JP2003513282A - 哺乳動物の癌腫の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞が正常状態にあるか或いは発癌状態への形質転換を受けているかどうかを確立することができる、哺乳動物細胞核中のたんぱく質または他の分子のような特異性成分の空間分布に基づいた個体中の細胞増殖障害の検出方法が提供される。形質転換が生じている場合、そのような空間分布により、腫瘍の検出およびグレード付けが可能になる。本発明方法は、a)分析すべき個体からの検体の細胞核中の少なくとも1種の特異性成分の空間分布を測定すること；b)上記の空間分布を参照検体中の同じ少なくとも1種の特異性成分の空間分布と比較すること；および、c)上記分析すべき検体の上記少なくとも1種の成分を、上記参照検体中の上記少なくとも1種の特異性成分との比較に基づいて特性決定することを特徴とする。本発明方法は、とりわけヒトにおける増殖障害、とりわけ癌腫の(早期)検診および治療のモニタリングにおける効率的な方法として、診断において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、分子および細胞生物学並びに診断の分野に属し、とりわけ、ヒトの
ある種の癌腫の新規で有効な早期検出方法に関する。

【０００２】 （背景技術） 健常な生体中の正常細胞は、複雑な個々の状況において活性であり、それによっ
て、個々の細胞がその特定の機能を発揮し得る。この複雑な状況を維持するため
に、各細胞は、相互の増殖を制御している。事実、正常細胞は、その近接細胞に
よって発せられた特定のシグナルによってそうするように指示されたときにのみ
再生している。 対照的に、癌細胞は、この正常挙動から逸脱している。癌細胞は、もはや増殖
の正常制御に感応し得ず、より独自の形で再生を続ける。正常細胞をそのような
遺伝子的に変性された細胞として形質転換させた場合、この変性細胞は、同じタ
イプの細胞を過多産生する。実際に、癌細胞は、近隣組織を浸潤し、それによっ
て周辺組織に置換わり、相互依存関係を混乱させる。その最も脅威的な特性は、
癌細胞が始まった部位から他の場所に転移し、他の組織および器官を浸潤し、そ
れによってこれらの器官の正常な機能を不調化し混乱させる能力である。癌発症
のこのパターンが長時間気付かないままに進行した場合、治療は、一層困難とな
り、不可能とさえなる。従って、極めて早期の段階で人体中の疑いのある細胞の
異常増殖と拡大を検出する信頼し得る方法が、適切な治療にとって極めて重要で
ある。

【０００３】 基礎研究により、今日まで、100種以上の癌が発見されている。細胞分裂の異
常制御に関連する多数の遺伝子が見出されている(例えば、R.A. Weinberg, Scie
ntific American, September 1996を参照されたい)。遺伝子の変異は、遺伝子産
生物を過活性化し得(癌遺伝子の場合)、正常抑制活性を破壊せしめ得る(腫瘍サ
プレッサー遺伝子の場合)。細胞調節の複雑な機序に関連する多くの他の遺伝子
は、まだ同定されていない。 種々の方法が、癌細胞のスクリーニングのために探索されてきている。専門的
な病理学者によって未だに使用されている伝統的な方法は、小組織検体中に含ま
れる細胞を染色し、これらの細胞を熟練者によって目視検査することを含む。異
常増殖は、癌細胞の存在および癌発症の段階の指標であり得る。この方法は、極
めて遅速で労力を要し、特別に訓練した人員を必要とする。さらにまた、比較的
進行性である癌増殖のみが一般に検出され、比較的数多くの擬陽性および偽陰性
結果がこの方法においては発生する。

【０００４】 幾つかの方法は、悪性細胞を検出するためのパラメーターとしての細胞核の形
態学に基づいている。例えば、小核体機能と大きさの関係、および癌細胞の細胞
倍化時間を研究したM. Derenzini et al., Amer. J. Path (1998) 152:1291-129
7。 癌細胞においては、rRNA転写活性と核の大きさは、細胞倍化時間に反比例的に相
関すると結論付けされている。癌細胞内の核構造体の量的分布は、細胞増殖速度
の細胞組織学的パラメーターを表している。 P. Kronqvist et al., Anal. Cell. Path. (1997) 15:47-59は、浸潤性乳癌に
おける核の形態測定の再現性を研究している。 この方法のさらに発展させた開発は、米国ボックスボロー(Boxborough)のCyty
c Corporation社によって開発されたThinPrep2000システムであり、このシステ
ムにおいては、パパニコロー(Pap)試験における癌細胞の存在に関する剥脱子宮
頚部細胞のスクリーニングをデジタルカメラによって行っている。この方法は、
労力を要することから、偏向結果が修正されていない限られた成功しか達成され
ていない(例えば、M.T. Fahey et al., Amer. J. Epidem. (1995) 141:680-689
を参照されたい)。この領域におけるさらなる発展は、報告されていない。

【０００５】 癌細胞を検出するための他の方法は、基礎研究によって明らかになった癌細胞
と正常細胞との特異性の差異に基づいている。例えば、正常細胞と癌細胞間の差
異を検出する広範な研究により、腫瘍マーカーを認識する極めて特異的な抗体に
より認識される癌細胞の特異性細胞成分が判明している。癌細胞におけるこれら
の腫瘍マーカーは、その存在において、その過産生、継続産生および/または分
泌の混乱により、正常細胞と異なっている(例えば、G.I. Abelev & S. Sell, 19
99, Seminers in Cancer Biology 9:61-65を参照されたい)。多くのこれら腫瘍
マーカーは、商業的に使用されている。 さらにまた、米国特許第5,310,653号は、p65腫瘍関連たんぱく質の精製方法、
およびこのたんぱく質のステロイド関連癌の診断用の腫瘍マーカーとしての使用
を開示している。米国特許第5,272,256号は、自己免疫疾患検出用の核自己抗原
の分離および使用を開示している。 他の方法は、癌細胞と正常細胞との遺伝子的差異に基づく。最近の研究におい
ては、各遺伝子の遺伝子物質における大きな差異と極めて小さな差異の双方が、
細胞分裂制御の機序に、或いは乳癌のある種のタイプ(BRCA1、BRCA2)、結腸癌(M
SH2、MLH1、APC)、メラノーマ(CDK4)、網膜芽細胞腫(RB)のような遺伝性タイプ
の癌に強く係っている遺伝子に関連していることが判明している。例えば、EP-A
-0,819,767号は、乳癌細胞を検出するに当って染色体の大きな変化を開示してい
る。

【０００６】 米国特許第5,587,833号は、蛍光顕微鏡測定法(FISH)による癌細胞のDNA中の単
一ヌクレオチド変化の感応的検出方法を開示している。 米国特許第4,885,236号は、“核マトリックス”と称せられる特異的な細胞下
たんぱく質画分の諸成分の分離および分析に基づく剖検または体液検体における
細胞の同定および特性決定を開示している。この核マトリックスは、種々の細胞
タイプに対して特異的なたんぱく質と核マトリックス関連DNAを含む。これらの
たんぱく質および核酸は、変性されているか、或いはウィルス感染、遺伝子欠陥
または悪性度の結果として発現した新たなたんぱく質および核酸である。 Terris et al., Cancer Research (1995) 55:1590-1597は、幾つかのヒトの正
常組織、炎症性組織、および新生物組織における前骨髄球たんぱく質(PML)の発
現を研究している。PMLレベルは正常組織においては低いが、PML発現は、炎症中
および腫瘍状態において著しく増大していることを開示している。さらにまた、
肝癌においては、PMLの過発現は、細胞質中への非局在化によって達成されてい
る。PMLは、刺激転写および細胞高活性に関連する明白な病理学的状況において
過発現していると結論付けている。

【０００７】 Ochs et al., J. Cell Sci (1994) 107:385-399は、乳癌細胞の小核体中のコ
イル体の存在を開示している。米国特許第5,264,343号においては、癌細胞と正
常組織の差異を、核DNAの受容性の差異に基づいて説明している。米国特許第5,8
91,857号は、癌細胞中の特異的遺伝子産生物(たんぱく質)の分布を開示している
。米国特許第5,599,919号は、細胞中でゲノムおよびたんぱく質レベルでのCENP-
Fの検出を使用して細胞の増殖状態についての情報を得ることを開示している。D
os Santos et al., Human Molecular Genetics (1997) 6:1549-1558は、2種のた
んぱく質の核局在化像を記載している。LeBrun et al., Oncogene (1997) 15:20
59-2067は、2種のたんぱく質の核分布を開示している。Everett et al., J. Vir
ol. (1998) 72:6581-6591は、ウィルス遺伝子産生物とPML体間の相互作用につい
ての観察を記載している。Duprez et al., J. Cell Sci. (1999) 112:381-393は
、PMLたんぱく質の核分布に関連するPMLたんぱく質のSUMO変性を開示している。
Everett et al., J. Cell Sci. (1999) 112:3443-3454は、PML体たんぱく質とセ
ントロメア間の相互作用を記載している。Stuurman et al., J. Cell Sci. (199
2) 101:773-784は、後でPMLとして同定され、PML体用のマーカーとして広く使用
されている抗原を検出するモノクローナル抗体を記載している。Rafki-Beljebba
r et al., Analytical Cellular Pathology (1999) 18:175-181は、細胞中でのM
DRの発現に関連する核たんぱく質NuMAの空間分布における変化を記載している。 上述の各方法において、臨床用途として、正常細胞と悪性細胞間の核成分の空
間分布の差異を使用している方法はない。

【０００８】 （発明の開示） 本発明の目的は、哺乳動物、とりわけヒトの癌の早期検出および診断において
有用且つ有益である、正常細胞および悪性細胞間の核成分の空間分布の差異に基
づいた検出方法を提供することである。 本発明によれば、個体における細胞増殖障害の新規な検出およびグレード付け
方法が提供され、この方法は、下記を含むことを特徴とする： (a)分析すべき個体からの検体の細胞核中の少なくとも1種の特異性成分の空間
分布を測定すること； (b)上記の空間分布を参照検体中の同じ少なくとも1種の特異性成分の空間分布
と比較すること；および、 (c)上記分析すべき検体の上記少なくとも1種の成分を、上記参照検体中の上記
少なくとも1種の特異性成分との比較に基づいて特性決定すること。 本発明の１つの局面においては、検査すべき増殖障害は、胃腸管中に存在する
。 本発明のもう1つの局面においては、細胞核中の上記少なくとも1種の特異性成
分は、p-80-コイリン、PML、SC35、アセチル化ヒストン類、CstF64、hnRNP-1、
およびNuMAプロテインの各抗原からなる群から選ばれる。 本発明のさらなる局面においては、細胞核中の上記少なくとも1種の特異性成
分の空間分布は、免疫蛍光法または他の方法によって測定する。 本発明の上記および他の局面は、以下の説明および添付図面においてさらに詳
細に説明する。

【０００９】 本明細書において使用するとき、“個体”なる用語は、人間およびペットのよ
うな動物類双方のあらゆる哺乳動物を一般に称するが、この用語は、とりわけ人
間に関連して使用する。 “検体”なる用語は、組織検体に限定されることなく、種々のタイプの癌のよ
うな増殖障害のスクリーニングにおいて病理学者(および他の者)によって通常検
査されるあらゆるタイプの生物学的物質源を包含する。これらの生物学的物質源
としては、血液、リンパ液、尿、糞便等がある。 本明細書において使用するとき、“参照検体”なる用語は、空間分布像が一般
に組織特異性であるので、検査すべき検体と同じタイプの検体を本質的に称する
。参照検体は、同じまたは同様な物質源、通常は同じまたは異なる個体からの分
析すべき検体と同じ組織の正常細胞に通常由来する。また、参照検体は、適切な
数の個体に由来し、当該技術の熟練者、例えば、1人以上の病理学者または癌学
者によって選択された、分析すべき検体と同じまたは同様な物質源、通常は同じ
タイプの組織の空間分布像の統計的平均である。

【００１０】 本発明は、哺乳動物の細胞核中のたんぱく質および他の分子のような特異性成
分の空間分布が、細胞が正常状態にあるか或いは発癌状態に形質転換を受けてい
るかどうかを確立することを可能にするという理解に基づいている。形質転換が
生じた場合、そのような空間分布は正常細胞と異なっており、その異なる空間分
布の度合によって、腫瘍のグレード付けが可能である。特定のたんぱく質(抗原)
中の特異性成分を、適切な検出方法、例えば、これらの抗原に対して特異性であ
る抗体を使用する蛍光顕微鏡測定法により同定する。 細胞核は、高度に動的でコンパートメント化されたオルガネラであり、DNA複
製、DNA修復、RNA合成、プロセシングおよび輸送のような多くの核プロセスが生
ずる。細胞核は、核小体、ヘテロクロマチンドメイン、局所高濃度の機能性核機
構を表すドメイン、および各種の核本体、例えば、コイル体、開裂体およびPML
体を含む多くの容易に同定可能な核構成体からなる。これらの核構成体は、正常
な二倍体哺乳動物細胞核中において特異的なパターンで機能的に組織化されてい
る。

【００１１】 腫瘍のグレードおよび段階が比較的容易に定義付けされ得ることから、モデル
として結腸直腸癌を使用して、本発明を、1つの実施態様において、結腸直腸癌
の上皮細胞の形質転換フェノタイプと核成分の変質空間組織との相関により、さ
らに詳細に基礎付けする。この目的に対し、種々の核成分の空間分布を、正常組
織およびアデノーマ性癌腫組織の大腸上皮細胞核中で検査する。新生物性の上皮
細胞核においては、種々の顕著な差異を、正常細胞核と比較して観察できる：(i
)PML体およびコイル体のような核本体数の増大、(ii)幾つかの核成分(スプライ
シング因子、開裂因子、hnRNP-Al、hnRNP-1、分裂装置たんぱく質)における空間
分布の変化。 結腸直腸癌細胞核におけるこれらの知見は、発癌により、多くの核成分の空間
組織中での変質が誘発されていることを示している。これらの原理に基づき、本
発明は、1つの局面において、分析すべき個体からの検体の細胞核中の少なくと
も1種の特異性成分の空間分布を測定し、上記の空間分布を参照検体中の同じ少
なくとも1種の特異性成分の空間分布と比較し、上記分析すべき検体の上記少な
くとも1種の成分を、上記参照検体中の上記少なくとも1種の特異性成分との比較
に基づいて特性決定することによる個体中の細胞増殖障害を検出しグレード付け
する方法を提供する。

【００１２】 上述したように、参照検体は、通常、同じまたは異なる個体からの検査すべき
検体と本質的に同じ物質源、通常は同じ組織の正常細胞に由来する。好ましくは
、検査すべき検体および参照検体は、同じ固体に由来する。さらに好ましくは、
検査すべき検体および参照検体は、同じ固体からの本質的に同じ組織に由来する
。また、参照検体は、適切な数の個体に由来し、当該技術の熟練者、例えば、1
人以上の病理学者またが癌学者によって選択された、分析すべき検体と同じまた
は同様な物質源、通常は同じ組織からの空間分布像の統計的平均である。そのよ
うな選択された空間分布像は、データベース中またはキャリヤー上に都合良く保
存される。この別法としての実施態様は、大規模診断および結果の自動化のため
の優れた機会を提供する。 核たんぱく質のような細胞核由来の特異性成分の検出および特性決定は、当該
技術において公知であり、各種の目的成分の明確な分布像を得て適切で好ましく
は明確な比較を行うのに有用である任意の適切な手段によって実施することがで
きる。

【００１３】 例えば、各々1種以上の核成分を認識する入手し得る抗体類のパネルを使用し
て、正常組織および発癌性組織間の核成分の空間分布の1種以上の差異を認識す
る抗体を選択することができる。また、発癌性細胞と正常細胞においては異なっ
て分布している疑いのある特異性核成分を、標準的手順を使用して分離し、正常
細胞と発癌性細胞間の識別において有用である特異性抗体を調製するのに使用す
ることもできる。 本明細書において説明するようなたんぱく質類は、抗体類の調製における免疫
原として、これらの抗体類を比色、免疫学的、蛍光または放射活性ラベルとコン
ジュゲートさせる場合に有用である。上述した各成分の空間分布像の検出および
特性決定において使用するのに有用な抗体類は、検出可能で再現性のあるラベル
化像を生ずるモノクローナルまたはポリクローナルいずれかの任意のタイプの抗
体類である。本発明の目的に適する抗体類としては、例えば、核マトリックス関
連核本体を認識するモノクローナル抗体5E10がある(Stuurman et al., J. Cell
Sci. (1992) 101:773-784)。この文献に記載さている上記抗体の調製方法は、興
味ある任意の抗原類に対する抗体類の調製において一般に応用可能である。細胞
核からの各種の他の成分も、本発明の目的に適する抗体源として使用可能である
。これらの抗体源は、例えば、DNA、RNA、たんぱく質、炭水化物とのたんぱく質
複合体、およびこれらの組合せに由来し得る。

【００１４】 このようにして得られた抗体類、および選択したある種の商業的に入手し得る抗
体類は、細胞核中の興味ある成分の空間分布を決定し、従って、腫瘍またはウィ
ルス抗原の存在、異常たんぱく質、またはそれらの不存在等を検出するのに有用
である。放射活性または蛍光物質でラベル化した抗体は、例えば、診断画像形成
または各種疾患の治療進捗のモニタリングにおいてとりわけ有用である。 本発明の検出およびグレード付け方法は、興味ある特異性成分の空間分布に基
づいているので、腫瘍性の如何にかかわらず、あらゆるタイプの細胞の検査に適
している。しかしながら、本発明方法は、広範囲の増殖障害、特に、結腸癌、肺
癌、乳癌、子宮頚部癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、ホジキン病および非ホジキ
ン病等のような各種癌の早期検出においてとりわけ適している。本発明の方法を
使用して検出できる各種癌のサーベイについては、例えば、Scientific America
n, September 1996を参照されたい。すでに説明したように、検査すべき細胞は
、上述したような各種癌の検出用組織から、或いは生物学的検体物質、例えば、
血液(例えば、白血病の検出)、リンパ液(例えば、リンパ節癌)、尿(例えば、膀
胱癌)もしくは糞便(例えば、結腸癌)から通常採取する。

【００１５】 参考として、本発明の優先権日後に発行され、核形態における変性と他の非前
骨髄球急性白血病に関連する調節因子の現場局在化との相互関係を開示している
Gordon et al., J. Cellular Biochem. (2000) 77:30-43も引用する。参考とし
て本明細書に引用したこの開示は、本発明の原理を、とりわけ急性白血病の領域
において確証している。 本発明に従う方法から得られた情報は、例えば、解析用プロセシングデータか
ら電子データプロセシングに医療専門家(例えば、病理学者または癌学者)により
手動的に変換して、数種の方法で加工することができる。本発明に従う個体中の
細胞増殖障害の存在について細胞学的物質を解析する適切なデータプロセシング
システムは、下記の工程を含む： (a)個体からの細胞核中の少なくとも1種の特異性成分の空間分布から得たデー
タを発生させるモニタリング装置(例えば、ビデオカメラ)； (b)上記モニタリング装置から得たデータを加工する第1コンピュータプロセッ
サー手段； (c)上記第1コンピュータからのデータを第1の保存媒体上に保存する第1保存手
段； (d)各種タイプの癌中の同じ少なくとも1種の特異性成分の空間分布、癌発現の
グレード等を含む参照細胞学的物質からのデータを含む第2保存手段；および、 (e)第1保存手段からのデータを第2保存手段と比較し、上記細胞学的物質中に
細胞増殖障害が存在するかどうかを決定し、増殖障害のタイプおよび障害のグレ
ードを評価する第2プロセッサー手段。

【００１６】 （発明を実施するための最良の形態） 以下、実験により本発明のある局面を例示するが、本発明を如何なる点におい
ても限定するものではない。 材料および方法 組織試験標本 大腸の組織検体を、アムステルダムの病院から臨床診断により提供された患者
から入手した。各ドナーから、健常組織および腺癌組織からの検体を採取した。
各ドナーは、表1に記載している；女性5人および男性5人、52〜89歳の年齢範囲
、平均年齢72歳。

【００１７】表1

【００１８】 各検体は、−70℃で保存した。クリオスタット切片化を、ミクロトームにより
−20℃で行った。各切片(5μm厚)をオルガノシランコーティングガラススライド
(MENZEL, Superfrost、76×26 mm)上に付着させ、室温で1〜2時間乾燥させた。
免疫蛍光測定に当たっては、各組織切片を、リン酸塩緩衝塩水(PBS)中で希釈し
た4％(質量/容量)パラホルムアルデヒドにより、4℃で10分間固定した。 各腫瘍検体を、組織プロセシングおよび組織学的染色後に、肉眼および顕微鏡
レベルでの形態学的特長(退形成)に従ってグレード付けし、ジュークス(Duke's)
分類に従って段階付けした。

【００１９】 免疫蛍光レベル化 すべての工程は、特に断らない限り、室温で実施した。固定化後、各組織切片
をPBSで2回洗浄し、各細胞をPBS中0.5％ Triton-X 100 (Sigma Chemical社、ミ
ズーリ州セントルイス)で5分間浸透処理した。その後、各組織切片をPBS中で2回
洗浄し、100 mMのグリシン(Sigma社)を含有するPBS中で10分間インキュベートし
て遊離アルデヒド基を残したまま不活化し、PBG[0.5%のBSA (Sigma社)および0.0
5％のゼラチン(Sigma社)を含有するPBS]中で10分間ブロックした。 間接免疫蛍光ラベル化に当っては、各固定組織切片を、PBG中に希釈した一次
抗体と4℃で1夜インキュベートした。使用した各一次抗体を下記の表2に示す。

【００２０】表2 1．N. Stuurman et al., J. Cell Sci. (1992) 101:773-784 2．W. Schul et al., Mol. Biol. Cell (1998) 9:1025-1036 3．W. Schul et al., EMBO J. (1996) 15:2883-2892 4．M.A. Grande et al., J. Cell Sci. (1997) 110:1781-1791 5．K.A. Mattern et al., Exp. Cell Res. (1999) 246

【００２１】 その後、各組織切片をPBG中で5分間4回洗浄し、PBG中に希釈した二次抗体と一
緒に1〜1.5時間インキュベートした。ビオチン標識化二次抗体を用いた場合には
、組織切片を再度PBG中で5分間4回洗浄し、PBGで希釈したCy3またはFITCに結合
させたストレプタビジン(Jackson Immuno Research Laboratories社、米国ペン
シルベニア州)と一緒に30分間インキュベートした。 一重および二重ラベル化に当っては、下記の二次抗体を使用した：FITCまたは
Cy3に結合させたロバ抗マウスIgG (Jackson社)、FITCまたはCy3に結合させたロ
バ抗マウスIgM (Jackson社)、FITCまたはCy3に結合させたロバ抗ウサギIgG (Jac
kson社)。 ラベル化後、各組織切片をPBG中で5分間2回、PBS中で5分間2回洗浄し、次いで
、0.4μg/mlのHoechst 33258 (Sigma社)、1/100,000に希釈したSytox Green、ま
たは1：40に希釈した1 mg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)を含有するPBS中で5分間
インキュベートした。各ガラススライドを、退色防止材としての培地ベクタシー
ルド(Vectashield) (Vevtor Laboratories社、米国)を備えたカバースリップ上
に取り付けた。 対照類は、一次抗体を予備免疫血清またはPBGで置換えることからなっていた
。これらの対照は、一貫して陰性であるか、或いは組織マトリックス(とりわけ
、腫瘍組織中の)が自己蛍光していることを明らかにした。

【００２２】 顕微鏡 CCDカメラを備えたライカ(Leica)蛍光顕微鏡を使用して、顕微鏡像を収集した
。 同焦点レザー走査顕微鏡測定 各ラベル化組織切片の像も、ライカ同焦点レザー走査顕微鏡(CLSM)で、25×、
40×、100×倍率の油浸漬対物によって収集した。二重波アルゴンイオンレザー
を使用して、グリーン(FITCまたはSytox Green)およびレッド(Cy3またはPI)蛍光
色素を、それぞれ、488 nmおよび514 nmで同時に励起させた。各蛍光シグナルを
、FITCまたはSytox Green用の525DF10バンドパスフィルター、およびCy3またはP
I用の550 nmロングパスフィルターを使用して検出した。両蛍光色素からの蛍光
シグナルを、同時に記録した。像は、単一の光セクションとしてまたは512×512
×ｙのボキセル(voxel)像(ｙは、必要なスタック当りの光セクション数に依存す
る)として記録した。 像の解析 CCDカメラにおいては、使用した像解析ソフトウェアは、Metamorph and Image
Pro-Plusであった。デジタル像を表出のために加工した。CLSMにおいては、像
解析は、ソフトウェアパッケージScillmageを使用して行った(Van Balen et al,
1994)。

【００２３】 結果 凍結物質によるラベル化手順 明確な特異性ラベル化は、下記の抗体によって得られた：5E10、α-p80コイリ
ン、α-CstF 64、α-CPSF 100、α-CPSF 160、SC-35、4G3、4B10、４DII、7G12
、2D3、R232、R252。シグナルは、CCDカメラおよびCLSMの両方において容易に検
出できた。 免疫蛍光ラベル化 図1と2、および下記の表3は、ヒト結腸直腸腫瘍およびその形質転換していな
いフェノタイプの核たんぱく質由来の各種核成分の空間分布の相関の本発明に従
う典型的な例を示す。これらの結果は、各因子がRNAプロセシングに関与し(開裂
因子、hnRNP、スプライシング因子、コイル体およびPML体)、アセチル化ヒスト
ン分布が結腸直腸癌組織の核中で変質されていることを示している。

【００２４】表3 ヒト結腸直腸上皮組織における特異性抗原類における核分布の顕著な差異 1．W. Schul et al., J. Cell. Biochem. (1998) 70:15-171 2．G.G. Maul, BioEssays (1998) 20:660-667 3．T. Misteli and D.L. Spector, Current Oinion in Cell Biology (1998) 10:323-331 4．M.N. Kuo and C.D. Allis, BioEssays (1998) 20:615-626 5．G. Varani and K. Nagai, Annual Review of Biophsics and Biomolecular Structure (1998) 27:407-445

【図面の簡単な説明】

【図１および２】 それぞれ、正常および腫瘍胃腸上皮組織断面中のモノラベル化核を示す。核中
のそれぞれのコイル体は、モノクローナル抗体204/5(p80コイリンに対して調製)
によってイムノラベル化されている。正常細胞の核は、腫瘍細胞よりも少ないコ
イル体を含有している。さらに、腫瘍中の組織形成は、障害を有する。

【図３】 CstF 64に対する抗体を有する組織断面(ドナー2番)における正常(AおよびB)お
よび腫瘍(CおよびD)上皮からのモノラベル化核の同焦点断面を示す。(AおよびB)
のCstF 64は、正常組織断面の上皮核中の核質粒状ラベル化像を示していた。(C
およびD)のCstF 64は、腫瘍組織断面の上皮核中の複雑な相互連結したドメイン
様の像を示していた。

【図４】 抗体7G12を有する組織断面(ドナー2番)における正常(AおよびB)および腫瘍(C
およびD)上皮からのモノラベル化核の同焦点断面を示す。(AおよびB)の7G12は、
健常上皮の核中の僅かな鮮明な増殖巣を強く染色した。(CおよびD)のhnRNP1は、
腫瘍上皮の核中の弱いプンテーテッド(puntated)なラベル化像を示した。

【図５】 正常(A)および腫瘍(B)組織断面における抗原p80コイリンを含有するモノラベ
ル化核の蛍光顕微鏡像を示す(倍率 x 25)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 CA25 CB01 CB03 CB04 DA36 DA78 FA16 FA18 FA19 FB03 FB07 FB12 JA01

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (a)分析すべき個体からの検体の細胞核中の少なくとも1種の
   特異性成分の空間分布を測定すること； (b)上記の空間分布を参照検体中の同じ少なくとも1種の特異性成分の空間分布
   と比較すること；および、 (c)上記分析すべき検体の上記少なくとも1種の成分を、上記参照検体中の上記
   少なくとも1種の特異性成分との比較に基づいて特性決定すること； を特徴とする個体における細胞増殖障害を検出しグレード付けするか或いはその
   ような細胞増殖障害の治療をモニターする方法。
2. 【請求項２】 上記検体が、組織、血液、リンパ液、尿および糞便からなる
   群から選ばれた生物学的物質源由来である請求の範囲第1項記載の方法。
3. 【請求項３】 上記参照検体が、上記分析すべき検体と同じまたは同様な物
   質源の正常細胞由来、好ましくは同じ個体由来である請求の範囲第1項または第2
   項記載の方法。
4. 【請求項４】 上記参照検体が、複数の個体に由来し、当該技術の熟練者に
   よって選択された、分析すべき検体と同じまたは同様な物質源からの空間分布像
   の統計的平均である請求の範囲第1項または第2項記載の方法。
5. 【請求項５】 上記空間分布像をデータベース中またはキャリヤー上に保存
   する請求の範囲第4項記載の方法。
6. 【請求項６】 検査すべき増殖障害が、結腸癌、肺癌、乳癌、子宮頚部癌、
   卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、ホジキン病および非ホジキン病からなる群から選ば
   れる請求の範囲第1項〜第5項のいずれか1項記載の方法。
7. 【請求項７】 上記細胞核中の上記少なくとも1種の特異性成分が、p-80-コ
   イリン、PML、SC35、アセチル化ヒストン類、CstF64、hnRNP-1、およびNuMAプロ
   テインの各抗原からなる群から選ばれる請求の範囲第1項〜第6項のいずれか1項
   記載の方法。
8. 【請求項８】 上記細胞核中の上記少なくとも1種の特異性成分の空間分布
   を免疫蛍光顕微鏡測定によって測定する請求の範囲第1項〜第7項のいずれか1項
   記載の方法。
9. 【請求項９】 上記免疫蛍光顕微鏡測定が、分析すべき細胞タイプ由来の核
   成分に対して産生した1種以上の抗体の使用を含む請求の範囲第8項記載の方法。
10. 【請求項１０】 上記1種以上の抗体が、モノクローナルである請求の範囲
    第9項記載の方法。
11. 【請求項１１】 (a)個体からの細胞核中の少なくとも1種の特異性成分の空
    間分布から得たデータを発生させるモニタリング装置(例えば、ビデオカメラ)； (b)上記モニタリング装置から得たデータを加工する第1コンピュータプロセッ
    サー手段； (c)上記第1コンピュータからのデータを第1の保存媒体上に保存する第1保存手
    段； (d)各種タイプの癌中の同じ少なくとも1種の特異性成分の空間分布、癌発現の
    グレード等を含む参照細胞学的物質からのデータを含む第2保存手段；および、 (e)第1保存手段からのデータを第2保存手段と比較し、上記細胞学的物質中に
    細胞増殖障害が存在するかどうかを決定し、増殖障害のタイプおよび障害のグレ
    ードを評価する第2プロセッサー手段； を含む個体の細胞増殖障害の存在について細胞学的物質を分析するためのデータ
    プロセシングシステム。