CN111983220B - 多肽磁性纳米颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽纳米磁性纳米颗粒，所述多肽磁性纳米颗粒包括：特异性靶向多肽和磁性纳米颗粒；其中，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为VRRDAPRFSMQGLDA‑X，其C末端X为5～20个、优选为5～15个、更优选为9～12个氨基酸的序列；优选地，所述X氨基酸序列中的氨基酸选自以下一种或多种：C，G，N。所述多肽纳米磁珠技术可用于多种癌症类型的CTC检测和分子分型，包括食管癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌等。所述CTC分子分型的生物标志物包括PD‑L1、HER2、ER、PR、AR、EGFR和CXCR4等。本发明有助于对CTC检测并在CTC水平进行生物标志物表达水平的定性和半定量分析，从而对患者进行有针对性的个体化靶向治疗或免疫治疗等精准治疗。

Description

多肽磁性纳米颗粒、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及一种多肽磁性纳米颗粒、其制备方法和应用。
背景技术
癌症已经成为当今严重危害人类健康和生命的一类疾病，全球每年800多万人死于癌症。临床上肿瘤常规检测方法多为影像学和组织活检，受限于影像学的分辨率，5mm以下的肿瘤难以发现。而组织活检又很难实现多次取样，并且给病人带来痛苦和风险。从肿瘤原发灶脱落进入血液循环的循环肿瘤细胞(CTC)，携带原位肿瘤组织几乎所有的遗传和蛋白质信息，CTC检测作为目前液体活检的一种形式，可以动态反映肿瘤进展情况，为肿瘤的疗效预测、预后评估和复发监测等提供依据。
肿瘤是高度异质性的，即使组织学和形态相同的肿瘤，其分子生物学改变也不尽相同，不同的生物学改变具有不同的生物学行为以及治疗的敏感性，目前临床上常用的分期、分级等传统的病理分型对肿瘤的预测能力有限。近年来，随着科学技术的发展，肿瘤的靶向治疗和免疫治疗越来越受到关注，为了达到最大疗效和最小毒性，肿瘤类型的分子诊断和精确分型是治疗的关键。因此对肿瘤进行分子分型是肿瘤个体化治疗的必然要求。目前乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，严重威胁着女性的身心健康。目前已发现与乳腺癌发生发展有关的基因多达40多个，最重要的有人表皮生长因子受体-2(HER2)、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)和雄激素受体(AR)等，并研究和开发了各种靶向治疗和激素治疗。美国食品药品管理局(FDA)在2002年已批准了靶向HER2阳性乳腺癌的药物—单克隆抗体赫赛汀用于治疗乳腺癌。临床疗效显示该药在晚期乳腺癌的术前和术后辅助治疗中均能提高患者的治疗效率，延长患者的生存期。因此，乳腺癌分子分型在肿瘤治疗，特别是靶向用药方面有着非常重要的意义。因外周血中的CTC携带原位肿瘤组织几乎所有的遗传和蛋白质信息，所以对检测的患者外周血中的CTC进行HER2和ER、PR等进行分子分型对指导患者临床治疗具有非常重要的意义。
除肿瘤的靶向治疗外，肿瘤的免疫疗法在近年来也取得了一系列进展，改变了许多癌症的治疗格局。针对免疫检查点的PD-1/PD-L1抗体药物是当前备受瞩目同时发展最快的肿瘤免疫疗法，因此肿瘤细胞的PD-L1表达量对于该免疫治疗效果的预评估至关重要，所以对CTC水平上PD-L1表达量的伴随诊断对PD-1/PD-L1抗体药物的免疫治疗具有重要的临床指导意义。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于循环肿瘤细胞检测以及肿瘤标志物分子分型的多肽磁性纳米颗粒及其制备方法和应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“PBS”是指：磷酸盐缓冲液。
术语“HEPES”是指：4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
术语“PD-L1”是指：程序性死亡受体配体-1。
术语“HER2”是指：人表皮生长因子受体2。
术语“ER”是指：雌激素受体。
术语“PR”是指：孕激素受体。
术语“AR”是指：雄激素受体。
术语“EGFR”是指：表皮生长因子受体。
术语“CXCR4”是指：趋化因子受体4。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种多肽纳米磁性纳米颗粒，所述多肽磁性纳米颗粒包括：特异性靶向多肽和磁性纳米颗粒；其中，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为VRRDAPRFSMQGLDA-X，其C末端X为5～20个、优选为5～15个、更优选为9～12个氨基酸的序列，且X不为CGGNCC、CGGNCN、CGGNNC、CGGNNN、CGGNCCN、CGGNCCNN、CGGNCNN、CGGNCNNN、CGGNNCN、CGGNNCNN、CGGNNNN、CGGNNNNN；
优选地，所述X氨基酸序列中的氨基酸选自以下一种或多种：C，G，N。
根据本发明第一方面多肽磁性纳米颗粒，其中，所述多肽为靶向上皮细胞粘附分子的特异性识别多肽；
优选地，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9；最优选地，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。
根据第一方面多肽磁性纳米颗粒，其中，所述磁性纳米颗粒为带有链霉亲和素的磁性纳米颗粒；优选地，所述磁性纳米颗粒粒径为100～900nm；更优选地，所述磁性纳米颗粒粒径为300nm～800nm。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的多肽磁性纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备多肽和磁性纳米颗粒溶液；
(2)将步骤(1)制得的多肽和磁性纳米颗粒溶液混合反应得到所述多肽磁性纳米颗粒。
根据本发明第二方面方法，其中，所述步骤(1)中，制备所述多肽溶液的溶剂选自以下一种或多种：水、生理盐水、PBS、HEPES；和/或
制备所述磁性纳米颗粒溶液的溶剂选自以下一种或多种：水、PBS、HEPES。
根据本发明第二方面方法，其中，所述步骤(1)中，所述多肽溶液的终浓度为1-1000μg/mL，优选为100-500μg/mL；和/或所述磁性纳米颗粒溶液的终浓度为1-10000μg/mL，优选为1000-5000μg/mL。
根据本发明第二方面方法，其中，所述步骤(2)中，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1:10-5:1，优选为2:5。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的多肽磁性纳米颗粒或按照第二方面所述的制备方法制得的多肽磁性纳米颗粒在制备用于诊断或治疗癌症的药物和/或医疗产品中的应用。
根据本发明第三方面的应用，其中所述癌症选自以下一种或多种：食管癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌；优选为乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和/或前列腺癌。
本发明的第四方面提供了第一方面所述的多肽磁性纳米颗粒或按照第二方面所述的制备方法制得的多肽磁性纳米颗粒在制备用于循环肿瘤细胞检测和/或分子分型的药物和/或医疗产品中的应用；
优选地，所述循环肿瘤细胞检测和/或分子分型的生物标志物选自以下一种或多种：PD-L1、HER2、ER、PR、AR、EGFR、CXCR4。
本发明提供了一种用于CTC检测的多肽磁性纳米颗粒包括：
1)靶向上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性识别多肽，对应的优选序列为VRRDAPRFSMQGLDACGGNNCNNNNN。
2)带有链霉亲和素的磁性纳米颗粒，粒径为100～900nm，优选地，粒径为300nm～800nm)将上述1)和2)中的结合。
所述方法包括以下步骤：
a)将多肽粉末溶解于一定量的溶剂中，得到浓度为1-1000μg/mL的多肽溶液；
优选地，所述溶剂选自多肽的良溶剂为水、生理盐水、PBS、HEPES。
b)将磁性纳米颗粒用一定量的溶剂稀释，得到浓度为1-10000μg/mL的磁性纳米颗粒溶液；
优选地，所述溶剂为磁珠分散剂水、PBS、HEPES。
c)将上述多肽溶液和磁性纳米颗粒溶液按一定比例混合，置于25-37℃温度，100-160rpm转速的摇床上发生反应0.5-2h，将得到多肽磁性纳米颗粒组装体离心洗涤，优选地，离心转速为5000-10000rpm，将得到的多肽磁性纳米颗粒悬液置于4℃保存。
本发明还提供了所述的多肽纳米检测装置对CTC的检测。
优选地，所述CTC为SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、H1975、H1650和A549肿瘤细胞。
本发明还提供了所述的多肽纳米检测装置对肿瘤患者外周血的CTC检测和检出的CTC进行肿瘤标志物的分子分型。优选地，适用于乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌等癌症患者外周血中的CTC检测和分子分型。所述的多肽纳米技术检测CTC的步骤包括孵育、洗涤、离心、固定、封闭、免疫荧光染色、CTC鉴定等。
本发明还提供了对于检测出的CTC进行相关的分子分型。CTC相关分子分型的鉴定包括对CTC相应分子的荧光强度统计分析，并按照一定的阈值进行表达强度的界定。分子分型包括阳性表达和阴性表达，其中阳性表达包括高、中、低表达。
CTC分子分型的生物标志物包括PD-L1(程序性死亡受体配体-1)、HER2(人表皮生长因子受体2)、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)、AR(雄激素受体)、EGFR(表皮生长因子受体)和CXCR4(趋化因子受体4)等多种实体肿瘤细胞的生物标志物。
多肽纳米磁珠技术可以用于除脑部肿瘤、骨肉瘤、淋巴瘤之外的几乎所有实体肿瘤，包括食管癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌等。
本发明的目的之一是提供一种利用一种用于循环肿瘤细胞检测以及肿瘤标志物分子分型的多肽磁性纳米颗粒和应用。该方法可对乳腺癌实现体外诊断及分子分型。该方法操作简便、成本低，检测过程迅速，非侵入的特性避免了常规的病理检测给患者带来的痛苦。除此之外，该方法有望对病情进行实时追踪，根据病情发展及时调节治疗方案，为实现个性化医疗提供了指导思路。
本发明公开了循环肿瘤细胞的HER2、ER、PR和AR蛋白作为癌症诊断及分子分型标志物的应用。本发明借助倒置荧光显微镜检测蛋白标志物表达量作为肿瘤患者分子分型的应用。本发明的实验，在临床血液样本的检测中证实了该方法用于诊断和分子分型的可行性。
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用中，所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌细胞中的一种或多种。
本发明的用于循环肿瘤细胞检测及分子分型的多肽磁性纳米颗粒可以具有但不限于以下有益效果：
1.本发明所述的多肽纳米技术对CTC的检测具有较高的灵敏度和特异性，能对临床多种肿瘤患者的外周血进行CTC的检测，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌和宫颈癌等多种肿瘤。
2.本发明涉及对检测到的CTC进行肿瘤相关标志物的分子分型的方法。利用循环肿瘤细胞中目标蛋白标志物的表达量对受试者进行体外诊断及分子分型，该方法有望实现疾病的早筛及病情的实时追踪，为辅助肿瘤检测及跟踪治疗效果提供了新方法，同时还可成为预后评价的重要手段，为实现个性化医疗提供了指导思路，在提高患者的生存质量，延长生存期方面有着很好的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了试验例1NO:1多肽纳米磁珠富集乳腺癌细胞并进行HER2分子分型的结果，其中，图1A为试验例1SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠对SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞的捕获。图1B为试验例1SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠检测到的HER2表达量不同的典型乳腺癌细胞。
图2示出了试验例2SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠富集肺癌细胞并进行PD-L1分子分型的结果，其中，图2A为试验例2SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠对H1975、H1650和A549细胞肺癌细胞的捕获。图2B为试验例2SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠检测到的PD-L1表达量不同的典型肺癌细胞。
图3为试验例3检测到的HER2表达量不同的乳腺癌患者外周血中典型的CTC。
图4为试验例4检测到的HER2表达量不同的乳腺癌患者外周血中典型的CTC。
图5为试验例5检测到的典型PR分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
图6为试验例6检测到的典型AR分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
图7为试验例7检测到的典型PD-L1分子表达量不同的食管癌患者外周血的CTC。
图8为试验例8检测到的典型PD-L1分子表达量不同的肺癌患者外周血的CTC。
图9为试验例9检测到的典型EGFR分子表达量不同的肺癌患者外周血的CTC。
图10为试验例10检测到的典型PD-L1分子表达量不同的肝癌患者外周血的CTC。
图11为试验例11检测到的典型PD-L1分子表达量不同的宫颈癌患者外周血的CTC。
图12为试验例12检测到的典型PD-L1分子表达量不同的胃癌患者外周血的CTC。
图13为试验例13检测到的典型CXCR4分子表达量不同的乳腺癌癌患者外周血的CTC。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
除非特别指明，以下实施例中所用的人源肿瘤细胞系SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、H1975、H1650、A549均购自中国医学科学院基础研究所的细胞库。
除非特别指明，以下实施例中所用的多肽纯度为98％以上。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液，电阻率18.2MΩ.cm。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的扫描显微镜均为奥林巴斯显微镜IX73。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
磁珠，购自Thermo Fisher。
多肽，由北京中科纳泰生物科技有限公司自行合成，纯度为98％。
PBS，多聚甲醛，完全培养基，DAPI工作液，免疫荧光染色封闭液，均购自Hyclone。
仪器：
磁力架，北京中科纳泰生物科技有限公司自制，可放置15毫升离心管的磁力架。
荧光显微镜：
Olympus IX73，购自北京冷泉科技有限公司。
ZEISS Axio Vert A1和ZEISS Z2，购自蔡司遠東有限公司。
Thermo Fisher CX5，购自Thermo Fisher。
Nikon Ti-S，购自北京恒三江仪器销售有限公司。
优先推荐ZEISS Z2，其次Olympus IX73和Thermo Fisher CX5。
实施例1：多肽磁性纳米颗粒组装体配制
1)取400μL500nm的磁珠于2毫升Ep管中，加入1毫升PBS洗涤，然后把管放于磁力架上富集磁珠10分钟，弃上清。
2)加入2毫升PBS洗涤，然后把管放于磁力架上富集磁珠10分钟，弃上清。
3)加入1毫升PBS溶解多肽粉末，震荡涡旋，将多肽溶液加入到盛有磁珠的Ep管中，涡旋仪涡旋1分钟，将多肽磁珠混合液放置在脱色摇床上，转速调为60rpm，室温孵育1小时。
4)将Ep管放于磁力架上富集多肽磁珠10分钟，弃上清。再加1.5毫升PBS洗3遍。
5)加入400μLPBS，涡旋1分钟，将配制好的多肽磁珠存放于4℃冰箱。
以下试验例中，试验例1-2采用SEQ ID NO:1-9的多肽磁性纳米颗粒组装体，试验例3-13均采用SEQ ID NO:1的多肽磁性纳米颗粒组装体。
试验例1：多肽磁性纳米颗粒富集乳腺癌细胞并进行HER2分子分型
收集对数生长期的SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231细胞，将细胞重悬至各自的完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中，计数细胞浓度，每种细胞各取约1000个加入到2毫升健康人血中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-HER2(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和HER2荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/HER2+/CD45-的细胞指认为表达HER2的CTC，并根据HER2通道的荧光强度来判读CTC的HER2表达量。如图1A所示，SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠对SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231的捕获率稳定性好且都达到90％以上，表明该多肽纳米磁珠对乳腺癌细胞具有非常高的富集和检出效率。图1B为SEQID NO:1多肽纳米磁珠富集到的HER2表达量不同的乳腺癌细胞，表1为SEQ ID NO:1-9对SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231三种乳腺癌细胞的检出率。
表1对SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231三种乳腺癌细胞的检出率
试验例2：多肽磁性纳米颗粒富集肺癌细胞并进行PD-L1分子分型
收集对数生长期的肺癌H1975、H1650和A549细胞，将细胞重悬至各自的完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中，计数细胞浓度，每种细胞各取约1000个加入到2毫升健康人血中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mLPBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的CTC分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描和荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。如图2A所示，该多肽纳米磁珠对H1975、H1650和A549的捕获率都达到60％以上，表明该多肽纳米磁珠对乳腺癌细胞具有非常高的富集和检出效率。图2B为SEQ ID NO:1多肽纳米磁珠富集到的PD-L1分子表达量不同的肺癌细胞。表2为SEQ ID NO:1-9对肺癌H1975、H1650和A549细胞的检出率。
表2对肺癌H1975、H1650和A549细胞的检出率
试验例3：多肽磁性纳米颗粒检测乳腺癌患者外周血的CTC并进行HER2分子分型
取2mL乳腺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-HER2(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和HER2荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/HER2+/CD45-的细胞指认为表达HER2的CTC，并根据HER2通道的荧光强度来判读CTC的HER2表达量。图3为检测到的典型HRE2表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
试验例4：多肽磁性纳米颗粒检测乳腺癌患者外周血的CTC并进行ER分子分型
取2mL乳腺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-ER(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和ER荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/ER+/CD45-的细胞指认为表达ER的CTC，并根据ER通道的荧光强度来判读CTC的ER表达量。图4为检测到的典型ER分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
试验例5：多肽磁性纳米颗粒检测乳腺癌患者外周血的CTC并进行PR分子分型
取2mL乳腺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PR(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PR荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PR+/CD45-的细胞指认为表达PR的CTC，并根据PR通道的荧光强度来判读CTC的PR表达量。图5为检测到的典型PR分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
试验例6：多肽磁性纳米颗粒检测乳腺癌患者外周血的CTC并进行AR分子分型
取2mL乳腺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-AR(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和AR荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/AR+/CD45-的细胞指认为表达AR的CTC，并根据AR通道的荧光强度来判读CTC的AR表达量。图6为检测到的典型AR分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
试验例7：多肽磁性纳米颗粒检测食管癌患者外周血的CTC并进行PD-L1分子分型
取2mL食管癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PD-L1荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。图7为检测到的典型PD-L1分子表达量不同的食管癌患者外周血的CTC。
试验例8：多肽磁性纳米颗粒检测肺癌患者外周血的CTC并进行PD-L1分子分型
取2mL肺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PD-L1荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。图8为检测到的典型PD-L1分子表达量不同的肺癌患者外周血的CTC。
试验例9：多肽磁性纳米颗粒检测肺癌患者外周血的CTC并进行EGFR分子分型
取2mL肺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-EGFR(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和EGFR荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/EGFR+/CD45-的细胞指认为表达EGFR的CTC，并根据EGFR通道的荧光强度来判读CTC的EGFR表达量。图9为检测到的典型EGFR分子表达量不同的肺癌患者外周血的CTC。
试验例10：多肽磁性纳米颗粒检测肝癌患者外周血的CTC并进行PD-L1分子分型
取2mL肝癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育0.5-1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mLPBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PD-L1荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。图10为检测到的典型PD-L1分子表达量不同的肝癌患者外周血的CTC。
试验例11：多肽磁性纳米颗粒检测宫颈癌患者外周血的CTC并进行PD-L1分子分型
取2mL宫颈癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PD-L1荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。图11为检测到的典型PD-L1分子表达量不同的宫颈癌患者外周血的CTC。
试验例12：多肽磁性纳米颗粒检测胃癌患者外周血的CTC并进行PD-L1分子分型
取2mL胃癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-PD-L1(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和PD-L1荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/PD-L1+/CD45-的细胞指认为表达PD-L1的CTC，并根据PD-L1通道的荧光强度来判读CTC的PD-L1表达量。图12为检测到的典型PD-L1分子表达量不同的胃癌患者外周血的CTC。
试验例13：多肽磁性纳米颗粒检测乳腺癌患者外周血的CTC并进行CXCR4分子分型
取2mL乳腺癌患者外周血到15mL离心管中，加入10μL多肽纳米磁珠混匀，室温摇床孵育1小时，取下离心管，加5mL PBS轻轻混匀，放到磁力架上，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，加5mL PBS，再将磁力架置于水平摇床上，富集30min。取下磁力架，弃去上清，将离心管从磁力架上取下，用多聚甲醛将管壁上的磁珠吹下，室温固定30分钟，加5mL PBS离心洗涤；滴加DAPI工作液染细胞核，染核结束后加5mL PBS离心洗涤；加200μL免疫荧光染色封闭液，室温封闭30分钟，加5mL PBS离心洗涤；富集到的细胞分别用FITC-CK、PE-CD45和Alexa Fluor 647-CXCR4(Abcam)抗体染色1h；加5mL PBS离心洗涤封片，20倍物镜下观察找到细胞界面，设置DAPI、FITC、PE和Alexa Fluor 647各荧光通道相应的曝光时间并对样品区域进行荧光扫描，对检测到的细胞进行CTC鉴定和CXCR4荧光强度分析。其中DAPI+/CK+/CD45-并且符合细胞形态的细胞指认为CTC，DAPI+/CK+/CXCR4+/CD45-的细胞指认为表达CXCR4的CTC，并根据CXCR4通道的荧光强度来判读CTC的CXCR4表达量。图13为检测到的典型CXCR4分子表达量不同的乳腺癌患者外周血的CTC。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 北京中科纳泰生物科技有限公司
<120> 多肽磁性纳米颗粒、其制备方法及应用
<130> YZDI-190035
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Asn Asn Cys Asn Asn Asn Asn Asn
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Asn Asn Cys Asn Asn Asn Asn
20 25
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Asn Asn Cys Asn Asn Asn
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Cys Asn Asn Asn Asn Asn Asn
20 25
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Cys Asn Asn Asn Asn Asn
20
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Cys
1 5 10 15
Gly Gly Cys Asn Asn Asn Asn
20
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys Asn Asn Cys Asn Asn Asn Asn
20 25
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys Asn Asn Cys Asn Asn Asn
20
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Arg Arg Asp Ala Pro Arg Phe Ser Met Gln Gly Leu Asp Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys Asn Asn Cys Asn Asn
20

Claims (14)

1.一种多肽磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽磁性纳米颗粒包括：特异性靶向多肽和磁性纳米颗粒；其中，所述特异性靶向多肽为靶向上皮细胞粘附分子的特异性识别多肽，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
制备所述多肽磁性纳米颗粒的方法包括以下步骤：制备所述多肽和所述磁性纳米颗粒溶液；其中，所述多肽溶液的终浓度为1-1000μg/mL；所述磁性纳米颗粒溶液的终浓度为1-10000μg/mL。
2.根据权利要求1所述的多肽磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为带有链霉亲和素的磁性纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的多肽磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒粒径为100～900nm。
4.根据权利要求3所述的多肽磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒粒径为300nm～800nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备多肽溶液和磁性纳米颗粒溶液；
(2)将步骤(1)制得的多肽和磁性纳米颗粒溶液混合反应得到所述多肽磁性纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，制备所述多肽溶液的溶剂选自以下一种或多种：水、生理盐水、PBS、HEPES；和/或制备所述磁性纳米颗粒溶液的溶剂选自以下一种或多种：水、PBS、HEPES。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述多肽溶液的终浓度为100-500μg/mL；和/或所述磁性纳米颗粒溶液的终浓度为1000-5000μg/mL。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为1:10-5:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述多肽和磁性纳米颗粒的质量比为2:5。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽磁性纳米颗粒或按照权利要求5至9中任一项所述的制备方法制得的多肽磁性纳米颗粒在制备用于诊断或治疗癌症的药物和/或医疗产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述癌症选自以下一种或多种：食管癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症选自以下一种或多种：乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和/或前列腺癌。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽磁性纳米颗粒或按照权利要求5至9中任一项所述的制备方法制得的多肽磁性纳米颗粒在制备用于循环肿瘤细胞检测和/或分子分型的药物和/或医疗产品中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述循环肿瘤细胞检测和/或分子分型的生物标志物选自以下一种或多种：PD-L1、HER2、ER、PR、AR、EGFR、CXCR4。
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