ES2245783T3 - Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas. - Google Patents

Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas.

Info

Publication number
ES2245783T3
ES2245783T3 ES96912393T ES96912393T ES2245783T3 ES 2245783 T3 ES2245783 T3 ES 2245783T3 ES 96912393 T ES96912393 T ES 96912393T ES 96912393 T ES96912393 T ES 96912393T ES 2245783 T3 ES2245783 T3 ES 2245783T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
neu
amino acid
seq
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96912393T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin A. Cheever
Mary L. Disis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Original Assignee
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington filed Critical University of Washington
Application granted granted Critical
Publication of ES2245783T3 publication Critical patent/ES2245783T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

SE DESCUBREN COMPUESTOS Y COMPOSICIONES PARA PROVOCAR O ESTIMULAR REACTIVIDAD INMUNITARIA A LA PROTEINA HER COMPUESTOS INCLUYEN POLIPEPTIDOS Y MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN DICHOS PEPTIDOS. LOS COMPUESTOS PUEDEN UTILIZARSE PARA LA PREVENCION O TRATAMIENTO DE TUMORES ASOCIADOS AL ONCOGEN HER

Description

Dominio intracelular de la proteína HER-2/neu para la prevención o el tratamiento de neoplasias malignas.
Campo de la técnica
La presente invención generalmente se refiere a los polipéptidos, y las moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, que incluye el uso en el tratamiento de las neoplasias malignas a las que se asocia el oncogén HER-2/neu.
Antecedentes de la invención
A pesar de numerosas inversiones de recursos humanos y económicos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la causa principal de muerte en las mujeres con edades entre 35 y 74 años. El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común en las mujeres y la incidencia de padecer cáncer de mama está en alza. Una de nueve mujeres será diagnosticada con la enfermedad. Los métodos convencionales para curar el cáncer de mama se han centrado en torno a una combinación de intervención quirúrgica, radioterapia y quimioterapia. Estos enfoques han dado lugar a algunos éxitos espectaculares en determinadas neoplasias malignas. Sin embargo, estos métodos no han tenido éxito con todas las neoplasias malignas y, muy a menudo, el cáncer de mama es incurable cuando se intenta tratarlo más allá de una determinada etapa. Se necesitan unos métodos alternativos para la prevención y el tratamiento.
Una característica común de las neoplasias malignas es el desarrollo incontrolado de las células. Las células neoplásicas parecen haberse sometido a un procedimiento de transformación desde el fenotipo normal a un fenotipo maligno, capaz de desarrollarse de manera autónoma. La amplificación y la sobreexpresión de genes de las células somáticas se considera un acontecimiento primario común que da lugar a la transformación de las células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncógenos se pasan a la progenie de las células transformadas durante la división celular.
La investigación en marcha en relación con los oncogenes ha identificado, al menos, cuarenta oncogenes que actúan en las células malignas y que son responsables de la transformación, o que se asocian a ella Los oncogenes se han clasificado en diferentes grupos sobre la base de la función putativa o de la ubicación de sus productos génicos (como la proteína expresada por el oncogén).
Se cree que los oncogenes son esenciales para determinados aspectos del funcionamiento celular normal. Respecto a esto, el oncogén de HER-2/neu es un miembro de la familia de oncogenes con tirosina-cinasa y comparte un elevado grado de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Presumiblemente, HER-2/neu desempeña una función en el crecimiento y/o diferenciación celulares. Parece ser que HER-2/neu induce neoplasias malignas por medio de mecanismos cuantitativos que son resultado del aumento o la desregulación de la expresión, esencialmente, de un producto génico normal.
HER-2/neu (p185) es el producto proteico del oncogén de HER-2/neu. El gen de HER-2/neu está amplificado y la proteína HER-2/neu se sobreexpresa en multitud de neoplasias malignas, como el cáncer de mama, de ovario, de colon, el carcinoma broncopulmonar y el cáncer de próstata. HER-2/neu se relaciona con la transformación maligna. Se encuentra en el 50% al 60% de los carcinomas ductales in situ y en el 20% al 40% de todos los cánceres de mama, así como en una fracción significativa de adenocarcinomas que se producen en los ovarios, la próstata, el colon y los pulmones. HER-2/neu se encuentra íntimamente asociada no sólo al fenotipo maligno, sino también a la agresividad de la neoplasia maligna, que se encuentra en una cuarta parte de los cánceres de mama invasores. La sobreexpresión de HER-2/neu se correlaciona con un mal pronóstico en el cáncer de mama y en el de ovario. HER-2/neu es una proteína transmembranaria con una masa molecular relativa de 185 kDa que tiene, aproximadamente, 1255 aminoácidos (aa) de longitud. Tiene un dominio de unión extracelular (DUE) de aproximadamente 645 aa, con una homología del 40% con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), un dominio de anclaje transmembranario muy hidrófobo (DTM) y un dominio citoplásmico (DC) carboxiterminal de aproximadamente 580 aa con una homología del 80% con el RFCE.
En Disis et al. (Cancer Res. 54, 16-20, 1994) se informa sobre la inmunidad de HER-2/neu en las pacientes que tienen cánceres de mama.
Debido a las dificultades de las actuales metodologías para el tratamiento de las neoplasias malignas en las que está asociado el oncogén de HER-2/neu, hay una necesidad en la técnica de mejorar los compuestos y las composiciones. La presente invención satisface esta necesidad y, además, proporciona otras ventajas relacionadas.
Compendio de la invención
De manera breve, la presente invención proporciona polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos (que dirigen la expresión de tales polipéptidos) y vectores víricos (que dirigen la expresión de tales polipéptidos) para usarlos en la inmunización, o en la fabricación de un medicamento para la inmunización, de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la que está asociado el oncogén de HER-2/neu. Un polipéptido o una molécula de ácido nucleico según esta invención puede estar presente en una composición que incluye un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede usar tal polipéptido, molécula de ácido nucleico, vector vírico o composición farmacéutica para la inmunización con una pauta "de una vez" (p. ej., cuando se sospecha una neoplasia maligna) o una administración periódica (p. ej., para un individuo con un riesgo elevado de adquirir o volver a adquirir una neoplasia maligna). Un medicamento para la inmunización puede ser útil para tratar un tumor existente o para prevenir la aparición o la recidiva de un tumor.
En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido codificado por una secuencia de ADN de los nucleótidos 2026 a 3765 de la SEQ ID n.º 1, en la que la secuencia de ADN codifica un polipéptido que produce una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu. En una realización preferida, un polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante del mismo que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente. Se proporciona una composición que comprende un polipéptido de la presente invención en combinación con un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
En otra realización, se proporciona un polipéptido o composición de la presente invención para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la que está asociado el oncogén de HER-2/neu. En otra realización, se usa tal polipéptido o composición para fabricar un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
En otra realización, se proporciona según la presente invención una molécula de ácido nucleico que dirige la expresión de un polipéptido para inmunizar al transfectar las células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico. En otra realización, se usa tal molécula de ácido nucleico para fabricar un medicamento para inmunizar un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
En otra realización, se proporciona según la presente invención un vector vírico que dirige la expresión de un polipéptido para inmunizar mediante la infección de las células de un animal de sangre caliente con el vector. En otra realización, se usa tal vector vírico para fabricar un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
Estos y otros aspectos de la presente invención quedarán claros tras referirse a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados de la sensibilización con células dendríticas (CD) de los linfocitos T indiferenciados para el polipéptido de HER-2/neu. Las CD derivadas de la médula ósea se generaron con el GM-CSF e IL6 de hemocitoblastos CD34+. Las CD tratadas con un pulso de polipéptido de HER-2/neu indujeron la proliferación específica de proteína de los linfocitos T autógenos CD4+/CD45RA+ después de 7 días de cultivar linfocitos T con las CD. Los hemocitoblastos CD35+ derivados de la médula ósea cultivados durante una semana en un medio sin suero que contenía GM-CSF e IL-6 se usaron como APC. Se colocaron las APC en placas de 96 pocillos de fondo redondeado (Corning, Corning, NY, EEUU) en varias concentraciones y se incubaron durante 16 a 18 horas con 20 a 25 \mug/ml del polipéptido recombinante de HER-2/neu. Los linfocitos T CD4+ se aislaron de las células mononucleares autógenas de la sangre periférica por medio de una selección positiva, mediante columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Bothell, WA, EEUU). Se irradiaron (10 Gy) las APC tratadas con un pulso de antígeno y se añadieron linfocitos T CD4+ a razón de 10^{5} por pocillo. La respuesta proliferativa de los linfocitos T se calculó por la captura de [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) añadida en el día 7 durante 16 a 18 horas. Los ensayos de proliferación se realizaron en un medio sin suero y sin citocinas en 5 pocillos de réplica. Los símbolos representan: ---\medbullet--- CD + polipéptido de HER-2/neu + linfocitos T CD4+/CD45RA+; ---\medcirc--- CD + linfocitos T CD4+/CD45RA+; y –-\Box--- CD + polipéptido de HER-2/neu.
La figura 2 muestra la respuesta de los linfocitos CD4+ al polipéptido de HER-2/neu. Mediante el ensayo de sensibilización descrito para la figura 1, se probaron las respuestas al polipéptido recombinante humano de HER-2/neu en los linfocitos T CD4+ de donantes normales. Los símbolos representan: ---\blacksquare--- HC + CD4; y \cdot\cdot\cdot\blacklozenge\cdot\cdot\cdot SC + CD4 + polipéptido de HER-2/neu. "HC" son los hemocitoblastos.
La figura 3 muestra que las ratas inmunizadas con el polipéptido de rata HER-2/neu generan anticuerpos específicos contra el neu de rata. Las ratas se inmunizaron con 25 \mug del polipéptido recombinante de HER-2/neu de rata en MPL o vaccel adyuvante. Se aplicaron tres inmunizaciones, separadas 20 días cada una. Veinte días después de la inmunización final, se evaluaron las respuestas con anticuerpos contra el neu de rata en las ratas. Los animales inmunizados con el polipéptido de rata HER-2/neu y el vaccel adyuvante mostraron unas respuestas específicas contra el neu de rata de elevado título. El control fue un animal inmunizado con el polipéptido de HER-2/neu humano (proteína extraña). En experimentos separados, las ratas inmunizadas con 100 \mug y 300 \mug del neu completo purificado no desarrollaron anticuerpos detectables específicos contra neu (no se muestran los datos). Los datos representan la media y la desviación estándar de 3 animales. Los símbolos representan: ---\blacksquare--- polipéptido de HER-2/neu de rata/MPL; \cdot\cdot\cdot\blacklozenge\cdot\cdot\cdot polipéptido de HER-2/neu de rata/vaccel; \cdot\cdot\cdot\Box\cdot\cdot\cdot MPL solo; \cdot\cdot\cdot\medcirc\cdot\cdot\cdot vaccel solo; y 1 control. "MPL" y "vaccel" son adyuvantes (Ribi, Bozeman, MT, EEUU). "Neu" es la proteína HER-2/neu.
La figura 4 muestra que las pacientes con cáncer de mama tienen una inmunidad preexistente al polipéptido de HER-2/neu. Se evaluaron los LMSP de las pacientes mediante la incorporación de timidina tritiada en 24 pocillos replicados. Los pocillos que respondieron están puntuados como mayores que la media y 3 desviaciones estándares (372 cpm) de los pocillos de control. Esta paciente con cáncer de mama de etapa II con positividad para HER-2/neu tiene una respuesta significativa al polipéptido humano recombinante de HER-2/neu. Los símbolos "p" representan péptidos para la proteína HER-2/neu, "tt" representa la vacuna antitetánica y "PHNh" representa el polipéptido de HER-2'neu humano recombinante.
Descripción detallada de la invención
Antes de exponer la invención, puede ser útil comprender la misma para presentar definiciones de determinados términos que se usarán más adelante.
Polipéptido de HER-2/neu: tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una porción de la proteína HER-2/neu (la proteína conocida también como p185 o c-erbB2) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, y se puede obtener naturalmente, producir sintéticamente, manipularse genéticamente o ser una variante funcionalmente equivalente de la misma, p, ej., donde se reemplaza uno o más aminoácidos por otro(s) aminoácido(s) o no aminoácido(s), que no afecta(n) significativamente la inducción o el refuerzo de una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu (p. ej., la variante estimula una respuesta por medio de los linfocitos T cooperadores o los linfocitos T citotóxicos).
Proliferación de linfocitos T: tal y como se usa en la presente invención, incluye la multiplicación de los linfocitos T así como la estimulación de los linfocitos T que conducen a la multiplicación, a saber, el inicio de acontecimientos que conducen a la mitosis y la misma mitosis. Los métodos para detectar la proliferación de los linfocitos T se discuten más adelante.
Como se observó anteriormente, la presente invención está dirigida hacia compuestos y composiciones para inducir o reforzar la inmunidad al producto proteico expresado por el oncogén de HER-2/neu, incluidas las neoplasias malignas, en un animal de sangre caliente, en el cual un gen de HER-2/neu amplificado está asociado con la neoplasia maligna. La asociación de un gen de HER-2/neu amplificado con una neoplasia maligna no requiere que el producto proteico de la expresión del gen esté presente en el tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión del producto de la expresión proteico puede estar implicada en la iniciación de un tumor, pero, posteriormente, se puede perder la expresión de la proteína. Un uso de la presente invención es inducir o reforzar una respuesta inmunitaria autóctona eficaz para convertir el tumor que expresa HER-2/neu en un tumor que no expresa HER-2/neu.
Más específicamente, la descripción de la presente invención, en un aspecto, demuestra que los linfocitos dependientes del timo (de aquí en adelante, "linfocitos T") pueden reconocer un polipéptido basado en una porción particular (polipéptido de HER-2/neu) del producto de expresión proteico del gen de HER-2/neu y, por lo tanto, se puede utilizar la respuesta inmunitaria autóctona del linfocitos T profilácticamente o para tratar neoplasias malignas, en las que tal proteína está sobreexpresada o se ha sobreexpresado. En otro aspecto, la descripción de la presente invención también demuestra que, para la inmunización, las moléculas de ácidos nucleicos que dirigen la expresión de tal péptido se pueden usar solas o en un vector vírico.
En general, se considera que las poblaciones de linfocitos T CD4+ funcionan como cooperadores/inductores por medio de la liberación de linfocinas cuando un antígeno específico las estimula; no obstante, un subconjunto de linfocitos CD4+ puede actuar como linfocitos T citotóxicos (LTC). Similarmente, se considera que los linfocitos T CD8+ funcionan directamente lisando las dianas antigénicas; sin embargo, en una variedad de circunstancias, pueden secretar linfocinas para proporcionar una función cooperadora o DTH. A pesar del que las funciones se puedan solapar, los marcadores fenotípicos CD4 y CD8 están relacionados con el reconocimiento de los péptidos unidos a los antígenos del CMH de clase I o II. El reconocimiento del antígeno en el contexto del CMH de clase I o II hace que los linfocitos T CD4+ y CD8+ respondan a diferentes antígenos o al mismo antígeno presentado en diferentes circunstancias. La unión de los péptidos inmunógenos a los antígenos del CMH de clase II se produce, más comúnmente, en los antígenos ingeridos por las células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, generalmente, los linfocitos T CD4+ reconocen antígenos que son ajenos a las células tumorales. En cambio, en circunstancias normales, la unión de péptidos al CMH de clase I se produce sólo para las proteínas presentes en el citosol y sintetizadas por la propia diana, de manera que las proteínas en el medio externo quedan descartadas. Una excepción es la unión de péptidos exógenos con un motivo de unión de clase I preciso que se encuentran fuera de la célula en grandes concentraciones. Así, los linfocitos T CD4+ y CD8+ tienen funciones ampliamente diferentes y tienden a reconocer diferentes antígenos como reflejo de donde residen los antígenos normalmente.
Como se describe dentro de la presente invención, los linfocitos T reconocen una porción del polipéptido del producto proteico expresado por el oncogén de HER-2/neu. El polipéptido de HER-2/neu en circulación es degradado a fragmentos peptídicos. Los fragmentos peptídicos del polipéptido se unen a antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Mediante el despliegue de un péptido unido al antígeno del CMH en la superficie celular y el reconocimiento de la combinación del péptido más el antígeno del propio CMH por los linfocitos T del hospedador, el polipéptido de HER-2/neu (incluido el que se expresa en una célula maligna) será inmunógeno para los linfocitos T. La especificidad tan delicada del receptor del linfocito T permite que los linfocitos T individuales discriminen entre los péptidos que difieren en un resto de un sólo aminoácido.
Durante la respuesta inmunitaria a un fragmento peptídico del polipéptido, los linfocitos T que expresan un receptor del linfocito T con una gran afinidad de unión por el complejo péptido-CMH se unirán al complejo péptido-CMH y, por lo tanto, se activarán e inducirán a proliferar. En el primer encuentro con un péptido, unas pequeñas cantidades de linfocitos T inmunes secretarán linfocinas, proliferarán y se diferenciarán en linfocitos T efectores y en linfocitos T de memoria. La respuesta inmunitaria primaria se producirá in vivo aunque ha sido difícil detectarla in vitro. El posterior encuentro del linfocito T de memoria con el mismo antígeno conducirá a una respuesta inmunitaria más rápida e intensa. La respuesta secundaria se producirá in vivo o in vitro. La respuesta in vitro se mide fácilmente calculando el grado de proliferación, el grado de la producción de citocinas o la generación de actividad citolítica de la población de linfocitos T reexpuesta en el antígeno. Se considera que una proliferación significativa de la población de linfocitos T en respuesta a un antígeno particular es indicativa de una exposición previa o de una sensibilización al antígeno.
Por lo general, los compuestos de esta invención comprenden polipéptidos de HER-2/neu o moléculas de ADN que dirigen la expresión de tales péptidos, en los que las moléculas de ADN pueden estar presentes en un vector vírico. Como se observó anteriormente, los polipéptidos de la presente invención incluyen variantes del polipéptido de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255, que conserva la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria. Tales variantes incluyen formas estructurales del polipéptido natural. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, un polipéptido de HER-2/neu puede estar en forma de una sal ácida o básica, o puede estar en forma neutra. Los restos de cada uno de los aminoácidos también se pueden modificar por oxidación o reducción.
Las variantes dentro del alcance de esta invención también incluyen los polipéptidos en los que se modifica la estructura primara de los aminoácidos del polipéptido del HER-2/neu natural al formar conjugados covalentes o en agregación con otros péptidos o polipéptidos, o radicales químicos como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Se pueden preparar derivados covalentes, por ejemplo, uniendo determinados grupos funcionales a cadenas laterales de aminoácidos o al extremo amino o al extremo carboxilo.
La presente invención también incluye los polipéptidos de HER-2/neu con o sin glucosilación. Los polipéptidos expresados en los sistemas de expresión de la levadura o de los mamíferos pueden ser similares o ligeramente diferentes en la masa molecular y el patrón de glucosilación que las moléculas naturales, según el sistema de expresión. Por ejemplo, la expresión en bacterias como E. coli de ADN que codifique polipéptidos normalmente proporciona unas moléculas sin glucosilar. Los sitios de la N-glucosilación de las proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z_{1}, en el que A_{1} es cualquier aminoácido salvo Pro y Z_{1} es Ser o Thr. Las variantes de los polipéptidos de HER-2/neu, que tienen sitios de N-glucosilación inactivados, se pueden producir por técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como las técnicas de síntesis y ligación de oligonucleótidos o de mutagénesis específica de sitio, y se encuentra dentro del alcance de esta invención. Alternativamente, los sitios de N-glucosilación se pueden añadir al polipéptido de HER-2/neu.
Los polipéptidos de esta invención también incluyen variantes del polipéptido de la SEQ ID nº. 2 (a saber, variantes de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 a partir del aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255) que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de esta secuencia, debido a una o más deleciones, inserciones, sustituciones u otras modificaciones. En una realización, tales variantes son considerablemente homólogas al polipéptido natural de HER-2/neu y conservan la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria. "Homología considerable", como se usa en la presente invención, se refiere a secuencias de aminoácidos que pueden estar codificadas por secuencias de ADN, que pueden hibridarse en condiciones moderadamente rigurosas para una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ADN que se produce naturalmente y que codifica la porción del polipéptido especificada de la SEQ ID nº. 2 descrita en la presente invención (a saber, los nucleótidos 2026 a 3765 de la SEQ ID nº. 1). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen el prelavado en una disolución de SSC 5X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH8,0); la hibridación a 50ºC-65ºC en SSC 5 X durante una noche; seguida de dos lavados a 65ºC durante 20 minutos, cada uno con SSC 2X, 0,5X y 0,2X (que contienen SDS al 0,1%). Tales secuencias de ADN que hibriden también se encuentran dentro del alcance de esta invención. Se puede determinar, fácilmente, el efecto de cualquier modificación por la capacidad de un polipéptido de HER-2/neu para producir una respuesta inmunitaria (p. ej., analizando la capacidad del polipéptido de HER-2/neu mutado para inducir una respuesta de linfocitos T mediante, por ejemplo, los métodos descritos en la presente invención).
Generalmente, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos por diversos modos para proporcionar otras realizaciones de variantes dentro de la presente invención. Primero, por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos de manera conservativa; a saber, un aminoácido sustitutivo reemplaza un aminoácido que tiene unas propiedades similares, de tal manera que el experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambiasen de manera significativa. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservativos: 1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; 2) cys, ser, tyr, thr; 3) val, ile, leu, met, ala, phe; 4) lys, arg, his; y 5) phe, tyr, trp, his. Un ejemplo de un cambio no conservativo es reemplazar un aminoácido de un grupo con un aminoácido de otro grupo.
Otro modo de realizar sustituciones de aminoácidos para producir variantes de la presente invención es identificar y reemplazar aminoácidos en los motivos de los linfocitos T que sirven para unirse a las moléculas del CMH de clase II (para la respuesta de los linfocitos T CD4+) o a moléculas del CMH de clase I (para la respuesta de los linfocitos T CD8+). Los segmentos peptídicos (de un polipéptido de HER-2/neu) con un motivo con la capacidad teórica de unirse a las moléculas del CMH de clase II se pueden identificar por análisis informático. Por ejemplo, se puede usar un paquete de análisis de secuencias de proteínas, el T Sites, que incorpora varios algoritmos informáticos diseñados para distinguir potenciales sitios para el reconocimiento de los linfocitos T (Feller y de la Cruz, Nature, 349: 720-721, 1991). Se usan dos algoritmos de búsqueda: 1) el algoritmo AMPHI descrito por Margalit (Feller y de la Cruz, Nature, 349: 720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213-2229, 1987) identifica motivos de epítopos según la periodicidad alfa-helicoidal y la anfipatía; 2) el algoritmo de Rothbard y Taylor identifica motivos de epítopos según la distribución de las cargas y la polaridad (Rothbard y Taylor, EMBO 7: 93-100, 1988). Los segmentos con ambos motivos son más apropiados para unirse a moléculas del CMH de clase II. Los linfocitos T CD8+ reconocen los péptidos unidos a las moléculas del CMH de clase I. Falk et al han determinado que los péptidos que se unen a unas determinadas moléculas del CMH comparten unos motivos de secuencia perceptibles (Falk et al., Nature, 351:290-296, 1991). Con la degradación de Edman de los péptidos despojados de las moléculas de HLA-A2.1 de una estirpe celular cultivada se ha definido un motivo peptídico para la unión en el surco del HLA-A2.1 (tabla 2, de Falk et al., véase más arriba). El método identificó el péptido de unión a HLA-A2.1 típico o promedio, que es de 9 aminoácidos de longitud con unos restos de anclaje dominantes que se producen en las posiciones 2 (L) y 9 (V). Se han identificado restos de fuerte unión que se producen comúnmente en las posiciones 2 (M), 4 (E,K), 6 (V) y 8 (K). El motivo identificado constituye el promedio de muchos péptidos de unión.
El motivo de restricción de HLA-A2.1
Posición de los aminoácidos Asignación de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 puntos
Resto dominante L V +3
del anclaje de la
unión
Resto de fuerte M E V K +2
unión K
Resto de unión I A G I I A E L +1
débil L Y P K L Y S
F F D Y T H
K P T N
M M G
Y S V
H
El motivo peptídico obtenido que se ha definido actualmente no es particularmente riguroso. Algunos péptidos de unión de HLA-A2.1 no contienen ambos restos de anclaje dominante y los aminoácidos que flanquean los restos de anclaje dominante desempeñan papeles muy importantes al permitir o impedir la unión. No se unirán todos los péptidos con el motivo de unión antes descrito y se unirán algunos péptidos sin dicho motivo. Sin embargo, el motivo actual es lo suficientemente válido como para permitir la identificación de algunos péptidos capaces de unirse. Cabe observar que el motivo actual de HLA-A2.1 coloca 6 aminoácidos entre los aminoácidos de anclaje dominante en los restos 2 y 9.
Después de identificar los motivos peptídicos dentro de un polipéptido de HER-2/neu, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos de manera conservativa o no conservativa. El último tipo de sustituciones pretenden producir un polipéptido mejorado que es más potente y/o que reaccione cruzadamente con más facilidad (polimorfismo del CMH). Un ejemplo de un polipéptido más potente es el que se une con una mayor afinidad a la molécula del mismo CMH como un polipéptido natural, sin afectar al reconocimiento del polipéptido natural por los linfocitos T. Un ejemplo de un polipéptido con una reactividad cruzada más amplia es el que induce unas respuestas inmunitarias cruzadas más ampliamente (a saber, se une a un mayor abanico de moléculas del CMH) que el polipéptido natural. Similarmente, se puede sustituir de manera conservativa o no conservativa uno o más aminoácidos que residan entre los motivos peptídicos y que tengan una función espaciadora (p. ej., no interaccionan con una molécula del CMH o con el receptor de los linfocitos T). A los expertos en la técnica les resultará evidente que se pueden probar las interacciones inmunológicas beneficiosas o adversas de los polipéptidos que contienen sustituciones de uno o más aminoácidos por medio de diversos ensayos, incluidos aquéllos descritos en la presente invención para la capacidad de estimular el reconocimiento por los linfocitos T.
Las variantes dentro del alcance de esta invención pueden contener también, o alternativamente, otras modificaciones, incluidas la deleción o adición de aminoácidos, que influyan mínimamente sobre las propiedades inmunológicas deseables del polipéptido. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar las formas truncadas o las formas extendidas no naturales de un polipéptido de HER-2/neu, siempre que las propiedades inmunológicas deseadas sean, al menos, aproximadamente equivalentes a las del polipéptido natural de HER-2/neu completo. Los restos de cisteína se pueden eliminar o reemplazar por otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes de disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Otros enfoques para la mutagénesis implican la modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para mejorar la expresión en los sistemas de levadura en los que haya actividad de la proteasa KEX2.
Por lo general, se puede obtener un polipéptido de HER-2/neu usando un clon genómico o de ADNc que codifica la proteína. En la SEQ ID nº. 1 se muestra una secuencia genómica que codifica el HER-2/neu completo, y en la SEQ ID nº. 2 se presenta la secuencia de aminoácidos deducida. Se pueden aislar tales clones rastreando una genoteca de expresión adecuada en busca de clones que expresan la proteína HER-2/neu. Generalmente, la preparación y la detección de la genoteca se pueden llevar a cabo mediante los métodos que conocen los expertos en la técnica, tal que los métodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, que se incorpora en la presente invención mediante referencia. Brevemente, se puede sembrar en placas una genoteca de expresión en bacteriófagos y transferirse a filtros. Luego, los filtros se pueden incubar con un reactivo de detección. En el contexto de esta invención, un "reactivo de detección" es cualquier compuesto capaz de unirse a la proteína HER-2/neu que, luego, se puede detectar por medio de uno cualquiera de los métodos que los expertos en la técnica conocen. Los reactivos de deleción típicos contienen un "agente de unión", tales como la proteína A, la proteína G, la IgG o una lectina, acoplado a un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. Más preferiblemente, el grupo indicador es la peroxidasa de rábano, que se puede detectar al incubarla con un sustrato como tetrametilbencidina o ácido 2,2'-azino-di-3-etil-benzotiazolina sulfónico. Las placas que contienen secuencias genómicas o de ADNc que expresan la proteína HER-2/neu se aislan y se purifican por medio de técnicas que conocen los expertos en la técnica. Se pueden encontrar métodos adecuados, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.
Generalmente, se pueden identificar las variantes del polipéptido que conservan la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria al modificar la secuencia en uno o más de los aspectos descritos anteriormente y analizando la capacidad del polipéptido resultante de estimular una respuesta inmunitaria, p, ej., una respuesta de linfocitos T. Por ejemplo, generalmente, se pueden realizar tales ensayos haciendo contactar los linfocitos T con el polipéptido modificado y analizando la respuesta. También se pueden aislar las variantes del polipéptido que se producen naturalmente mediante, por ejemplo, el rastreo de una genoteca genómica o de ADNc adecuada con una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o una variante del mismo.
Las modificaciones de la secuencia descritas anteriormente se pueden introducir mediante las técnicas recombinantes estándares o mediante síntesis automática del polipéptido modificado. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir en varios locus determinados mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante flanqueados por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción del aminoácido deseado.
Alternativamente, se pueden utilizar procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen, en el que se alteran determinados codones según la sustitución, deleción o inserción requerida. Métodos ejemplares para realizar las alteraciones presentadas anteriormente se describen en Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37: 73, 1985; Craik, BioTechniques, Enero 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; y las patentes de los EEUU nº. 4 518 584 y nº. 4 737 462.
Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para expresar los péptidos de HER-2/neu deben, por supuesto, conservar el marco de lectura de las secuencias codificantes y, preferiblemente, no crearán unas regiones complementarias que podrían hibridarse para producir estructuras secundarias en el ARNm, tales como bucles u horquillas, que afectarían de manera adversa la traducción del ARNm. Aunque se puede predeterminar un sitio de mutación, no es necesario que la naturaleza de la mutación esté predeterminada per se. Por ejemplo, para seleccionar unas características óptimas de mutantes en un sitio determinado, se puede realizar una mutagénesis al azar en el codón diana, y en los mutantes expresados del polipéptido de HER-2/neu se rastrea la actividad deseada.
No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de HER-2/neu se expresarán en el producto final. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos para mejorar la expresión, principalmente para evitar unos bucles de estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase, p. ej., la solicitud de la patente europea EP 75 444A), o para proporcionar unos codones que el huésped seleccionado traduzca más rápidamente, tal como los codones preferidos conocidos de E. coli para la expresión en E. coli.
Los polipéptidos de la presente invención, tanto los que se producen naturalmente como los modificados, se producen preferiblemente por los métodos de ADN recombinante. Tales métodos incluyen introducir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de HER-2/neu en un vector de expresión recombinante y expresar la secuencia de ADN en un sistema de expresión celular recombinante en microorganismos, mamíferos o insectos, en unas condiciones que favorecen la expresión. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos proporcionados por esta invención se pueden reunir a partir de los fragmentos de ADNc y de conectores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que se puede introducir en un vector de expresión recombinante y expresar en una unidad transcripcional recombinante.
Los vectores de expresión recombinantes contienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de HER-2/neu operativamente unido a unos elementos reguladores adecuados transcripcionales o traduccionales, derivados de genes de mamíferos, microorganismos, virus o insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión ribosómicos adecuados en el ARNm y secuencias que controlar la terminación de la transcripción y la traducción. Adicionalmente, se puede incorporar un origen de replicación y un marcador de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
Las regiones del ADN están operativamente unidas cuando están relacionadas funcionalmente unas a otras. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si se coloca de manera que permita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa contiguo y, en el caso de los líderes secretores, en el marco de lectura. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de HER-2/neu que deben expresarse en un microorganismo no contendrán, preferiblemente, intrones que terminarían, prematuramente, la transcripción del ADN a ARNm.
Los vectores de expresión para uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen bacteriano de replicación derivado de los plásmidos disponibles comercialmente que comprendan elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Estas secciones "vertebrales" del pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural a expresar. Normalmente, E. coli se transforma usando derivados del pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene, 2:95, 1977). El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y, así, proporciona unos medios sencillos para identificar células transformadas.
Los promotores usados comúnmente en los vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema del promotor de la \beta-lactamasa (penicilina) y la lactosa (Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema del promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980); y la solicitud de patente europea EP 36 776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor termolábil cl857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la American Type Culture Collection, que incorporan derivados del promotor P_{L} de \lambda, incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092), y el plásmido pPLc28, residente en de E. coli RR1 (ATCC 53082).
Las secuencias del promotor adecuadas en los vectores de levadura incluyen los promotores para la metalotioneína, la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosa-fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Además, se describen vectores y promotores adecuados para usarse en la expresión en la levadura en R. Hitzeman et al, solicitud de patente europea EP 73 657.
Se pueden reunir los vectores de levadura preferidos usando las secuencias de ADN de pBR322, para la selección y la replicación en E. coli (el gen de Amp^{r} y el origen de replicación) y secuencias de ADN de levadura que incluyan un promotor ADH2 reprimible por glucosa y el líder de secreción del factor a. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russel et al (j. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor a de la levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, se puede introducir entre el promotor y el gen estructural a expresar (véase, p. ej., Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984). Se puede modificar la secuencia del líder para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder con genes extraños. Las secuencias de control transcripcional y traduccional en los vectores de expresión a usar para transformar las células de vertebrados se pueden proporcionar por fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores usados comúnmente se derivan del polioma, del adenovirus 2, del virus de simio 40 (SV40) y del citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN obtenidas del genoma vírico del SV40, por ejemplo, los sitios del SV40 de origen de replicación, promotores temprano y tardío, potenciador, ayuste y poliadenilación, se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos requeridos para expresar una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores tempranos y tardíos son particularmente útiles porque se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación del virus SV40 (Fiers et al., Nature, 273: 113, 1978). También se pueden utilizar fragmentos menores o mayores de SV40, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende del sitio HindIII hasta el sitio BglII localizado en el origen de replicación del virus. Además, se pueden utilizar el promotor genómico del virus y las secuencias de control y/o señal, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora elegida. Se pueden construir vectores ejemplares como se describe en Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983.
Se puede construir un sistema útil para la expresión estable en gran cantidad de los ADNc del receptor de mamíferos en las células epiteliales de mama murinas de C127 como describen Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) esencialmente. Un vector eucariótico preferido para la expresión del ADN de la proteína LbelF4A es el pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) e incluye unas secuencias reguladoras derivadas del SV40, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de Epstein-Barr (VEB). Otros vectores preferidos incluyen el pDC409 y el pDC410, que se derivan del pDC406. El pDC410 se derivó del pDC406 el sustituir el origen de replicación del VEB por las secuencias que codifican el antígeno T grande del SV40. El pDC409 difiere del pDC406 en que se ha eliminado el sitio de restricción BglII que está fuera del sitio de clonación múltiple, lo que convierte en único al sitio BglII dentro del sitio de clonación múltiple.
La CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) es una estirpe celular útil que permite la replicación episómica de los vectores de expresión, como el pDC406 y el pDC409, que contienen el origen de replicación del VEB. La estirpe celular CV-L/EBNA se derivó por transfección de la estirpe celular CV-1, con un gen que codificaba el antígeno I nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y que expresa de manera constitutiva el EBNA-1 gracias al potenciador/promotor inmediato-temprano del CMV humano.
Las células transformadas del huésped son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos mediante técnicas de ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican un polipéptido de HER-2/neu de la presente invención. Las células transformadas del huésped pueden expresar el polipéptido deseado de HER-2/neu, pero las células transformadas del huésped con el propósito de clonar o amplificar el ADN de HER-2/neu no necesitan expresar el polipéptido de HER-2/neu. Los polipéptidos expresados se secretarán, preferiblemente, en el sobrenadante del cultivo, según el ADN seleccionado, pero también se pueden depositar en la membrana celular.
Las células del huésped adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes incluyen procariotas, levadura o células de eucariotas superiores bajo el control de los promotores adecuados. Los procariotas incluyen los organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, E. coli o diversos Bacillus. Las células de los eucariotas superiores incluyen estirpes celulares establecidas de insectos o mamíferos, como se describe más adelante. También se pueden utilizar sistemas de traducción acelular para producir polipéptidos HER-2/neu mediante los ARN derivados a partir de construcciones de ADN. Se describen vectores adecuados de clonación y expresión para usar con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamíferos, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985.
Se pueden utilizar huéspedes de expresión procarióticos para la expresión de polipéptidos de HER-2/neu, que no requieren un procesamiento extenso proteolítico ni de formación de disulfuros. Por lo general, los vectores de expresión procarióticos comprenden uno o más marcadores de selección fenotípicos, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confieren resistencia a los antibióticos o que suministran un requisito autótrofo, y un origen de replicación que el huésped reconoce para asegurar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden utilizar otros huéspedes.
Los polipéptidos recombinantes de HER-2/neu también se pueden expresar en huéspedes de levadura, preferiblemente de especies de Saccharomyces, como S. cerevisiae. También se puede utilizar levaduras de otros géneros, como Pichia o Kluyveromyces. Generalmente, los vectores de levadura contendrán un origen de replicación del plásmido 2 \mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, un ADN que codifica el polipéptido de HER-2/neu, secuencias para la poliadenilación y la terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levadura incluirán un origen de replicación y un marcador de selección que permita la transformación de la levadura y E. coli, p, ej., el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de proliferar en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura muy expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural hacia 3'. Luego, la presencia de lesión del trp1 en el genoma celular de la levadura huésped proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por medio de la proliferación en ausencia de triptófano.
Los expertos en la técnica conocen los protocolos adecuados para transformar levaduras. Una técnica ejemplar descrita por Hind et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978) implica seleccionar transformantes Trp^{+} en un medio selectivo que consiste en una base nitrogenada de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina a 10 mg/ml y uracilo a 20 g/ml. Se pueden cultivar para expresar las cepas hospedadoras transformadas con los vectores que comprenden el promotor ADH2, en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% complementado con adenina a 80 mg/ml y uracilo a 80 mg/ml. La pérdida de la represión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura brutos se recogen por filtración y se mantienen a 4ºC antes de una purificación posterior.
También se pueden utilizar varios sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos (p. ej., Spodoptera o Trichoplusia) para expresar un polipéptido recombinante. Los sistemas del baculovirus para la producción de polipéptidos heterólogos en células de insectos se revisan, por ejemplo, en Luckow y Summers, Biol Technology 6: 47, 1988. Ejemplos de estirpes celulares adecuadas hospedadoras de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de células de riñón de mono, descritas en Gluzman (Cell 23: 175, 1981) y otras estirpes celulares capaces de expresar un vector apropiado, incluidas, por ejemplo, las estirpes celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, ET3, de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa y celulares BHK. Los vectores de expresión en mamíferos pueden comprender elementos no trascritos como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unidos al gen a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3' y secuencias no traducidas en 5' o 3', como los sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donante y receptor del ayuste, y secuencias de terminación de la transcripción.
Se pueden preparar polipéptidos purificados de HER-2/neu cultivando los sistemas huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los ADN de la presente invención que, luego, se purifican de los medios de cultivo o de los extractos de células. Por ejemplo, se pueden concentrar los sobrenadantes de sistemas, que segregan el polipéptido recombinante en medios de cultivo, usando primero un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, como una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una proteína de estructura complementaria (a saber, una proteína a la que se une un polipéptido de HER-2/neu de forma específica en base a la estructura) o una lectina o una molécula de anticuerpo unidas a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tenga expuestos grupos de dietil-aminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente utilizados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración en gel también proporciona un medio para purificar HER-2/neu.
La cromatografía de afinidad es un método preferido para purificar polipéptidos de HER-2/neu. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra el polipéptido de HER-2/neu también pueden ser útiles en la purificación por cromatografía de afinidad, mediante el uso de unos métodos que se conocen bien en la técnica.
Finalmente, se puede utilizar una o más etapas de cromatografía líquida de gran resolución en fase inversa (RP-HPLC), utilizando unos medios de RP-HPLC hidrófobos (p, ej., gel de sílice que tenga expuesto un metilo u otros grupos alifáticos), para purificar adicionalmente una composición del polipéptido de HER-2/neu. También se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, para proporcionar un polipéptido recombinante homogéneo.
El polipéptido recombinante de HER-2/neu producido en un cultivo bacteriano se aísla, preferiblemente, por extracción inicial de los sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, precipitación con sal, intercambio acuoso de iones o cromatografía de exclusión por tamaños. Se puede utilizar la cromatografía líquida de gran resolución (HPLC) para las últimas etapas de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína recombinante LbeIF4A se pueden lisar por cualquier método conveniente, incluidos los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de la levadura que expresa el polipéptido de HER-2/neu como una proteína secretada simplifica enormemente la purificación. La proteína recombinante secretada, que es resultado de una fermentación a gran escala, se puede purificar por métodos análogos a los descritos en Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos etapas de HPLC en fase inversa secuenciales para purificar el GM-CSF humano recombinante en una columna preparativa de HPLC.
Las preparaciones de los polipéptidos HER-2/neu sintetizados en un cultivo recombinante pueden contener componentes celulares que no son de HER-2/neu, incluidas proteínas, en unas cantidades y que dependen de las etapas de purificación llevadas a cabo para recuperar el polipéptido de HER-2/neu del cultivo. Ordinariamente, estos componentes serán de procedencia de levadura, procariótica o eucariótica no humana. Típicamente, tales preparaciones están libres de otras proteínas que se puedan asociar normalmente a la proteína HER-2/neu que se encuentra en la naturaleza en su especie de origen.
La síntesis automática proporciona un método alternativo para preparar los polipéptidos de esta invención. Por ejemplo, se puede emplear cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963). El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible comercialmente de proveedores como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, CA (EEUU) y, por lo general, se pueden manejar según las instrucciones del fabricante.
Dentro de un aspecto de la presente invención, se puede detectar el uso de un polipéptido de HER-2/neu (o una molécula de ADN que dirige la expresión de tal péptido) para generar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu (incluida la expresada en una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu). Los ejemplos representativos de tales neoplasias malignas incluyen el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el carcinoma broncopulmonar y el cáncer de próstata. Una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, una vez generada por un polipéptido de HER-2/neu, puede ser duradera y se puede detectar mucho después de la inmunización, independientemente de si la proteína está presente o ausente en el cuerpo durante las pruebas. Se puede detectar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, generada por la reacción a un polipéptido de HER-2/neu al examinar la presencia o ausencia, o refuerzo, de la activación específica de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+}. Más específicamente, los linfocitos T aislados de un individuo inmunizado por técnicas rutinarias (como la centrifugación de los linfocitos de la sangre periférica en un gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque) se incuban con la proteína HER-2/neu. Por ejemplo, se pueden incubar los linfocitos T in vitro durante 2 a 9 días (normalmente, 4 días) a 37ºC con la proteína HER-2/neu (normalmente, 5 \mug/ml de la proteína entera o cantidades graduales de células que sintetizan la proteína HER-2/neu). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de linfocitos T en ausencia de la proteína HER-2/neu para servir como un control.
Se puede detectar la activación específica de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} de diversos modos. Los métodos para detectar la activación específica de los linfocitos T incluyen detectar la proliferación de los linfocitos T, la producción de citocinas (p. ej., linfocinas) o la generación de actividad citolítica (a saber, la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de la proteína HER-2/neu). Para los linfocitos T CD4^{+}, un método preferido para detectar la activación específica de los linfocitos T es la detección de la proliferación de los linfocitos T. Para los linfocitos T CD8^{+}, un método preferido para detectar la activación específica de los linfocitos T es la detección de la generación de una actividad citolítica.
La detección de la proliferación de los linfocitos T se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede detectar la proliferación de los linfocitos T midiendo la tasa de síntesis del ADN. Los linfocitos T que se han estimulado para que proliferen muestran un aumento de la tasa de la síntesis de ADN. Un modo típico para medir la tasa de síntesis del ADN es, por ejemplo, mediante cultivos de linfocitos T con marcación por pulsos con timidina tritiada, un precursor nucleosídico que se incorpora en el ADN recién sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada se puede determinar usando un espectrofotómetro de centelleo líquido. Otros modos para detectar la proliferación de linfocitos T incluyen medir los aumentos en la producción de la interleucina-2 (IL-2), el flujo de Ca^{2+} o la absorción de un colorante, como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio. Alternativamente, se puede medir la síntesis de las linfocinas (como el interferón gamma) o se puede cuantificar el número relativo de linfocitos T que son capaces de responder a la proteína intacta p185^{HER-2/neu}.
Con el uso o la expresión de un polipéptido de HER-2/neu, se puede hacer proliferar in vivo a los linfocitos T que reconocen la proteína HER-2/neu. Por ejemplo, un medicamento para la inmunización con un péptido de HER-2/neu (a saber, como una vacuna) puede inducir una expansión continua del número de linfocitos T necesarios para el ataque terapéutico contra un tumor al que está asociado el oncogén HER-2/neu. Normalmente, se administrarán desde aproximadamente 0,01 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por vía intradérmica, subcutánea o intravenosa. Una dosis preferida es desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, con una dosis particularmente preferida desde aproximadamente 5 \mug/kg hasta aproximadamente 200 \mug/kg. Para los expertos en la técnica, será evidente que el número y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente. Puede ser deseable administrar el polipéptido de HER-2/neu repetitivamente. A los expertos en la técnica les resultará evidente que se puede administrar más de un polipéptido de HER-2/neu, tanto simultánea como secuencialmente. Los péptidos preferidos para usar en un medicamento para inmunización son los que incluyen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 que comienza cerca del resto de lisina en la posición del aminoácido 676 y se extiende hasta cerca del resto de valina en la posición del aminoácido 1255. Los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención contempla el uso de un polipéptido intacto HER-2/neu así como la división de tal polipéptido en un gran número de péptidos. No se usan solos para la inmunización ni una proteína intacta p185^{HER-2/neu} ni un péptido que tenga la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular completo (a saber, un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde la posición del aminoácido 1 hasta la posición del aminoácido 650, con un margen de más o menos cinco posiciones, y con o sin los primeros 21 aminoácidos).
Un polipéptido de HER-2/neu (o ácido nucleico) se formula, preferiblemente, para usarlo en los métodos anteriores como una composición farmacéutica (p. ej., vacuna). Generalmente, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más polipéptidos en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos no serán tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas. También se contempla el uso de un polipéptido de HER-2/neu junto con fármacos quimioterápicos.
Además del polipéptido de HER-2/neu (que funciona como un antígeno), puede ser deseable incluir otros componentes en la vacuna, como un vehículo para la administración del antígeno y las sustancias inmunoestimuladoras diseñadas para reforzar la inmunogenia de la proteína. Ejemplos de vehículos para la administración del antígeno incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradable, emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables y liposomas. Ejemplos de sustancias inmunoestimuladoras (adyuvantes) incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), lipopolil-sacáridos (LPS), glucano, IL-2, GM-CSF, interferón gamma e IL-15. A los expertos en esta técnica les resultará evidente que se puede preparar sintéticamente un polipéptido de HER-2/neu para una vacuna u obtenerlo naturalmente.
Mientras que se puede emplear cualquier excipiente adecuado que conozcan los expertos en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo del excipiente variará dependiendo del modo de administración y de si se desea una liberación sostenida. Para la administración parenteral, como una inyección subcutánea, el excipiente comprende, preferiblemente, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los excipientes anteriores o un excipiente sólido, como manitol, lactosa, almidón, estereato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear las microesferas biodegradables (p. ej., galáctido poliláctico) como excipientes para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de los EEUU nº. 4 897 268 y 5 075 109. Se puede encapsular un polipéptido de HER-2/neu dentro de la microesfera biodegradable o se puede asociar a la superficie de la microesfera. Por ejemplo, en una realización preferida, se encapsula un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255 dentro de una microesfera biodegradable. Respeto a esto, es preferible que la microesfera mida más de unos 25 \mum.
Las composiciones farmacéuticas (incluidas las vacunas) también pueden contener diluyentes como los tampones, antioxidantes como el ácido ascórbico, polipéptidos de baja masa molecular (menos de unos 10 restos), proteínas, aminoácidos, glúcidos incluidos la glucosa, la sacarosa o las dextrinas, quelantes como el EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. Son diluyentes ejemplares apropiados una solución salina tamponada neutra o una solución salina mezclada con albúmina de suero inespecífica. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando unas disoluciones de excipiente adecuadas (p, ej, sacarosa) como diluyentes.
Como una alternativa a la presentación de los polipéptidos de HER-2/neu, el objeto de la invención incluye las composiciones capaces de administrar unas moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de HER-2/neu. Tales composiciones incluyen vectores víricos recombinantes [p. ej., retrovirus (véanse, las patentes internacionales WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 y WO 94/03622), adenovirus (véase Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene. Ther. 4: 403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134, 1993; y Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 215-219, 1994), virus de la varicela (véanse las patentes de los EEUU nº. 4 769 330, nº. 5 017 587 y la patente internacional WO 89/01973)], ADN desnudo (véase la patente internacional WO 90/11092), molécula de ácido nucleico complejada a una molécula policatiónica (véase la patente internacional WO 93/03709) y ácido nucleico asociado a liposomas (véase Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). En determinadas realizaciones, el ADN puede estar unido a un adenovirus muerto o inactivado (véase Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Otras composiciones adecuadas incluyen combinaciones ADN-ligando (véase Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989) y lípido-ADN (véase Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989). Además, se puede aumentar la eficacia de la captación del ADN desnudo en las células recubriendo el ADN en perlas biodegradables.
Además de los procedimientos directos in vivo, se pueden utilizar procedimientos ex vivo en los que se retiran células de un animal, se modifican y se colocan en el mismo u otro animal. Resultará evidente que uno puede utilizar cualquiera de las composiciones anotadas anteriormente para introducir moléculas de ácido nucleico de HER-2/neu en células de tejidos en un contexto ex vivo. En la técnica se conocen bien los protocolos para los métodos víricos, físicos y químicos de captación.
En consecuencia, la presente invención es útil para reforzar o inducir, en un paciente o cultivo celular, una respuesta inmunitaria celular (p. ej., la generación de linfocitos T citolíticos específicos del antígeno). Como se usa en la presente invención, el término "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede padecer cáncer, como un cáncer de mama, o estar normal (a saber, sin una enfermedad o infección detectable). Un "cultivo celular" es cualquier preparación de linfocitos T o de células de un componente aislado (incluidos macrófagos, monocitos, linfocitos B y células dendríticas, pero sin limitarse a ellas). Se pueden aislar tales células mediante cualquiera de una variedad de técnicas que los expertos en la técnica conocen bien (como la centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque). Las células se pueden haber aislado (aunque no es necesario) de un paciente que padece una neoplasia maligna asociada a HER-2/neu, y se pueden reintroducir en un paciente después del tratamiento.
La presente invención también describe que el polipéptido de HER-2/neu, además de ser inmunógeno para los linfocitos T, parece estimular los linfocitos B para producir anticuerpos capaces de reconocer el polipéptido de HER-2/neu. Se pueden encontrar anticuerpos específicos (a saber, que muestran una afinidad de unión de aproximadamente 10^{7} litros/mol o mejor) para la proteína HER-2/neu en una variedad de líquidos corporales incluidos los sueros y la ascitis. Brevemente, se aísla una muestra de líquido corporal de un animal de sangre caliente, como un humano, de quien se desea determinar si hay presentes anticuerpos específicos contra el polipéptido de HER-2/neu. Se incuba el líquido corporal con el polipéptido de HER-2/neu en unas condiciones y con un tiempo suficientes como para permitir formar inmunocomplejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos contra la proteína. Por ejemplo, se puede incubar un líquido corporal y un polipéptido de HER-2/neu a 4ºC durante 24 a 48 horas. Después de la incubación, se analiza la presencia de los inmunocomplejos en la mezcla de reacción. La detección de uno o más inmunocomplejos formados entre el polipéptido de HER-2/neu y los anticuerpos específicos contra el polipéptido de HER-2/neu se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas, como los radioinmunoensayos (RIA) y los inmunoensayos enzimáticos ligados a enzimas (ELISA).
Los inmunoensayos adecuados incluyen la técnica del inmunoensayo intercalado con un anticuerpo monoclonal doble de David et al. (patente de los EEUU nº. 4 376 110); ensayos intercalados con anticuerpos monoclonal-policlonales (Wide et al., in Kirkham y Hunter, eds. Radioimmunoassay Methods, E y S. Livingstone, Edinburgo, 1970); el método de "inmunotransferencia Western" de Gordon et al. (patente de los EEUU nº. 4 452 901); la inmunoprecipitación del ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem. 255: 4980-4983, 1980); inmunoensayos enzimáticos ligados a enzimas como los descritos, por ejemplo, por Raines y Ross (J. Biol. Chem. 257: 5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, incluido el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39: 477, 1980); y la neutralización de la actividad [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2396-2400 (1984)], todos los cuales se incorporan en la presente invención por referencia. Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, están disponibles otra serie de inmunoensayos, incluidos los descritos en las patentes de los EEUU nº. 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 y 4 098 876, que se incorporan en la presente invención por referencia.
Para propósitos de detección, el polipéptido de HER-2/neu ("antígeno") puede estar marcado o sin marcar. Cuando está sin marcar, el antígeno se usa en los ensayos de aglutinación. Además, se puede usar un antígeno sin marcar en combinación con moléculas marcadas que reaccionan con los inmunocomplejos, o en combinación con anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que reaccionan con el anticuerpo dirigido contra el polipéptido de HER-2/neu, como anticuerpos específicos para la inmunoglobulina. Alternativamente, se puede marcar directamente el antígeno. Cuando está marcado, el grupo indicador puede incluir radioisótopos, fluoróforos, enzimas, sustancias luminiscentes o partículas colorantes. Estas y otras marcas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes patentes de los EEUU: 3 766 162, 3 791 932, 3 817 837, 3 996 345 y 4 233 402.
Normalmente, en un ensayo de ELISA, el antígeno se absorbe a la superficie de un pocillo de microvaloración. Luego, se bloquean los sitios de unión a la proteína residuales en la superficie con un agente apropiado, como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal (SCN) inactivado por calor o BLOTTO (una disolución tamponada de leche en polvo desnatada que también contiene un conservante, sales y un antiespumante). Luego, se incuba el pocillo con una muestra de la que se sospecha que contiene el anticuerpo específico. La muestra se puede aplicar tal cual o, más a menudo, se puede diluir, normalmente en una disolución tamponada que contiene una pequeña cantidad (de 0,1% al 5,0% en peso) de proteína, como BSA, SCN o BLOTTO. Después de incubar durante suficiente tiempo como para permitir que se produzca una unión específica, se lava el pocillo para retirar la proteína sin unir y, luego, se incuba con un anticuerpo de inmunoglobulina específico de especie marcado con un grupo indicador. El grupo indicador se puede escoger entre un conjunto de enzimas, incluidas la peroxidasa de rábano, la beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa. Se deja tiempo suficiente para que se produzca la unión específica, luego se lava de nuevo el pocillo para retirar el conjugado sin unir, y se añade el sustrato de la enzima. Se deja aparecer el color y se determina, visual o instrumentalmente, la densidad óptica del contenido del pocillo.
En una realización preferida de este aspecto de la presente invención, se une un grupo indicador a la proteína HER-2/neu. La etapa de detectar inmunocomplejos implica retirar sustancialmente cualquier proteína HER-2/neu sin unir y, luego, detectar la presencia o ausencia del grupo indicador.
En otra realización preferida, se une un grupo indicador a un segundo anticuerpo capaz de unirse a los anticuerpos específicos para la proteína HER-2/neu. La etapa de detectar inmunocomplejos implica a) retirar considerablemente cualquier anticuerpo sin unir, b) añadir el segundo anticuerpo, c) retirar considerablemente cualquier segundo anticuerpo sin unir y luego, d) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Cuando se obtiene el anticuerpo específico para la proteína HER-2/neu a partir de un humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo antihumano.
En una tercera realización preferida para detectar inmunocomplejos, se une un grupo indicador a una molécula capaz de unirse a los inmunocomplejos. La etapa de detección implica a) añadir la molécula, b) retirar considerablemente cualquier molécula sin unir y luego, c) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Un ejemplo de una molécula capaz de unirse a los inmunocomplejos es la proteína A.
Al experto en la técnica le resultará evidente que se pueden emplear una variedad de métodos para detectar los inmunocomplejos dentro de la presente invención. Los grupos indicadores adecuados para usar en cualquiera de los métodos incluyen radioisótopos, fluoroforos, enzimas, sustancias luminiscentes y partículas colorantes.
En un aspecto relacionado de la presente invención, se puede utilizar, para controlar la eficacia del tratamiento contra el cáncer, la detección de los inmunocomplejos formados entre el polipéptido de HER-2/neu y los anticuerpos en el líquido corporal que son específicos para el polipéptido de HER-2/neu, que implica un polipéptido de HER-2/neu, en busca de una neoplasia maligna a la que esté asociado el oncogén HER-2/neu. Se pueden analizar, en busca de los inmunocomplejos, las muestras de líquido corporal tomadas de un individuo antes y después del inicio del tratamiento, por medio de las metodologías descritas anteriormente. Brevemente, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio significativo en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (inicio del postratamiento) respecto a la primera muestra (previa al tratamiento) indica un tratamiento
exitoso.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión y purificación del polipéptido de HER-2/neu recombinante humano
Se recuperó el polipéptido de HER-2/neu humano con el método de la PCR (p. ej., las patentes de los EEUU nº. 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159) de un plásmido preparado según Di Fiore et al. (King et al., Science 229: 974-976, 1985; Di Fiore et al., Science 237: 178-182, 1987), mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos que, adicionalmente, introdujeron un sitio de restricción BssHII y un sitio para la proteasa enterocinasa en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3'. El cebador del extremo 5' fue 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3'(SEQ ID nº. 3) mientras que el cebador del extremo 3' fue 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID nº. 4). Se subclonó el fragmento de la PCR de 1,8 kb resultante en el vector T de Novagen (Madison, WI, EEUU) y se determinó la secuencia de los clones seleccionados en el secuenciador de ADN automático ABI 373 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EEUU), usando cebadores de secuenciación solapantes. Luego, los fragmentos de la PCR con la secuencia que correspondía a la secuencia de ADN publicada para el ADNc de HER-2/neu humano (SEQ ID n. 1; Coussens et al., Science 230: 1132, 1985; Yamamoto et al., Nature 319: 230, 1986) se conectaron en el marco de lectura correcto mediante el sitio BssHII con una tiorredoxina reductasa de E. coli modificada. Una etiqueta de afinidad de 6 histidinas empleada para la purificación por afinidad con Ni-NTA de la proteína de fusión expresada se incorporó en el homólogo de fusión con la tiorredoxina reductasa. Este ADNc para la proteína de fusión TrxA-polipéptido de HER-2/neu humano se subclonó en un vector de expresión pET modificado para la expresión en E. coli.
Mientras que la tiorredoxina reductasa se ha descrito que estabiliza y solubiliza otras proteínas heterólogas expresadas en E. coli, no parece ofrecer ninguna ventaja significativa para la expresión del polipéptido del HER-2/neu humano en E. coli. Mientras que una proporción significativa de la proteína de fusión trxA-polipéptido de HER-2/neu era soluble, la mayoría se expresó en cuerpos de inclusión. La proteína de fusión también se sometió a degradación durante la expresión en E. coli. Sin embargo, la presencia del homólogo de fusión de la tiorredoxina reductasa puede estabilizar la proteína durante la purificación. La disponibilidad de los anticuerpos monoclonales contra la tiorredoxina reductasa proporciona un marcador de seguimiento conveniente durante la purificación.
Para purificar el polipéptido humano de HER-2/neu con el homólogo de fusión de la tiorredoxina reductasa, que contenía la etiqueta de afinidad 6XHis, se resuspendió el sedimento de E. coli con inhibidores de proteasas y lisozima, y se sonicó. Se aislaron los cuerpos de inclusión mediante centrifugación y se lavaron 3 veces con desoxicolato, y el último lavado fue durante una noche para retirar el LPS. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en GuHCl para la purificación por Ni. Se eluyó la columna de Ni con imidazol en urea y se dializó contra Tris pH8 a 10 mM. La recuperación del polipéptido de HER-2/neu mediante el uso de este protocolo proporcionó una proteína completa y pura al 80%-95% cuyo principal contaminante era proteína degradada. De 500 ml de fermentación, se recuperaron 20 mg. Resultó que más del 98% era el polipéptido de HER-2/neu. Las técnicas usadas en la presente invención las conocen bien los expertos en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, Nueva York, EEUU.
Ejemplo 2 Las células dendríticas pueden sensibilizar para el polipéptido de HER-2/neu humano A. Generación de cultivos de CD de médula ósea
Se generaron cultivos de CD (células dendríticas) a partir de células CD34+ progenitoras hematopoyéticas (CPH). Se purificaron las células CD34+ a partir de médula ósea de donantes normales, usando el sistema de separación de células Ceprate LC Kit (CellPro, Bothell, WA, EEUU). Se determinó la pureza de las células recuperadas CD34+ con análisis de citometría de flujo, que fue del 80% al 95%. Se cultivaron las células CD34+ en un medio sin suero (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, EEUU) complementado con L-glutamina (584 \mug/l), penicilina (10 IU/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), rGM-CSF humano a 100 ng/ml y rIL-6 humana a 50 ng/ml (Immunex, Seattle, WA, EEUU). Después de 0 a 17 días de cultivo, se recogieron las células y se usaron para fenotipado y ensayos de estimulación de los linfocitos T. Se ha descrito que el GM-CSF solo y en combinación con la IL-4 o el TNF\alpha inducen el desarrollo in vivo de las CD. En experimentos usando KLH y OVA como antígenos para sensibilizar los linfocitos T naturales, el GM-CSF más la IL-6 ofrecieron de manera concordante una estimulación total comparable, pero con un menor ruido de fondo y, así, un mayor índice de estimulación en comparación con el GM-CSF más la IL-4 o el
TNF\alpha.
B. Ensayo de sensibilización de los linfocitos T
Como APC, se usaron CPH CD34+ obtenidos a partir de médula ósea cultivados en un medio sin suero que contenía el GM-CSF y la IL-6 después de un periodo de cultivo de 0 a 17 días. Se determinó la capacidad sensibilizadora de las CD cultivándolas con linfocitos T autógenos sin sensibilizar en presencia o ausencia del polipéptido de HER-2/neu humano (PHNh) recombinante (10 \mug/ml) como antígeno proteico. Se aislaron linfocitos T CD4+ a partir de células mononucleares de la sangre periférica con selección positiva mediante columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Bothell, WA, EEUU). Se seleccionaron los linfocitos T (sin sensibilizar) CD4+ CD45RA+ a partir de los linfocitos T CD4+ con el uso del anticuerpo monoclonal anti-CD45RA que se conjugó directamente a FITC (Immunotech, Westbrook, ME, EEUU), con clasificación por citometría de flujo. Los linfocitos T CD4+ CD45RA+ obtenidos estaban puros al 99%. Se colocaron los cultivos de las CD en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU) a varias concentraciones y se incubaron durante 16 a 18 horas con una concentración final de 10 \mug/ml del PHNh. Se irradiaron (10 Gy) las CD expuestas a un pulso con el antígeno y se les añadieron los linfocitos T CD4+ CD45RA+ (5 x 10^{4} linfocitos por pocillo). Se midió la respuesta proliferativa de los linfocitos T por medio de la captación de [^{3}H]-timidina (1 \muCi por pocillo) añadida en el día 6 durante 16 a 18 horas. Se realizaron ensayos de proliferación en un medio sin suero y sin citocina. Los resultados se muestran en la figura 1. La figura 2 muestra los resultados de las pruebas de los linfocitos T CD4+, de un donante normal, en relación a las respuestas al PHNh. Se obtuvieron unos datos similares con los linfocitos T de nueve de los diez individuos normales.
Ejemplo 3 Ensayo para detectar los precursores de linfocitos poco frecuentes
Se pueden usar tres ensayos para detectar las respuestas de los CD4+: un ensayo de proliferación estándar, un método de detección sistemática de acontecimientos de baja frecuencia y un ensayo de dilución limitante (EDL). Los ensayos de proliferación convencionales son capaces de detectar rápidamente las respuestas sensibilizadoras. El índice de estimulación de la respuesta proliferativa proporciona una correlación a grosso modo con la frecuencia de precursores de los linfocitos T reactivos del antígeno. Se considera que cualquier respuesta proliferativa específica detectada a partir de PBL es una respuesta sensibilizada.
Para proporcionar una interpretación más cuantitativa de las respuestas de los linfocitos T CD4+, se usa el sistema de ensayo desarrollado para detectar respuestas de baja frecuencia del precursor de linfocitos (descrito más adelante). Este ensayo es simple y rentable. En las situaciones en las que se necesita más precisión, se valida la frecuencia del precursor por medio de ensayos de dilución limitante (Bishop y Orosz, Transplantation 47: 671-677, 1989).
Las respuestas mayores que las detectadas en individuos normales se definen como una respuesta sensibilizada e implican una inmunidad existente. Se consideran que las respuestas bajas, detectables sólo mediante condiciones del EDL, son respuestas sin sensibilizar. Se considera que la ausencia de respuesta mediante el EDL o una respuesta menor que la definida por el análisis de poblaciones normales es tolerancia/anergia.
En general, las respuestas sensibilizadoras de los linfocitos T CD4+ se pueden detectar en ensayos proliferativos convencionales, mientras que las respuestas no sensibilizadoras son indetectables en los mismos ensayos. La detección de pequeñas cantidades de linfocitos T sin sensibilizar está limitada por una absorción de timidina de fondo entorpecedora, incluida la respuesta de los linfocitos mixtos autógenos (RLMA) al antígeno del propio CMH más las respuestas a las propias proteínas del suero procesadas y a las proteínas del suero añadido exógenamente.
Para inducir y detectar linfocitos T sin sensibilizar, se usó un sistema de ensayo para las respuestas de baja frecuencia basado en la estadística de muestras de Poisson (en Pinnacles, Chiron Corporation, 1:1-2, 1991). Este tipo de análisis se aplica específicamente a acontecimientos de baja frecuencia en los que, si la frecuencia del precursor es menor que el número de células en un cultivo de replicado, se necesitan muchos replicados para detectar un número estadísticamente significativo de positivos. Teóricamente, el análisis corregirá las respuestas autógenas instalando un control positivo conocido (como PHA o vacuna antitetánica) y un control negativo conocido (sin antígeno) y evaluando todos los puntos de datos desde el más bajo al más elevado independientemente del grupo experimental al que pertenecen. Se calcula un valor discriminatorio sobre la base de la ecuación "valor discriminatorio = M + (F + DE)", donde M = media aritmética, F = 3,29, un factor de las tablas de distribución normal estandarizadas elegido de manera que no más del 0,1% de los "negativos reales" de un fondo de distribución normal esté por encima del valor discriminatorio, y DE = desviación estándar. En este ensayo de detección, se considera que los pocillos por encima del valor discriminatorio son positivos reales que, posiblemente, contienen un linfocito que prolifera específicamente para el antígeno de interés. Aunque es posible estimar la frecuencia de los precursores de los linfocitos usando este método, la determinación precisa requiere un análisis formal por EDL.
Ejemplo 4 La vacuna a base del polipéptido de HER-2/neu induce la inmunidad a la proteína HER-2/neu A. Animales
En este estudio, se utilizaron ratas de la cepa 344 de Fischer (CDF (F-344)/CrIBR) (Charles River Laboratories, Portage MI, EEUU). Las ratas se mantuvieron en las instalaciones para animales de la Universidad de Washington en condiciones específicas sin patógenos y, para los estudios experimentales, se usaron sistemáticamente ratas con una edad entre 3 y 4 meses.
B. Inmunización
Se inmunizaron las ratas de Fischer con el polipéptido de HER-2/neu recombinante de rata (PHNr) en diversos adyuvantes (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, EEUU). Los animales recibieron 50 \mug de la PHNr mezclada con el adyuvante por vía subcutánea. Veinte días después, se reforzaron los animales con una segunda inmunización de 50 \mug de la PHNr, administrados del mismo modo. Veinte días después de la inmunización de refuerzo, se analizaron los animales en busca de la presencia de anticuerpos dirigidos contra la proteína HER-2/neu de rata (neu).
C. Estirpes celulares
Se utilizaron dos estirpes celulares como fuente de proteínas neu. La SKBR3, una estirpe celular del cáncer de mama humano que sobreexpresa notablemente HER-2/neu (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU) se mantuvo en un cultivo en suero bovino fetal (SBF) al 10% (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA, EEUU) y RPMI. La DHFR-G8, una estirpe celular NIH/3T3 cotransfectada con cneu-p y pSV2-DHFR (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU), se usó como una fuente no transformante de la proteína de rata neu (Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6854-6858, 1987). Esta estirpe celular se mantuvo en SBF al 10% y en un medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa. Las células DHFR-G8 se pasaron por el mismo medio complementado con 0,3 \muM de metotrexato en cada tercer pase para conservar el neu transfectante.
D. Preparación de lisados celulares
Se prepararon lisados de la SKBR3 y de la DHFR-G8 y se utilizaron como una fuente de la proteína neu. Brevemente, se preparó un tampón de lisis que consistió en una base de tris, cloruro de sodio y Triton-X al 1% a pH de 7,5. Se añadieron inhibidores de las proteasas: aprotinina (1 \mug/ml), benzamidina (1 mM) y PMSF (1 mM). Se usó 1 ml del tampón de lisis para suspender 10^{7} de células. Las células se agitaron con un vórtex durante 15 segundos cada 10 minutos durante una hora, hasta que se rompieron. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en hielo en una cámara fría a 4ºC. Después de la lisis, las células se centrifugaron en una microcentrífuga a 4ºC durante 20 minutos. Se retiró el sobrenadante de los residuos celulares y se almacenó en pequeñas alícuotas a -70ºC, hasta que se usaran. Se documentó la presencia del neu de rata y de humanos en los lisados mediante el análisis por inmunotransferencia Western.
E. ELISA para las respuestas del anticuerpo contra el neu de rata
Se incubaron placas Immunlon 4 de 96 pocillos (Baxter SP, Redmon, WA: Dynatec Laboratories) durante una noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal específico del neu de rata (Oncongene Science), 7.16.4, a una concentración de 10 \mug/ml diluido en tampón carbonato (concentraciones equimolares de Na_{2}CO_{3} y NaHCO_{3}, con un pH de 9,6). Después de incubar, se bloquearon todos los pocillos con una BSA al 1% en PBS (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EEUU), 100 \mul/pocillo durante 3 horas a temperatura ambiente. Se lavó la placa con un Tween al 0,5% en PBS y se añadieron lisados de DHFRG8, una estirpe celular murina transfectada con ADN de neu de rata (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU) a modo de una fuente de proteína neu de rata, en columnas alternas. Se incubó la placa durante una noche a 4ºC. Luego, se lavó la placa con un Tween al 0,5% en PBS y se añadieron los sueros experimentales en las siguientes diluciones: 1:25 a 1:200. Se diluyeron los sueros en un PBS con BSA al 1%, SBF al 1%, IgG de ratón a 25 \mug/ml y NaN_{3} al 0,01%, y luego, en serie, en PBS con BSA al 1%. Se añadieron 50 \mul de los sueros diluidos por pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió cada suero experimental a un pocillo con neu de rata y a un pocillo sin neu de rata. Se añadió Ig F(ac')_{2} antirrata de oveja con peroxidasa de rábano (PRP) a los pocillos, en una dilución 1:5000 en PBS con BSA al 1% y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (Amersham Co., Arlington Helgts, IL, EEUU). Tras el lavado final, se añadió el reactivo de revelado TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, EEUU). Se leyó la reacción del color en una densidad óptica (DO) de 450 nm. Se calculó la DO de cada dilución de suero como la DO de los pocillos recubiertos con el neu de rata menos la DO de los pocillos recubiertos con BSA al 1% en PBS. También se evaluaron los sueros de animales inmunizados solo con los adyuvantes y un animal inmunizado con la PHNh (proteína foránea), de manera similar. Los resultados se muestran en la figura 3.
F. Ensayos de proliferación de linfocitos T
Para el análisis de las respuestas específicas del polipéptido de HER-2/neu, se recogen células frescas del bazo o de ganglios linfáticos mediante rotura mecánica y se hacen pasar a través de una malla de alambre y se lavan. Se siembran 2 x 10^{5} células de bazo por pocillo y 1 x 10^{5} células de ganglio linfático por pocillo en placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU) con 6 replicaciones por grupo experimental. Los medios consisten en EHAA 120 (Biofluids) con L-glutamina, penicilina/estreptomicina, 2-mercaptoetanol y SBF al 5%. Se incuban las células con los polipéptidos. Después de 4 días, se pulsan los pocillos con 1 pCi de [^{3}H]-timidina durante 6 a 8 horas y se realiza el recuento. Los datos se expresan como el índice de estimulación (IE), que se define como la media de los pocillos experimentales dividida por la media de los pocillos de control (sin antígeno). Para el análisis de las respuestas específicas de la proteína HER-2/neu, se cultivan células de bazo o de ganglio linfático durante 3 estimulaciones in vitro. Durante el análisis, 1 x 10^{5} linfocitos T de bazo o de ganglio linfático en cultivo se siembran en placas de microvaloración de 96 pocillos, como se describió anteriormente. Se incuban las células con 1 \mug/ml de neu de rata purificada mediante columna de inmunoafinidad (a partir de células DHFR-G8 como la fuente del neu de rata). Después de 4 días, los pocillos recibieron un pulso con 1 \muCi de [^{3}H]-timidina durante 6 a 8 horas y se realizó el recuento. Los datos se expresan como un índice de estimulación que se define como la media de los pocillos experimentales dividida por la media de los pocillos de control (sin antígeno).
Ejemplo 5 Se pueden detectar las respuestas de sensibilización al polipéptido de HER-2/neu humano en pacientes con cáncer de mama
Se obtuvo sangre heparinizada de un paciente con un cáncer de mama de etapa II que sobreexpresaba HER-2/neu. Se separaron los linfocitos mononucleares de sangre periférica (LMSP) por medio de la centrifugación en densidad con Ficol Hypaque. Los LMSP se sembraron a una concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo en unas placas de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU). Se realizaron replicaciones de 24 pocillos para cada grupo experimental. A cada replicación de 24 pocillos, se le añadieron antígenos que consistieron en 25 \mug/ml de péptidos derivados de HER-2/neu (de 15 a 20 aminoácidos de longitud con el número del primer aminoácido en la secuencia listada), 1 \mug/ml del polipéptido de HER-2/neu humano (PHNh), 1 \mug/ml de vacuna antitetánica y 25 \mug/ml de p30, un péptido derivado de la toxina tetánica. El ensayo se realizó en unos medios que contenían sueros humanos al 10%. Se midió la respuesta proliferativa de los linfocitos T mediante la captación de [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) añadida en el día 4 durante 10 horas. Los pocillos positivos, los pocillos que reaccionaban al antígeno, se puntuaban como positivos si las cpm eran mayores que la media más 3 desviaciones estándares de los pocillos sin antígenos. Los resultados se muestran en la figura 4. Este paciente con cáncer de mama de etapa II tiene una respuesta significativa al PHNh recombinante.
A partir de lo anterior, será evidente que, aunque se han descrito en la presente invención realizaciones específicas de la invención para propósitos de ilustración, se pueden realizar varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
SOLICITANTE: University of Washington 
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS PARA INDUCIR O REFORZAR LA REACTIVIDAD INMUNITARIA A LA PROTEÍNA HER-2/NEU PARA PREVENIR O TRATAR LAS NEOPLASIAS MALIGNAS EN LAS QUE ESTÁ ASOCIADO EL ONCOGÉN HER-2/NEU 
\vskip0.800000\baselineskip
(III)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(IV)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 98104-7092
\vskip0.800000\baselineskip
(V)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn distribución nº. 1.0 Versión nº. 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 28-3-1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(VIII)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sharkey. Richard G.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32629
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: 920010.448PC
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (206) 622-4900
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (206) 682-6031
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3768 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
RASGOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..3765
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2
3
4
5
6
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1255 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12
13
14
15 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 
\hfill
39

Claims (25)

1. Una composición que comprende un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en combinación con un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1 para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2, desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
4. El uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polipéptido de la composición, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu.
5. Una molécula de ácido nucleico para la inmunización por transfección de las células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico, en la que dicha molécula de ácido nucleico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en la que las células se transfectan ex vivo para la posterior administración al animal.
7. El uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu, en la que dicha molécula de ácido nucleico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
8. Un vector vírico para la inmunización por infección de las células de un animal de sangre caliente con el vector, en la que dicho vector vírico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
9. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, en la que las células se infectan ex vivo para la posterior administración al animal.
10. El uso de un vector vírico para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu, en la que dicho vector vírico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID n.º 1.
11. Una composición que comprende un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en combinación con un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1 para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
14. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 11, 12 ó 13, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
15. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
16. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
17. Una molécula de ácido nucleico o el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, 15 ó 16, en la que el polipéptido codificado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
18. Una molécula de ácido nucleico o el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, 15 ó 16, en la que el polipéptido codificado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
19. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
20. El uso de un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
21. Un vector vírico o el uso de un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 19 ó 20, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
22. Un vector vírico o el uso de un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 19 ó 20, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
23. La composición o el uso de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11 a 14, en la que el polipéptido se une a un péptido o un polipéptido.
24. La composición o el uso de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11 a 14, en la que el polipéptido está truncado.
25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el polipéptido se une a un péptido o a un polipéptido.
ES96912393T 1995-03-31 1996-03-28 Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas. Expired - Lifetime ES2245783T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US414417 1995-03-31
US08/414,417 US5801005A (en) 1993-03-17 1995-03-31 Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2245783T3 true ES2245783T3 (es) 2006-01-16

Family

ID=23641368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96912393T Expired - Lifetime ES2245783T3 (es) 1995-03-31 1996-03-28 Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas.

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5801005A (es)
EP (2) EP1418235A3 (es)
JP (2) JP4510147B2 (es)
KR (1) KR100554186B1 (es)
CN (3) CN1150318C (es)
AT (1) ATE299180T1 (es)
AU (1) AU708237B2 (es)
BR (1) BR9607889A (es)
CA (1) CA2216601C (es)
CZ (2) CZ296617B6 (es)
DE (1) DE69634912T2 (es)
DK (1) DK0817846T3 (es)
ES (1) ES2245783T3 (es)
HU (1) HUP9801826A3 (es)
NO (2) NO321941B1 (es)
NZ (1) NZ306616A (es)
PT (1) PT817846E (es)
RU (2) RU2236461C2 (es)
WO (1) WO1996030514A1 (es)

Families Citing this family (336)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
WO1996018409A1 (en) * 1994-12-14 1996-06-20 The Scripps Research Institute In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
ES2193240T3 (es) * 1996-05-15 2003-11-01 Altarex Inc Metodo y composicion para reconformar antigenos multi-epitopicos para iniciar una respuesta inmune.
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
US6703484B2 (en) 1997-01-08 2004-03-09 Invitrogen Corporation Methods for production of proteins
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
JP5037747B2 (ja) * 1997-01-30 2012-10-03 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 免疫応答を刺激するための吸着された抗原を有するマイクロパーティクルの使用
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
CA2330212A1 (en) * 1998-05-08 1999-11-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Compositions and methods for active vaccination
GB9810040D0 (en) 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
HU228180B1 (hu) * 1998-08-11 2013-01-28 Biogen Idec Inc Anti-CD20-ellenanyag alkalmazása B-sejtes limfómák kombinációs terápiájára
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
DK1616572T3 (da) * 1998-11-09 2010-12-06 Biogen Idec Inc Kimært anti-CD20-antistof, rituxan, til anvendelse i behandling af kronisk lymfatisk leukæmi
MXPA01004649A (es) * 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamiento con anticuerpo quimerico anti-cd20 para pacientes que reciben transplantes de medula osea o celulas madre de sangre periferica.
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7625859B1 (en) * 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7396810B1 (en) * 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
ATE425749T1 (de) 1999-01-27 2009-04-15 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-uberexprimierung einhergehendem krebs
CZ20012587A3 (cs) * 1999-01-29 2002-05-15 Corixa Corporation Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu
US7198920B1 (en) * 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
EP1165144A2 (en) * 1999-03-15 2002-01-02 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (en) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
NZ516237A (en) * 1999-05-25 2004-03-26 Human Genome Sciences Inc Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
ATE355079T1 (de) * 1999-06-25 2006-03-15 Genentech Inc Behandlung von prostata-krebs mit anti-erbb2 antikörpern
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
AU6620300A (en) 1999-08-03 2001-02-19 Ohio State University, The Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US6627196B1 (en) 1999-08-27 2003-09-30 Genentech, Inc. Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CA2383615A1 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
EP1216055A2 (en) * 1999-09-30 2002-06-26 Corixa Corporation Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
CA2393738A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
AU2744201A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
WO2001053463A2 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation COMPOUNDS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HER-2/neu ASSOCIATED MALIGNANCIES
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
AU4791901A (en) * 2000-03-30 2001-10-15 Dendreon Corp Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
WO2001078766A1 (de) * 2000-04-13 2001-10-25 Bio Life Science Forschungs Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Vakzine gegen krebserkrankungen, die sich auf mimotope von auf tumorzellen exprimierte antigenen stützt
WO2001083781A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a novel human trypsin family member and uses thereof
ES2331646T3 (es) 2000-05-19 2010-01-12 Genentech, Inc. Ensayo para la deteccion de genes para mejorar la probabilidad de una respuesta eficaz a una terapia contra el cancer basada en antagonistas de erbb.
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) * 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
KR20030048009A (ko) * 2000-08-14 2003-06-18 코릭사 코포레이션 Ｈｅｒ-2/ｎｅｕ 관련 악성 종양의 치료 및 진단용 조성물및 방법
DK1889630T3 (da) 2000-10-18 2012-03-05 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacciner omfattende MAGE-antigen koblet til protein D-fragment
EP1404359A2 (en) * 2000-12-07 2004-04-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7507724B2 (en) * 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
HUP0402656A3 (en) * 2001-02-20 2012-03-28 Ortho Mcneil Pharm Inc A cell therapy method for the treatment of tumors
ES2394293T3 (es) * 2001-02-28 2013-01-30 Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Vacuna contra cánceres que están asociados con el oncogén HER-2/neu
CA2440610C (en) 2001-03-09 2011-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1399183B1 (en) 2001-05-31 2010-06-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
EP1287831B1 (de) * 2001-09-03 2006-11-22 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Antigen-Mimotope und Vakzine gegen Krebserkrankungen
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
CA2477780A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
AU2003230603A1 (en) 2002-03-08 2003-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens
CA2481796A1 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Altarex Medical Corporation Binding agents and their use in targeting tumor cells
US20040132097A1 (en) * 2002-06-19 2004-07-08 Bacus Sarah S. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
AU2003259109A1 (en) 2002-07-12 2004-02-02 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
EP2044948B1 (en) * 2002-08-12 2013-10-30 Jennerex Biotherapeutics ULC Vaccinia viruses for use in treating cancer
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
EP1560651A1 (en) * 2002-11-12 2005-08-10 Millipore Corporation Evaporation control device for multiwell plates
GB2424070B (en) * 2002-11-14 2007-06-27 Univ Nottingham Methods for preparing tumour marker proteins
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
EP1583833A1 (en) 2003-01-03 2005-10-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2514058C (en) * 2003-01-24 2014-05-13 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254p1d6b useful in treatment and detection of cancer
KR20060002793A (ko) * 2003-03-03 2006-01-09 더 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 Ｍｄａ-7을 포함하는 방법 및 조성물
US20080274129A1 (en) 2003-04-18 2008-11-06 Fikes John D Hla-A2 Tumor Associated Antigen Peptides and Compositions
AU2004265226A1 (en) * 2003-05-16 2005-02-24 Receptor Biologix, Inc. Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
US20050118186A1 (en) * 2003-06-17 2005-06-02 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in compositions for various types of cancers
CN100558894C (zh) * 2003-07-21 2009-11-11 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
JP4914216B2 (ja) 2003-10-22 2012-04-11 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 細胞、組織、臓器、および生物においてスタシスを誘導するための方法、組成物、および装置
DK1725249T3 (en) 2003-11-06 2014-03-17 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugating to ligands.
CA2548220A1 (en) * 2003-12-01 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Use of mda-7 to inhibit infection by pathogenic organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
AU2005245896A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
WO2005118806A2 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
CA2571710A1 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Nicholas Valiante Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2583230A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
WO2006041959A2 (en) * 2004-10-06 2006-04-20 Wellstat Biologics Corporation Detection of elevated levels of her-2/neu protein on circulating cancer cells and treatment
ES2534300T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
SG158154A1 (en) * 2004-12-29 2010-01-29 Mannkind Corp Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against mhc class i-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
KR101379364B1 (ko) * 2005-02-08 2014-03-31 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료를 위한 ｍｄａ-7을 포함하는 조성물
MX2007013196A (es) 2005-04-20 2008-01-18 Hutchinson Fred Cancer Res Metodos, composiciones y articulos de fabricacion para mejorar la supervivencia de celulas, tejidos, organos y organismos.
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
AU2006249199A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
SI1889059T1 (sl) 2005-05-27 2009-12-31 Oncimmune Ltd Izboljšani imunotestni postopek
CA2612394C (en) 2005-06-15 2017-02-21 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
KR20080026181A (ko) 2005-06-17 2008-03-24 맨카인드 코포레이션 암세포 및 종양 기질에 발현된 우성 및 준우성 에피토프에대한 다가 면역반응을 유발하기 위한 방법 및 조성물
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
EP1933864A4 (en) * 2005-09-07 2009-12-16 Receptor Logic Ltd ANTIBODIES AS T-CELL RECEPTOR MIMICS, METHOD OF MANUFACTURE AND ITS USES
CA2621982C (en) * 2005-09-07 2017-11-28 Jennerex Biotherapeutics Ulc Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US8945573B2 (en) 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
ES2628308T3 (es) * 2005-09-08 2017-08-02 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Identificación selectiva de péptidos inmunogénicos
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
JP2009528267A (ja) * 2006-01-17 2009-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 治療を増強するグルカン
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
CA2646891A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
EP2010530A2 (en) * 2006-03-23 2009-01-07 Novartis AG Methods for the preparation of imidazole-containing compounds
ES2376492T3 (es) 2006-03-23 2012-03-14 Novartis Ag Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores.
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
JP2009544974A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 鮮明に分解する標識タンパク質分子量標準
US7972602B2 (en) * 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
WO2008036776A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
WO2008039874A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
WO2008039969A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
AU2007333106A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
JP2010525326A (ja) * 2007-04-19 2010-07-22 ウェルスタット バイオロジックス コーポレイション 分離されていない循環癌細胞由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の上昇したレベルの検出および治療
PL2162149T3 (pl) * 2007-06-01 2014-04-30 Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc Szczepionka do zapobiegania nawrotowi raka sutka
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
EP2198050A1 (en) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
DK2225563T3 (en) 2007-11-27 2015-02-09 Janssen Diagnostics Llc AUTOMATIC DETERMINATION AND CHARACTERIZATION OF FAN melanoma BLOOD
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
WO2009137807A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
PL2328923T3 (pl) * 2008-09-02 2016-06-30 Cedars Sinai Medical Center Epitopy CD133
CA2744035C (en) 2008-12-10 2018-07-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer recurrence
US8585505B2 (en) 2008-12-15 2013-11-19 Tetris Online, Inc. Inter-game interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
CA2761777A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Prometheus Laboratories Inc. Biomarkers for determining sensitivity of breast cancer cells to her2-targeted therapy
WO2010144874A2 (en) * 2009-06-12 2010-12-16 University Of Southern California Clusterin pharmaceuticals and treatment methods using the same
IN2012DN03025A (es) 2009-09-09 2015-07-31 Ct Se Llc
ES2848650T3 (es) 2009-09-14 2021-08-11 Sillajen Biotherapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico
CN102858959B (zh) 2009-12-10 2016-02-24 渥太华医院研究院 溶瘤弹状病毒
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
US20130028917A1 (en) 2010-04-15 2013-01-31 Spirogen Developments Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2011154863A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
WO2011156328A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
JP6121910B2 (ja) 2011-01-04 2017-04-26 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与による腫瘍抗原に対する抗体の生成および腫瘍特異的補体依存性細胞傷害の生成
CN103459598B (zh) 2011-02-03 2016-08-10 米尔纳医疗股份有限公司 Mir-124的合成模拟物
AU2012212023B9 (en) 2011-02-03 2017-01-12 Mirna Therapeutics, Inc. Synthetic mimics of miR-34
JP5987053B2 (ja) 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
ES2627529T3 (es) 2011-06-08 2017-07-28 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Composiciones para tratamiento de glioblastoma
AU2012294814A1 (en) 2011-08-05 2014-02-27 Research Development Foundation Improved methods and compositions for modulation of Olfml3 mediated angiogenesis
WO2013036201A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Agency For Science, Technology And Research Polypeptide vaccine
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
AU2012322607B2 (en) 2011-10-14 2017-02-16 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2814836B1 (en) 2012-02-17 2017-11-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
ME03486B (me) 2012-10-12 2020-01-20 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2887899C (en) 2012-10-12 2020-03-31 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
PT2906296T (pt) 2012-10-12 2018-06-01 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
LT2906253T (lt) 2012-10-12 2018-10-10 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepino-anti-psma antikūno konjugatas
EP2906298B1 (en) 2012-10-12 2018-10-03 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2014066590A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Research Development Foundation Jam-c antibodies and methods for treatment of cancer
EA031585B1 (ru) 2012-12-21 2019-01-31 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
US9567340B2 (en) 2012-12-21 2017-02-14 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
CA2898474A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Immunocellular Therapeutics, Ltd. Cancer vaccines and vaccination methods
US10363293B2 (en) 2013-02-21 2019-07-30 Turnstone Limited Partnership Vaccine composition
CN105209077B (zh) 2013-03-13 2019-06-11 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓以及其结合物
AR096287A1 (es) 2013-03-13 2015-12-23 Spirogen Sàrl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados
CA2904044C (en) 2013-03-13 2020-03-31 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10442836B2 (en) 2013-08-12 2019-10-15 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[E]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
SG11201601047SA (en) 2013-08-14 2016-03-30 Univ Rice William M Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
CN106659909B (zh) 2013-08-21 2022-01-11 德克萨斯州大学系统董事会 用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法
WO2015031735A1 (en) 2013-08-29 2015-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes as antineogenic agents
WO2015031771A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9921223B2 (en) 2013-12-04 2018-03-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Analysis of genomic DNA, RNA, and proteins in exosomes for diagnosis and theranosis
MX2016007826A (es) 2013-12-16 2017-03-31 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y sus conjugados de anticuerpo-farmaco.
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
BR112016012410A2 (pt) 2013-12-16 2017-09-26 Genentech Inc conjugado de droga e anticorpo, composto conjugado de droga e anticorpo, composto não-peptídico, método de tratamento de doenças em seres humanos e composição farmacêutica
WO2016153761A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-29 Czerniecki Brian J Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
EP3185860A4 (en) 2014-08-29 2018-08-29 The Board of Regents of the University of Texas System Novel capsazepine analogs for the treatment of cancer and other proliferative diseases
US9975959B2 (en) 2014-08-29 2018-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN107108724A (zh) 2014-09-12 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 半胱氨酸改造抗体和缀合物
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SG11201702079UA (en) 2014-09-17 2017-04-27 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2016130516A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
US10563204B2 (en) 2015-03-04 2020-02-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating cancer harboring hemizygous loss of TP53
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
EP3302539A4 (en) * 2015-05-22 2018-12-19 Brian J. Czerniecki Manufacturing multi-dose injection ready dendritic cell vaccines
WO2016196506A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Galena Biopharma, Inc. PEPTIDE VACCINE THERAPY FOR TREATMENT OF FRα-EXPRESSING TUMORS
MX2017015962A (es) 2015-06-10 2018-07-06 Univ Texas Uso de exosomas para el tratamiento de enfermedades.
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
CA2993823C (en) 2015-07-28 2024-01-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
CA3001005A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
US20190038713A1 (en) 2015-11-07 2019-02-07 Multivir Inc. Compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
CA3004438A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
WO2017096051A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Stcube & Co., Inc. Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof
CN108925136B (zh) 2015-12-02 2022-02-01 斯特赛恩斯公司 特异于糖基化的btla（b和t淋巴细胞衰减因子）的抗体
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3419998A4 (en) 2016-02-26 2019-09-25 The Board of Regents of The University of Texas System CONNEXIN (CX) 43 HEMICANAL BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF
AU2017225769B2 (en) 2016-03-02 2023-01-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Sting activating nanovaccine for immunotherapy
EP3433621A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
CN109071636A (zh) 2016-03-29 2018-12-21 斯特库比股份有限公司 用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
WO2017172518A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Stcube, Inc. Dual function antibodies specific to glycosylated pd-l1 and methods of use thereof
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
JP7131773B2 (ja) 2016-04-29 2022-09-06 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ホルモン受容体に関連する転写活性の標的尺度
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
ES2858151T3 (es) 2016-05-20 2021-09-29 Hoffmann La Roche Conjugados de PROTAC-anticuerpo y procedimientos de uso
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
MA45169A (fr) 2016-05-31 2019-04-10 Sellas Life Sciences Group Inc Thérapie vaccinale pour le traitement du cancer de l'endomètre et de l'ovaire
EP3464560A4 (en) * 2016-06-03 2020-01-15 Etubics Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR VACCINATION AND IMMUNOTHERAPY WITH HER2 / NEU
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
JP2019520392A (ja) 2016-07-06 2019-07-18 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ヒト酵素媒介性シスチン枯渇
JP2019528251A (ja) 2016-07-20 2019-10-10 エスティーキューブ，インコーポレイテッド グリコシル化ｐｄ−ｌ１に結合する抗体の組合せを使用するがんの処置および治療の方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
US9963498B2 (en) 2016-08-18 2018-05-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of VLA-4 and IGF-1R
KR20190053905A (ko) 2016-09-16 2019-05-20 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포솜 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 병용 요법
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3538112A4 (en) 2016-11-09 2020-09-02 Musc Foundation for Research Development CD38-NAD + REGULATED METABOLIC AXIS IN ANTITUMOR IMMUNOTHERAPY
EP3551226A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 MultiVir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR20200032243A (ko) 2017-02-08 2020-03-25 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
US11693007B2 (en) 2017-02-24 2023-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Assay for detection of early stage pancreatic cancer
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
EP3612234B1 (en) 2017-04-20 2024-03-13 ADC Therapeutics SA Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
US10865403B2 (en) 2017-05-12 2020-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
WO2018209192A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Board Of Regetns, The University Of Texas System Human-enzyme mediated depletion of homocysteine for treating patients with hyperhomocysteinemia and homocystinuria
KR20200015602A (ko) 2017-05-31 2020-02-12 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 분자 및 이의 치료적 용도
US20200131266A1 (en) 2017-05-31 2020-04-30 Stcube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1
CN110997724A (zh) 2017-06-06 2020-04-10 斯特库伯株式会社 使用结合btn1a1或btn1a1-配体的抗体和分子治疗癌症的方法
UA127900C2 (uk) 2017-06-14 2024-02-07 Ейдісі Терапьютікс Са Схема дозування для введення adc до cd19
DK3668874T3 (da) 2017-08-18 2022-02-14 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepin-konjugater
RU2020113749A (ru) 2017-09-20 2021-10-20 пиЭйч ФАРМА Ко., ЛТД. Аналоги таиланстатина
EP4116327A1 (en) 2017-10-11 2023-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Human pd-l1 antibodies and methods of use therefor
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
WO2020036635A2 (en) 2018-03-19 2020-02-20 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
EP3768726A4 (en) 2018-03-23 2021-12-22 Board of Regents, The University of Texas System DOUBLE SPECIFICITY ANTIBODIES FOR PD-L1 AND PD-L2 AND METHOD OF USING THEREOF
US20210361655A1 (en) 2018-03-27 2021-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds with anti-tumor activity against cancer cells bearing her2 exon 19 mutations
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
TW202037381A (zh) 2018-10-24 2020-10-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 綴合化學降解誘導劑及使用方法
WO2020106621A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
WO2020113029A2 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
KR20210096648A (ko) 2018-11-29 2021-08-05 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 자연 살해 세포의 생체외 확장을 위한 방법 및 이의 용도
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN113710234A (zh) 2019-02-08 2021-11-26 得克萨斯州大学系统董事会 用于治疗衰老相关疾病和年龄相关器官功能障碍的含端粒酶的外排体
EP3966315A1 (en) 2019-05-09 2022-03-16 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
US10945981B2 (en) 2019-05-17 2021-03-16 Cancer Prevention Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating familial adenomatous polyposis
AU2020317009A1 (en) 2019-07-19 2022-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric antigen receptors containing Glypican 2 binding domains
CN114514035A (zh) 2019-09-13 2022-05-17 伊勒卓菲公司 递送用于治疗疾病的治疗性生物制剂的组合物和方法
CN114729045A (zh) 2019-09-26 2022-07-08 斯特库比公司 对糖基化的ctla-4特异性的抗体及其使用方法
US20220356248A1 (en) 2019-10-09 2022-11-10 Stcube & Co Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof
WO2021087458A2 (en) 2019-11-02 2021-05-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
BR112022012918A2 (pt) 2020-01-07 2022-09-06 Univ Texas Variantes de enzima de exaustão de metiltioadenosina/adenosina humana melhorada para terapia do câncer
CA3168337A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Marie-Andree Forget Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
US20230212256A1 (en) 2020-05-21 2023-07-06 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors with vgll1 specificity and uses thereof
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
IL302728A (en) 2020-11-13 2023-07-01 Catamaran Bio Inc Genetically modified natural killer cells and methods of using them
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
CN117529338A (zh) 2021-01-19 2024-02-06 威廉马歇莱思大学 多肽的骨特异性递送
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
AU2022324040A1 (en) 2021-08-04 2024-02-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Lat activating chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
WO2023020612A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric her2
CA3234457A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Cytovia Therapeutics, Llc Natural killer cells and methods of use thereof
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
TW202330612A (zh) 2021-10-20 2023-08-01 日商武田藥品工業股份有限公司 靶向ｂｃｍａ之組合物及其使用方法
WO2023076880A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
TW202405011A (zh) 2022-04-01 2024-02-01 美國德州系統大學評議委員會 針對人類pd-l1及pd-l2之雙重特異性抗體及其使用方法
WO2023211972A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Medical University Of South Carolina Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
EP0474727B1 (en) * 1989-05-19 1997-07-23 Genentech, Inc. Her2 extracellular domain
EP0444181B2 (en) * 1989-08-04 2010-11-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft C-erbb-2 external domain: gp75
ATE120860T1 (de) * 1990-01-26 1995-04-15 Washington Res Found Immunreaktivität gegenüber exprimierten aktivierten oncogenen zur diagnose und behandlung von bösartigen geschwülsten.
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
AU6359494A (en) * 1993-03-05 1994-09-26 Epimmune, Inc. Hla-a2.1 binding peptides and their uses
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
WO1996018409A1 (en) * 1994-12-14 1996-06-20 The Scripps Research Institute In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

Also Published As

Publication number Publication date
CZ296618B6 (cs) 2006-05-17
NO974502L (no) 1997-11-27
AU708237B2 (en) 1999-07-29
EP1418235A2 (en) 2004-05-12
WO1996030514A1 (en) 1996-10-03
CN1183117A (zh) 1998-05-27
US20040082758A1 (en) 2004-04-29
JPH11502710A (ja) 1999-03-09
US6075122A (en) 2000-06-13
US5876712A (en) 1999-03-02
EP1418235A3 (en) 2004-08-11
NO20061723L (no) 1996-10-01
DK0817846T3 (da) 2005-11-07
HUP9801826A2 (hu) 1998-11-30
US7247703B2 (en) 2007-07-24
RU2236461C2 (ru) 2004-09-20
CN1150318C (zh) 2004-05-19
AU5522296A (en) 1996-10-16
US5801005A (en) 1998-09-01
NO321941B1 (no) 2006-07-24
DE69634912D1 (de) 2005-08-11
EP0817846B1 (en) 2005-07-06
DE69634912T2 (de) 2006-04-20
RU2004115492A (ru) 2005-11-10
US7655239B2 (en) 2010-02-02
US6664370B2 (en) 2003-12-16
CZ309697A3 (cs) 1998-01-14
CN1597953A (zh) 2005-03-23
ATE299180T1 (de) 2005-07-15
KR100554186B1 (ko) 2007-04-11
NO974502D0 (no) 1997-09-29
CA2216601A1 (en) 1996-10-03
JP4510147B2 (ja) 2010-07-21
JP2008056679A (ja) 2008-03-13
US20020055614A1 (en) 2002-05-09
EP0817846A1 (en) 1998-01-14
US5726023A (en) 1998-03-10
CN1951398A (zh) 2007-04-25
US20080076904A1 (en) 2008-03-27
US5846538A (en) 1998-12-08
HUP9801826A3 (en) 2000-12-28
US20100087621A1 (en) 2010-04-08
KR19980703453A (ko) 1998-11-05
PT817846E (pt) 2005-11-30
BR9607889A (pt) 1999-08-10
CZ296617B6 (cs) 2006-05-17
MX9707501A (es) 1998-06-30
CA2216601C (en) 2002-10-22
NZ306616A (en) 2001-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2245783T3 (es) Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas.
US5869445A (en) Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US10251912B2 (en) MHC class II restricted T cell epitopes from the cancer antigen, NY ESO-1
ES2311027T3 (es) Composiciones y metodos para la inmunoterapia especifica de wt1.
ES2294844T3 (es) Peptidos antigenicos tumorales derivados de ciclofilina b.
RU2237674C2 (ru) Композиции и способы wt1-специфичной иммунотерапии
DK2186889T3 (en) CDCA1 PEPTID AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, INCLUDING THIS
US20060121046A1 (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20040235070A1 (en) Immune reactivity to expressed activated oncogenes for diagnosis and treatment of malignancy
JP4223072B2 (ja) ｐ１５及びチロシナーゼ黒色腫抗原並びに診断及び治療方法におけるそれらの使用
JP4615805B2 (ja) Ｎｙ−ｅｓｏ−１ペプチド誘導体およびその使用
US8524491B2 (en) Compounds for eliciting or enhancing immune reactivity to HER-2/neu protein for prevention or treatment of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US7071294B1 (en) Tumor antigen protein art-1 and tumor antigen peptide thereof
US20030228325A1 (en) Isolated peptides which bind to HLA-B18 molecules and uses thereof
US20060009393A1 (en) Immunogenic epitopes for fibroblast growth factors 5 (FGF-5)
MXPA97007501A (es) Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o tratamiento de malignidades
WO2004045555A2 (en) Immunogenic epitopes for fibroblast growth factor 5 (fgf-5) presented by hla-a3 and hla-a2