen, DsRED zu exprimieren. Diese Beobachtungen legen nahe, dass lösliche Faktoren, die von den DsRED+ Klonen sezerniert werden, oder eine Verdünnung der Faktoren, die noch in den DsRED-konditionierten Medium vorhanden sind, zu der Plastizität beitragen können.
  • Beispiel 3. AT3-M und AT3-T Zellen sind tumorigen
  • Die erste Charakterisierung der AT3-T zeigte, dass diese transitionalen Zellen langsamer wuchsen und eine geringere konfluente Dichte als die AT3-M Zellen erreichten (3A). 3A zeigt die Wachstumskurven für die Klone AT3-T und AT3-M. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 Std. ausplattiert, trypsiniert und zu den angegebenen Zeitpunkten gezählt. Die Daten sind der Durchschnitt ± S.D. (Standardabweichung) (n = 3). Um ihr Wachstum in vivo zu untersuchen, wurden AT3-M und AT3-T Zellen mit pGint kotransfiziert, ein Plasmid, das EGFP (hierin GFP) sowohl in mesenchymalen als auch in epithelialen Zellen exprimiert, und sortierte stabile Populationen von jeder Zelllinie unter Verwendung von Durchflusszytometrie aufgrund uniformer GFP-Intensität. Die GFP-exprimierenden Zellen behielten ihre morphologischen Eigenschaften, die differenzierte DsRED Expression und die Unterschiede in dem Spleißen von pRIIIcl2 und FGFR2 Transkripten, die zuerst nach der Subklonierung beobachtet wurden.
  • Wir injizierten 3 × 105 GFP-exprimierende AT3-T oder AT3-M Zellen subkutan in beide Schenkel von männlichen weißen Copenhagen 2331 Ratten. Sämtliche Tiere entwickelten bilaterale Tumore, was zeigt, dass sowohl AT3-M als auch AT3-T Zellen in diesen syngenen Ratten hoch tumorigen waren. Als „humaner“ (möglichst schmerzloser) Endpunkt, wurden Ratten geopfert, wenn die durch Abtasten geschätzte Tumorlänge 1 cm erreichte. Die in vivo Wachstumskurven für die AT3-M und AT3-T Tumore waren signifikant unterschiedlich, wie mittels eines Logrank-Tests bestimmt (p = 0,0020; 3B). 3B ist eine Verlustkurve für Ratten, denen AT3-M oder AT3-T Zellen injiziert wurden. 3C zeigt ein Vergleich der Tumorvolumina, die aus der Injektion von AT3-T und AT3-M resultieren. Die Y-Achse zeigt die Tumorvolumina zum Zeitpunkt des Opferns der Tiere, und die X-Achse die Tage vom Zeitpunkt der Implantation bis zum Zeitpunkt des Opferns. Durchschnittliche Tumorvolumina und durchschnittliche Anzahl von Tagen bis zur Opferung sind durch Standardabweichungsbalken angezeigt. Einige Punkte repräsentieren mehr als einen Tumor mit demselben Volumen an demselben Tag. Das Tumorvolumen wurde gemessen (3C), und obwohl die meisten AT3-T Tiere später geopfert wurden, gab es keinen signifikanten Unterschied in der Tumorgröße (p = 0,76). Wie in 3 gezeigt, wuchsen AT3-T Zellen langsamer als die Mesenchymal-ähnlichen AT3-M Zellen in vitro und in vivo, jedoch waren beide in gleichem Maße tumorigen. Wir schlussfolgerten, dass obwohl AT3-T Zellen in vitro und in vivo im Vergleich zu ihren mesenchymaleren Geschwistern langsamer wuchsen, diese transitionalen Zellen fähig waren, Tumore zu bilden.
  • Beispiel 4. Sowohl AT3-M als auch AT3-T sind plastisch
  • Da die implantierten AT3-M und AT3-T Zellen anhand der GFP Expression verfolgt werden konnten, konnte der epitheliale Charakter mittels DsRED Expression abgefragt werden, die Plastizität der Tumore konnte untersucht werden. Die überwältigende Mehrheit der Zellen in AT3-M Tumoren exprimierte GFP, jedoch nicht DsRED (4A). Wie in 4 gezeigt, zeigen sowohl Tumore von AT3-T als auch von AT3-M Klonen Anzeichen für Plastizität. 4A zeigt ein repräsentatives Beispiel von Fällen, die sowohl RFP als auch GFP an der Peripherie eines AT3-M Tumors exprimieren, der stabil mit Gint und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurde. Die Bilder wurden bei 200-facher Vergrößerung gemacht. Um ein geringes RFP-Signal zu kompensieren, wurde die Farbkurve des gesamten Bildes angepasst. Nichtsdestotrotz wurden in zahlreichen AT3-M Tumorschnitten Zellgruppen beobachtet, die sowohl GFP als auch DsRED exprimieren, insbesondere nahe der Tumorkapsel (4A; siehe auch 5). 5 zeigt ein repräsentatives Beispiel für Zellen, die sowohl RFP als auch GFP an der Peripherie eines AT3-M Tumors exprimieren, der stabil mit Gint und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurde. Die Bilder wurden bei einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen. In dieser Version wurde das RFP-Gesamtsignal nicht über die Farbkurve angepasst, nachdem das Bild aufgenommen wurde. RFP positive Zellen lagen klar über dem Hintergrundlevel.
  • Viele Schnitte von AT3-T Tumoren koexprimierten GFP und DsRED; jedoch wurden in allen 64 untersuchten Schnitten große Bereiche beobachtet, die GFP, jedoch nicht DsRED exprimierten (4B). 4B zeigt ein repräsentatives Beispiel eines Schnittes von einem AT3-T Tumor, der stabil mit GFP und pRIIIcl2 Reportern transfiziert wurde. Die Bilder wurden bei 200-facher Vergrößerung aufgenommen. RNA, die aus diesen Bereichen der AT3-T Tumore extrahiert wurde, bestätigte das Vorhandensein des pRIIIcl2 Transkriptes. Sowohl AT3-T als auch AT3-M Zellen waren plastisch und erzeugten Tumore mit Zellen, die eine Reihe von epithelial-mesenchymalen Eigenschaften zeigten.
  • Beispiel 5. AT3-T Zellen sind motil in vitro und metastatisch in vivo
  • Ein Vergleich der Mobilität und des invasiven Potentials von AT3-T und AT3-M wurde in Kultur durchgeführt. Die Motilität wurde in der Kultur durch ein „Wound Closure“-Assay gemessen und kein signifikanter Unterschied in der Motilität (p = 0,59) wurde zwischen den Zelllinien 24 und 48 Stunden nachdem Scratch-Wound in den Kulturen durchgeführt wurde festgestellt (6). 6A zeigt ein repräsentatives Bild für das Scratch-Wundassay (Experiment dreifach für jeden Klon durchgeführt). Bilder wurden bei 40-facher Vergrößerung gemacht. 6B zeigt die Quantifizierung der Migration, wie im Methodenteil erläutert. Werte für Durchschnitt und Standardabweichung stammten aus Experimenten in dreifacher Ausführung. 6C zeigt ein Invasionsassay unter Verwendung von mit Matrigel beschichteten Membranen. Repräsentative Bilder für jeden Klon und sowohl für Kontrollmembranen als auch für Matrigel-beschichtete Membranen (n = 5). Zellen wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Bilder wurden bei 40-facher Vergrößerung gemacht. 6D zeigt die Quantifizierung der Ergebnisse des Invasionsassays. Werte für Durchschnitt und Standard-Abweichung stammen aus fünf einzelnen Experimenten. Um die invasiven Eigenschaften der Zellen zu beurteilen, haben wir die Anzahl der Zellen gemessen, die in einem 22-stündigen Zeitraum durch die Matrigel-Membranen hindurch gelangt sind. Dieselbe Anzahl von AT3-T und AT3-M Zellen wurde auf den Matrigel-Membranen beobachtet, was nahelegt, dass die beiden Zelllinien gleich fähig waren, in diese Membran einzudringen (6). Während eine höhere Anzahl von Zellen des AT3-T Klons im Vergleich zu dem Klon AT3-M auf der Kontrollmembran beobachtet wurde, zeigen diese Studien dennoch, dass die eher epithelialen AT3-T Zellen eine ähnliche Motilität und ein ähnliches invasives Potential wie die AT3-M Zellen hatten. Wie in 6 gezeigt, zeigten AT3-M und AT3-T Zellen eine ähnliche Migration in vitro.
  • Um die Invasivität in vivo zu bestimmen, wurden die Lungen von zwanzig Tieren mit AT3-M und AT3-T Tumoren auf das Vorhandensein metastatischer Foki untersucht. Keine makroskopischen metastatischen Knoten wurden in den Lungen beobachtet, was wahrscheinlich auf das Opferungsprotokoll zurückgeht, das auf die Tiere angewandt wurde, wenn die Tumore eine bestimmte Größe erreicht hatten, anstatt das Überleben als Endpunkt zu verwenden. Die GFP Expression von dem Gint-Reporter wurde untersucht, um das Vorhandensein von Mikrometastasen mittels Epifluoreszenzmikroskopie zu bewerten. Um eine umfassende Bewertung sicherzustellen, wurden 7–8 Schnitte von jeder Lunge in ähnlichem Abstand untersucht (insgesamt 150 Schnitte für jeden Klon). Das Vorhandensein von metastatischen Foki wurde mittels GFP-Fluoreszenz bestimmt, gefolgt von einer Gegenfärbung der Schnitte mit Hämatoxylin-Eosin (7). 7A zeigt (oberer Bereich) ein Beispiel eines Schnittes, der das erwartete Muster für Klon AT3-T (d. h., GFP+, DsRED+) in einem metastatischen Fokus zeigt und (unterer Bereich) ein Beispiel eines Schnittes, der ein plastisches Muster für Klon AT3-T (d. h., GFP+, DsRED–) in einem metastatischen Fokus zeigt. 7B zeigt (oberer Bereich) ein Beispiel eines Schnittes, der das erwartete Muster für Klon AT3-M (d. h., GFP+, DsRED–) in einem metastatischen Fokus zeigt und (unterer Bereich) ein Beispiel für einen Schnitt, der ein plastisches Muster für Klon AT3-M (d. h., GFP+, DsRED+) in einem metastatischen Fokus zeigt. Wie in 7 gezeigt, wiesen metastatische Foki in Lungen von Tieren mit Tumoren sowohl von AT3-T Klonen als auch von AT3-M Klonen (stabil transfiziert mit GFP und pRIIIcl2 Reportern) Anzeichen von Plastizität auf. Metastatische Foki wurden in 7 von 10 Lungen für Klon AT3-M und in 6 von 10 Lungen für Klon AT3-T gefunden.
  • Die Beurteilung der Plastizität der metastatischen Foki unter Verwendung der kombinierten Ergebnisse der GFP- und DsRED-Reporter offenbarte plastische Foki (DsRED+ für AT3-M und DsRED– für AT3-T) im Falle von beiden Klonen: 3 von 12 für Klon AT3-T und 13 von 16 für Klon AT3-M (7). Diese Studien zeigten eine phänotypische Plastizität für die AT3-M Zellen und legten sie für die AT3-T Zellen nahe. Entscheidend ist, dass beide Zelllinien metastatisch waren, trotz Unterschiede in dem ursprünglichen epithelialen gegenüber mesenchymalen Phänotyp.
  • Plastizität und metastatisches Verhalten von Krebszellen. Sowohl die mesenchymalen AT3-M als auch die eher epithelialen AT3-T Zellen metastasierten effizient. Die Antriebsfaktoren für die Metastasierung jedoch können in diesen beiden Zellen unterschiedlich sein. Der Vergleich der Genexpression zwischen den AT3-M und AT3-T Klonen offenbarte wenigstens eine faszinierende Möglichkeit: Die Microarray-Analyse zeigte eine 12-fache Zunahme der Expression des Junktionalen Adhäsionsmolekül C (junctional adhesion molecule C, JAM-C) in AT3-T im Vergleich zu AT3-M, und dieses wurde durch RT-PCR und Immunblotanalyse bestätigt. JAMs waren in Leukozyten und an den dichten Verbindungen (tight junctions) von epithelialen und endothelialen Zellen vorhanden, und es wurde gezeigt, dass sie an der transendothelialen Migration von Monozyten beteiligt sind. JAM-C wird in mehreren Zelllinien mit hohem metastatischem Potential exprimiert und ein Knock-down dieses Moleküls in der humanen Fibrosarkomlinie HT1080 verringerte deren metastatischen Eigenschaften in vivo signifikant. Darüberhinaus ist JAM-C auch in Gensets vorhanden, die mit Stammzellartigkeit assoziiert werden, die signifikante Überlappungen mit Genen aufwiesen, die den Klon AT3-T definieren. Daher könnte der Klon AT3-T durch Überexpression verschiedener Adhäsionsmoleküle metastatische Fähigkeiten erwerben. Zusätzlich kann die Überexpression des stromabwärts gelegenen Hedgehog Signalweg-Effektors GLI3 in den eher epithelialen und Stammzell-ähnlichen AT3-T Zellen im Vergleich zu den eher mesenchymalen AT3-M Zellen hochreguliert sein. Hedgehog-Signalgebung wurde in Zusammenhang gebracht mit EMT, Stammzellartigkeit und Metastasierung/Aggressivität in verschiedenen Tumorarten, und folglich könnte die differentielle Expression oder Regulation von Entwicklungsprogrammen diesen phänotypischen Unterschieden in diesen Zelllinien zugrunde liegen. Eine erhöhte Expression von Patched, eine Komponente des Hedgehog-Signalweges, wurde mit Prostatatumoren während der Progression zu Androgen-Unabhängigkeit in Zusammenhang gebracht und in zirkulierenden Tumorzellen von Männern mit metastasiertem Kastrations-resistentem Prostatakrebs.
  • Beispiel 6. AT3-T Zellen zeigen eine Stammzell-artige Genexpressionssignatur
  • AT3-T Zellen bildeten manchmal feste Cluster, die Protosphären (protospheres) ähnelten. Während die Sphärenbildung keine exklusive Eigenschaft von Stammzellen ist, wurde sie in vielen verschiedenen Systemen mit Stammzellartigkeit in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Beobachtungen und der hohen Tumorigenität von AT3-T und AT3-M Zellen wurden sie auf die Expression von Markern getestet, die mit Krebs-Stammzell-ähnlichen Zellen assoziiert sind. Ebenfalls eingeschlossen wurden die parentalen AT3 Zellen und eine andere Dunning Tumor-Zelllinie, DT Zellen, die epitheliale Marker aufweisen und in weißen Copenhagen Ratten nur schwach tumorigen sind. Die DT Zellen exprimierten sehr geringe Mengen an CD44 und CD133, die mit hoch malignen, Krebs-Stammzell-ähnlichen Zellen assoziiert sind (8). CD133 war in DT Lysaten nur nachweisbar, wenn viermal mehr Lysat aufgetragen wurde. Die Mesenchymal-ähnlichen AT3 Zellen exprimierten viel höhere Mengen sowohl an CD44 als auch CD133 als die DT Zellen (man beachte, dass die Spuren für die DT-Proben überladen sind in 8A), was im Einklang steht mit jüngeren Berichten, wonach EMT Stammzellartigkeit in epithelialen Brustkarzinomzellen induziert. 8A zeigt eine Membran mit seriellen, zweifachen Verdünnungen von Vollzellen-Lysaten, die in zwei Hälften geschnitten und im Hinblick auf CD133 (oberer Bereich) oder β-Actin (unterer Bereich) immungeblottet wurde. Größenmarker sind in kDa. Eine schneller wandernde CD133 Bande, die wiederholt nur in DT-Lysaten nachgewiesen wurde, ist markiert (*), was eine mögliche posttranslationelle Regulation nahelegt. 8B zeigt eine Membran mit seriellen, zweifachen Verdünnungen von Vollzell-Lysaten, die in zwei Hälften geschnitten und im Hinblick auf CD44 (oberer Bereich) oder β-Actin (unterer Bereich) immungeblottet wurde. Repräsentative Blots von zwei unabhängigen Sets von Lysaten werden gezeigt. AT3-T exprimierte CD44 und CD133. Interessanterweise exprimierten die AT3-T Zellen insgesamt höhere Mengen an CD44 und CD133 als die eher mesenchymalen AT3-M. Darüberhinaus exprimierten AT3-T Zellen ein höheres Verhältnis von CD44H zu CD44E im Vergleich zu AT3-M Zellen. Die CD44H Isoform wurde mit Malignität in Zusammenhang gebracht, was für CD44E nicht der Fall ist. Dies legt ein komplexeres Verhältnis zwischen epithelialen Transitionen und dem Erwerb von Stammzell-ähnlichen Eigenschaften nahe. In Übereinstimmung mit der Expression von Stammzell-ähnlichen Markern bildeten sowohl AT3-M als auch AT3-T Zellen Kolonien in Softagar und Tumore, wenn sie in weiße Copenhagen Ratten injiziert wurden, und diese Tumore führten zu extensiven Metastasen, ähnlich wie für die parentalen AT3 Zellen (3B).
  • Um diese Verbindungen zwischen Transitionen und Stammzellartigkeit weiter zu untersuchen, wurde die globale Genexpression in AT3-M und AT3-T Zellen verglichen. Diese Analyse zeigte, dass 422 Gene in diesen beiden Fällen differenziert exprimiert (≥ 2-fach; p-Wert < 0,05) sind (Tabelle 3). Viele der Gene, die in AT3-T bezogen auf AT3-M hochreguliert waren, waren in epithelialen Zellen präferentiell exprimiert, und umgekehrt, für diejenigen, die präferentiell in mesenchymalen Zellen exprimiert waren (Tabelle 4). Es gab jedoch einige Ausnahmen hiervon. Die Expression des Gens Disintegrin-like und Metalloprotease (disintegrin-like and metalloprotease) stand in Übereinstimmung mit einem mesenchymalen Phänotyp, aber dieser mRNA-Spiegel lag 4-mal höher in AT3-T im Vergleich zu AT3-M. Integrin-β-4, das normalerweise mit Epithelial-ähnlichen Zellen assoziiert ist, wurde 3-mal geringer in AT3-T im Vergleich zu AT3-M exprimiert. Diese Beobachtungen standen im Einklang mit der Charakterisierung von AT3-T Zellen als solche, die eher epitheliale Merkmale zeigen als AT3-M Zellen und einen intermediären phänotypischen Zustand annehmen. Tabelle 3.
    x-fache Veränderung (AT3-T/AT3-M) Gensymbol (Human) Gensymbol (Ratte)
    0,00771 P2RX5 P2rx5
    0,011 CCNB1IP1 #kA
    0,0296 STRA6 Stra6
    0,0327 G0S2 G0s2
    0,0835 SERPINF1 Serpinf1
    0,101 GSTA1 #kA
    0,107 RSNL2 Clip4
    0,115 ADAMTS7 #kA
    0,134 GZMB #kA
    0,137 SPON2 #kA
    0,156 MMP3 #kA
    0,191 ATP8A1 #kA
    0197 EVPL Evpl
    0,21 LGALS3BP Lgals3bp
    0,216 SERPINB2 Serpinb2
    0,219 NETO2 Neto2
    0,223 PTX3 #kA
    0,23 SERPINB7 Serpinb7
    0,233 RASIP1 #kA
    0,235 OMD #kA
    0,239 HLA-G #kA
    0,239 HLA-A #kA
    0,247 CD97 Cd97
    0,251 GJA4 Gja4
    0,254 DSU #kA
    0,257 MGLL Mgll
    0,261 SPHK1 #kA
    0,268 HRBL Zcwpw1
    0,268 ZCWPW1 Zcwpw1
    0,27 ENPP3 Enpp3
    0,275 PTGS1 Ptgs1
    0,278 RAMP1 Ramp1
    0,281 DHRS3 Dhrs3
    0,282 FAM117A Fam117a
    0,284 TUBB2A///TUBB2B Tubb2b
    0,284 TUBB2B Tubb2b
    0,285 C10orf10 LOC500300
    0,289 SYTL2 #kA
    0,291 SLC39A4 Slc39a4
    0,292 CHRD Chrd
    0,292 GIP Gip
    0,293 CKLF Cklf
    0,294 PLAU Plau
    0,295 GUF1 #kA
    0,307 CGI-38 Tppp3
    0,311 LECT2 Lect2
    0,318 NQO2 #kA
    0,32 C11orf75 RGD1309410
    0,324 DOCK2 #kA
    0,325 LGALS2 #kA
    0,326 CASP4 Casp1
    0,326 LTBP4 Ltbp4
    0,334 HSPB1 Hspb1
    0,335 ITGB4 Itgb4
    0,34 BPHL Bphl
    0,341 FOXF2 #kA
    0,345 MYH1 #kA
    0,345 SMAD6 Smad6
    0,348 TGFB1 Tgfb1
    0,351 MMP10 #kA
    0,363 MMP9 Mmp9
    0,363 COL18A1 Col18a1
    0,366 HES1 #kA
    0,369 SLC35D2 #kA
    0,377 ADORA2B Adora2b
    0,377 COL3A1 Col3a1
    0,379 DPEP2 Dpep2
    0,382 GPR153 Gpr153_predicted
    0,383 LOC55908 #kA
    0,389 SELPLG #kA
    0,394 P2RX1 Atp2a3
    0,394 ATP2A3 Atp2a3
    0,394 ADD3 Add3
    0,395 TSPAN9 Tspan9
    0,399 LOC54103 #kA
    0,4 BFSP2 #kA
    0,4 FLJ14213 RGD1309969
    0,4 PGGT1B Pggt1b
    0,401 HCN2 Hcn2
    0,403 C2orf33 RGD1310230
    0,404 TMEPAI #kA
    0,405 INHA Inha
    0,406 HPSE #kA
    0,409 CRY1 Cry1
    0,413 IL3RA ll3ra
    0,413 CDC42EP1 #kA
    0,416 ARG1 Arg1
    0,417 MAPK14 Mapk14
    0,419 FLJ22028 #kA
    0,421 GALR2 Galr2
    0,422 TSPAN8 Tspan8
    0,422 FAM77C RGD1561205
    0,422 USP2 Usp2
    0,422 LAMA3 #kA
    0,424 CCNE1 Ccne1
    0,424 NSF Nsf
    0,428 ST3GAL5 St3gal5
    0,429 SYNJ2 Synj2
    0,43 ADA Ada
    0,43 PCBP3 Pcbp3
    0,433 ZNF43 #kA
    0,433 C14orf130 Ubr7
    0,436 SOS2 #kA
    0,436 RASSF3 #kA
    0,436 GLMN Glmn
    0,438 OSR2 Osr2
    0,44 AGTPBP1 Agtpbp1
    0,444 DBNDD2 RGD1311642
    0,445 SGCB #kA
    0,446 HBLD2 Isca1
    0,448 SCARB1 Scarb1
    0,448 EVI2A Evi2a
    0,448 AP4M1 #kA
    0,451 IGF2BP3 #kA
    0,452 FLJ10404 Ddx41
    0,454 TGFB2 Tgfb2
    0,459 PASK Pask
    0,461 C19orf37 Zfp428
    0,462 BMP1 Bmp1
    0,464 PTPN13 Ptpn13
    0,47 PTPRG #kA
    0,47 EFNB1 Efnb1
    0,472 PER2 Per2
    0,472 IRS3L///LOC442715 Irs3
    0,472 HRBL Irs3
    0,472 MAP3K3 Kcnh6
    0,472 WDR68 Kcnh6
    0,472 KCNH6 Kcnh6
    0,472 CCDC44 Kcnh6
    0,473 CIB2 Cib2
    0,475 MPZL1 Mpzl1
    0,475 FADS2 #kA
    0,48 ZNF185 #kA
    0,482 SLC29A1 Slc29a1
    0,487 RUNX3 Runx3
    0,488 NINJ1 Ninj1
    0,489 RASL11B Rasl11b
    0,49 ECE2 Ece2
    0,49 TNNC2 Tnnc2
    0,491 WASPIP Wipf1
    0,492 FN1 Fn1
    0,494 NDE1 Nde1
    0,494 CAMK2G Camk2g
    0,495 CUTL1 Cux1
    0,495 ABHD6 Abhd6
    0,495 PTPN14 Ptpn14
    0,497 FLJ13946 #kA
    0,498 BAIAP2 Baiap2
    0,499 MSL3L1 Msl3l1
    0,499 DYNLT1 Dynlt1
    0,499 GSTM3 Gstm5
    2 CHES1 Foxn3
    2,004 AQR Agr///Znf770
    2,006 EPN1 Epn1
    2,011 PPBP Ppbp
    2,019 SLC35D1 #kA
    2,022 PTPRC #kA
    2,031 USP47 Usp47
    2,041 DHX29 #kA
    2,047 HMOX1 #kA
    2,05 CAV1 Cav1
    2,053 BUB1B Bub1b
    2,069 KCNIP4 #kA
    2,072 - #kA
    2,072 ADAM10 #kA
    2,073 KIAA1155 #kA
    2,074 PSTPIP2 #kA
    2,083 MAML1 #kA
    2,084 RAB32 #kA
    2,089 FAM111A #kA
    2,095 ATRNL1 #kA
    2,101 PPIC Ppic
    2,101 CHD4 Chd4
    2,109 IDE Ide
    2,117 PITPNM3 #kA
    2,121 NFE2L1 Nfe2l1
    2,121 MFSD1 #kA
    2,133 KITLG Kitlg
    2,161 ING3 Ing3
    2,167 CD24 #kA
    2,169 IDS #kA
    2,177 MGC3196 LOC686289///LOC690285
    2,185 FBXL11 Fbxl11
    2,185 - Fbxl11
    2,191 ZC3H12A #kA
    2,195 RKHD2 #kA
    2,201 LAMC2 Lamc2
    2,217 KIF11 Kif11
    2,242 SNAPC5 Snapc5
    2,252 THRAP3 #kA
    2,261 HS6ST1 #kA
    2,264 OXCT1 #kA
    2,266 TEK #kA
    2,268 HIST2H4///H4/o///LOC648164 #kA
    2,271 TMF1 Tmf1
    2,273 ZBTB7B Zbtb7b
    2,274 CAMSAP1L1 RGD1310950
    2,279 CYP3A5 Cyp3ai
    2,279 CYP3A7 Cyp3a9
    2,279 CYP3A4 Cyp3a9
    2,282 PENK Penk1
    2,283 KIAA2010 Smek1
    2,284 CHRNA1 #kA
    2,299 BAT3 Bat3
    2,302 ROM1 Rom1
    2,306 HOXB8 #kA
    2,309 KLK14 #kA
    2,31 SUV39H1 #kA
    2,315 LOC440354///BOLA2///LOC595101 RGD1564579
    2,315 UBN1 Ubn1
    2,323 C1orf103 #kA
    2,333 EYA2 Eya2
    2,347 MT2A #kA
    2,353 KIAA1815 Ermp1
    2,355 SETD1B #kA
    2,369 MPHOSPH1 Kif20b
    2,38 EFNA1 Efna1
    2,392 ABCF2 Abcf2
    2,397 LIMA1 Lima1
    2,418 EXTL3 Extl3
    2,418 ARL6IP2 Arl6ip2
    2,442 GRAMD3 Gramd3
    2,456 JARID1A Jarid1a
    2,476 ARHGEF9 Arhgef9
    2,485 CAD Cad
    2,493 RAI17 #kA
    2,526 KIAA0284 #kA
    2,529 SGPP1 Sgpp1
    2,531 ABCB1 #kA
    2,531 ABCB1///ABCB4 #kA
    2,542 KIF1C #kA
    2,553 KIAA0020 LOC499339
    2,563 ADAM15 Adam15
    2,577 UBE1 Uba1
    2,577 INE1 Uba1
    2,58 GRIP2 Grip2
    2,59 PPEF1 #kA
    2,619 SC65 Sc65
    2,62 FER1L3 #kA
    2,62 NOC3L #kA
    2,62 RBP4 #kA
    2,645 SPINK4 Spink4
    2,653 ATXN2L #kA
    2,711 AHCYL1 Ahcyl1
    2,723 TUBB3 Tubb3
    2,723 MC1R Tubb3
    2,729 AGPAT7 Lpcat4
    2,749 HOXC11 #kA
    2,766 APH1A Aph1a
    2,785 CNOT1 RGD1308009
    2,785 CSNK2A2 RGD1308009
    2,794 STAC #kA
    2,904 STAG1 #kA
    2,942 MBNL1 #kA
    2,982 MNT Mnt
    3,007 RANBP5 Ipo5
    3,014 HERC1 Herc1
    3,065 ALDOC Aldoc
    3,122 KIAA0460 -
    3,174 FLT3 #kA
    3,278 CXCL6 Cxcl6
    3,366 GLI3 #kA
    3,489 SSR3 #kA
    3,585 BCAN Bcan
    3,824 FKBP10 Fkbp10
    3,903 GSTK1 Gstk1
    3,931 PSCDBP #kA
    3,974 ALCAM Alcam
    4,056 ADAMTS13
    4,203 SPRR2B #kA
    4,276 GPR126 #kA
    5,169 SULF1 Sulf1
    5,529 TFF1 Tff1
    6,52 PTN Ptn
    8,591 MLF1 Mlf1
    9,012 THBS2 Thbs2
    10,79 HEPH Heph
    12,53 JAM3 Jam3
    Tabelle 4. Beispiele für epitheliale oder mesenchymale Gene in der Expressiodatenanalyse der Klone AT3-T und AT3-M.
    Genname X-fache Veränderung in AT3-T gegenüber AT3-M
    Junktionales Adhäsionsmolekül C (junctional adhesion molecule C) 12,53
    Disintegrin-like und Metalloprotease 4,05
    Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule 3,97
    Tubulin 2,73
    Epithelial Protein Lost in Neoplasm 2,39
    Laminin 2,20
    TGFβ2 0,45
    MMP9 0,36
    Collagen, Typ XVIII 0,36
    MMP10 0,35
    Integrin β4 0,33
    TGFβ1 0,31
    Urokinase Plasminogen-Aktivator 0,29
    MMP3 0,15
  • Zwei Gensets wurden zusammengestellt: Eines bestehend aus Genprodukten, die in AT3-T (relativ zu AT3-M) hochreguliert waren und das zweite mit denen, die in AT3-T (relativ zu AT3-M) herunterreguliert waren. Die beiden Gensets wurden in Bezug auf eine Überlappung mit 5.452 Gensets aus den Molecular Signature Datenbank-Sammlungen (Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) http://www.broad.mit.edu/gsea/) verglichen. Die Analyse der in AT3-T im Vergleich zu AT3-M überexprimierten Gene in Bezug auf eine Überlappung mit den 5.452 Gensets aus den Molecular Signature Datenbank-Sammlungen über Gene Set Enrichtment Analysis (GSEA) zeigte keine signifikante Anreicherung von Sets, die mit EMT oder MET assoziiert sind. Diesbezüglich ähnelten sowohl AT3-M als auch AT3-T der Mesenchymal-ähnlichen, parentalen AT3 Linie. Unter den 15 signifikantesten Überlappungen für in AT3-T überexprimierte Gene waren drei Sets von Genen, die in hämatopoetischen Stammzellen (p = 3,24 × 10–8), neuralen Stammzellen (p = 3,07 – 10–7) und embryonalen murinen Stammzellen (p = 5,14 × 10–6) aktiviert sind (Tabelle 5), während unter den 20 signifikantesten Überlappungen für Gene, die relativ gesehen in AT3-T Zellen herunterreguliert sind, zwei Gensets waren, die mit der Entwicklung von reifen Zelltypen assoziiert sind. Es wurde festgestellt, dass die Expression des Downstream Hedgehog-Signalweg-Effektors GLI3 in AT3-T Zellen im Vergleich zu AT3-M Zellen 3,4-fach überexprimiert war, was darauf hinweist, dass die Regulation dieses Entwicklungs-/Stammzellartigkeit-Signalwegs in Prostatakrebs mit dem zugrunde liegenden phänotypischen Zustand während EMT/MET verknüpft sein könnte, ähnlich zu dem, was in anderen Tumoren berichtet wurde. Diese Daten zeigten, dass AT3-T Zellen Genexpressionsprofile ähnlich den Stammzellen haben, und in Einklang mit der Analyse der CD44 und CD133 Protein-expression, legt nahe, dass AT3-T Zellen in einem eher Stammzell-ähnlichen Zustand als die eher mesenchymalen AT3-M Zellen existieren. Tabelle 5.
    GSEA Sammlungen: C1, C3, C2, C5, C4
    # gezeigte Überlappungen: 20
    # Gensets in den Sammlungen: 5452
    # Gene im Vergleich (N) 127
    # Gene in Sammlungen (N) 39655
    Genset-Name # Gene in Genset (k) Beschreibung # Gene in Überlappung (k) k/K p-Wert
    TATAAA_V$TATA_O1 1333 Gene mit Promoterregionen [–2kb, 2kb] um die Transkriptionsstart stelle, enthaltend das Moviv TATAAA, das übereinstimmt mit der Annotation für TAF<br> TATA 20 0,015 8,07E-09
    STEMCELL_HEMATOPOIET IC_UP 1452 Angereichert in hämatopoetischen Stammzellen der Maus, im Vergleich zu differenzierten Hirn- und Knochenmarkszellen 20 0,0138 3,24E-08
    GNF2_RAP1B 37 Nachbarschaft von RAP1B 5 0,1351 1,23E-07
    STEMCELL_NEURAL_UP 1838 Angereichert in neuralen Stammzellen der Maus, im Vegleich zu differen zierten Hirn- und Knochenmarkszellen 21 0,0114 3,07E-07
    module_2 383 Gene in Modul_2 10 0,0261 4,34E-07
    CTTTGA_V$LEF1_Q2 1270 Gene mit Promotor-regionen [–2kb, 2kb] um die Transkriptionsstart stelle, enthaltend das Motiv CTTTGA, das übereinstimmt mit der Annotation für LEF1: lymphoid en hancer-binding factor 1 17 0,0134 5,48E-07
    SINAL_TRANSDUCTION 1637 Gene annotiert mit dem GO-Terminus GO:0007165. Die Kaskade von Prozes sen, durch die ein Signal mit einem Rezeptor interagiert, was eine Verände rung in dem Level oder der Aktivität eines zweiten Messengers oder eines anderen Downstream targets, und schließlich eine Änderung in Funkti onsweise der Zelle bewirkt. 19 0,0116 9,33E-07
    module_385 28 Gene in Modul 385 4 0,1429 1,91E06
    V$MYCMAX_O1 261 Gene mit Promotor-regionen [–2kb, 2kb] um die Transkrip tionstartstelle, enthal tend das Motiv NNACCACGTGGTN N, das übereinstimmt mit der Annotation für MYC: v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (Vogel)<br> MAX: MYC assoziier ter Faktor X 8 0,0307 1,98E06
    GGGCGGR_V$SP1_Q6 3053 Gene mit Promotor-regionen [–2kb, 2kb], um die Transkripti onsstartstelle, enthal tend das Motiv GGGCGGR, das übereinstimmt mit der Annotation für SP1: Sp1 Transkriptions faktor 26 0,0085 2,59E-06
    AACTTT_UNKNOWN 1963 Gene mit Promotor-regionen [–2kb, 2kb], 20 0,0102 3,29E-06
    um die Transkripti onsstartstelle, enthal tend das Motiv AACTTT. Das Motiv passt nicht zu irgend einem bekannten Transkriptionsfaktor.
    V$AP1_C 281 Gene mit Promotor-regionen [–2kb, 2kb] um die Transkripti onsstartstelle, enthal tend das Motiv NTGASTCAG, das übereinstimmt mit der Annotation für JUN: jun Onkogen 8 0,0285 3,38E-06
    MEMBRANE_PART 1673 Gene annotiert mit dem GO-Terminus GO:0044425. Jeder Bestandteil einer Membran, eine Dop pelschicht von Lipidmolekülen, die sämtliche Zellen um fasst und in Eukaryonten viele Organellen; kann aus einem einzelnen oder doppelten Lipid- Bilayer bestehen; umfasst auch assozi ierte Proteine. 18 0,0108 5,09E-06
    STEMCELL_EMBRYONIC_UP 1344 Angereichert in embryonalen Stammzel-len der Maus, im Vergleich zu differen zierten Hirn- und Knochenmarkszellen 16 0,0119 5,14E-06
    INTRINSIC_TO_MEMBRANE 1350 Gene, annotiert mit dem GO-Terminus GO:0031224. In der Membran lokalisiert, so dass ein kovalent angefügter Teil des Genproduktes, z. B. ein Teil einer Peptidsequenz oder eine andere kovalent angeheftete Kompo nente wie z. B. ein GPI-Anker, eine oder beide Schichten der Membran überspannt oder in diese einge bettet ist. 16 0,0119 5,43E-06
    CELL_SURFACE 79 Gene, annotiert mit dem GO-Terminus GO:0009986. Der 5 0,0633 5,58E-06
    externe Teil der Zell wand und/oder Plas mamembran.
    UVC_XPCS_8HR_DN 408 Herunterreguliert 8 Std. Nach der Be-handlung von XPB/CS Fibroblasten mit 3 J/m^2 UVC 9 0,0221 6,35E-06
    NOTCH_SIGNALING_PATHWAY 12 Gene, annotiert mit dem GO-Terminus GO:0007219. Die Serie von molekula ren Signalen, die durch Binden eines extrazellulären Li ganden an einen Notch-Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzelle initiiert wird. 3 0,25 6,86E-06
    LEI_MYB_REGULATED_GENES 325 Myb-regulierte Gene 8 0,0246 9,62E-06
    MORF_DDBI 246 Nachbarschaft von DDBI 7 0,0285 1,40E-05
  • Epitheliale Plastizität und Stammzell-ähnliches Verhalten. Es ist sehr anerkannt, dass Zellen, die induziert worden sind zur EMT, Stammzell-Signalwege aktivieren. Die hierin präsentierte Arbeit zeigt, dass AT3 Zellen, die in einen eher epithelialen Zustand übergegangen sind, d. h., in EMT involviert waren, auch die Expression von Stammzell-ähnlichen Markern aktivierten. Diese Erkenntnis legte einen weiteren Zusammenhang zwischen Plastizität und Stammzell-ähnlichem Charakter oder Stammzellartigkeit nahe, was unter Verwendung eines Gibbs Free Energy-Diagramms (9) modelliert wurde. 9 zeigt ein Modell, das den Stammzell-ähnlichen Charakter und Epithelial-mesenchymalen Phänotyp, vergleicht. Die X-Achse zeigt das Spektrum endothelialer bis mesenchymaler Phänotypen und die Y-Achse zeigt den Stammzell-ähnlichen Charakter der Zellen. Der linke Pfeil repräsentiert eine EMT und der rechte Pfeil repräsentiert eine MET. Das Modell postuliert, dass sich Zellen, während sie hin und zurück entlang der epithelialen und mesenchymalen X-Achse Übergänge vollziehen, durch Zustände unterschiedlicher Stammzellartigkeit bewegen, und diese Eigenschaft erreicht ihren Höhepunkt in intermediären Zuständen zwischen den epithelialen und mesenchymalen Phänotypen. Die Anzahl unterschiedlicher Zustände und die exakte Höhe der Schranken zwischen Zuständen sind spekulativ und soll nicht als proportional interpretiert werden. Zwei phänotypische Transitionen sind gezeigt, die erste ist eine teilweise EMT (linker Pfeil) und die zweite ist eine teilweise MET (rechter Pfeil). Beide dieser Transitionen resultieren in Zuständen mit stärken Stammzell-ähnlichem Charakter. Es sollte beachtet werden, dass das Modell auch vorhersagt, dass einige EMTs und genauso einige METs zu einer Abnahme der Stammzellartigkeit führen werden, und tatsächlich wurde dies beobachtet, wenn die hoch aggressive humane DKAT basal-artige Brustkrebszelllinie zum Durchleben einer EMT induziert wird (N. D’Amato und V. Seewaldt, persönliche Kommunikation). Das Modell legt außerdem eine Verbindung zwischen Stammzellartigkeit, Plastizität und Neigung zur Metastasierung nahe, vielleicht durch Aktivierung bestimmter onkogener Signalwege (z. B. PI3 Kinase/Akt) und Entwicklungssignalwege erklärbar.
  • Das Modell sagt außerdem voraus, dass Zellen mit maximalem Stammzell-ähnlichen Charakter, die per Definition hochmaligne sein werden, sowohl epitheliale als auch mesenchymale Eigenschaften zeigen sollten, da sie intermediäre Zustände in der Epithelial-mesenchymalen-Achse einnehmen. Die hoch malignen Adenokarzinom AT3-T Zellen der Ratte befinden sich in dieser Art von Zustand. Wichtigerweise existieren in Menschen mit metastasierten Brust- und Prostatakarzinomen viele CTCs auch in diesen intermediären Zuständen. Diese Zellen korrelieren mit Progression der Erkrankung und von ihnen wird angenommen, dass sie hoch aggressiv sind. Eine Population von Zellen, in der CTCs angereichert wurden, exprimierte RNAs, die für mesenchymale Marker kodieren; jedoch zeigten die Daten nicht, ob epitheliale und mesenchymale Marker in derselben Zelle koexprimiert wurden oder nicht. Ein weiteres klinisches Beispiel für Zellen in intermediären Zuständen ist in sarkomatoiden Nierenzellkarzinomen zu finden, von denen gezeigt wurde, dass sie epitheliale Marker, wie das epitheliale Membran-Antigen und mesenchymale Marker, wie Vimentin, koexprimieren. Diese Tumore, obwohl selten (1–8% der Nierentumore) sind hoch aggressiv und schwierig zu behandeln. Eine ähnliche Situation könnte in Karzinosarkomen sowohl der Prostata als auch der Brust zu finden sein, hoch aggressive, seltene Tumore mit gemischten epithelialen und mesenchymalen Anteilen, jedoch klonalen Ursprungs. Es ist nicht vollständig geklärt, ob einzelne Zellen in diesen Tumoren epitheliale und mesenchymale Marker koexprimieren oder nicht und sich folglich in der Tat in intermediären Zuständen befinden.
  • Schließlich legt das Modell nahe, dass Sarkome, wenn sie eine MET durchleben, Stammzell-ähnliche Signalwege aktivieren werden und aggressiver werden. Tatsächlich gibt es zahlreiche Beschreibungen von Sarkomen mit gemischten epithelialen und mesenchymalen Komponenten in unmittelbarer Nähe, wie in einigen Synovial- und Osteosarkomen zu sehen. Neue, genetisch-definierte Mausmodelle des Weichgewebssarkoms geben Aufschluss über die Existenz und Bedeutung von Zellen in intermediären Zellstadien bei der Progression dieser Tumore.
  • Beispiel 7 – Phänotypische Plastizität unter humanen zirkulierenden Tumorzellen
  • Die oben beschriebenen Experimente zeigen, dass Dunning Prostata-Adenokarzinomzellen der Ratte, die einen intermediären phänotypischen Zustand einnehmen, tumorigen sind, metastatisch und Stammzell-ähnliche Antigene und zelluläre Programme besitzen. Um zu untersuchen, ob ähnliche transitionale Zellen eine Rolle in humanen Krebserkrankungen spielen könnten oder nicht, wurden Krebszellen untersucht, die aus dem Blut von Männern mit metastasiertem Kastrations-resistentem progressivem Prostatakrebs (CRPC) oder Frauen mit progressivem metastasiertem Brustkrebs (mBC) isoliert wurden. Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) repräsentieren eine ideale Gewebequelle, um Anhaltspunkte für diese Plastizität in vivo zu untersuchen, da wahrscheinlich ist, dass sich diese Zellen vor und während der metastatischen Kollonisierung in der Blutzirkulation befinden. CTCs haben sowohl eine unabhängige prognostische als auch eine prädiktive Bedeutung in mehreren epithelialen Malignitäten, einschließlich Brust- und Prostatakrebs. Diese Zellen können gesammelt, isoliert und auf eine Vielzahl von für die Krebsbiologie-relevanten Biomarkern hin analysiert werden.
  • Es wurde getestet, ob es eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür gab, transitionale Zellen innerhalb einer Population von CTCs zu finden, die mittels FDA-zugelassenen EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)-targeted ferromagnetischen Antikörper erfasst (eingfangen) wurden. Diese Zellen wurden mittels Immunfluoreszenz auf Expression von CD45 (in vielen Leukozyten exprimiert; 10A), Cytokeratin (CK; ein epithelialer Marker) und Vimentin (ein mesenchymaler Marker) untersucht. CTCs wurden definiert als CD45 negative und CK positive, kernhaltige, intakte Zellen (10B), und transitionale CTCs wurden so definiert, wenn sie zusätzlich Vimentin koexprimiert (10C–D). 10 zeigt, dass CTCs aus Patienten mit Prostata-Adenokarzinomen positiv für epitheliale und mesenchymale Marker gefärbt waren. Eine Dreifachfärbung wurde durchgeführt unter Verwendung eines Anti-CD45-Antikörpers, der mit Alexa 647 markiert war, eines Anti-Cytokeratin (CK) Antikörpers, markiert mit Alexa 555 und eines Anti-Vimentin Antikörpers, markiert mit Alexa 488. Zellkerne wurden mit DAPI markiert. 10A zeigt ein Beispiel eines Leukozyten aus einer humanen Probe von mononukleären Zellen des peripheren Blutes: CD45 (+), CK (–) und Vimentin (+). Zusätzlich wurden CD45 (+), CK (–) und Vimentin (–) Zellen beobachtet. 10B zeigt ein Beispiel einer CD45 (–), CK (+) und Vimentin (–) Zelle eines Patienten mit metastasiertem Brustkrebs. Solche Zellen wurden als Vimentin (–) CTCs in Tabelle 6 gezählt. 10C zeigt ein Beispiel einer CD45 (–), CK (+) und Vimentin (+) aus einem Patienten mit metastasiertem Brustkrebs. Solche Zellen wurden als Vimentin (+) CTCs in Tabelle 6 gezählt. 10B zeigt ein Beispiel einer CD45 (–), CK (+), Vimentin (+) aus einem Patienten mit metastasiertem, progressivem Kastrat-resistentem Prostatakrebs. Solche Zellen wurden als Vimentin (+) CTCs in Tabelle 6 gezählt.
  • Transitionale CTCs koexprimierten Vimentin und CK in vielen Patienten mit erhöhten CTC Zahlen (≥ 5 CTCs/7.5 mL durch Standardtests) (Tabelle 6, 10). Tatsächlich wurde festgestellt, dass unter den neun Patienten mit progressivem metastasiertem CRPC und den acht Patienten mit progressivem mBC etwa 75% (Bereich 0 bis 100%, 85,5% in CRPC, 54% in mBC) der CTCs sowohl für CK als auch für Vimentin angefärbt wurden (10C–D), was auf einen transitionalen Phänotyp hinweist. Diese Daten zeigten, dass zirkulierende Tumorzellen in Patienten mit metastasiertem Brust- und Prostatakrebs epitheliale (EpCAM und Cytokeratin) and mesenchymale (Vimentin) Marker koexprimieren und folglich in einem transitionalen Phänotyp existieren, ähnlich zu dem, was in unseren präklinischen Modellen beobachtet wurde. Tabelle 6 Anzahl zirkulierender Tumorzellen (CTCs) und Vimentin Expression in Patienten mit metastasiertem Kastrations-resistentem Prostatakrebs oder metastasiertem Brustkrebs.
    Individuum Nr. CTC Zahl (Cellsearch)* Verhältnis: Vimentin (+) CTCs/Gesamt-CTC Zahl
    Kastrations-resistenter metastasierter Prostatakrebs
    1 5 4/6
    2 41 11/11
    3 45 6/10
    4 626 5/8
    5 110 17/21
    6 182 5/6
    7 17 13/16
    8 19 33/34
    9 34 12/12
    Summe 106/124 (85,5%)
    Metastasierter Brustkrebs
    1 21 0/6
    2 7 2/2
    3 8 4/4
    4 21 1/2
    5 12 2/2
    6 188 21/22
    7 138 8/20
    8 377 6/23
    Summe 44/81 (54,3%)
    Gesamtsumme - 150/205 (73,1%)
    *Spalte 2 stellt die CTC Zahl dar, wie sie mittels Cellsearch EpCAM-basiertem Standardverfahren für jedes Individuum bestimmt wurde, während Spalte 3 die Anzahl und das Verhältnis von CTCs darstellt, die manuell gezählt wurden, von denen festgestellt wurde, dass sie Zytokin exprimierten und Vimentin koexprimierten, ausgedrückt als Verhältnis und Prozentangabe.
  • Plastizität und CTCs. Die Identifikation von Plastizität unter CTCs in einer signifikanten Untergruppe von Patientenproben bietet mehrere wichtige klinische Möglichkeiten. Die Expression von Plastizität könnte prognostischen und präditiven Wert in Patienten mit metastasierten Krebsarten haben, vor allen in mBC, wo eine signifikante Reihe von Werten für Plastizität gezeigt wurde. Folglich könnte die Untergruppe von Patienten mit sehr hoher Plastizität einen aggressiveren natürlichen Krankheitsverlauf haben und eine größere Resistenz gegenüber systemischen Behandlungen zeigen. Was die Diagnose und Nützlichkeit als prädiktive Biomarker betrifft, legten die Daten nahe, dass zusätzlich zu Zellen, die sowohl epitheliale als auch mesenchymale Marker exprimieren, eine unbekannte Zahl an CTCs vorhanden sein könnte, die sich weiter in Richtung mesenchymalem Pol bewegt haben und EpCAM negativ sind. Diese Zellen werden durch das FDA-zugelassene CELLSEARCH® System und auch durch den Adna Test (AdnaGen AG) und derzeitige Mikrofluidik-Technologien übersehen werden, die mittels Immunabsorption von Zellen, die MUC1 oder EpCAM exprimieren, CTCs anreichern. Tatsächlich haben jüngere Studien in Brustkrebs nahegelegt, dass „normalen“ Brustkrebszelllinien, die sowohl EMT- als Stammzell-Antigene überexprimieren (CD44+, CD24–), EpCAM fehlen kann und sie folglich durch gegenwärtig anerkannte CTC Nachweissysteme nicht nachweisbar sind. Daher ist es möglich, dass die Anzahl von CTCs im Patienten mit metastasiertem Krebs viel höher als derzeit anerkannt ist. Die Identifikation dieser zusätzlichen Untergruppe von CTCs kann einen höheren prognostischen Wert zur Verfügung stellen als die CTC Zahlen, wie sie derzeit bestimmt werden, ebenso wie einen früheren Nachweis der CTCs und des metastatischen Potentials in Patienten mit Erkrankungen in einem frühen Stadium.
  • Darüberhinaus stellen CTCs in intermediären Zuständen, welche die 50–75% der hierin aus Patienten mit metastierendem Brust- und Prostatakrebs isolierten Zellen umfassen, ebenso wie diejenigen Zellen, die unentdeckt bleiben, weil sie eine vollständigere EMT durchlebt haben, ein therapeutisches Problem dar. Es ist gut dokumentiert worden, dass EMT die Empfindlichkeit von Lungenkrebszellen gegenüber einem Arzneimittel ändert, und es war schwierig, die Therapie auf Krebszellen mit Stammzell-ähnlichen Eigenschaften auszurichten, vielleicht aufgrund ihrer Widerspenstigkeit gegenüber Apoptose.
  • Während jüngere Studien sowohl ein Screening-Verfahren als auch Verbindungen (z. B. Salinomyzin) vorschlagen, die selektiv auf Krebsstammzellen abzielen, stellen diese aggressiven Zellen noch immer eine erhebliche therapeutische Herausforderung dar. Folglich stellen Moleküle, die ein bindendes Agens umfassen, das eine Bindungsspezfität für einen EMT-Biomarker aufweist, wie hierin beschrieben, und die mit einem Anti-Krebsmittel verbunden sind, zusätzliche therapeutische Alternativen zur Verfügung.
  • Beispiel 8. CTCs aus Patienten mit metastasiertem Brust- und Postatakrebs exprimieren Vimentin und N-Cadherin
  • Geeignete Männer hatten progressiven, metastasierten CRPC (Progression trotz Testosteron < 50 ng/dl) und waren dabei, eine neue systemische Therapie zu beginnen. Geeignete Frauen hatten progressiven, metastasierten Brustkrebs (mBC) und waren dabei, eine neue systemische Therapie zu beginnen. Die Eigenschaften der Patienten (n = 29) im Ausgangszustand sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7. Eigenschaften der Patienten (n = 29) im Ausgangszustand
    Metastasierter Prostatakrebs (n = 17) Metastasierter Brustkrebs (n = 12)
    DEMOGRAPHISCHE ANGABEN
    Alter, median 69 (59–82) 61,5 (48–81)
    Rasse, Ethnie
    Weiß, nicht-hispanisch 76% 58%
    Andere, nicht-hispanisch 23% 42%
    KRANKHEITSVERLAUF IM AUS GANGSZUSTAND
    Gleason Score, median 7 (7–9) -
    ER/PR, % - 75%/67%
    Medianer PSA im Ausgangszustand, Bereich 396,4 (14–13.419,5) -
    Schmerz-Score im Ausgangszustand (0–10), median 1 (0–7) 0 (0–6)
    Karnofsky Performance Status, median 90 (70–100) 90 (70–100) (n = 6)
    # frühere Hormontherapie 2 (0–5) 2 (0–4)
    Frühere Chemotherapie 47% 83%
    Ausgangszustand CTC-Zahl, median 40 (4–828) 13 (0–1062)
    METASTATISCHE REGIONEN
    Lymphknoten 65% 50%
    Leber 24% 50%
    Lunge 47% 42%
    Knochen 94% 75%
  • CTCs wurden in FDA-zugelassene Cellsave Röhrchen gefüllt und innerhalb von 48 Stunden unter Verwendung der CELLSEARCH® Methodik unter Verwendung von EpCAM-basierter ferromagnetischer Erfassung (ferromagnetic capture) verarbeitet. Eine CTC wurde definiert als eine intakte, zellkernhaltige (DAPI+) Zelle, die pan-CK exprimiert und der die Expression des Leukozyten-Antigens CD45 fehlt und wurde unter Verwendung von Standardverfahren gezählt. Ein zweites CELLSEARCH® Röhrchen wurde entnommen und unter Verwendung von EpCAM Erfassung verarbeitet, und die isolierten Zellen wurden mit CK (IgG1, AbD Serotec), markiert mit Alexa 555, CD45 (IgG1, AbCam), markiert mit Alexa 647 und entweder Vimentin (IgG1, BD Biosciences) oder N-Cadherin (IgG1, DAKO) unter Verwendung einer immunfluoreszenten Markierung mit Alexa 488, angefärbt. Der Anteil von CTCs, in denen ein EMT-Antigen positiv angefärbt wurde, wurde aus der Gesamtzahl der CTCs errechnet, die, ausgehend von dem zweiten Röhrchen, manuell errechnet wurde. Positive Kontrollen wurden für jeden Marker verwendet, in dem PBMCs vom amerikanischen Roten Kreuz (CD45), PC3 Prostatakrebszellen (Vimentin, N-Cadherin) und T47D Brustkrebszellen (CK) verwendet wurden. Negative Kontrollen, die einen Mock-Antikörper verwenden, wurden verwendet, um die Färbung/Auszählung für jedes Antigen zu optimieren.
  • Die Prävalenz der Vimentin und CK Koexpression in CTCs und die Prävalenz der N-Cadherin und CK Koexpression in CTCs ist in den Tabellen 8 und 9 dargestellt. Vimentin Koexpression wurde in 17/20 (85%) der Patienten mit mCRPC oder mBC und 78% aller CTCs nachgewiesen. N-Cadherin Koexpression wurde in 8/9 (89%) der Patienten und 81% der CTCs nachgewiesen. Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC sind in 11 gezeigt (A, ein Leukozyt; B, Vimentin negative CTC (CRPC); C, Vimentin positive CTC (BC); und D) Vimentin positive CTC (CRPC)). Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC sind in 12 gezeigt (A, Leukozyt B, Ncad positive CTC (BC); C, Ncad-negative CTC (BC); und D, zwei Ncad positive CTCs (Pfeile) und 1 Ncad-negative CTC (CRPC)). Immunfluoreszenzbilder von CTCs aus Patienten mit mCRPC und mBC sind in 13 gezeigt (A, Phase/DAPI; B, CD45/DAPI; C, CK/DAPI; D, Vimentin/DAPI Positivfärbung in einem Mann mit mCRPC; E, Phase/DAPI; F, CD45/DAPI; G, CK/DAPI; und H, Vimentin/DAPI Negativfärbung in einem zweiten Mann mit mCRPC).
  • Die Daten zeigten die Koexpression von Cytokeratin mit den EMT-Antigenen Vimentin und N-Cadherin in CTCs aus Männern mit metastasiertem CRPC und Frauen mit metastasiertem Brustkrebs. Eine Mehrzahl mittels Immunfluoreszenzmarkierung untersuchter CTCs koexprimierte CK- und EMT-Proteine. Die Mehrzahl von Patienten in dieser Studie hatte CTCs, die Vimentin oder N-Cadherin koexprimierten, was eine mögliche epitheliale Plastizität während der Metastasierung nahelegt. Die Daten legen nahe, dass den CTCs epitheliale Marker fehlen können und stellen Verfahren zum Beurteilen von Patienten mit Brust- und Prostatakrebs, ebenso wie für den optimalen Nachweis zirkulierender Tumorzellen in anderen häufigen Malignitäten, zur Verfügung. Tabelle 8.
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch) Verhältnis von: Vimentin (+) CTCs/Gesamt-CTC-Zahl, manuell
    Kastrationsresistenter metastasierter Prostatakrebs 1 5 4/6
    2 4 2/2
    3 54 11/11
    4 45 6/10
    5 626 5/8
    6 110 17/21
    7 182 5/6
    8 17* 13/16
    9 19 33/34
    10 34 12/12
    Summe 1127 108/126 (86%)
    Metastasierter Brustkrebs 1 13 0/6
    2 85 2/2
    3 8 4/4
    4 21 1/2
    5 12 2/2
    6 188 21/22
    7 324** 29/33
    8 377 6/23
    9 0 0/0
    10 3 0/3
    Summe 884 65/97 (67%)
    Gesamtsumme - 173/223 (78%)
    Tabelle 9.
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch) Verhältnis von: N-Cadherin (+) CTCs/ Gesamt-CTC-Zahl, manuell
    Kastrationsresistenter metastasierter Prostatakrebs 1 45 13/19
    2 12 5/7
    3 10 8/8
    4 5 8/9
    5 12 4/4
    6 221 11/13
    7 828 81/96
    Total 1132 130/156 (83%)
    Metastasierter Brustkrebs 1 1062 9/13
    2 2 0/3
    Total 1064 9/16 (56%)
    Gesamt Total - 139/172 (81%)
    *Zählung 3 Monate vor dem Ausgangszustand (keine Therapie in der Zwischenzeit)
    **Zählung zum Zeitpunkt #2
  • In einem zweiten Experiment zum Überprüfen der Existenz transitionaler CTCs wurde Blut von 31 Männern mit mCRPC und 16 Frauen mit mBC entnommen (siehe Eigenschaften der Patienten im Ausgangszustand in Tabelle 10 und 11). Die CTCs wurden unter Verwendung des CELLSEARCH® EpCAM-basierten Immun-Erfassungs-Verfahrens verarbeitet und Profile für die Expression von CD45 (PTPRC) (ein Leukozytenmarker), Cytokeratinen (CK) (epitheliale Marker), Vimentin (VIM) und N-Cadherin (CDH2) (mesenchymale Marker) sowie CD133 (ein Stammzellmarker) mittels Immunfluoreszenz (IF) erstellt (Tabelle 2). Leukozyten wurden definiert als zellkernhaltige (DAPI positive), CD45 positive und CK-negative Zellen, während CTCs definiert wurden als zellkernhaltige (DAPI positive), CD45 negative und CK positive Zellen. Unter den CTCs identifizierten wir transitionale Zellen als solche, die zusätzlich Vimentin oder N-Cadherin exprimierten. Tabelle 10. Demographische und klinische Eigenschaften von Männern mit metastasiertem CPRC im Ausgangszustand.
    DEMOGRAPHISCHE ANGABEN n = 31
    Alter, Jahre (Bereich) 71 (59–89)
    Rasse, Ethnie
    Weiß, nicht-hispanisch 71%
    Schwarz, nicht-hispanisch 29%
    KRANKHEITSVERLAUF IM AUSGANGSZUSTAND
    Medianer Gleason Score (Bereich) 8 (5–10)
    Medianer PSA1 im Ausgangszustand (ng/dl, Bereich) 267,5 (14,0–13.419,5)
    Medianer Schmerz im Ausgangszustand (Bereich)2 1 (0–7)
    Medianer Karnofsky Performance Status (Bereich) 90 (60–100)
    Mediane Anzahl früherer Hormontherapien (Bereich) 3 (0–5)
    Frühere Chemotherapie 65%
    Frühere Bisphosphonate 71%
    REGIONEN DER METASTATISCHEN ERKRANKUNG
    Viszeral (Lunge + Leber) 35%
    Nur Lymphknoten 0%
    Knochenmetastatisch:
    Knochenmetastatisch mit Lymphknoten (keine viszeralen Metastasen) 39%
    Knochenmetastatisch ohne Lymphknoten (keine viszeralen Metastasen) 26%
    1PSA: Prostata-spezifisches Antigen
    2Schmerz wird gemessen als lineare analoge Skala (Bereich 0–10) Tabelle 11. Eigenschaften von mBC-Patienten im Ausgangszustand.
    DEMOGRAPHISCHE ANGABEN n = 16
    Medianes Alter (Bereich) 61 (48–81)
    Rasse, Ethnie
    Weiß, nicht-hispanisch 44%
    Schwarz, nicht-hispanisch 50%
    Asiatisch, nicht-hispanisch 6%
    KRANKHEITSVERLAUF IM AUSGANGSZUSTAND
    ER und/oder PR positiver Erkrankung 56%
    HER2 positiver Erkrankung (HER2 3+) 0%
    Medianer Karnofsky Performance Status (Bereich) 90 (70–90)
    Mediane Anzahl früherer endokriner Therapien (Bereich) 1 (0–4)
    Mediane Anzahl früherer Chemotherapien 2 (0–7)
    REGIONEN METASTATISCHER ERKRANKUNGEN
    Viszeral (Lunge oder Leber) 75%
    Nur Lymphknoten 0%
    Lymphknoten, Weichgewebe oder kontralaterale Brust, ausschließlich 13%
    Nur Knochenmetastasen:
    Knochenmetastatisch mit Lymphknoten (keine viszeralen Metastasen) 0%
    Knochenmetastatisch ohne Lymphknoten (keine viszeralen Metastasen) 13%
  • Unter den zehn Männern mit mCRPC koexprimierten die CTCs Vimentin und CK in 10/10 (100%) der Patienten, und durch dieses Kriterium waren 108/126 (86%) der gezählten CTCs transitional (Tabelle 12, 14). Biopsien von knöchernen Metastasen, die innerhalb einer Woche nach der CTC-Entnahme in zwei dieser Patienten durchgeführt wurden, zeigten keine Vimentin Expression in den CK positiven Tumor Foki, jedoch eine starke Vimentin Expression in dem umgebenden Knochenstroma, dem CK Expression fehlte. Denselben Patienten wurden CTCs entnommen, zu demselben Zeitpunkt wie die CT-gesteuerte Tumorbiopsie, die gewöhnlich CK und Vimentin koexprimierten. Diese Erkenntnisse stehen im Einklang mit der Invasion und Metastasierung durch transitionale CTCs, die anschließend eine MET durchleben; alternativ könnte die Vimentin Expression heterogen exprimiert sein in Metastasen, ähnlich der CTC Expression. Tabelle 12. Zirkulierende Tumorzelle (CTC) und transitionale CTCs in Patienten mit metastasiertem CRPC.
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch)i Verhältnis: Vimentin (+) CTCs/Gesamt-CTC-Zahlii, manuell
    1 5 4/6
    2 4 2/2
    3 54 11/11
    4 45 6/10
    5 626 5/8
    6 110 17/21
    7 182 5/6
    8 17 13/16
    9 19 33/34
    10 34 12/12
    Summe 1127 108/126 (86%)
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch) Verhältnis: N-Cadherin (+) CTCs/Gesamt-CTC-Zahl, manuell
    11 45 13/19
    12 12 5/7
    13 10 8/8
    14 5 7/8
    15 12 3/4
    16 220 11/13
    17 828 81/96
    18 26 6/11
    19 12 18/22
    20 42 15/18
    Summe 1224 167/206 (81%)
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch) Verhältnis: CD133 (+) CTCs/Gesamtzahl CTC, manuell
    21 485 38/38
    22 16 6/11
    23 91 15/21
    24 6 0/0
    25 36 29/29
    26 27 9/9
    27 43 10/15
    28 2 0/0
    29 23 12/14
    30 38 23/26
    31 30 12/17
    Summe 797 154/180 (86%)
    i Die mittlere Spalte zeigt die CTC-Zahl aus der FDA zugelassenen CELLSEARCH®-Zählung von CTCs für jedes Individuum.
    ii Die rechte Spalte zeigt das Verhältnis von Vimentin exprimierenden CTCs (die Koexpression von Vimentin bewegte sich im Bereich von 60–100% der Zellen in einem bestimmten Individuum und korrelierte nicht mit der CTC-Zahl (R2 = 0,11)), N-Cadherin (die Koexpression von N-Cadherin bewegte sich im Bereich von 55–100% der Zellen in einem bestimmten Individuum und korrelierte nicht mit der CTC-Zahl (R2 = –0,09)), oder CD133 (die CD133-Koexpression bewegte sich im Bereich von 55–100% der auswertbaren Zellen in einem bestimmten Individuum und korrelierte nicht mit der CTC-Zahl (R2 = 0,04)) zur Gesamtzahl von CTCs, die manuell gezählt wurden. Eine CTC wurde definiert als eine intakte, DAPI positive (zellkernhaltige) Zelle, der CD45 Expression fehlte und die Cytokeratin exprimierte. Tabelle 13 CTCs und transitionale CTCs in Patienten mit mBC.
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch)i Verhältnis: Vimentin (+) CTCs/Gesamt-CTC-Zahlii, manuell
    1 21 0/6
    2 7 2/2
    3 8 4/4
    4 21 1/2
    5 12 2/2
    6 188 21/22
    7 324 29/33
    8 377 6/23
    9 0 0/0
    10 3 0/3
    Summe 961 65/97 (67%)
    Individuum Nummer CTC-Zahl (Cellsearch) Verhältnis: N-Cadherin (+) CTCs/Gesamt-CTC-Zahl, manuell
    11 1062 9/13
    12 2 0/3
    13 147 52/59
    14 6 2/5
    15 3 15/15
    16 2 0/0
    Summe 1252 78/95 (82%)
  • In der nächsten Kohorte von 10 Männern mit mCRPC koexprimierten CTCs N-Cadherin und CK in 10/10 (100%) der Patienten, und durch dieses Kriterium wurden 167/206 (81%) der CTCs als transitional identifiziert (Tabelle 12, 15). Unter 10 Frauen mit mBC wiesen neun nachweibare CTCs auf, und von diesen fanden wir in sieben (78%) Patienten einen Nachweis auf Vimentin Koexpression, und 55/88 CTCs insgesamt (63%) koexprimierten Vimentin (Tabelle 13, 14). Unter weiteren sechs Frauen mit nachweisbaren CTCs und mBC zeigten vier Hinweise auf CK und N-Cadherin Koexpression, und insgesamt 78/95 CTCs (82%) wiesen N-Cadherin Expression auf, mit signifikanter Heterogenität in der Expression in einem bestimmten Individuum (Tabelle 13, 15). Diese Daten zeigen, dass viele CTCs in Patienten mit mBC und mCRPC epitheliale (EpCAM und Cytokeratin) und mesenchymale (Vimentin, N-Cadherin) Marker koexprimieren und folglich in einem transitionalen phänotypischen Zustand existieren, ähnlich dem, der in unseren präklinischen Modellen beobachtet wurde.
  • In Anbetracht der Expression des Stammzellen-assoziierten Antigens CD133 in transitionalen AT3-T Zellen wurde die CD133 Expression in CTCs von Männern mit mCRPC ausgewertet. CD133 wurde in 11/11 (100%) der Männer mit CTCs exprimiert, und in 154/180 (86%) der CTCs von diesen Männern (Tabelle 12, 16). Diese Daten legen nahe, dass CTCs aus Patienten mit häufigen epithelialen Malignitäten transitionale Stadien einnehmen können, charakterisiert durch Koexpression epithelialer und mesenchymaler Marker, ebenso wie CD133, Biomarker, die in Verbindung gebracht wurden mit Stammzell-ähnlichen Eigenschaften, Invasivität und Chemoresistenz.
  • Beispiel 9. CTC-Isolierung
  • Antikörperselektion. Für die Zellerfassung (cell capture) wurden mehrere Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von OB-Cadherin oder N-Cadherin unter Verwendung von Zelllinien als positive Kontrolle (PC3) und negative Kontrolle (LNCaP) getestet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Antikörper mit dem stärksten Signal in den PC3 Zellen und dem geringsten Hintergrund in LNCaP Zellen wurden für die Konjugation mit magnetischen Partikeln ausgewählt. Der Anti-OB-Catherin Antikörper (R&D Systems, Klon 283416) und Anti-N-Cadherin Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, D-4) wurde mit magnetischen Partikeln konjugiert, indem Methoden ähnlich den zuvor beschriebenen Verfahren verwendet wurden (Allard et al. (2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904; siehe auch US-Patent Nr. 6,645,731 ).
  • Mesenchymales Capture Assay. Ein mesenchymales Erfassungs-(capture)Assay wurde mit der CELLSEARCH®-Plattform (Veridex LLC) verwendet, einschließlich des CELLTRACKS® AUTOPREP® zur Probenpräparation und des CELLTRACKS ANALYZER II® zur Analyse der erfassten (eingefangenen) Zellen (Allard et al. (2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904). Das mesenchymale Capture-Assay umfasste Ferrofluid, beschichtet mit Anti-OB-Cadherin Antikörpern oder Anti-N-Cadherin Antikörpern, um ein Erfassungsreagenz (Capture-Reagenz) zu erzeugen, das mesenchymale Zellen immunmagnetisch anreichern würde, sowie Färbereagenzien, wie Phycoerythrin(PE)-konjugiertem Antikörper, der an β-Catenin bindet (Klon L54E2 von Cell Signaling Technology, Inc.); einen Antikörper gegen CD45, konjugiert mit Allphycozyanin (APC); und nukleärem Farbstoff 4‘-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Zellen fluoreszent zu markieren. Das Assay umfasste Puffer zum Waschen, Permeabilisieren und Resuspendieren der Zellen, wie die folgenden Komponenten aus dem CELLSEARCH® Kit: Capture Enhancement Reagenz, Permeabilisierungs-Reagenz, Zellfixierungsmittel und Verdünnungspuffer.
  • Probenpräparation. 7,5 ml Blut wurden in 15 ml CELLTRACKS® AUTOPREP® Probenröhrchen transferriert und mit 6,5 ml Verdünnungspuffer gemischt, bei 800 g für 10 Min. zentrifugiert und anschließend zur automatisierten Probenpräparation unter Verwendung des mesenchymalen Capture-Assays auf den CELLTRACKS® AUTOPREP® (Veridex LLC) gegeben. Nach der Aspiration der Plasma- und Pufferschicht durch das Gerät wurde Ferrofluid dazugegeben. Nach der Inkubationszeit und anschließender magnetischer Trennung wurden ungebundene Zellen und verbleibendes Plasma aspiriert. Die Zielzellen wurden angereichert, mit Fluoreszenz markiert und resuspendiert unter Verwendung des CELLTRACKS® AUTOPREP® in dem MAGNEST® Cell Presentation Device (Veridex LLC). Das durch das MAGNEST®-Gerät erzeugte magnetische Feld bewirkte, dass sich die magnetisch markierten Zellen gleichmäßig über die Analyseoberfläche der Kammer zur Analyse unter Verwendung des CELLTRACKS ANALYZER II® verteilten.
  • Probenanalyse. Nach der ferromagnetischen Antikörper-Erfassung wurden die Färbereagenzien dazugegeben, zusammen mit einem Permeabilisierungspuffer, um die immunmagnetisch angereicherten Zellen mit Fluoreszenz zu markieren. Die Zellen wurden mit markierten Anti-β-Catenin Antikörpern, markierten anti-CD45 Antikörpern und DAPI zur Visualisierung gefärbt. Die Anti-β-Catenin Anrtikörper wurden verwendet, um mesenchymale CTCs zu identifizieren. Nach Inkubation in dem System wurde die magnetische Trennung wiederholt und überschüssige Färbereagenzien wurden aspiriert. In dem letzten Verarbeitungsschritt wurden die Zellen in dem MAGNEST®-Gerät resuspendiert, das eine Kammer enthielt und zwei Magnete, welche die immunmagnetisch markierten Zellen für die Analyse unter Verwendung des CELLTRACKS ANALYZER II® ausrichteten.
  • Der MAGNEST® wurde auf den CELLTRACKS ANALYZER II® gegeben, ein Vierfarben-semi-automatisiertes Fluoreszenzmikroskop. Bilderrahmen, welche die vollständige Oberfläche der Kammer für jeden der vier Fluoreszenz-Filter-Kuben abdeckte, wurden aufgenommen. Die aufgenommenen Bilder, die PE ebenso wie DAPI positive Ereignisse in demselben Rahmen enthielten, wurden in einer internetfähigen Browsergallerie für die Klassifizierung der Ereignisse auf Grundlage der Zellfluoreszenz und Morphologie präsentiert. Die endgültige Selektion der Zellen wurde durch den Anwender vorgenommen. Die Kriterien zum Klassifizieren des Objektes als eine mesenchymale Zelle (bezeichnet als „Ereignisse“) umfassten runde oder ovale Morphologie, eine intakte Zelle großer als 4 µm mit einem sichtbaren Nukleus (DAPI positiv), positive Färbung für anti-β-Catenin-PE und negative Färbung für anti-CD45-APC, wie in 17 bildlich dargestellt. Die Ergebnisse der Zellzählung wurden ausgedruckt als die Anzahl der Zellen pro 7,5 ml Blut.
  • Eine isolierte „CTC“ unter Verwendung dieses Assays wurde definiert als eine β-Catenin positive, CD45 negative, zellkernhaltige intakte Zelle, basierend auf unseren vorläufigen Daten, wonach beta-Catenin in Tumorzellen visualisiert war, nicht jedoch in Leukozyten, wie in 18 bildlich dargestellt. Im Vergleich waren 50–75% der EpCAM-erfassten CTCs für β-Catenin gefärbt, wie in 19 gezeigt (Bitting et al. (2012) J Clin Oncol 30S:abstr 10533). Ein mesenchymaler CTC-Phänotyp wurde identifiziert unter Verwendung des OB-Cadherin Antikörper- oder N-Cadherin Antikörper-Ferrofluids, um CTCs mit positiver β-Catenin Expression, fehlender CD45 Expression und positiver nukleärer DAPI Färbung zu erfassen, um die Zellen zu charakterisieren.
  • Um zu bestimmen, ob zirkulierende mesenchymal-ähnliche Tumorzellen, welche die oben genannten Kriterien erfüllen, in gesunden Individuen vorhanden waren, wurde von gesunden Erwachsenen im Alter von mehr als 18 Jahren Blut in 10 ml EDTA Röhrchen entnommen. Die Individuen waren nicht geeignet, wenn sie irgendwelche chronischen medizinischen Zustände hatten, die eine medikamentöse Behandlung erforderten oder eine Vorgeschichte einer Krebserkrankung. Die Proben wurden, wie oben beschrieben, innerhalb von 8 Stunden nach der Blutentnahme verarbeitet. Alle Individuen wurden unter Verwendung eines von einem institutionellen Prüfungsausschuss genehmigten Protokolls eingeschlossen und gaben eine informierte Einwilligungserklärung ab. Die OB-Cadherin erfassten, β-Catenin positiven Ereignisse („seltene Ereignisse“) wurden in gesunden Freiwilligen nachgewiesen. Die seltenen Ereignisse, die in gesunden Freiwilligen nachgewiesen wurden, wurden mit dem endothelialen Marker CD31 (BD Bioscience, Klon WM59) für die weitere Charakterisierung, wie zuvor beschrieben, (Pusztaszeri et al. (2006) J Histochem Cytochem 54:385-395) gefärbt. Alle nachgewiesenen Ereignisse in gesunden Freiwilligen waren CD31 positiv, was zeigt, dass diese Zellen Endothelzellen darstellen könnten. Beispiele für OB-Cadherin erfasste, β-Catenin positive und CD31 positive Ereignisse in gesunden Freiwilligen sind in 20 gezeigt.
  • Nach dem Etablieren eines Schwellenwertes für den Nachweis in gesunden Freiwilligen (Null OB-Cadherin, β-Catenin positive Zellen, wenn CD31 als zusätzlicher Charakterisierungsmarker eingeschlossen wurde) wurde die Prävalenz dieser zellulären Ereignisse in Männern mit progressivem, metastasiertem CRPC bestimmt, die für eine korrelative klinische Blutentnahmestudie vor dem Beginn einer neuen systemischen Therapie eingeschlosen wurden. Siehe Tabelle 14. Diese Population war größtenteils zusammengesetzt aus Männern mit Knochenmetastasen (> 90%) und würde folglich theoretisch angereichert sein mit OB-Cadherin positiven Zellen, wenn vorhanden. Tabelle 14.
    Eigenschaften von CRPC-Patienten im Ausgangszustand Ergebnisse (n = 10)
    Medianes Alter, Jahre (Bereich) 68 (57–74)
    Rasse
    Kaukasisch, n (%) 7 (70)
    Schwarz, n (%) 3 (30)
    Karnofsky Performance Status, median (Bereich) 90 (80–100)
    Gleason Score, median (Bereich) 8 (7–10)
    Schmerz Score > 4, n (%) 4 (40)
    Initiale lokale Therapie
    Prostatektomie, n (%) 3 (30)
    Externe Bestrahlung, n (%) 3 (30)
    Keine, n (%) 4 (40)
    Laborwerte
    PSA ng/ml, median (Bereich) 408 (7–4377)
    LDH U/l, median (Bereich) 220 (206–291)
    Hämoglobin g/dl, median (Bereich) 9,8 (8,8–12,1)
    Alkalische Phosphate U/l, median (Bereich) 197 (57–463)
    CTC-Zahl, median (Bereich) 34 (1–1000)
    Regionen der Metastasierung
    Knochen, n (%) 10 (100)
    Leber, n (%) 2 (20)
    Lunge, n (%) 4 (40)
    Nur Lymphknoten 0
    Frühere Therapien
    Anzahl hormonaler Therapien, median (Bereich) 4 (1–5)
    Abirateron, MDV3100, oder TAK700, n (%) 7 (70)
    Siputeucel-T, n (%) 3 (30)
    Docetaxel, n (%) 8 (80)
    Cabazitaxel, n (%) 2 (20)
    > 1 Chemotherapie, n (%) 2 (20)
    Knochen-gezielte Therapie, n (%) 9 (90)
    Palliative Bestrahlung, n (%) 3 (30)
    Art der Progression vor dem Einschluss in die Studie
    Bildgebung 8 (80)
    Klinisch (Symptome, PSA-Zunahme) 2 (20)
  • [00208] Ein CELLSAVE® und zwei EDTA 10 ml Röhrchen mit Blut wurden zum Zeitpunkt des Ausgangszustands, in Zyklus 3 der Behandlung und zur Progression entnommen. Das in EDTA-Röhrchen erhaltene Blut wurde für die OB-Cadherin Erfassung in zweifacher Ausführung verwendet und so bald wie möglich verarbeitet, wobei nicht mehr als 8 Std. von dem Zeitpunkt der Entnahme verstrichen war. Das in den CELLSAVE®-Röhrchen erhaltene Blut wurde nur verwendet für die Standard-EpCAM Erfassung und wurde innerhalb von 72 Stunden verarbeitet, gemäß des etablierten Protokolls (Allard et al. (2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904). Unter Verwendung des CELLSEARCH®-Systems wurden zirkulierende mesenchymale Zellen mit Anti-OB-Cadherin-Ferrofluid erfasst, anschließend permeabilisiert und für die weitere Charakterisierung gefärbt, wie oben beschrieben. Die Zellen wurden pro 7,5 ml Blut gezählt, und die Zählung der mesenchymalen CTCs wurde verglichen mit dem Standard EpCAM-basierten Erfassungsverfahren. Jegliche Diskrepanz bei der Auswertung der Ereignisse wurde durch eine Diskussion zwischen zwei unabhängigen Gutachtern gelöst.
  • Das EpCAM-basierte Capture-Assay wies in der Mehrheit der Patienten mehr Tumorzellen nach, jedoch gab es Ausnahmen, in denen mehr mesenchymale Ereignisse gesehen wurden. Auch resultierte die OB-Cadherin-Erfassung in mehr Zellschichten oder Zellklumpen und mehreren Zellen pro Feld als die EpCAM-Erfassung, wie in 22 bildlich dargestellt ist.
  • Wie in Tabelle 15 gezeigt, wurden seltene Ereignisse in gesunden Freiwilligen unter Verwendung des mesenchymalen Erfassungs-Verfahrens nachgewiesen. In CRPC-Patienten wies die OB-Cadherin-Erfassung („O-cad capture“) in 3 von 5 Individuen mehr Ereignisse nach als die EpCAM-basierte Erfassung, und die Mehrzahl der erfassten Zellen waren Cytokeratin negativ. Tabelle 15.
    O-cad capture, (O-cad-Erfassung) beta-catenin+ N-cad capture, (N-cad-Erfassung) beta-catenin+ EpCAM capture, (EpCAM-Erfassung) Cytokeratin+
    Gesunde Freiwillige 0–51 Ereignisse (Durch-schnitt 5,95) n = 21 0–4 Ereignisse (Durchschnitt 0,28) n = 25 KA
    CRPC Patienten 0–465 Ereignisse (Durchschnitt 138,4) n = 5 0–2 Ereignisse (Durchschnitt 1,2) n = 5 1–123 CTCs (Durchschnitt 50,8) n = 5
  • Tabelle 16 zeigt Ereignisse, die von Zellen im Blut von CRPC-Patienten erfasst wurden, unter Verwendung des N-Cadherin (“N-cad”) und OB-Cadherin (“O-cad”) Ferrofluids. Die Anzahl der aus CRPC-Patienten erfassten Zellen schien in einigen Patienten höher zu sein im Vergleich zu der EpCAM-basierten Technologie, und die Rate des Nachweises schien höher als in gesunden Freiwilligen zu sein, wenigstens für die OB-Cadherin Erfassung. Tabelle 16.
    Individuum N-cad Capture (N-cad-Erfassung) O-cad Capture (O-cad-Erfassung) EpCAM Capture (EpCAM-Erfassung) CELLSEARCH® Expertenstandard
    #Ereignisse CD31+ #Ereignisse CD31+ #Ereignisse CD31+
    1 2 ka 4 ka 102 ka 46
    2 1 ka 458 ka 71 ka 45
    3 2 ka 3 ka 2 ka 7
    4 0 - 0 - 31 ka 50
    5 1 ka 220 ka 17 ka 23
    6 1 1 3 0 1351 ka > 1000
    7 ka ka 1 0 0 - 1
    8 2 0 0 - 53 1 22
    9 0 - 29 29 9 0 12
    10 ka ka 2 1 11 1 69
  • Beispiel 10.
  • Um zu verifizieren, dass das mesenchymale Erfassungs-Assay unter Verwendung von anti-OB-Cadherin Antikörpern die Zellen von Interesse isolieren und nachweisen konnten, wurden Aufstockungsstudien (spiking studies) positiver und negativer Kontrollzellen durchgeführt. Vorläufige Daten, welche die OB-Cadherin Expression auf der Prostatakrebszelllinie PC-3 untersuchten, offenbarten eine OB-Cadherin Expression auf etwa 40–50% der PC3 Zellen sowohl mittels Immunfluoreszenz als auch mittels Durchflusszytometrie, wie in 23 gezeigt.
  • Die Prostatakrebszelllinie PC-3 wurde in Flaschen enthaltend DMEM High-Glucose, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert und anschließend unter Verwendung des Cell Dissociation Buffer (Gibco Cat. Nr. 13150-016) gemäß der Packungsbeilage geerntet. Die Zellen wurden in einem Hämocytometer gezählt, und entweder 500 oder 1.000 Zellen wurden in 7,5 ml Blut, das von gesunden Freiwilligen erhalten wurde, wie oben beschrieben, aufgestockt. Ein Median von 31,4% (Bereich 16,1–103,4, n = 13) aufgestockter Zellen wurde durch Verwenden der OB-Cadherin-Erfassung zurückgewonnen und als beta-Catenin positive, CD45 negative Zellen wie oben beschrieben charakterisiert.
  • Das Sammeln der CTC mit mesenchymalen Phänotyp ließ die Möglichkeit offen, dass zelluläre Ereignisse nicht Krebszellen waren, sondern eher Wirtszellen. Zum Beispiel handelte es sich bei den OB-Cadherin positiven Zellen in gesunden Freiwilligen höchstwahrscheinlich um endotheliale Zellen, die aus einer Phlebotomie stammten, da sie CD31 psoitiv waren. In Männern mit metastasiertem CRPC (mCRPC) könnten diese OB-Cadherin positiven Zellen endothelial oder zirkulierende Osteoblasten sein, aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Zellen oder andere zirkulierende mesenchymal-ähnliche Zellen, die OB-Cadherin exprimieren. Um die Signifikanz der OB-Cadherin erfassten Ereignisse aus Patienten zu bestimmen und ob diese zellulären Ereignisse Wirtszellen oder Prostatakrebszellen repräsentierten, wurde Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Prostatakrebs-spezifische genomische Ereignisse durchgeführt. Die zellulären Ereignisse wurden unter Verwendung des CELLSTRACKS ANALYZER II®, wie oben beschrieben, identifiziert und anschließend auf der Kammer für DNA FISH fixiert und getrocknet. Unter Verwendung eines 4-Farben FISH-Assays für Androgenrezeptor (AR) Amplifikation, PTEN-Verlust und Genfusion umfassend den TMPRSS2-ERG-Lokus (ERG Break-apart Assay), wie zuvor beschrieben (Attard et al. (2009) Cancer Res 69:2912-2918), wurden die erfassten mesenchymalen Zellen auf die Prostatakrebs-spezifischen Veränderungen überprüft. Wie in 24 gezeigt, waren AR-Amplifikation und die TMPRSS2-ERG-Fusion sowohl in EpCAM als auch in OB-Cadherin erfassten Zellen vorhanden, was zeigt, dass diese zellulären Ereignisse Tumor-assoziiert waren.
  • Da es unwahrscheinlich war, dass die genomischen Amplifikations- oder Deletionsereignisse in normalem Gewebe zu finden sind, und sie in den EpCAM positiven Zellen zu finden waren, legten diese Erkenntnisse nahe, dass zumindest einige der OB-Cadherin, beta-Catenin positive Zellen von Prostatakrebs stammten und nicht aus der Tumormikroumgebung oder von normalen Wirtszellen stammten. Die weitere Analyse der Prävalenz dieser CTCs mit mesenchymalem Phänotyp in einer ausgedehnteren Population von Männern mit mCRPC und anderen Tumorarten zeigen die Nützlichkeit dieses Assays, existierende CTC-Assays zu ergänzen. Diese Analysen können den Vergleich mit EpCAM-basierten Ansätzen umfassen, insbesondere in Männern mit niedrigen CTC-Zahlen trotz progressiver metastasierter Erkrankung, um die klinische Anwendbarkeit OB-Cadherin positiver Ereignisse zu definieren. Außerdem definieren die Korrelationen von OB-Cadherin positiven zellulären Ereignissen mit klinischen und pathologischen Merkmalen und Patientenergebnissen mit systemischen Therapien weiterhin die unabhängige Rolle dieses Assays im Zusammenhang mit weiteren pronostischen Biomarkern. Diese Verfahren und Daten legen nahe, dass diese Zellen in Männern mit mCRPC nachweisbar waren, in gesunden Freiwilligen nicht vorhanden waren, und dass die offenbarten Verfahren OB-Cadherin positive, humane Prostatakrebszellen im Blut nachwiesen.
  • Die verbreitete Expression von OB-Cadherin in CTCs legte Osteomimikry nahe und stellte einen Einblick in den Mechanismus des Homings von Prostatakrebs in Knochen und die Entwicklung osteoblastischer Knochenmetastasen bereit. OB-Catherin Ereignisse in gesunden Freiwilligen exprimierten einheitlich den endothelialen Marker CD31, während der CD31-Status in Patienten mit einer Krebserkrankung variabler war. Zusätzliche Marker können verwendet werden, um zu bestätigen, dass diese mesenchymal-ähnlichen Zellen Tumorzellen waren (z. B. FISH, Cytokeratin, PSA).
  • Es ist klar, dass die vorangehende detaillierte Beschreibung und die dazugehörigen Beispiele lediglich der Veranschaulichung dienen und nicht als für den Umfang der Erfindung beschränkend aufzufassen sind, der ausschließlich durch die angefügten Ansprüche und ihre Äquivalente definiert wird.
  • Verschiedene Änderungen und Modifikationen der offenbarten Ausführungsformen werden für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein. Derartige Änderungen und Modifikationen, einschließlich und ohne Beschränkung solcher, die sich auf chemische Strukturen, Substituenten, Derivate, Intermediate, Synthesen, Zusammensetzungen, Formulierungen oder Verfahren zur Verwendung der Erfindung beziehen, können durchgeführt werden, ohne von dem Geist und dem Umfang abzuweichen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (46)

  1. Ein Verfahren zum Isolieren, Erfassen oder Anreichern einer zirkulierenden Tumorzelle aus einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) (EMT Biomarker) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; und d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren, Erfassen oder Anreichern der zirkulierenden Tumorzelle.
  2. Ein Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren einer zirkulierenden Tumorzelle in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; und d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Nachweisen oder Identifizieren der zirkulierenden Tumorzelle.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle wenigstens eines der Folgenden umfasst: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die zirkulierende Tumorzelle bestätigt wird, wenn die DAPI Färbung positiv ist, die β-Catenin Expression positiv ist, die CD45 Expression negativ ist und die CD31 Expression negativ ist.
  6. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die zirkulierende Tumorzelle einen mesenchymalen Phänotyp hat.
  7. Verfahren zum Isolieren oder Erfassen einer intakten Zelle aus einem Patienten, wobei die Zelle β-Catenin positiv, DAPI positiv und CD45 negativ ist, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der intakten Zelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-intakte Zelle-Komplex zu bilden; und d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-intakte Zelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe, dadurch Isolieren oder Erfassen der intakten Zelle.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die intakte Zelle einen mesenchymalen Phänotyp hat.
  9. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der EMT Biomarker wenigstens einer der Folgenden ist: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der EMT Biomarker OB-Cadherin oder N-Cadherin ist.
  11. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der EMT Biomarker OB-Cadherin ist.
  12. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Patient eine Krebserkrankung hat.
  13. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Krebserkrankung wenigstens eine der Folgenden umfasst: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs.
  14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Krebserkrankung Prostatakrebs oder Brustkrebs ist.
  15. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Krebserkrankung Prostatakrebs ist.
  16. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebsspezifischen genomischen Ereignis.
  17. Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das wenigstens eine Prostatakrebsspezifische genomische Ereignis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Androgenrezeptor-Amplifikation, PTEN(phosphatase and tensin homolog)-Verlust, Genfusion des Transmembran Protease, Serin 2 (TMPRSS2) Gens und des ETS related (ERG) Gens, und Kombinationen davon.
  18. Das Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei der Bestimmungsschritt mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt wird.
  19. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe von einem Organismus umfasst.
  20. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologische Probe Blut umfasst.
  21. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fänger-bindende-Protein ein Antikörper ist.
  22. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die feste Phase ein Mikropartikel ist.
  23. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Mikropartikel magnetisch oder paramagnetisch ist.
  24. Ein Verfahren zum Nachweis und Behandeln einer Krebserkrankung in einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; e) Bestimmen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; f) Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle mit einem Referenzwert der zirkulierenden Tumorzelle, g) Nachweis einer Krebserkrankung in dem Individuum, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzelle höher ist als der Referenzwert der zirkulierenden Tumorzelle, wird eine Krebserkrankung in dem Individuum nachgewiesen, und h) Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an das Individuum, das als an Krebs erkrankt identifiziert wurde.
  25. Ein Verfahren zum Überwachen der Progression einer Krebserkrankung in einem Individuum, das sich einer therapeutischen Behandlung unterzieht, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; e) Bestimmen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle in dem Feste Phase-Fänger-bindendes-Protein zirkulierende Tumorzelle-Komplex; f) Korrelieren des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle mit der Progression der Krebserkrankung in dem Individuum, wobei das Individuum als Individuum mit Progression einer Krebserkrankung identifiziert wird, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzelle höher ist im Vergleich zu dem Anteil der zirkulierenden Tumorzelle in einer früheren biologischen Probe von dem Individuum; und g) Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an das Individuum, das als Individuum mit Progression einer Krebserkrankung identifiziert wurde.
  26. Ein Verfahren zum Bestimmen einer Krebsprognose in einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; e) Bestimmen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle in dem Feste-Phase-Fänger-bindendes-Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; f) Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle mit einem Referenzwert der zirkulierenden Tumorzelle, g) Bestimmen der Krebsprognose in dem Individuum, wobei das Individuum als mit Krebs erkrankt identifiziert wird, wenn der Anteil der zirkulierenden Tumorzelle höher als der Referenzwert der zirkulierenden Tumorzelle ist, und h) Verabreichen einer Therapie gegen Krebs an das Individuum, das als an Krebs erkrankt identifiziert wurde.
  27. Ein Verfahren zum Vorhersagen der Ansprechempfindlichkeit eines Individuums mit einer Krebserkrankung auf einen Behandlungsverlauf, wobei das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer biologischen Probe von einem Patienten; b) Erhalten von wenigstens einem Fänger-bindenden Protein, wobei das Fänger-bindende Protein an eine feste Phase gekoppelt ist, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu bilden; c) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-Komplex zu erlauben, an wenigstens einen Biomarker für epithelial-mesenchymale Transition (EMT) auf der zirkulierenden Tumorzelle zu binden, um einen Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex zu bilden; d) Trennen des Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplexes von der Probe und von ungebundenen Magnetischer Partikel-Fänger-bindendes Protein-Komplexen durch Anwenden eines externen magnetischen Feldes auf die Probe; e) Bestimmen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle in dem Feste-Phase-Fänger-bindendes-Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex; und f) Vergleichen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle mit einem Referenzwert der zirkulierenden Tumorzelle.
  28. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das Bestimmen des Anteils der zirkulierenden Tumorzelle in dem Feste Phase-Fänger-bindendes Protein-zirkulierende Tumorzelle-Komplex das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle umfasst.
  29. Das Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das Bestätigen der zirkulierenden Tumorzelle wenigstens eines der Folgenden umfasst: DAPI Färbung, β-Catenin Nachweis, CD45 Nachweis und CD31 Nachweis.
  30. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei der EMT Biomarker wenigstens einer der Folgenden ist: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133.
  31. Das Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei der EMT Biomarker OB-Cadherin oder N-Cadherin ist.
  32. Das Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei der EMT Biomarker OB-Cadherin ist.
  33. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die Krebserkrankung wenigstens eine der Folgenden umfasst: Brustkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Gehirnkrebs, Hautkrebs, Rektumkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskarzinom, Sarkom, Trachealkrebs, Kopf und Halskrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Ovarialkrebs, lymphoider Krebs, Zervixkrebs, Vulvakrebs, Melanom, Mesotheliom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Knochenkrebs, Karzinom, Sarkom und Weichgewebskrebs.
  34. Das Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Krebserkrankung Prostatakrebs oder Brustkrebs ist.
  35. Das Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Krebserkrankung Prostatakrebs ist.
  36. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 35, weiterhin umfassend das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebsspezifischen genomischen Ereignis.
  37. Das Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei das wenigstens eine Prostatakrebsspezifische genomische Ereignis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Androgenrezeptor-Amplifikation, PTEN(phosphatase und tensin homolog)-Verlust, Genfusion des Transmembran Protease, Serin 2 (TMPRSS2)-Gens und des ETS related (ERG)-Gens, und Kombinationen davon.
  38. Das Verfahren gemäß Anspruch 36 oder 37, wobei das Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von wenigstens einem Prostatakrebs-spezifischen genomischen Ereignis mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) durchgeführt wird.
  39. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 38, wobei die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe von einem Organismus umfasst.
  40. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 38, wobei die biologische Probe Blut umfasst.
  41. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 40, wobei das Fänger-bindende Protein ein Antikörper ist.
  42. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 41, wobei die feste Phase ein Mikropartikel ist.
  43. Das Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei der Mikropartikel magnetisch oder paramagnetisch ist.
  44. Ein Kit zum Isolieren oder Erfassen einer zirkulierenden Tumorzelle in einer biologischen Probe, wobei der Kit einen Antikörper umfasst, der an einen magnetischen Partikel gekoppelt ist, wobei der Antikörper spezifisch an wenigstens einen Biomarker für epithelialmesenchymale Transition (EMT) bindet, und wenigstens ein Färbereagenz.
  45. Der Kit gemäß Anspruch 44, wobei der wenigstens eine EMT Biomarker wenigstens einer der Folgenden ist: OB-Cadherin, N-Cadherin, Vimentin, E-Cadherin, FGFR2 Spleißvarianten-Isoformen oder CD133.
  46. Der Kit gemäß Anspruch 44 oder 45, wobei das wenigstens eine Färbereagenz wenigstens eines der Folgenden umfasst: Phycoerythrin-markierter Anti-β-Catenin Antikörper und ein Allophycocyanin-markierter Anti-CD45 Antikörper.
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