CN1502044A - 癌症诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种能于细胞或组织标本中检测出癌细胞的方法。其中的一个步骤是确定标本中是否含有表达“细胞周期蛋白E型蛋白”的处于S期或G2期的细胞。此法是依靠同时确定标本中个体细胞“周期蛋白E型蛋白”的水平以及仅存在于S期和/或G2期的“后G1期物质”的水平。如果处于S期或G2期的细胞被发现有“周期蛋白E型蛋白”，则可以认为标本含有癌细胞。含有“周期蛋白E型蛋白”的S期和/或G2期的细胞比例高则表明肿瘤细胞高度恶性。

Description

癌症诊断方法

技术领域

本文陈述的发明是一种在组织和细胞标本中诊断癌症和癌前病变的方法。对于已经确诊的肿瘤还可获得预后和预测信息。

目前的技术观点

常规的癌症诊断是基于分析来自肿瘤或可疑肿瘤组织中的细胞和组织标本。通过组织染色，个体细胞或细胞群就可以鉴别开来。常规诊断依靠分析形态特征，如细胞形状，大小和染色性状的改变，以及组织结构的不规则性。所以，癌症诊断是对异与相应正常组织的形态变异的一种主观判断。

正确而可靠的诊断技能需要长时间的训练和丰富的经验。介于癌和癌前病变以及癌前病变和非癌病变的病例，对于即使是最有经验的病理学家和细胞学家也是一种挑战。由于现在很多肿瘤能得以早期捡出，也由于还没有开发出完整的肿瘤诊断形态标准，这一类问题也越来越多。形态分析的另一个方面是判断肿瘤的恶性程度(肿瘤分级)，肿瘤治疗的选择经常依靠于此。由于很多病例肿瘤的形态并不反映其真正的恶性程度，这也造成了很多问题。考虑到此，很明显地能以客观的和定量的方式诊断恶性肿瘤和判断其恶性程度的新方法将是一个重大突破。

从正常细胞到肿瘤细胞的转变一般称为转化，此是由于控制正常细胞的一些特异的基因的程序性的改变造成的。此转化过程中细胞获得癌细胞的特征，即侵润周围组织和形成子肿瘤(转移).近二十年来实验性肿瘤研究已经获得了很大突破。大约50个控制基因已被发现在癌细胞中有改变。其中的一些在癌细胞中活性增高(癌基因)，产生过量的细胞分裂信号。其他的控制基因则经常在癌细胞中失活(肿瘤抑制基因)。在正常细胞中肿瘤抑制基因通常能平衡癌基因产生的生长刺激信号。目前尚未发现单一的完全是癌特有的遗传性改变。所以我们集中于发现一种特性组合，其组合本身在癌细胞中是异常的。

近十年来细胞周期研究获得了重要进展，如基因组复制和细胞分裂之间的协调机制。细胞周期机制中的中心部分得以认定并被发现在过去10亿年的进化中保持不变。此部分在孝母，植物和动物中据有普遍的重要性。涉及细胞周期控制过程的普遍机制已得到公认。两个很不同的生物化学过程调节控制细胞周期。其一是可逆转的磷酸化，如磷酸基团可结合或解离于目标蛋白从而改变这些蛋白的结构和功能。这一过程由被称为激酶的蛋白所控制。细胞周期调控中主要的激酶又称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)，其活性由细胞周期蛋白调节。第二个过程是高度控制的细胞周期蛋白的合成和降解。两种与此相关的细胞周期蛋白是细胞周期蛋白E和A。

人们以前认为细胞周期在癌细胞和正常细胞中以同样的方式运行，并且认为主要是增殖控制机制(细胞外的生长调节信号传递到胞核中的基因组)有缺陷。细胞周期本身在癌中也有改变这一惊人的发现很快成为肿瘤研究的中心并且其也是见于癌细胞中染色体不稳定性的可能原因之一。由此可见肿瘤细胞无控制的增殖和染色体不稳定性似乎都与细胞周期失调有关。这一有关细胞周期和肿瘤细胞中细胞周期失调的新知识具有应用于将来癌症诊断的潜在价值。

细胞周期根据基因组复制和细胞分裂分为不同的时期。细胞分裂期，染色体被分配到两个新的子细胞中，称为M期(有丝分裂)。两个M期之间，细胞通过合成DNA复制其基因组(又称DNA复制)。DNA复制期又称S期(DNA合成期)。在M期和S期之间还有两个期别。一个是M期和S期之间的间隔称为G1期。第二个间隔，亦即S期和M期之间的间隔，称为G2期。所以，完整的细胞周期包括M-G1-S-G2-M，见图1。新分裂产生的细胞自G1进入周期。如果其决定继续分裂，则通过G1进入S期复制其DNA。当完整的基因组复制合成后，细胞进入G2，准备有丝分裂(M期)。细胞接着进入M期，通过细胞分裂将染色体分配到每一个新的子细胞中。至此，子细胞又回到G1，细胞周期完成。正常和癌细胞都经过上述的细胞各周期。

多细胞生物如人类中的大多数细胞处于静止状态(休止期)，称为G0。细胞可以长时间处于G0，当接受生长刺激信号时开始进入G1。有些组织实际上所有的细胞都处于静止状态，如肌肉和神经组织。其他的组织，如肠道，皮肤，骨髓，胚胎组织，以及肿瘤组织既有G0细胞又有处于周期中的细胞(G1，S，G2和M期)。

研究人员付出了大量精力用以发现是什么因素和过程控制细胞周期从一个期别进展到另一个期别，如G1到S期的过度。已经发现了若干只存在于特殊期别的蛋白质。其中之一是细胞周期蛋白E，由Lew等于1991年发现，见文献Lew，D.J.，Dulic，V.，Reed，D.I.，Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1cyclin(Cln)function in yeast，Cell 66，pages 1197-1206，1991。细胞周期蛋白E是细胞周期特异性表达。研究表明在正常细胞中其存在于G1后期和S期早期的胞核中。另一个与细胞周期特异性表达相关的蛋白是周期蛋白A，在细胞进入S期时出现，并且一直存在于胞核中直到M期，见文献Pines，J.，Hunter，T.，Humancyclin A is adenovirus E1A-associated protein p60 andbehaves differently from cyclin B，Nature 346，pages 760-763，1990，和Erlandsson，F.，Linnman，D.，Ekholm，S.，Bengtsson，E.，Zetterberg.A.，A detailed investigation ofcyclin A accumulation at the G1/S border in normal andtransformed cells，Experimental Cell Research 259，pages86-95，2000.

研究表明周期蛋白E在一些肿瘤和衍生于肿瘤的细胞系中异常升高，见文献 Keyomarsi，K.，Pardee，A.B. Redundant cyclinoverexpression and gene amplification in breast cancercells，Proc Natl Acad Sci，USA 90，pages 1112-1116，1993.其所测的周期蛋白E的水平是通过将培养细胞在不同的期别进行同步化而得到。虽然细胞周期被同步化所干扰，结果仍表明在培养的肿瘤细胞中周期蛋白E不仅仅在Gl期表达。但是其所用的方法尚不能用于研究肿瘤组织不同周期中周期蛋白E表达的方式。其仅适用于培养中的实验肿瘤细胞。

1994年，Keyomarsi等研究表明肿瘤中存在缺陷形周期蛋白E分子，并且此类缺陷型周期蛋白E分子可能预示不良预后。见文献Keyomarsi，K.，O Leary，N.，Molnar，G.，Lees，E.，Fingert，H.J.，Pardee，A.B.，Cyclin E，a potential prognostic marker forbreast cancer，Cancer Research 54，pages 380-385

，1994.在这一研究中所用的是来自于人类肿瘤的活检组织。Keyomarsi等发现肿瘤组织较周围的正常组织含有更多的细胞周期蛋白E。在一些肿瘤中他们还发现缺陷形周期蛋白E分子。作者建议周期蛋白E的水平以及缺陷形周期蛋白E和肿瘤恶性度相关。但是此法不能确定升高的周期蛋白E是由于肿瘤中处于细胞周期的细胞简单的增多，或是由于周期蛋白E异常表达所致。此研究采用一种生物化学-免疫学方法称为“蛋白印迹”。此方法检测可疑肿瘤组织标本，其中即含有增殖的又含有静止期的正常细胞，还含有癌细胞。组织先行匀浆，然后自标本中提出蛋白混合物。蛋白混合物接着通过一种凝胶，此凝胶可以根据分子大小和/或电荷将不同的蛋白质分离开来。所查蛋白可以用标有同位素或显色剂的特异抗体检测出来。这一方法的主要缺点是当应用于临床常规检送的可疑肿瘤标本时无法明确所测周期蛋白E是源于标本中的正常细胞或是来自肿瘤细胞。

过去5年来已有研究用组织标本中的周期蛋白E水平作为诊断方法的报告。这些研究或者采用上述的测定总蛋白水平的蛋白印迹技术，或者采用基于免疫组化的技术测定肿瘤组织中含有周期蛋白E细胞的比例。蛋白印迹技术最主要的缺点是无法区分肿瘤标本中周期蛋白E水平的升高是由于其过度表达，还是由于细胞周期的异常造成的。另外，也难以将其用于在大量的正常细胞中检测少量存在的肿瘤细胞，而此又正是临床组织标本中极为常见的。为了得到只含有肿瘤细胞的标本，一些研究小组试图用显微切割技术来获取部分纯化了的主要含有肿瘤细胞的标本。但是，显微切割是令人厌烦的操作，并且也得配合形态诊断步骤。一种高效的诊断技术还必须能适用于未知是否含有肿瘤细胞的标本。虽然不同的蛋白印迹技术的确令人关注，但其过程一般来讲耗时，并且此技术太过粗显而难以用于临床诊断。

另一种检测细胞周期蛋白E是否存在的方法是采用免疫组化技术。这一技术是通过孵育与抗周期蛋白E的抗体反应然后显色。继之可以用显微镜检查含有周期蛋白E的细胞。周期蛋白E阳性细胞数目的增加可以代表处于增殖中如细胞周期中的细胞数目的增加，也可以是反应了对于周期蛋白E表达而言细胞周期的异常，如其表达于非G1期的其他期别。仅仅通过分析周期蛋白E而不清楚含有此蛋白的细胞所在的期别就无法区分这两种可能性。已经有一些研究试图通过用一个并列的标本着染细胞周期标记物如周期蛋白A来获得细胞增殖的信息(见文献Dutta，A.，Chandra，R.，Leiter，L.M.，Lester，S.Cyclins as markers of tumor proliferation：Immunocytochemical studies in breast cancer.Proc Natl AcadSci USA 92，pages 5386-5390，1995)。此可能提供另外有关肿瘤增殖活动的信息，但是对于以周期蛋白E表达方式显示的细胞周期异常的信息只能通过下述我们建议的同时结合周期蛋白E和细胞周期标记物染色的方法获得。

发明概要

本申请陈述的发明是基于细胞周期蛋白E在癌细胞周期中调控失常这一事实，如周期蛋白E表达于细胞周期中不适当的期别。在正常细胞中周期蛋白E只存在于G1后期和S期早期，而在癌细胞中，其出现于整个S期甚至G2期。此展示了开发一种基于癌细胞周期中周期蛋白E非正常地存在于细胞周期较晚期别(S期晚期或G2期)这一事实的诊断方法。

所以，本发明涉及的是一种分析癌症疾病的方法，即细胞周期蛋白E型蛋白质和后G1期物质如周期蛋白A在同一个细胞中出现则表明是癌症相关的疾病。本发明还涉及一种通过检测含有周期蛋白E型蛋白质和后G1期物质的细胞数量来判断恶性程度的方法。

发明阐述

本发明的一个方面是一种能通过测定个体细胞是否有″周期蛋白E型蛋白″异常的细胞周期表达来诊断组织标本中有癌症的方法。其意味着″周期蛋白E型蛋白″在细胞周期较晚的期别出现，如″周期蛋白E型蛋白″在大多数的S期中持续存在并且/或者存在于G2期。这一方法是基于正常细胞″周期蛋白E型蛋白″在S早期即降解而癌细胞核在整个S期有时甚至G2期都表达的知识上建立的。此法是一种对同一个细胞进行两种测定的结合，即应用如免疫组织化学技术测定″周期蛋白E型蛋白″的水平同时明确每一被分析细胞所在的周期(G1，S或G2)位置。如果被查细胞或组织标本中表达″周期蛋白E型蛋白″的S晚期和/或G2期细胞的数目升高，则存在癌细胞。含有″周期蛋白E型蛋白″的S晚期和/或G2期细胞的数目信息不仅用于准确诊断，还有判断愈后的价值，如能提供肿瘤细胞的恶性度信息。事实正是如此，因为含有较多的细胞周期失调的细胞的肿瘤很可能比细胞周期受轻微干扰的肿瘤恶性程度高。了解个体肿瘤的恶性程度对治疗方式的选择是至关重要的。

贯穿于本公文的″周期蛋白E型蛋白″是这样定义的：既可以是细胞周期蛋白E(缺陷型或正常周期蛋白E分子)，也可以是其他在正常S期早期的胞核被清除而更长时间地存在于癌细胞中的类似于周期蛋白E的蛋白质。所以，所有″周期蛋白E型蛋白″仅存在于G1期和S早期的正常细胞的胞核中。前面提到的″周期蛋白E型蛋白″主要包括细胞周期蛋白E的两种表型，即细胞周期蛋白E1和E2。正常细胞和肿瘤细胞中周期蛋白E的表达方式见图2。其他此种″周期蛋白E型蛋白″的例子是上述提到过的由Keyomarsi描述的分子量介于42至35 KDa的周期蛋白E的变异型，以及一些与周期蛋白E无关但是在正常和肿瘤细胞中的表达方式与周期蛋白E相似的蛋白质。

每一个体细胞″周期蛋白E型蛋白″水平的测定优先采用免疫组织化学技术。见于文献 Brandtzaeg，P.，Halstensen，T.S.，Huitfeldt，H.S.，and Valnes，K.N.(1997)Immunohistochemistry：A practical approach 2. Editors Johnstone，A.P.andtuner，M.W.，IRL，Oxford，pages 71-130，对于很多各种现行的免疫组织化学方法有详尽的论述。组织标本中或悬浮细胞中含有″周期蛋白E型蛋白″的个体细胞都可以应用显微镜或流式细胞计进行检测。细胞周期中″周期蛋白E型蛋白″的表达方式理论上可以用多种不同的方法检测。在Gong，J等(1994)Cancer Research 54(16)，pages 4285-4288，所用的方法中，除了测定周期蛋白E的水平，每一细胞的DNA含量被用于确定细胞周期的位置。但是这一方法的一个严重的限制因素是只有在分析严格的二倍体细胞时才可以用细胞中的DNA含量作为细胞周期的标记物，如含有46条染色体的细胞处于G1期时有2c的相对DNA单位(大约6pg的DNA)，处于G2期时有4c的相对DNA单位。处于S期的细胞，由于其正进行DNA复制，所以含有介于2c和4c之间的相对DNA单位。问题是肿瘤细胞经常为异倍体，如它们并不准确地含有46条染色体，所以G1期不含有2c的DNA。另外，肿瘤细胞群的异倍体程度有很大的不同，在单一肿瘤中G1期的细胞DNA含量可以自1.5c到超过6c不等(实例见文献Forsslund等，Cancer，Oct15 1996，78(8)，pages 1748-55或者Auer G.等，Anal Quant Cytol Histol，May 1987，9(2)，pages 138-46).很自然地，这使得Gong等采用的方法不可能用于大多数的人类肿瘤，并且这也是为什么Gong等的工作与本申请无关的原因。我们另辟蹊径开发了一种不依赖于DNA含量来确定细胞周期位置的方法。我们的方法是基于分析细胞周期特异性标记物的含量来实现，而此又是通过染色只存在于癌细胞的S期和/或G2期的一种物质来完成。我们于此将仅存在于S期和/或G2期细胞或胞核中的蛋白质称为″后G1期物质″。″后G1期物质″包括如周期蛋白A，增殖细胞核抗原(PCNA)以及渗入于细胞群的溴脱氧尿甘(BrdU)。

同时染色″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″使得在相同的胞核中用影象细胞测定法或流式细胞测定法检测″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″的水平成为可能。影象或流式细胞测定法资料可用很多原则上不同的方法来分析。例如可以用单一灰度水平域值，最大可能性分类法，或者用界定值算法将图象分段。见文献Gonzales，R.C.，Woods，R.E.，1993，Digital Image Processing，Addison-Wesley，New York，chapter 7，对于目前最常用的图象界段分析有专述。如采用将被研究的细胞分为染色阳性或阴性的分类法，则可以用更多的现时可用的方法来实现，诸如Bayes分类，基于神经网络的分类法，和由我们在Erlandsson，F.，Linnman，C.，Ekholm，S.，Bengtsson，E.，Zetterberg，A.，2000，Exp Cell Res 259，pages86-95文中提出的分类法，以及其他一些能将阴性细胞和阳性细胞区分开来的可靠方法。文献Gonzales，R.C.，Woods，R.E.，1993，Digital Image Processing，Addison-Wesley，New York，chapter9对一些已知的分类方法有详尽的论述。另外，并不总是需要分类，每一细胞中代表染色强度的实测值可直接用于统计分析。经过分析所测″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″的水平的关系，就可以区分如正常细胞和癌细胞群以及低度恶性细胞群和高度恶性细胞群。流式细胞计也经常配有带适当算法分析所测染色强度的软件。最后，还可以由检查者人工判断染色标本，简单地将细胞计数并且靠视觉主观地判断细胞是否含有″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″。

经过统计分析是否″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″在过高比例的的细胞群中出现，就可以判断所查标本是否存在癌细胞以及癌细胞的恶性度如何。含有周期蛋白E的S期或G2期的细胞的比例在高度恶性的肿瘤细胞群中很高而在正常细胞群中很低。一般来将，其比例在前者中超过40％而在正常组织中小于10％。其确切的比例随肿瘤类型，标本处理以及染色和分析的方法不同而不同。这些变量必须在方法常规应用之前事先确定。这一发明的主要优点是其代表了一种不依赖于被查标本中细胞增殖程度的的方法。此方法依靠的是分析″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″同时阳性的细胞的比例，并且这样是测定了有细胞周期失调的细胞的存在。应该注意的是我们并没有试图注册周期蛋白E存在于S期的癌细胞中这一发现作为专利，虽然是我们首先证明其确实如此。相反这一专利申请是针对于保护我们的靠同时染色″周期蛋白E型蛋白″和″后G1期物质″来检测组织标本中细胞周期异常这一独特的方法的。

我们的方法一个主要的优点是客观和定量地判断癌是否存在。所以这一方法能开发成高效，快速和自动化的癌症诊断技术。还有另一个优点是它的高敏感性，如有效地检出极少量的含″周期蛋白E型蛋白″的S期细胞。另外，正如所述，检查过程不破坏标本，这使得用常规显微镜检测方法检查含″周期蛋白E型蛋白″的S期或G2期细胞来追踪特殊病例成为可能。这些特点，适合自动化以及高敏感性使之成为进行普查的理想方法。应用的一个例子是宫颈涂片检查，其常需要检出极少量的异常细胞。

附图说明

图1，用图解表示细胞周期及其各期别。

图2，示一个正常细胞(上)和一个癌细胞(下)细胞周期中周期蛋白E和A的表达方式。注意，正常细胞中周期蛋白E和A成顺序性表达，而癌细胞中周期蛋白E和A的表达方式有重叠，即周期蛋白E和A在S期中同时表达。

图3，示正常宫颈上皮周期蛋白A和E表达的分布。每一点代表一个细胞。与图2比较。

图4，示在一个治疗后6年仍存活良好的低度恶性的宫颈癌肿瘤中周期蛋白A和E表达的分布。每一点代表一个细胞。与图2和3比较。

图5，示在一个最初治疗3年后死亡的高度恶性的宫颈癌肿瘤中周期蛋白A和E表达的分布。每一点代表一个细胞。与图2，3和4比较。

应用举例

以下陈述了几个依据本发明采用的方法的例子并以前述图表佐正。在下述例子中，细胞周期蛋白E作为″周期蛋白E型蛋白″的代表而细胞周期蛋白A作为″后G1期物质″的代表。

这一工作包括应用根据本发明而采用的方法来测定所捡查的个体细胞中细胞周期蛋白E的水平，同时还确定每一检查细胞在细胞周期的位置。在其中的一个例子中，应用双重免疫组织化学染色技术染色得自治疗前病人的宫颈癌活检细胞。对于在单层培养细胞上，细胞学标本的细胞上或者组织切片细胞上进行此操作并无大的技术区别，为了检测体内的细胞周期蛋白E的表达方式，，我们检查了来自于宫颈癌患者的常规处理过的，如福尔马林固定及石蜡包埋的组织切片标本。切片厚度0.4微米。切片于47℃过夜固定于购自MenzlerGlaser公司的Superfrost Plus显微镜玻片。切片存于-20℃然后在染色前在二甲苯和梯度酒精中逐步脱蜡及水化。用微波炉将切片在柠檬酸缓冲液中煮沸两次各5分钟来暴露抗原。

切片染色应用购自Santa Cruz生物技术公司的细胞周期蛋白E单克隆抗体(HE12)和一种抗细胞周期蛋白A的兔多克隆抗体(H-432)。第二抗体包括得自Jackson ImmunoResearch公司的FITC结合的抗兔抗体和Cy3结合的抗鼠抗体。除非另有说明，以下的步骤均在室温进行。玻片染色前于冲洗缓冲液(0.3mM NaCI，0.05％mMTris-HCI及0.02％Tween 20，pH7.6)中冲洗10分钟，接着于封闭缓冲液(含有1％牛血清清蛋白和0.5％Tween 20的PBS)中孵育15分钟封闭第一抗体的非特异结合。之后，切片在4℃与稀释于封闭缓冲液的第一抗体孵育48小时。非结合的和非特异性结合的抗体经于冲洗缓冲液中彻底冲洗3次各15分钟而清除。

显微镜玻片在稀释于封闭缓冲液的4％的驴血清中孵育30分钟来阻断二抗的非特异性结合。然后于室温下与稀释于4％的驴血清中的第二抗体孵育30分钟。然后如前冲洗3次各15分钟。

最后用含有DAPI(购自Vector Laboratories公司的4，6-二氨基-2本基吲哚)的封片液封片并进行荧光显微镜捡。DAPI结合于DNA使得可以将标本中的单个细胞鉴别出来。这使得实验涉及的荧光素为3个：与周期蛋白A对应的是FITC，与周期蛋白E对应的是Cy3以及对应于DNA的DAPI。

当荧光素被一定波长的光照射或激发时即发射另一特殊波长的光，也即荧光。用配有可内部转变的激发和发射光滤片和照相机的显微镜就可以测量每一荧光素发射的荧光的水平。这样，一个半定量测得的每一胞核中周期蛋白E和周期蛋白A的浓度就可以计算出来。每次染色都设置一张细胞种类，固定和保存时间完全一样的玻片作阴性对照。阴性对照玻片经过相同的染色步骤，只是用封闭缓冲液代替了第一抗体。与检测标本相比，所有的阴性对照玻片仅显示极弱的非特异性核染色。

肿瘤图象是通过蔡司公司的63倍的Plan-Neofluar油镜来获取，其安装于Applied Precision公司的Delta Vision系统上。这一系统包括带光导纤维系统的水银灯，常规显微镜头，和一个Photometrics公司(亚利桑那图森)的冷CCD照相机，所得图象的分辨率达0.2微米。应用IMP图象处理软件完成图象界段分割和提取数据，染色强度由Matlab或Excell软件包图象分析理。每一标本分析800到3000个细胞。

图象分析首先得除去背景荧光。用DAPI图象进行界段分割，判明图象中所有的个体细胞核。分割产生的蒙片用于FITC(周期蛋白A)和Cy-3(周期蛋白E)图象，这样这些荧光素于每一个体细胞发射产生的荧光就可以测量出来。DAPI无一例外地被用于判明细胞核而没有参与确定细胞周期的位置。

至此，我们就可以用周期蛋白A作为标记物确定哪些细胞处于S期或G2期。图3，4和5展示了主要的结果。图表展示了来自三种不同组织的周期蛋白A和周期蛋白E的分布。图3示正常宫颈上皮，图4示一低度恶性肿瘤(患者治疗后6年仍存活)，图5示一高度恶性肿瘤(患者治疗后3年死亡)。

图例3-5中的图表清楚地表明每一病例中周期蛋白E和周期蛋白A的水平的相互关系的差异有多大。含有高水平周期蛋白A的宫颈癌细胞(如处于S和G2期的细胞)很明显地较正常宫颈上皮含有更多的周期蛋白E。恶性程度较高的肿瘤细胞显示其周期蛋白E的表达方式更加异常。即很高比例的S期或G2期的细胞含有高水平的周期蛋白E。我们提呈的方法，能清楚地检测出相对于细胞周期的周期蛋白E表达方式的差异，正是这一发明的核心。

由于在癌细胞中上述的异常极为显著并且方法简单易行，所以其可能在不远的将来很快就可应用于常规诊断。如果方法得以进一步的改进，由于同时含有高水平周期蛋白E和周期蛋白A的细胞在正常细胞群中并不存在这一事实，其可能于含有几百万细胞的标本中检测出单个或者仅仅是几个癌细胞。在判断肿瘤的恶性程度方面，这一方法也可以被证明极为有用。本方法易行自动化，并且由于标本进行过一次如上述的应用后还可以行其他染色如苏木精/伊红染色，所以很容易与传统的诊断技术相结合。对于以此种方式处理过的标本，病理学家和细胞学家就可以将其注意力集中在显示细胞周期异常的细胞上。

根据本发明，这一方法可以在独立的专利权利要求所设定的框架范围内以多种方式变化。所以陈述于此的这一具体的过程只能被视作本发明应用的一个例子。

Claims (15)

1.一种于个体细胞中检测细胞周期调节紊乱而在细胞或组织标本中诊断癌症或癌前病变，或者对于已经明确的癌症判断其愈后的方法，其特征在于包括以下几个步骤：

---检测标本中单个细胞的细胞周期蛋白E型蛋白

---检测标本中单个细胞的后G1期物质

---确定胞核中含有细胞周期蛋白E型蛋白的细胞

---根据后G1期物质的含量确定处于S期和G2期的细胞，以及

---当胞核中含有过量的细胞周期蛋白E型蛋白的细胞数目增加而同时同一细胞处于S期或G2期表明标本中存在有细胞周期调节紊乱的细胞，其具有诊断癌症和判断其预后的价值。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于细胞周期蛋白E型蛋白的检测是通过染色该蛋白质来完成的。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于所选择的细胞周期蛋白E型蛋白的染色是通过针对于该选择的细胞周期蛋白E型蛋白的一种抗体来完成的。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于优先选择细胞周期蛋白E作为细胞周期蛋白E型蛋白。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于将后G1期物质的含量用于确定处于S期或G2期的细胞。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于后G1期物质含量的确定是通过染色该物质来完成的。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于所选择的后G1期物质的染色是通过针对于该所选择的后G1期物质的一种抗体来完成的。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于优先选择细胞周期蛋白A作为后G1期物质。

9.根据权利要求2和6的方法，其特征在于染色检查

a)细胞周期蛋白E型蛋白的含量和

b)后G1期物质的含量

是应用两种不同的颜色，一种特定于a)，另一种特定于b)。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于用光照射细胞，并基于不同类型的细胞分别发射和吸收特定波长的光来确定细胞类型a)和b)。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于从每一个体细胞周期蛋白E型蛋白的含量和后G1期物质的含量获得指征，两者的含量是通过分别分析相应的不同发光的细胞a)和b)的光强度和光吸收得到的。

12.根据权利要求9的方法，其特征在于通过用一种对胞核特异的染色剂着染标本并根据胞核受照射时反射或吸收针对于染色剂的特殊波长的光来鉴定出细胞核。

13.根据权利要求12的方法，其特征在于标本发射或吸收的光线被照相或用一个配有能区分开来自胞核的光线以及来自已着染细胞a)和b)的光线的CCD照相机来检测，来自每一胞核的各光波强度相关的数据用一个分析图象的计算机程序提取，给出每一细胞核周期蛋白E型蛋白的含量和后G1期物质含量的测定值。

14.根据权利要求12的方法，其特征在于用流式细胞计分析标本，给出每一细胞核周期蛋白E型蛋白的含量和后G1期物质含量。

15.根据权利要求13或14的方法，其特征为于S期和/或G2期含有过量的周期蛋白E型蛋白是一种表明标本中含有周期调控紊乱的细胞的指征，其具有诊断癌症和判断愈后的价值。

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