CN102552943A - 一种氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂的制备及其在肿瘤诊断中的应用。本发明利用阳离子树状大分子材料的高度分枝特性，在其表面连接较大数量的Gd3+，提高MRI诊断的信号强度，减小诊断药物用量，同时使用极具临床应用潜力的肿瘤靶向头基——氯代毒素CTX修饰阳离子树状大分子材料，增加Gd3+在肿瘤部位的富集，增强肿瘤部位的MRI信号，提高肿瘤诊断的灵敏度和准确性。本发明的肿瘤靶向造影剂与现有商用小分子钆类造影剂比较，驰豫率高，使用剂量小，可靶向性增强肿瘤部位MRI信号，提高肿瘤部位和正常组织的信号对比度，同时可有效延长肿瘤部位MRI信号的可观察时间，有利于更确切地诊断肿瘤。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂的制备及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤以及肿瘤的性质（良性或恶性）的早期诊断，对肿瘤的治疗具有重要的意义。目前，恶性肿瘤的临床检测主要依靠免疫生化检测，并辅以电子计算机X射线断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等物理手段。生物学的组织化学检测虽然具有较高的检测灵敏度和特异性，但需组织切片，只能局限于离体检测，并且耗时较长。MRI对诊断颅内原发性肿瘤和转移瘤、原发性肝癌等疾病的诊断优于CT。现有技术MRI诊断中主要通过钆类造影剂进行，但临床应用的钆类MRI造影剂如钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）的敏感性较低（微克分子水平），在体内的分布无组织特异性，滞留时间很短。为了达到靶向分子显影，需要对造影剂进行表面修饰，使其主动靶向肿瘤细胞。目前已有报道使用脂质体、纳米粒包载临床上使用的MRI造影剂Gd-DTPA，提高其靶向性和检测灵敏度。
研究公开了多肽的修饰能提高纳米载药系统肿瘤组织的识别能力，已被广泛用于抗肿瘤研究。近年来有学者发现一段由36个氨基酸残基组成的多肽——氯代毒素（chlorotoxin，简称CTX）。该CTX具有良好的肿瘤靶向性，能够特异性结合多种肿瘤细胞，如神经胶质瘤、恶性肉瘤、肠癌以及前列腺癌等。研究表明，CTX通过基质金属蛋白酶-2（MMP-2）介导进入肿瘤细胞，而MMP-2只在肿瘤细胞表面高量表达，正常细胞表面不表达，这就解释了CTX特异性结合肿瘤细胞的原因。同时，研究显示CTX虽然对无脊椎动物有强烈毒性，却对哺乳动物无毒。目前已有利用CTX修饰的放射治疗药物131I-TM-601，正在接受FDA审批，并已进入II期临床试验阶段。还有有研究将CTX与荧光染料连接用于手术过程的肿瘤显像等。因此，CTX可能成为一种肿瘤特异性非常高的靶向头基。
树状大分子是近年合成的一类纳米尺度的新型水溶性聚合物，其典型特征是高分枝并带有许多重复的、高密度的端基活性基团，这些结构对药物和靶向头基具有较强的结合能力，进而与细胞膜相互作用增加药物的靶向性和摄取量。使用树状大分子作为药物载体近年研究较多，但是作为钆类MRI造影剂载体用于肿瘤诊断药物研发的报道较少。阳离子树状大分子表面具有许多主胺基团，单个分子可能连接多个Gd3+，从而提高MRI诊断的信号强度，减小诊断药物用量，若再连接有效的靶向头基，有望较大程度提高该MRI造影剂的肿瘤靶向诊断效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有用于肿瘤诊断的MRI造影剂的不足，提供一种新的肿瘤靶向MRI造影剂。尤其涉及一种氯代毒素（chlorotoxin，简称CTX）修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂。
本发明还提供了所述氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂的制备方法和应用，尤其是在制备表达基质金属蛋白酶-2的肿瘤诊断制剂中的用途。
本发明的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，由肿瘤靶向载体、Gd螯合剂和Gd3+构成，所述的肿瘤靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和CTX组成。
本发明中，采用氯代毒素CTX作为肿瘤靶向头基，阳离子树状大分子为载体材料，通过亲水性聚合物连接CTX构建新的肿瘤靶向载体。
本发明在所述的肿瘤靶向载体上连接多个Gd螯合剂，再通过该螯合剂螯合多个Gd3+，可明显提高肿瘤部位的MRI信号，并延长该信号的可观察时间，有利于更确切的肿瘤诊断。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
以阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和CTX为组分，三者以共价方式连接制备CTX修饰的树状大分子肿瘤靶向载体。其中，亲水性聚合物与阳离子树状大分子材料的分子比是1~20:1，CTX与阳离子树状大分子材料的分子比为1~10:1；
本发明所述的肿瘤靶向载体按下述方法制备：
阳离子树状大分子材料和亲水性聚合物以1:1~20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60～180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液；同时，CTX与巯基化试剂反应后引入巯基，以1～10:1的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物-CTX，分子排阻色谱法除去未反应的CTX；
肿瘤靶向载体通过共价方式连接Gd螯合剂，再通过该螯合剂螯合Gd3+，制备肿瘤靶向造影剂。其中，肿瘤靶向载体与Gd螯合剂的分子比是1:100~120，肿瘤靶向载体与Gd3+的分子比是1:70~90；
本发明所述的肿瘤靶向造影剂按下述方法制备：
将制备的肿瘤靶向载体和功能化的Gd螯合剂分别溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液，适量饱和NaOH溶液调节pH至8.8～9.2；将两种溶液混合（肿瘤靶向载体和Gd螯合剂的分子比是1:100~120），室温搅拌反应24～72小时，两种材料中含有的基团发生特异性反应，生成肿瘤靶向载体-Gd螯合剂，超滤法除去未反应的Gd螯合剂并更换为pH值5.8～6.2的草酸盐缓冲液；将Gd3+溶于pH值5.8～6.2的草酸盐缓冲液，以与肿瘤靶向载体的分子比是70~90:1的量，4 oC搅拌反应24～72小时后生成肿瘤靶向造影剂，超滤法除去未反应的Gd3+并更换为pH值7.2～7.6的磷酸盐缓冲液；
本发明所述的肿瘤靶向造影剂，其使用的靶向头基是氯代毒素CTX；
本发明所述的阳离子树状大分子材料选自树枝状聚赖氨酸（dendrigraft poly-L-lysines DGL，简称DGL）和聚酰胺-胺（polyamidoamine，简称PAMAM）；
所述亲水性聚合物为聚乙二醇（polyethyleneglycol, 简称PEG）和聚氧乙烯；
所述Gd螯合剂选自二乙三胺五乙酸（DTPA）和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOPA）；
所述Gd3+为GdCl3·6H2O。
本发明所制备的肿瘤靶向造影剂适用于所有表达基质金属蛋白酶-2的肿瘤诊断；
本发明采用氢核磁共振技术对肿瘤靶向载体的中间产物进行结构鉴定，结果显示，树状大分子与含有双功能基团的PEG（琥珀酰亚胺-PEG3400-马来酰亚胺）反应后在3.5 ppm处出现PEG的特征吸收峰，并在6.7 ppm处出现马来酰亚胺的特征吸收峰，说明PEG已经修饰到树状大分子上，树状大分子-PEG合成成功；树状大分子-PEG进一步与功能化的DTPA反应后在7.2 ppm处出现DTPA苯环的特征吸收峰，说明树状大分子表面成功连接上DTPA；
本发明采用Ellman法鉴定CTX是否修饰到PEG末端，结果显示，巯基化的CTX和树状大分子-PEG反应之后，反应溶液中巯基的数目明显降低，说明肿瘤靶向载体——树状大分子-PEG-CTX合成成功；
本发明同时采用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-OES）检测肿瘤靶向造影剂中Gd3+的含量，结果显示，经过纯化后的肿瘤靶向造影剂中可检测到预期量的Gd3+，说明肿瘤靶向造影剂——树状大分子-PEG-CTX/DTPA-Gd合成成功；
通过使用荧光标记的CTX分别与肿瘤细胞和正常细胞孵育，结果显示，肿瘤细胞对于CTX的摄取非常明显，而正常细胞几乎不摄取，说明CTX是一种肿瘤细胞选择性非常强的靶向头基；
本发明所制备的肿瘤靶向载体分别与肿瘤细胞和正常细胞孵育，结果显示，肿瘤细胞对于CTX修饰的肿瘤靶向载体的摄取显著高于正常细胞，说明CTX的修饰可显著提高肿瘤细胞摄取载体的效率；
本发明小动物活体成像定位仪考察所制备的肿瘤靶向载体的肿瘤靶向特性，分别通过荷脑胶质瘤裸鼠和荷皮下移植肝肿瘤裸鼠尾静脉注射所制备的肿瘤靶向载体，结果显示，CTX修饰的肿瘤靶向载体在肿瘤部位的蓄积显著高于未经CTX修饰的载体，在动物水平上说明肿瘤靶向载体的肿瘤靶向性强；
本发明使用MRI仪考察肿瘤靶向造影剂的肿瘤诊断效果，结果显示，CTX修饰的肿瘤靶向造影剂在脑胶质瘤和肝肿瘤裸鼠模型上的肿瘤显像效果较未修饰组和市售组明显，且肿瘤信号维持时间较长；
本发明使用MTT法考察肿瘤靶向造影剂的体外细胞毒性，结果显示，细胞毒性随着造影剂浓度加大而增加，CTX修饰的肿瘤靶向造影剂的细胞毒性略低于未经CTX修饰的造影剂；
本发明使用绵羊血考察肿瘤靶向造影剂的溶血性，结果显示，是否经CTX修饰的造影剂均无明显的溶血性；
本发明使用苏木精-伊红染色法考察肿瘤靶向造影剂的体内毒性，石蜡切片结果显示，CTX修饰的肿瘤靶向造影剂在小鼠主要器官上未显示任何毒性，石蜡切片与正常组无明显区别；
本发明的突出优点及有益效果在于：
利用阳离子树状大分子材料的高度分枝特性，在其表面连接较大数量的Gd3+，提高MRI诊断的信号强度，减小诊断药物用量，同时使用极具临床应用潜力的肿瘤靶向头基——CTX修饰阳离子树状大分子材料，增加Gd3+在肿瘤部位的富集，增强肿瘤部位的MRI信号，提高肿瘤诊断的灵敏度和准确性。本发明所制备的肿瘤靶向造影剂与现有商用小分子钆类造影剂比较，驰豫率高，使用剂量小，可靶向性增强肿瘤部位MRI信号，提高肿瘤部位和正常组织的信号对比度，同时可有效延长肿瘤部位MRI信号的可观察时间，有利于更确切地诊断肿瘤，在肿瘤诊断应用上具有更高的价值。
附图说明
图1 核磁共振图谱
其中，A：DGL-PEG10
a. 溶剂重水特征峰
b. 树状大分子中赖氨酸单元上的亚甲基峰
c. PEG特征峰
B：DGL-PEG10-DTPA111
a. 溶剂重水特征峰
b. 树状大分子中赖氨酸单元上的亚甲基峰
d. DTPA分子中苯环特征峰。
图2 肿瘤造影载体经CTX修饰前后在人胚肾细胞（293细胞）、大鼠脑胶质瘤C6细胞和人肝细胞癌细胞（Bel-7402细胞）的摄取情况比较（DGL浓度为2 mM，bar = 100 mm）
其中，A：DGL-PEG在293细胞的摄取图
B：DGL-PEG在C6细胞的摄取图
C：DGL-PEG在Bel-7402细胞的摄取图
D：DGL-PEG-CTX在293细胞的摄取图
E：DGL-PEG-CTX在C6细胞的摄取图
F：DGL-PEG-CTX在Bel-7402细胞的摄取图。
图3 肿瘤造影载体经CTX修饰前后在荷脑胶质瘤裸鼠的分布情况比较
其中，A：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）1 h后的活体成像图
B：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）4 h后的活体成像图
C：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）4 h后的全脑成像图
D：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）4 h后的各主要器官成像图。
图4 肿瘤造影载体经CTX修饰前后在荷皮下移植肝肿瘤裸鼠的分布情况比较
其中，A：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）1 h后的活体成像图
B：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）4 h后的活体成像图
C：荷皮下移植肝肿瘤裸鼠的明场图
D：尾静脉注射DGL-PEG（左）和DGL-PEG-CTX（右）4 h后的各主要器官及肿瘤的成像图。
图5 肿瘤造影剂经CTX修饰前后的体外毒性考察
其中，A：MTT法测试一系列浓度造影剂在C6细胞上的毒性
B：体外测试一系列浓度造影剂对绵羊血的溶血毒性。
图6 肿瘤造影剂经CTX修饰前后在荷脑胶质瘤裸鼠的磁共振成像效果比较，以市售DTPA-Gd造影剂为对照
其中，A-G：尾静脉注射市售DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
H-N：尾静脉注射DGL-PEG/DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
O-U：尾静脉注射DGL-PEG-CTX/DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
V： 尾静脉注射上述三种造影剂后不同时间点的肿瘤相对信号增强定量结果。
图7 肿瘤造影剂经CTX修饰前后在荷皮下移植肝肿瘤裸鼠的磁共振成像效果比较，以市售DTPA-Gd造影剂为对照
其中，A-G：尾静脉注射市售DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
H-N：尾静脉注射DGL-PEG/DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
O-U：尾静脉注射DGL-PEG-CTX/DTPA-Gd造影剂0 h、5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h后的磁共振成像图
V： 尾静脉注射上述三种造影剂后不同时间点的肿瘤相对信号增强定量结果。
具体实施方式
实施例1.
DGL（第二代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:2溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲液（简称PBS）中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例2.
DGL（第二代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:5溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例3.
DGL（第二代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:10溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例4.
DGL（第二代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:10溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:5分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例5.
DGL（第三代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:2溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例6.
DGL（第三代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:5溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例7.
DGL（第三代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:10溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:1分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例8.
DGL（第三代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:10溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:5分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例9.
DGL（第三代）和含有双功能基团的PEG按照分子比1:10溶于pH 8.0的PBS中，室温搅拌反应2 h，生成DGL-PEG，超滤除去未反应的PEG并更换缓冲液为pH 7.0的PBS。与此同时，CTX与巯基化试剂Traut’s reagent反应后引入巯基基团，与DGL-PEG按照1:10分子比混合，室温搅拌反应24小时，分子排阻色谱法除去未反应的CTX即得DGL-PEG-CTX。
实施例10.
将实施例7制备的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1:226溶于pH 9.0的PBS中，室温搅拌反应48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超滤除去未反应的DTPA并将反应产物溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液。与此同时，GdCl3·6H2O溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液，与DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1:170混合，4 ℃搅拌反应24 h，超滤除去未反应的Gd即得Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。
实施例11.
将实施例8制备的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1:226溶于pH 9.0的PBS中，室温搅拌反应48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超滤除去未反应的DTPA并将反应产物溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液。与此同时，GdCl3·6H2O溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液，与DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1:170混合，4 ℃搅拌反应24 h，超滤除去未反应的Gd即得Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。
实施例12.
将实施例9制备的第三代的DGL-PEG-CTX和功能化的DTPA按照分子比1:226溶于pH 9.0的PBS中，室温搅拌反应48 h，生成DTPA-DGL-PEG-CTX，超滤除去未反应的DTPA并将反应产物溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液。与此同时，GdCl3·6H2O溶于pH 6.0的醋酸钠缓冲液，与DTPA-DGL-PEG-CTX按照分子比1:170混合，4 ℃搅拌反应24 h，超滤除去未反应的Gd即得Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX。
实施例13.
将实施例8制备的DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影载体使用红色荧光染料BODIPY标记，载体浓度为2 mM，和293细胞于37oC、5％CO2培养箱中孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察细胞摄取载体的情况，结果显示，293细胞摄取DGL-PEG-CTX不明显，且与未修饰的DGL-PEG没明显区别，见附图2A和2D。
实施例14.
将实施例8制备的DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影载体使用红色荧光染料BODIPY标记，载体浓度为2 mM，和C6细胞于37oC、5％CO2培养箱中孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察细胞摄取载体的情况，结果显示，C6细胞摄取DGL-PEG-CTX明显，且显著高于未修饰的DGL-PEG，见附图2B和2E。
实施例15.
将实施例8制备的DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影载体使用红色荧光染料BODIPY标记，载体浓度为2 mM，和Bel-7402细胞于37oC、5％CO2培养箱中孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察细胞摄取载体的情况，结果显示，Bel-7402细胞摄取DGL-PEG-CTX明显，且显著高于未修饰的DGL-PEG，见附图2C和2F。
实施例16.
将实施例8制备的DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影载体使用红色荧光染料BODIPY标记，荷脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射，剂量为50 μg DGL/裸鼠，分别于给药后1 h和4 h将裸鼠麻醉，使用小动物成像仪观察肿瘤靶向载体在荷瘤裸鼠体内的分布情况，在4 h时处死裸鼠，分别取脑、心、肝、脾、肺和肾，置于小动物成像仪观察肿瘤靶向载体的器官分布情况。成像结果显示，DGL-PEG-CTX在脑肿瘤的蓄积量显著高于未修饰的DGL-PEG，在肝脏的蓄积量相对减少，说明CTX的修饰具有脑肿瘤靶向效果，见附图3。
实施例17.
将实施例8制备的DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影载体使用红色荧光染料BODIPY标记，荷肝肿瘤裸鼠尾静脉注射，剂量为50 μg DGL/裸鼠，分别于给药后1 h和4 h将裸鼠麻醉，使用小动物成像仪观察肿瘤靶向载体在荷瘤裸鼠体内的分布情况，在4 h时处死裸鼠，分别取肿瘤、脑、心、肝、脾、肺和肾，置于小动物成像仪观察肿瘤靶向载体的分布情况。成像结果显示，DGL-PEG-CTX在肝肿瘤的蓄积量显著高于未修饰的DGL-PEG，在肝脏的蓄积量相对减少，说明CTX的修饰具有肝肿瘤靶向效果，见附图4。
实施例18.
使用实施例11制备的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影剂，在一系列浓度与C6细胞于37oC、5％CO2培养箱中孵育3 h，更换为的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（简称MTT）溶液继续孵育2 h，二甲基亚砜（简称DMSO）溶解，酶联免疫检测仪测定吸光度，以未经处理的细胞组为对照，计算细胞存活率。结果显示，造影剂浓度在10 mM以下时无明显细胞毒性，见附图5A。
实施例19.
使用实施例11制备的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影剂，在一系列浓度与经处理的无菌脱纤维绵羊血（含2%红细胞）于37 oC水浴孵育1 h，3000 rpm离心15 min，光度计检测上清液中的血红蛋白含量，以生理盐水为阴性对照（不溶血），以双蒸水为阳性对照（100%溶血），计算溶血百分率。结果显示，在测试的所有浓度，造影剂的溶血百分率均小于5%，见附图5B。
实施例20.
使用实施例11制备的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影剂，荷脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射，分别于给药前以及给药后5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h使用4.7 T Bruker Biospec磁共振扫描仪进行检测。结果显示，CTX修饰的肿瘤靶向造影剂于各测定时间点时在肿瘤部位的信号增强均高于市售组和未修饰组，且经CTX修饰后，脑肿瘤部位MRI信号增强持续时间最长，见附图6。
实施例21.
使用实施例11制备的Gd-DTPA-DGL-PEG-CTX肿瘤靶向造影剂，荷皮下移植肝肿瘤裸鼠尾静脉注射，分别于给药前以及给药后5 min、10 min、30 min、1 h、3 h和24 h使用4.7 T Bruker Biospec磁共振扫描仪进行检测。结果显示，CTX修饰的肿瘤靶向造影剂于各测定时间点时在肿瘤部位的信号增强均高于市售组和未修饰组，且经CTX修饰后，肝肿瘤部位MRI信号增强持续时间最长，见附图7。
本发明上述实验中采用的第二代和第三代DGL均购自COLCOM公司，氯代毒素CTX序列为MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQ，购自北京中昊时代生物有限公司，双功能PEG购自北京键凯公司，功能化的DTPA购自Macrocyclics公司，GdCl3·6H2O购自Sigma公司。
Claims (11)
1.一种氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，由肿瘤靶向载体、Gd螯合剂和Gd3+构成，所述的肿瘤靶向载体由阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和氯代毒素CTX组成；
所述的亲水性聚合物与阳离子树状大分子材料的分子比是1~20:1，CTX与阳离子树状大分子材料的分子比为1~10:1；
所述的CTX修饰的肿瘤靶向载体与Gd螯合剂的分子比是1:100~120，肿瘤靶向载体与Gd3+的分子比是1:70~90。
2.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，所述的氯代毒素为肿瘤靶向头基。
3.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，所述的阳离子树状大分子材料选自树枝状聚赖氨酸或聚酰胺-胺。
4.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，所述的亲水性聚合物为聚乙二醇PEG或聚氧乙烯。
5.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，所述的Gd螯合剂选自二乙三胺五乙酸或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。
6.按权利要求1所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂，其特征在于，所述的Gd3+为GdCl3·6H2O。
7.权利要求1的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，用氯代毒素CTX为靶向头基，通过亲水性聚合物修饰于树状大分子表面制得肿瘤靶向载体，制得的肿瘤靶向载体连接Gd螯合剂，再通过Gd螯合剂螯合Gd3+，制成氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂。
8.按权利要求7的方法，其特征在于，其中阳离子树状大分子材料、亲水性聚合物和CTX通过共价方式连接；肿瘤靶向载体与Gd螯合剂通过共价方式连接；Gd螯合剂与Gd3+通过螯合作用配位。
9.按权利要求7的方法，其特征在于，所述的肿瘤靶向载体通过下述步骤制备：
阳离子树状大分子材料和亲水性聚合物以1:1~20的分子比溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应60～180分钟，两种分子中含有的基团发生特异性反应，生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物，超滤法除去未反应的亲水性聚合物并更换为pH值6.8～7.2磷酸盐缓冲液；同时，CTX与巯基化试剂反应后引入巯基，以1～10:1的分子比与阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物上的特异基团室温搅拌反应12～36小时后生成阳离子树状大分子材料-亲水性聚合物-CTX，分子排阻色谱法除去未反应的CTX。
10.按权利要求7所述的方法，其特征在于所述的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂通过述步骤制备：
将权利要求9制得的肿瘤靶向载体和功能化的Gd螯合剂分别溶于pH值7.8～8.2磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液，适量饱和NaOH溶液调节pH至8.8～9.2；将两种溶液混合，其中肿瘤靶向载体和Gd螯合剂的分子比为1:100~120，室温搅拌反应24～72小时，生成肿瘤靶向载体-Gd螯合剂，超滤法除去未反应的Gd螯合剂并更换为pH值5.8～6.2的草酸盐缓冲液；将Gd3+溶于pH值5.8～6.2的草酸盐缓冲液，其与肿瘤靶向载体的分子比是70~90:1的量，4 oC搅拌反应24～72小时后生成肿瘤靶向造影剂，超滤法除去未反应的Gd3+并更换为pH值7.2～7.6的磷酸盐缓冲液。
11.权利要求1的氯代毒素修饰的肿瘤靶向磁共振造影剂在制备表达基质金属蛋白酶-2的肿瘤诊断制剂中的用途。
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