KR100554186B1 - 악성종양의예방또는치료용의HER-2/neu단백질의세포내도메인 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응성을 유발시키거나 증진시키기 위한 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 화합물은 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양을 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 HER-2/neu 온코진(oncogene)이 관련되어 있는 악성 종양의 치료 용도를 포함하는, 일반적으로 HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응을 유발시키거나 증진시키기 위한 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
재정적 및 인적 자원의 막대한 투자에도 불구하고, 암은 여전히 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 예를 들어, 암은 35세 내지 74세 연령의 여성에 있어서 주요 사망 원인이다. 유방암은 여성에게 있어서 가장 일반적인 악성 종양이며 유방암의 발병률은 증가일로에 있다. 9명의 여성 중 한명은 이 질병으로 진단될 것이다. 유방암을 치유하기 위한 표준 접근 방법은 외과 수술, 방사선 치료 및 화학치료요법의 조합으로 점철된다. 이러한 접근 방법은 특정의 악성 종양에 있어서 어느 정도 현저한 성공을 가져왔다. 그러나, 이러한 시도는 모든 악성 종양에 대해 성공적인 것은 아니며, 유방암은 특정 단계를 지나 치료하는 경우 대부분 치유 불가능하다. 따라서, 예방 및 치료요법에 대한 또 다른 시도가 요구되고 있다.
악성 종양의 일반적인 특징은 조절되지 않은 세포 성장이다. 암 세포는 정상의 표현형으로부터 자율적으로 성장할 수 있는 악성 종양 표현형으로 형질전환되는 과정을 겪는 것으로 여겨진다. 체세포 유전자의 증식 및 과발현은 정상 세포로부터 악성 종양 세포로의 형질전환을 초래하는 주요 현상인 것으로 고려된다. 발암성 유전자에 의해 암호화된 악성 종양 표현형 특성은 형질전환된 세포의 후대로 세포 분열동안에 이전된다.
온코진과 관련된 현재의 연구로, 악성 종양 세포내에서 작동성이고 형질전환에 관여하거나 이와 관련된 40개 이상의 온코진을 확인하였다. 온코진은 이들의 유전자 산물(예를 들어, 온코진에 의해 발현된 단백질)의 추정된 작용 또는 위치에 기초하여 상이한 그룹으로 분류된다.
온코진은 정상 세포 생리학의 특정 양태에 필수적인 것으로 여겨진다. 이와 관련하여, HER-2/neu 온코진은 온코진의 타이로신 단백질 키나제 군의 일원이며 상피 성장 인자 수용체와 매우 고도의 상동성을 공유한다. HER-2/neu는 아마도 세포 성장 및/또는 분화에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. HER-2/neu는 필수적으로 정상 유전자 산물의 증가되거나 조절저하된 발현의 결과로써 정량적 매카니즘을 통해 악성 종양을 유발시키는 것으로 여겨진다.
HER-2/neu(p185)는 HER-2/neu 온코진의 단백질 산물이다. HER-2/neu 유전자는 증폭되고 HER-2/neu 단백질은 유방, 난소, 결장, 폐 및 전립선 암을 포함하는 각종의 암에서 과발현된다. HER-2/neu는 악성 종양 형질전환에도 관련된다. 이것은 도관 악성 종양의 50% 내지 60% 및 모든 유방암의 20% 내지 40%에서 발견되고 난소, 전립선, 결장 및 폐내에서 발생하는 선암에서 소량 발견된다. HER-2/neu는 악성 종양 표현형과 밀접하게 관련되어 있을 뿐만 아니라, 악성 종양의 공격성과도 관련되어 있으며, 모든 침입성 유방암의 1/4에서 발견된다. HER-2/neu 과발현은 유방암 및 난소암 모두에 있어서의 불량한 예후와 관련되어 있다. HER-2/neu는 대략 길이가 1255개의 아미노산(aa)이고 상대 분자량이 185kd인 막통과(transmembrane) 단백질이다. 이것은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)와 40%가 상동성인 대략 645aa의 세포외 결합 도메인(ECD), 고도로 소수성인 막통과 앵커 도메인(transmembrane anchor domain: TMD) 및 EGFR과 80%가 상동성인 대략 580aa의 카복시 말단 세포질성 도메인(cytoplasmic domain: CD)을 갖는다.
HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 암의 치료에 대한 현재의 접근 방법에 있어서의 어려움에 기인하여, 당해 분야에서는 개선된 화합물 및 조성물이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 기타 관련된 장점을 추가로 제공한다.
발명의 요약
요약하면, 본 발명은 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대한 온혈동물의 면역화 또는 면역화용 약제의 제조에 사용하기 위한 폴리펩타이드, 핵산 분자(이러한 폴리펩타이드의 발현을 지시하는) 및 바이러스 벡터(이러한 폴리펩타이드의 발현을 지시하는)를 제공한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 핵산 분자는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물 중에 존재할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드, 핵산 분자, 바이러스 벡터 또는 약제학적 조성물은 1회(즉, 악성 종양이 예상되는 경우)로 또는 주기적(즉, 악성 종양을 획득하거나 또는 재획득할 위험이 높은 개인에 대해)으로 면역화에 사용할 수 있다. 면역화용 약제는 존재하는 종양을 치료하고 종양의 발생 또는 재발을 예방하는 데 유용할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명은 (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번; 및 (b) 적절한 엄중한 조건하에서 서열 1의 뉴클레오타이드 2026번 내지 3765번에 상보성인 뉴클레오타이드에 하이브리드화하는, HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응을 생성하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 제공한다. 바람직한 양태로서, 폴리펩타이드는 서열 2의 아미노산 서열 중 아미노산 676번의 라이신으로부터 아미노산 1255번의 발린에 이르는 서열 또는 적어도 동등한 면역 반응을 생성하는 이의 변이체를 지닌다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물은 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대한 온혈동물의 면역화를 위해 제공된다. 다른 양태로서, 이러한 폴리펩타이드 또는 조성물은 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성종양에 대한 온혈동물의 면역화용 약제의 제조에 사용된다.
다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 핵산 분자는 온혈동물의 세포를 핵산 분자로 형질감염시킴으로써 면역화에 제공된다. 다른 양태로서, 이러한 핵산 분자는 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대한 온혈동물의 면역화용 약제의 제조에 사용된다.
또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 바이러스 벡터는 온혈동물의 세포를 벡터로 감염시킴으로써 면역화에 제공된다. 다른 양태로서, 이러한 바이러스 벡터는 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대한 온혈동물의 면역화용 약제의 제조에 사용된다.
본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면과 관련하여 명백해질 것이다.
도 1은 수지상 세포에 의한 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대한 순수한 T 임파구를 프라이밍(priming)한 결과를 도시한 것이다. 골수 기원의 DC를 DC34 + 간 세포로부터의 GM-CSF 및 IL6을 사용하여 생성시킨다. HER-2/neu 폴리펩타이드를 사용하여 펄스시킨 DC는 T 세포를 DC와 함께 항온처리한지 7일 후, 자가 CD4+/CD45RA+ T 임파구의 단백질-특이적인 증식을 유발한다. 골수 기원의 CD34+ 간세포는 GM-CSF를 함유하는 혈청 비함유 배지내에서 1주일간 배양하고, IL-6은 APC로서 사용한다. APC는 각종 농도에서 96웰 환저 플레이트(Corning, NY, USA)내로 플레이팅하고 20 내지 25㎍/ml의 재조합 HER-2/neu 폴리펩타이드와 함께 16 내지 18시간 동안 항온처리한다. CD4+ T 임파구를 자가 말초 혈액 단핵 세포로부터 면역친화성 컬럼(CellPro, Inc., Bothell, WA, USA 제조원)을 사용한 포지티브 선별에 의해 분리한다. 항원-펄스된 APC를 조사(10Gy)하고, CD4+ T 임파구를 웰당 105으로 가한다. T 세포의 증식성 반응은 7일째에 가한 (3H)티미딘(1μ Ci/웰)의 16 내지 18시간 동안의 흡수에 의해 측정한다. 증식 검정은 5개의 웰 복제물 중에서 혈청- 및 사이토킨-비함유 배지 중에서 수행한다. 기호는 -
-가 DC + HER-2/neu 폴리펩타이드 + CD4+/CD45RA+ T 세포; -0 -가 DC + CD4+/CD45RA+ T 세포; -
-가 DC + HER-2/neu 폴리펩타이드를 나타낸다.
도 2는 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대한 CD4+ 세포의 반응을 도시한 것이다. 도 1에 기술한 프라이밍 검정을 사용하여, 정상인 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 재조합 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대한 반응에 대해 시험한다. 기호는 -
-가 SC+CD4; … ◆… 가 SC+CD4+HER-2/neu 폴리펩타이드를 나타낸다. "SC"는 간 세포이다.
도 3은 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드로 면역화된 랫트가 랫트 neu 특이적인 항체를 생성함을 나타낸다. 랫트를 MPL 또는 바셀(vaccel) 보조제 중 재조합 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드 25㎍으로 면역화시킨다. 3회의 면역화를 각각 20일 간격을 두고 수행한다. 최종 면역화후 20일 경과하여, 랫트를 랫트 neu에 대한 항체 반응에 대해 평가한다. 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드 및 바셀 보조제로 면역화시킨 동물은 고 역가의 랫트 neu 특이적 반응을 나타낸다. 대조군은 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드(외래 단백질)로 면역화시킨 동물이다. 별개의 실험에서, 정제된 전체의 랫트 neu 100㎍ 및 300㎍을 사용하여 면역화시킨 랫트는 검출가능한 neu 특이적 항체를 생성하지 않는다(데이타는 나타내지 않음). 데이타는 3마리 동물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 기호는 -
-가 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드/MPL; … 
… 가 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드/바셀; … 
… 가 MPL 단독; … 0 … 가 바셀 단독; 
가 대조군을 나타낸다. "MPL" 및 "바셀"은 보조제(Ribi, Bozeman, MT, USA)이다. "Neu"는 HER-2/neu 단백질이다.
도 4는 유방암 환자가 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대해 이미 존재하는 면역성을 갖는다는 것을 도시한 것이다. PBMC 환자를 24웰 복제물 중에서 삼중수소 티미딘 도입에 의해 평가한다. 반응성 웰은 대조군 웰의 평균 및 3개의 표준 편차(372 cpm)보다 큰 것으로 기록된다. 이러한 HER-2/neu 양성 II기의 유방암 환자는 재조합 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대해 현저하게 반응한다. 기호 "p"는 HER-2/neu 단백질에 대한 펩타이드를 나타내며, "tt"는 테타누스 톡소이드를 나타내고, "hHNP"는 재조합 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드를 나타낸다.
본 발명을 설명하기에 앞서, 이후 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 설명하여 본원의 이해를 도울 수 있다.
HER-2/neu 폴리펩타이드-본원에 기술된 바와 같이, 이 용어는 서열 2의 아미노산 서열 중 아미노산 676번 라이신으로부터 아미노산 1255번 발린에 이르는 서열을 지니며, 천연적으로 기원하고, 합성적으로 생성되며, 유전적으로 조작될 수 있는 HER-2/neu 단백질(이 단백질은 또한 p185 또는 c-erbB2로서 공지되어 있다)의 일부 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체[즉, 하나 이상의 아미노산이 실질적으로 HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응의 유발 또는 증진에 영향을 미치지 않는 비-아미노산으로 대체된다(즉, 변이체는 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포에 의한 반응을 자극한다)]를 언급한다.
T 세포의 증식-본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 T 세포의 증식 및 증식을 초래하는 T 세포의 자극, 즉 유사분열을 유도하는 현상의 개시 및 유사분열 자체를 포함한다. T 세포의 증식을 검출하는 방법은 하기에 기술된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 증폭된 HER-2/neu 유전자가 악성 종양과 관련되어 있는 온혈동물내 악성 종양을 포함하여, HER-2/neu 온코진에 의해 발현된 단백질 산물에 대한 면역성을 유발하거나 증진시키는 화합물 및 조성물에 관한 것이다. 증폭된 HER-2/neu 유전자와 악성 종양의 결합으로 유전자의 단백질 발현 산물이 종양상에 존재하여야 할 필요는 없다. 예를 들어, 상기 단백질 발현 산물의 과발현은 종양의 개시와 관련될 수 있으나, 당해 단백질 발현은 후속적으로 상실될 수 있다. 본 발명의 용도는 효과적인 본래의 면역 반응을 유발시키거나 증진시켜 HER-2/neu 양성 종양을 HER-2/neu 음성 종양으로 전환시키는 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 기술은 한 양태로서, HER-2/neu 유전자의 단백질 발현 산물의 특정 부위(HER-2/neu 폴리펩타이드)를 기본으로 하는 폴리펩타이드가 흉선-의존성 임파구(이후 "T 세포"로 언급)에 의해 인지될 수 있으므로 원래의 면역 T 세포 반응은 이러한 단백질이 존재하거나 과발현된 악성 종양을 치료하거나 예방하는 데 이용될 수 있음을 보여준다. 본 발명의 기술은 또한, 다른 양태로서, 이러한 펩타이드의 발현을 지시하는 핵산 분자가 면역화용 바이러스 벡터 중에서 또는 단독으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
일반적으로, CD4+ T 세포 집단은 특이적인 항원에 의한 자극시 림포킨의 방출을 통해 헬퍼/유도자로서 작용하지만; CD4+ 세포의 서브셋트는 세포독성 T 임파구(CTL)로서 작용하는 것으로 판단할 수 있다. 유사하게, CD8+ T 세포는 항원성 표적을 직접 분해함으로써 작용하는 것으로 판단되나, 다양한 조건하에서, 이들은 림포킨을 분비하여 헬퍼 또는 DTH 작용을 제공할 수 있다. 중복되는 작용의 효능에도 불구하고, 표현형 CD4 및 CD8 마커는 부류 II 또는 부류 I MHC 항원에 결합한 펩타이드의 인지(recognition)에 연결된다. 부류 II 또는 부류 I MHC의 측면에서 항원의 인지는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 상이한 환경하에서 나타나는 상이한 항원 또는 동일한 항원에 대해 반응하도록 명령한다. 부류 II MHC 항원에 대한 면역원성 펩타이드의 결합은 대부분 항원 제시 세포에 의해 흡수된 항원에 대해 일어난다. 따라서, CD4+ T 세포는 일반적으로 종양 세포에 대해 외적인 항원을 인지한다. 대조적으로, 정상 상황하에서, 부류 I MHC에 대한 펩타이드의 결합은 단지 세포질내에 존재하는 단백질에 대해서만 일어나며, 표적 자체에 의해서 합성되며, 외부 환경중의 단백질은 제외된다. 이러한 예외는 세포외에서 고 농도로 존재하는 정밀한 부류 I 결합 모티프(motif)와 외인성 펩타이드의 결합이다. 따라서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 광범위하게 상이한 작용을 가지며 항원이 정상적으로 존재하는 부위를 반영하는 것으로써 상이한 항원을 인지하는 경향이 있다.
본 발명에서 기술한 바와 같이, HER-2/neu 온코진에 의해 발현된 단백질 산물의 폴리펩타이드 부위는 T 세포에 의해 인지된다. 순환하는 HER-2/neu 폴리펩타이드는 펩타이드 단편으로 분해된다. 폴리펩타이드로부터의 펩타이드 단편은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 항원에 결합한다. 세포 표면상에서 MHC 항원에 결합된 펩타이드의 디스플레이 및 숙주 T 세포에 의한 펩타이드와 자가 MHC 항원의 배합의 인식에 의해, HER-2/neu 폴리펩타이드(악성 종양 세포상에서 발현된 것을 포함)는 T 세포에 대해 면역원성일 것이다. T 세포 수용체의 정밀한 특이성은, 개개의 T 세포로 하여금 한 개의 아미노산 잔기라도 상이한 펩타이드 사이를 식별가능케 한다.
폴리펩타이드로부터 펩타이드 단편에 대한 면역 반응 동안에, 펩타이드-MHC 복합체의 고 친화성 결합을 지닌 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포는 펩타이드-MHC 복합체에 결합할 것이며, 이로 인해 활성화되어 증식을 유도할 것이다. 펩타이드와 처음 대면하는 경우, 소수의 면역 T 세포는 림포킨을 분비하고, 증식하여, 효과기 및 기억 T 세포로 분화될 것이다. 1차 면역 반응은 생체내에서 일어날 것이지만 시험관내에서 검출하기는 어렵다. 기억 T 세포에 의한 동일한 항원과의 연속된 대면은 보다 빠르고 더욱 강력한 면역 반응을 초래한다. 2차 반응은 생체내 또는 실험관내에서 일어날 것이다. 실험관내 반응은 증식 정도, 사이토킨 생성 정도 또는 항원중에 재-노출된 T 세포 집단의 세포분해 활성의 생성을 측정함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 특수한 항원에 대한 반응에서 T 세포 집단의 연속적인 증식은 선행 노출 또는 항원에 대한 프라이밍의 지표인 것으로 간주된다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 HER-2/neu 폴리펩타이드 또는, 이러한 폴리펩타이드의 발현을 지시하고 바이러스 벡터 중에 존재할 수 있는 DNA 분자를 포함한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 폴리펩타이드 중 676번 아미노산으로부터 1255번 아미노산에 이르는 서열의 변이체를 포함하며 면역 반응을 자극하는 능력을 지닌다. 이러한 변이체는 천연 폴리펩타이드의 각종 구조형을 포함한다. 이온화가능한 아미노 그룹 및 카복실 그룹의 존재로 인하여, 예를 들어, HER-2/neu 폴리펩타이드는 산성 또는 염기성 염의 형태로 존재할 수 있거나 천연 형태로 존재할 수 있다. 개개의 아미노산 잔기는 또한 산화 또는 환원에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 영역내에서의 변이체는 또한 1차 아미노산 구조인 천연의 HER-2/neu 폴리펩타이드가 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 글리코실 그룹, 지질, 포스페이트, 아세틸 그룹 등과 같은 화학적 잔기와 함께 공유 접합체 또는 응집 접합체를 형성함으로써 변형되는 폴리펩타이드를 포함한다. 공유결합성 유도체는, 예를 들면, 아미노산 측쇄 또는 N- 또는 C-말단에 특정한 작용 그룹을 연결시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 글리코실화된 HER-2/neu 폴리펩타이드 또는 글리코실화되지 않은 HER-2/neu 폴리펩타이드를 포함한다. 효모 또는 포유동물 발현 시스템내에서 발현된 폴리펩타이드는 분자량 및 글리코실화 패턴에 있어서, 발현 시스템에 따라, 천연 분자와 유사하거나 이와는 약간 상이할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 세균내에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 발현은 통상적으로 글리코실화되지 않은 분자를 제공한다. 진핵세포성 단백질의 N-글리코실화 부위는 아미노산 3개 Asn-A1-Z(여기서, A1은 Pro를 제외한 특정한 아미노산이고, Z는 Ser 또는 Thr이다)에 의해 특성화된다. 불활성화된 N-글리코실화 부위를 갖는 HER-2/neu 폴리펩타이드의 변이체는 올리고뉴클레오타이드 합성 및 연결이나 부위-특이적 돌연변이 유발 기술과 같은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술에 의해 제조될 수 있으며, 본 발명의 범위내에 속한다. 달리는, N-결합된 글리코실화 부위를 HER-2/neu 폴리펩타이드에 가할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 결실, 삽입, 치환 또는 기타 변형으로 인하여 이러한 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 서열 2의 폴리펩타이드의 변이체(즉, 아미노산 676번으로부터 아미노산 1255번에 이르는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 변이체)를 포함한다. 한 양태로서, 이러한 변이체는 천연 HER-2/neu 폴리펩타이드와 실질적으로 상동성이며 면역 반응을 자극하는 능력을 지닌다. 본원에 사용된 바와 같이 "실질적으로 상동성인"은 적절히 엄중한 조건하에서 본원의 서열 2의 정의된 폴리펩타이드 부위를 암호화하는 천연적으로 존재하는 DNA 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열(즉, 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드)로 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있는 아미노산 서열을 언급한다. 적합하게 적절히 엄중한 조건은 5 × SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척하는 단계; 50 내지 65℃, 5 × SSC에서 밤새 하이브리드화하는 단계; 이어서 2×, 0.5× 및 0.2× SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척하는 단계를 포함한다. 이러한 하이브리드화 DNA 서열은 또한 본 발명의 범위내에 속한다. 면역 반응을 생성하는 HER-2/neu 폴리펩타이드의 능력에 미치는 이러한 특정 변형의 효과는 즉, 예를 들어, 본원에서 기재된 방법을 사용하여 T 세포 반응을 유발시키는 돌연변이된 HER-2/neu 폴리펩타이드의 능력을 분석함으로써 용이하게 측정할 수 있다.
일반적으로, 아미노산 치환은 본 발명에서 변이체의 다른 양태를 제공하는 각종 방법으로 달성할 수 있다. 우선, 예를 들어, 아미노산 치환은, 즉 아미노산 치환체를 유사한 특성을 갖는 아미노산으로 대체함으로써 보존적으로 달성할 수 있으므로, 펩타이드 화학 분야의 숙련가들은 실질적으로 변화되지 않은 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치법적 특성을 예측할 수 있다. 일반적으로, 하기 아미노산 그룹이 보존적인 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr: (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 비-보존적 변화의 예는 특정한 그룹의 아미노산을 다른 그룹의 아미노산으로 대체하는 것이다.
본 발명의 변이체를 제조하기 위해 아미노산을 치환하는 다른 방법은 부류 II MHC 분자에 결합하는 효능을 지닌(CD4+ T 세포 반응에 대해) 또는 부류 I MHC 분자에 결합하는 효능을 지닌(CD8+ T 세포 반응에 대해) T 세포 모티브내에서 아미노산을 확인하고 대체시키는 것이다. 부류 II MHC 분자에 결합하는 이론적 효능을 지닌 모티프를 사용한 HER-2/neu 폴리펩타이드의 펩타이드 절편은 컴퓨터 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, T 세포 인지에 대한 효능 부위를 구별하도록 설계된 몇가지의 컴퓨터 알고리즘이 도입된 단백질 서열 분석 패키지, T 사이트(T Sites)를 사용할 수 있다(참조: Feller and de la Cruz, Nature 349: 720-721, 1991). 2가지의 서치 알고리즘이 사용된다: (1) 마르갈리트(Maragalit)가 기술한 AMPHI 알고리즘(참조: Feller and de la Cruz, Nature 349: 720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213-2229, 1987)은 α-나선형 주기 및 양쪽성에 따른 에피토프 모티프를 확인하며; (2) 로드바드(Rothbard) 및 타일러(Taylor)의 알고리즘은 전하 및 극성 패턴에 따른 에피토프 모티프를 확인한다(참조: Rothbard and Taylor, EMBO 7: 93-100, 1988). 2개의 모티프를 지닌 절편은 부류 II MHC 분자에 결합하는데 가장 적합하다. CD8+ T 세포는 부류 I MHC 분자에 결합된 펩타이드를 인지한다. 팔크(Falk) 등은 특정한 MHC 분자에 결합하는 펩타이드가 식별가능한 서열 모티프를 공유함을 측정하였다(참조: Falk et al., Nature 351: 290-296, 1991). HLA-A2.1의 고랑(groove)에 결합하기 위한 펩타이드 모티프는 배양된 세포주의 HLA-A2.1 분자로부터 제거된 펩타이드의 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 정의된다(참조: Falk 등의 상기 문헌으로부터, 표 2). 이 방법은 통상의 또는 평균 HLA-A2.1 결합 펩타이드가 2번 위치(L) 및 9번 위치(V)에 존재하는 우성 앵커 잔기를 지닌 9개 아미노산 길이인 것으로 확인했다. 통상적으로 존재하는 강력한 결합 잔기는 2번 위치(M), 4번 위치(E, K), 6번 위치(V) 및 8번 위치(K)에서 확인하였다. 확인된 모티프는 많은 결합 펩타이드의 평균을 나타낸다.
HLA-A2.1 제한된 모티프
현재 정의된 것으로서 유도된 펩타이드 모티프는 특히 엄격하지 않은 것이다. 일부 HLA-A2.1 결합 펩타이드는 우성 앵커 잔기를 포함하지 않으며 우성 앵커 잔기를 플랭킹하고 있는 아미노산은 허용되거나 허용되지 않는 결합에 있어서 중요한 역할을 한다. 현재 기술된 결합 모티프를 지닌 어떠한 펩타이드도 결합하지 않을 것이며, 모티프를 지니지 않는 일부 펩타이드도 결합하지 않을 것이다. 그러나, 현재의 모티프는 결합할 수 있는 일부 펩타이드를 동정하는 데 있어서 충분히 효과적이다. 물론, 현재의 HLA-A2.1 모티프는 2번 및 9번 잔기에서 우성 앵커 아미노산간에 6개의 아미노산을 지닌다.
HER-2/neu 폴리펩타이드내 펩타이드 모티프를 확인한 후, 아미노산을 보존적으로 또는 비보존적으로 치환시킬 수 있다. 비보존적 형태의 치환은 더욱 강력하고/하거나 더욱 광범위한 교차-반응성(MHC 다형성)인 개선된 폴리펩타이드를 제조하는 것으로 의도된다. 더욱 강력한 폴리펩타이드의 예는 천연 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포에 의한 인지에 영향을 미치지 않으면서, MHC 분자에 대해 천연 폴리펩타이드와 동일한 높은 친화도로 결합하는 것이다. 광범위한 교차-반응성을 갖는 폴리펩타이드의 예는 천연 폴리펩타이드보다 광범위한 교차-반응성 면역 반응을 유발하는(즉, 더욱 큰 범위의 MHC 분자에 결합하는) 것이다. 유사하게는, 펩타이드 모티프 사이에 존재하며 스페이서 작용을 갖는(즉, MHC 분자 또는 T 세포 수용체와 상호작용하지 않는) 하나 이상의 아미노산이 보존적으로 또는 비보존적으로 치환될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게는 하나 이상의 아미노산 치환체를 포함하는 폴리펩타이드가 T 세포 인지를 자극하는 능력에 대해 본원에서 기술한 것을 포함하는 각종 검정에 의해 유리한 또는 유해한 면역학적 상호작용에 대해 시험될 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 영역내에서 변이체는 또한 달리는 폴리펩타이드의 바람직한 면역학적 특성에 대해 최소한의 영향을 지니는, 아미노산의 결실 또는 부가를 포함하는 다른 변형을 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 HER-2/neu 폴리펩타이드의 절두된 형태(truncated form) 또는 신장된 비천연 형태가 사용될 수 있으며, 완전한 길이의 천연 HER-2/neu 폴리펩타이드의 바람직한 면역학적 특성과 적어도 거의 동등한 바람직한 면역학적 특성을 제공함을 명백히 인식할 것이다. 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산으로 대체되어 재생(renaturation)시 부정확한 분자내 디설파이드 브릿지가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 돌연변이 유발에 대한 다른 시도는 인접한 이염기성 아미노산 잔기를 변형시켜 KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모 시스템에서 발현을 증진시키는 것이다.
HER-2/neu 폴리펩타이드는 일반적으로 단백질을 암호화하는 게놈성 또는 cDNA 클론을 사용하여 수득할 수 있다. 완전한 길이의 HER-2/neu를 암호화하는 게놈성 서열은 서열 1에 나타내며, 유추된 아미노산 서열은 서열 2에 나타낸다. 이러한 클론은 HER-2/neu 단백질을 발현하는 클론에 대한 적절한 발현 라이브러리를 스크리닝하여 분리할 수 있다. 라이브러리 제조 및 스크리닝은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법, 즉 본원에서 참조로 인용한 문헌(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 요약하면, 박테리오파지 발현 라이브러리를 플레이팅하고 필터로 전달할 수 있다. 이어서, 필터를 검출 시약과 함께 항온처리할 수 있다. 본 발명과 관련하여 "검출 시약"은 HER-2/neu 단백질에 결합할 수 있는 모든 화합물이며, 이후 이는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 각종 방법에 의해 검출될 수 있다. 통상의 검출 시약은 리포터 그룹(reporter group)에 커플링된 단백질 A, 단백질 G, IgG 또는 렉틴과 같은 "결합제"를 포함한다. 바람직한 리포터 그룹은 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 염료, 방사성핵종, 발광 그룹, 형광성 그룹 및 바이오틴을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 리포터 그룹은 테트라메틸벤지딘 또는 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설폰산과 같은 기질과의 항온처리에 의해 검출될 수 있는 서양고추냉이 퍼옥시다제이다. HER-2/neu 단백질을 발현하는 게놈성 또는 cDNA 서열을 포함하는 플라크는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기술에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 적절한 방법은 예를 들면, 문헌(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989)에서 찾을 수 있다.
면역 반응을 자극하는 능력을 지닌 폴리펩타이드의 변이체는 일반적으로 상술한 양태 하나 이상으로 서열을 변형시키고 수득되는 폴리펩타이드를 면역 반응, 즉 T 세포 반응을 자극하는 능력에 대해 검정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정은 일반적으로 변형된 폴리펩타이드와 T 세포를 접촉시키고 반응을 검정함으로써 수행할 수 있다. 폴리펩타이드의 천연적으로 존재하는 변이체는 또한, 예를 들면, 적절한 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA 서열로 스크리닝하여 분리할 수 있다.
상술한 서열 변형은 표준 재조합 기술 또는 변형된 폴리펩타이드의 자동화 합성에 의해 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 돌연변이 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 특정한 위치에 도입시키거나 천연 서열의 단편에 연결시킬 수 있는 제한 부위에 의해 플랭킹시킬 수 있다. 연결한 후, 수득되는 재작제된 서열은 바람직한 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 동족체를 암호화한다.
달리는, 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발 방법을 사용하여 필요한 치환, 결실 또는 삽입에 따라 특정한 코돈이 변형된 유전자를 제공한다. 상술한 변형을 달성하는 방법의 예는 문헌(참조: Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호)에 기술되어 있다.
이러한 HER-2/neu 폴리펩타이드의 발현을 위해 작제된 뉴클레오타이드 서열내의 돌연변이체는 물론 암호화 서열의 판독 프레임을 보존하여야 하며, 바람직하게는 mRNA의 해독에 역 영향을 미칠 수 있는 루프(loop) 또는 헤어핀(hairpin)과 같은 2차 mRNA 구조를 생성하도록 하이브리드화될 수 있는 상보성 영역을 생성시키지 않을 것이다. 비록 돌연변이 부위가 예측된다 해도, 돌연변이의 특성 자체를 예측할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 최적 특성을 위해 선별하기 위해서는 랜덤 돌연변이 유발이 표적 코돈에서 수행될 수 있으며, 발현된 HER-2/neu 폴리펩타이드 돌연변이체가 목적한 활성에 대해 선별될 수 있다.
HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열내의 어떠한 돌연변이도 최종 생성물내에서 발현되지 않는다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 치환은 발현을 증진시키고, 주로 전사된 mRNA에서 2차 구조의 루프를 피하기 위하여(참조: 유럽 특허원 제75,444A호) 또는 이. 콜라이 발현용의 공지된 이. 콜라이 선호 코돈과 같은 선별된 숙주에 의해 더욱 용이하게 해독되는 코돈을 제공하기 위해 제조될 수 있다.
천연적으로 존재하거나 변형된 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 재조합 DNA 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 재조합 발현 벡터내로 삽입하고, 재조합 미생물, 포유동물 또는 곤충 세포 발현 시스템내에서 이러한 발현을 촉진하는 조건하에 발현시킴을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오타이드 링커로부터, 또는 올리고뉴클레오타이드 계열로부터 조립되어 재조합 발현 벡터내에 삽입되고 재조합 전사 단위내에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 기원한 적합한 전사 또는 해독 조절 성분에 작동적으로 연결된 HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 조절 성분은 전사 프로모터, 전사를 조절하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보소옴 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 형질전환체의 인지를 용이하게 하는 선별 마커와 복제 기원을 추가로 도입시킬 수 있다.
DNA 영역은 서로 작동적으로 관련되는 경우에만 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 시그날 펩타이드(분비성 리더)에 대한 DNA가 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구체로서 발현되는 경우에는 폴리펩타이드용 DNA에 작동적으로 연결되거나, 프로모터가 서열의 전사를 조절하는 경우에는 암호화 서열에 작동적으로 연결되거나, 또는 리보소옴 결합 부위가 해독을 허용하도록 위치하는 경우에는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 인접함을 의미하며, 분비성 리더의 경우에 판독 프레임내를 의미한다. 미생물내에서 발현될 HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 바람직하게는 mRNA 내로 DNA의 전사를 조기에 종결시킬 수 있는 인트론을 포함하지 않는다.
세균용 발현 벡터는 선별가능한 마커와 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전자 요소를 포함하는 시판되는 플라스미드로부터 기원한 세균 복제 기원을 포함할 수 있다. 이러한 시판되는 벡터는, 예를 들면, pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)를 포함한다. pBR322 "주쇄" 단편은 적절한 프로모터와 발현될 구조 서열과 조합된다. 이. 콜라이는 통상적으로 pBR322의 유도체, 이. 콜라이 종으로부터 기원한 플라스미드를 사용하여 형질전환시킨다(참조: Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하므로 형질전환된 세포를 확인하는 단순한 수단을 제공한다.
재조합 미생물 발현 벡터 중에 일반적으로 사용된 프로모터는 β -락타마제(페니실린아제) 및 락토즈 프로모터 시스템(참조: Chang et al., Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), 트립토판(trp) 프로모터 시스템(참조: Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; 및 유럽 특허원 제36,776호) 및 tac 프로모터(참조: Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982)를 포함한다. 특히 유용한 세균 발현 시스템은 파아지 λ PL 프로모터 및 cI857ts 열분해성 리프레서를 사용한다. λ PL 프로모터의 유도체가 혼입되어 있는, 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수되는 플라스미드 벡터는 이. 콜라이 균주 JMB9(ATCC 37092)에 존재하는 플라스미드 pHUB2 및 이. 콜라이 RR1(ATCC 53082)에 존재하는 pPLc28을 포함한다.
효모 벡터내의 적합한 프로모터 서열을 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제(참조: Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 기타 당분해 효소(참조: Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; 및 Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978)용 프로모터를 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 알, 히츠만(R. Hitzeman) 등의 유럽 특허원 제73,657호에 상세히 기재되어 있다.
바람직한 효모 벡터는 이. 콜라이내에서 선별 및 복제하기 위한 pBR322로부터의 DNA 서열(Ampr 유전자 및 복제 기원) 및 글루코즈-억제가능한 ADH2 프로모터 및 α -인자 분비 리더를 포함하는 효모 DNA 서열을 사용하여 조립할 수 있다. ADH2 프로모터는 러셀(Russell) 등의 문헌(참조: J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) 및 바이어(Beier) 등의 문헌(참조: Nature 300:724, 1982)에 기술되어 있다. 이종 단백질의 분비를 지시하는 효모 α-인자 리더는 프로모터와 발현될 구조 유전자 사이에 삽입시킬 수 있다(참조: Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; 및 Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984). 리더 서열은, 자체의 3' 말단 근처에 리더 서열과 외래 유전자의 융합을 용이하게 하는 하나 이상의 유용한 제한 부위를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 척추동물 세포의 형질전환에 사용될 발현 벡터내의 전사 및 해독 조절 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용된 프로모터와 인핸서는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV40) 및 사람 사이토메갈로바이러스로부터 기원한다. SV40 바이러스 게놈으로부터 기원한 DNA 서열, 예를 들면, SV40 기원, 얼리(early) 및 레이트(late) 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 이종 DNA 서열의 발현에 요구되는 기타 유전자 성분을 제공할 수 있다. 얼리 및 레이트 프로모터가 특히 유용한데, 그 이유는 이들 모두가 SV40 바이러스의 복제 기원을 포함하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 입수되기 때문이다(참조: Fiers et al., Nature 273:113, 1978). 보다 작거나 큰 SV40 단편이 또한 사용될 수 있으며, Hind III 부위로부터 바이러스 복제 기원내에 위치한 Bgl II 부위를 향해 신장된 대략 250bp 서열이 포함된다. 또한, 바이러스 게놈성 프로모터, 조절 및/또는 시그날 서열을 이용할 수 있으며, 이러한 조절 서열은 선택된 숙주 세포와 양립성이다. 벡터의 예는 문헌(Okayama 및 Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)에 기술된 바와 같이 작제할 수 있다.
C127 쥐과 동물 유방 상피 세포내에서 포유동물 수용체 cDNA의 안정한 고 수준의 발현을 위해 유용한 시스템은 실질적으로 코스만(Cosman) 등의 문헌(참조: Mol. Immunol. 23:935, 1986)에 기재되어 있는 바와 같이 작제될 수 있다. LbeIF4A 단백질 DNA의 발현을 위한 바람직한 진핵세포 벡터는 pDC406이며(참조: McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991), SV40, 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 및 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus:EBV)로부터 기원한 조절 서열을 포함한다. 기타 바람직한 벡터는 pDC406으로부터 기원하는 pDC409 및 pDC410을 포함한다. pDC410은 SV40 거대 T 항원을 암호화하는 서열로 EBV 복제 기원을 치환시킴으로써 pDC406으로부터 기원한다. pDC409는 다중 클로닝 부위의 외부에 있는 Bgl II 제한 부위가 결실되어 다중 클로닝 부위 단위내에 독특한 Bgl II 부위를 생성시킨다는 점에서 pDC406과는 상이하다.
pDC406 및 pDC409와 같이, EBV 복제 기원을 포함하는, 발현 벡터의 에피좀성 복제를 허용하는 유용한 세포주는 CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)이다. CV-1/EBNA 세포주는 CV-1 세포주를 엡스타인-바르 바이러스 핵 항원(Epstein-Barr virus nuclear antigen)-1(EBNA-1)을 암호화하는 유전자로 형질감염시킴으로써 기원하며, 사람 CMV 이미디어트-얼리 인핸서(immediate-early enhancer)/프로모터로부터 기원한 EBNA-1을 구조적으로 발현한다.
형질전환된 숙주 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포이며, 본 발명의 HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. 형질전환된 숙주 세포는 목적한 HER-2/neu 폴리펩타이드를 발혈할 수 있으나, HER-2/neu DNA를 클로닝시키거나 증폭시킬 목적으로 형질전환된 숙주 세포는 HER-2/neu 폴리펩타이드를 발현할 필요가 없다. 발현된 폴리펩타이드는 바람직하게는 선택된 DNA에 따라 배양 상청액내로 분비되지만, 또한 세포막내에 침착될 수도 있다.
재조합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터 조절하의 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵 세포는 그램 네가티브 또는 그램 포지티브 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실리(Bacilli)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 후술하는 바와 같은 곤충 또는 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포 비함유 해독 시스템을 이용하여, DNA 작제물로부터 기원한 RNA를 사용하는 HER-2/neu 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면 파우웰스(Pouwels) 등의 문헌(참조: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에 기재되어 있다.
원핵세포 발현 숙주는 광범위한 단백분해 및 디설파이드 프로세싱을 필요로하지 않는 HER-2/neu 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용할 수 있다. 원핵세포 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형 선별 마커, 예를 들면, 항생물질 내성을 부여하거나 영양 요구성 균주에 영양을 공급하는 단밸질을 암호화하는 유전자 및 숙주에 의해 인지되어 숙주내에서 증폭될 수 있는 복제 기원을 포함한다. 형질전환용의 적합한 원핵세포 숙주는, 비록 다른 숙주가 또한 사용될 수 있다 해도, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속내의 다양한 종을 포함한다.
재조합 HER-2/neu 폴리펩타이드는 또한, 바람직하게는 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)와 같은 사카로마이세스(Saccharomyces) 종으로부터의 효모 숙주내에서 발현될 수 있다. 피키아(Phchia) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 기타 속의 효모를 또한 사용할 수 있다. 효모 벡터는 일반적으로 2μ의 효모 플라스미드로부터의 복제 기원 또는 자동적으로 복제가능한 서열(ARS), 프로모터, HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA, 폴리아데닐화 및 전사 종결용 서열 및 선별 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 효모 벡터는 복제 기원 및 효모와 이. 콜라이의 형질전환을 허용하는 선별 마커, 즉, 이. 콜라이의 암피실린 내성 유전자 및 트립토판내에서 성장하는 능력을 상실하고 있는 효모의 돌연변이체 균주용 선별 마커를 제공하는 에스. 세레비지아에 trp1 유전자 및 고도로 발현된 효모 유전자로부터 기원한, 구조 서열 하부방향으로 전사를 유도하는 프로모터를 포함할 것이다. 이어서, 다음 효모 숙주 세포 게놈내 trp1 이상은 트립토판의 부재하에서 성장시킴으로써 형질전환체의 검출을 위한 효과적인 환경을 제공한다.
적합한 효모 형질전환 프로토콜은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 힌드(Hind) 등이 기재한 기술 예(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978)는 0.67% 효모 질소 염기, 0.5% 카사미노산, 2% 글루코즈, 10mg/ml 아데닌 및 20mg/ml 우라실로 이루어진 선별 배지 중에서 Trp+ 형질전환체를 선별하는 것을 포함한다. ADH2 프로모터를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 균주는 1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 80mg/ml의 아데닌과 80mg/ml의 우라실이 보충된 1% 글루코즈로 이루어진 강화 배지내에서 발현시키기 위해 성장시킬 수 있다. ADH2 프로모터의 탈억제(derepression)는 배지 글루코즈가 고갈되었을때 일어난다. 조 효모 상청액을 여과에 의해 수집하고, 추가로 정제하기 전에 4℃로 유지시킨다.
각종 포유동물 또는 곤충[예: 스포도프테라(Spodoptera) 또는 트리코프루시아(Trichoplusia)] 세포 배양 시스템을 사용하여 또한 재조합 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 곤충 세포내에서 이종 폴리펩타이드를 생성시키기 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌에서 찾을 수 있다(참조: Luckow 및 Summers, Bio/Technology 6:47, 1988). 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 글루즈만(Gluzman)이 기재한(참조: Cell 23:175, 1981) 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 및, 예를 들어, CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478), L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난모 세포(Chinese hamster ovary: CHO), COS, NS-1, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기원, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터와 인핸서 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹된 비전사 서열과 5' 또는 3' 비해독된 서열(예: 필수적인 리보소옴 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위와 전사 종결 서열)을 포함할 수 있다.
정제된 HER-2/neu 폴리펩타이드는 본 발명의 DNA의 재조합 해독 산물을 발현하기 위한 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양한 다음 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지내로 재조합 폴리펩타이드를 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 우선 시판되는 단백질 농축 여과기(예: Amicon 또는 Millipore Pellicon ultrafiltration unit)를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계에 이어서, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용시킬 수 있다. 예를 들어, 적합한 친화성 매트릭스는 카운터 구조 단백질(counter structure protein)(즉, HER-2/neu 폴리펩타이드가 구조를 기준으로 하여 특이적 상호작용으로 결합되어 있는 단백질) 또는 적합한 지지체에 결합된 렉틴이나 항체 분자를 포함할 수 있다. 달리는, 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 지닌 매트릭스 또는 기질과 같은 음이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 단백질 정제에 일반적으로 사용되는 기타 유형일 수 있다. 달리는, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체는 설포프로필 또는 카복시메틸 그룹을 포함하는 각종의 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 설포프로필 그룹이 바람직하다. 겔 여과 크로마토그래피 또한 HER-2/neu를 정제하기 위한 수단을 제공한다.
친화성 크로마토그래피가 HER-2/neu 폴리펩타이드를 정제하기 위한 바람직한 방법이다. 예를 들면, HER-2/neu 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체가 또한 당해 분야에 잘 공지된 방법을 이용함으로써 친화성 크로마토그래피 정제에서 유용할 수 있다.
최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질(즉, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 그룹을 가진 실리카 겔)을 이용하는 하나 이상의 역-상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용하여 HER-2/neu 폴리펩타이드 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 다양하게 조합된 전술된 정제 단계 일부 또는 전부를 또한 이용하여 상동성 재조합 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
세균 배양물 중에서 제조한 재조합 HER-2/neu 폴리펩타이드는 바람직하게는 세포 펠렛으로부터 초기에 추출하여 분리한 후, 1회 이상 농축시키고, 염석 단계, 수성 이온 교환 또는 크기 배출 크로마토그래피 단계에 의해 분리한다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에서 사용할 수 있다. 재조합 LbeIF4A 단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 파쇄 또는 세포 분해제의 사용을 포함하는 통상의 방법으로 파괴할 수 있다.
분비된 단백질로서 HER-2/neu 폴리펩타이드를 발현하는 효모의 발효는 정제 과정을 현저하게 단순화한다. 대규모 발효로부터 수득되는 분비된 재조합 단백질은 우달(Udal) 등의 방법(참조: J. Chromatog. 296:171, 1984)과 동일한 방법에 의해 정제할 수 있다. 이 참조 문헌에서는 예비 HPLC 컬럼상에서 재조합 사람 GM-CSF를 정제하기 위한 2회의 연속된 역상 HPLC 단계를 기술하고 있다.
재조합 배양물에서 합성된 HER-2/neu 폴리펩타이드의 제제는 배양물로부터 HER-2/neu 폴리펩타이드를 회수하기 위해 취해진 정제 단계에 따른 특성 및 양으로 단백질을 포함하는 비-HER-2/neu 세포 성분을 함유할 수 있다. 이 성분들은 주로 효모, 진핵 세포 또는 비-사람 진핵 세포로부터 기원할 것이다. 이러한 제제는 통상적으로 기원된 종의 특성에서 밝혀지는 바와 같이 일반적으로 HER-2/neu 단백질과 결합할 수 있는 기타 단백질이 유리되어 있다.
자동화된 합성은 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하기 위한 또 다른 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정의 시판되는 고체-상 기술, 즉 아미노산이 성장하는 아미노산 쇄에 연속적으로 가해지는 메리필드 고체상 합성법(Merrifield solid phase synthesis method)(참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963)을 사용할 수 있다. 폴리펩타이드의 자동 합성용 장치는 공급업자(Applied Biosystems, Inc., foster City, CA, USA 소재)로부터 시판되며, 일반적으로 제조업자의 지시에 따라 작동될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, HER-2/neu 단백질(HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양상에서 발현된 것을 포함)에 대한 면역 반응을 생성하기 위한 HER-2/neu 폴리펩타이드(또는 이러한 펩타이드의 발현을 지시하는 DNA 분자)의 사용이 검출될 수 있다. 이러한 악성 종양의 대표적인 예는 유방암, 난소암, 결장암, 페암 및 전립선암을 포함한다. 일단 HER-2/neu 폴리펩타이드에 의해 생성되면, HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응은 장기간 계속되므로, 시험시 단백질이 체내에 존재하는가에 상관없이 면역화후 오랫동안 검출될 수 있다. HER-2/neu 폴리펩타이드에 대한 반응에 의해 생성된 HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 존재 또는 부재, 또는 이의 특수한 활성화의 증진을 조사함으로써 검출할 수 있다. 더욱 특히, 통상의 기술(예: 말초 혈액 임파구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리)에 의해 면역화된 개인으로부터 분리한 T 세포를 HER-2/neu 단백질과 함께 배양할 수 있다. 예를 들면, T 세포를 실험관내에서 2 내지 9일간(통상적으로 4일간) 37℃에서 HER-2/neu 단백질(통상적으로 5㎍/ml의 전체 단백질 또는 HER-2/neu 단백질을 합성하는 단계적 수의 세포)과 함께 배양할 수 있다. 대조군으로서 공급되는 HER-2/neu 단백질의 부재하에 T 세포 샘플의 또 다른 분취량을 배양하는 것이 바람직하다.
CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 각종의 방법으로 검출할 수 있다. 특이적 T 세포 활성화를 검출하기 위한 방법은 T 세포의 증식, 사이토킨(예: 림포킨)의 생산 또는 세포분해 활성(예: HER-2/neu 단백질에 특이적인 세포독성 T 세포의 생성)을 검출하는 것을 포함한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성을 검출하기 위한 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성을 검출하기 위한 바람직한 방법은 세포분해 활성의 생성을 검출하는 것이다.
T 세포 증식의 검출은 각종의 공지된 기술에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성률을 측정함으로써 검출할 수 있다. 자극받아 증식된 T 세포는 DNA의 합성률이 증가된다. DNA 합성율을 측정하기 위한 통상의 방법은 예를 들면, T 세포를 삼중수소화된 티미딘 즉, 새로이 합성된 DNA내로 도입된 뉴클레오사이드 전구체와 함께 펄스-표지 배양하는 것이다. 도입된 삼중수소화된 티미딘의 양은 액체 신틸레이션 분광광도계를 사용하여 측정할 수 있다. T 세포 증식을 검출하기 위한 다른 방법은 인터루킨-2(IL-2) 생산, Ca2+ 유입 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리룸과 같은 염료의 흡수 증가를 측정함을 포함한다. 달리는 림포킨(예: 인터페론-γ)의 합성을 측정하거나 완전한 p185HER-2/neu 단백질에 반응할 수 있는 T 세포의 상대적인 수를 정량할 수 있다.
HER-2/neu 폴리펩타이드를 사용하거나 발현시킴으로써, HER-2/neu 단백질을 인지하는 T 세포를 생체내에서 증식시킬 수 있다. 예를 들면, HER-2/neu 단백질로 면역화시키기 위한(즉, 백신으로서 사용하기 위한) 약제는 HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 종양의 치료학적 공격에 필수적인 T 세포의 수를 계속해서 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 약 0.01㎍/체중(kg) 내지 약 100mg/체중(kg)이 경피, 피하 또는 정맥내 경로로 투여될 것이다. 바람직한 용량은 약 1㎍/체중(kg) 내지 약 1mg/체중(kg)이며, 약 5㎍/체중(kg) 내지 약 200㎍/체중(kg)이 특히 바람직하다. 투여 횟수 및 투여 빈도는 환자의 반응에 따라 달라질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. HER-2/neu 폴리펩타이드를 각각 투여하는 것이 바람직할 수 있다. HER-2/neu 폴리펩타이드를 1회 이상 동시에 또는 연속해서 투여할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 면역화용 약제에 사용하기 위한 바람직한 펩타이드는 서열 2의 아미노산 서열 중 아미노산 676번 위치의 대략 라이신 잔기에서 시작하여 아미노산 위치 1255번의 발린 잔기에 이르는 서열을 포함하는 것이다. 본 발명이 완전한 HER-2/neu 폴리펩타이드의 사용 및 이러한 폴리펩타이드로부터 다수의 펩타이드로 나뉘어진 것들의 사용을 고려함은 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이다. 완전한 p185HER-2/neu 단백질 뿐만 아니라 완전한 세포외 도메인(즉, 처음 21개 아미노산 위치들이 있거나 없는, 서열 2의 아미노산 서열 중 아미노산 1번 위치로부터 아미노산 650번 위치 ± 약 1 내지 5개 아미노산에 이르는 서열을 갖는 펩타이드)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드도 면역화에 단독으로 사용되지 않는다.
HER-2/neu 폴리펩타이드(또는 핵산)는 바람직하게는 약제학적 조성물(예: 백신)로서 상술한 방법에서 사용하기 위해 제형화된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 배합된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 담체는 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성일 것이다. 화학치료요법제와 함께 HER-2/neu 폴리펩타이드를 사용하는 것이 또한 고려된다.
항원으로서 작용하는 HER-2/neu 폴리펩타이드 외에, 항원 전달용 비히클 및 단백질의 면역원성을 증진시키도록 고안된 면역자극 물질과 같은 기타 성분이 백신중에 포함되는 것이 바람직하다. 항원 전달용 비히클의 예는 암모늄 염, 유중수 유액, 생분해성 오일 비히클, 수중유 유액, 생분해가능한 미세캡슐 및 리포좀을 포함한다. 면역자극 물질(보조제)의 예는 N-아세틸뮤라밀-L-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리-사카라이드(LPS), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론 및 IL-15를 포함한다. 백신용 HER-2/neu 폴리펩타이드가 합성적으로 제조되거나 천연적으로 기원할 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백하다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 담체가 본 발명의 약제학적 조성물중에 사용될 수 있지만, 담체 유형은 투여형 및 서방성이 요구되는지의 여부에 따라 변할 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물, 염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여의 경우, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고체 담체 또는 상술한 담체를 사용할 수 있다. 생분해가능한 중심체(예: 폴리락틱 갈락타이드)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물용 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 생분해가능한 중심체는, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기재되어 있다. HER-2/neu 폴리펩타이드는 생분해가능한 중심체내에 봉입되거나 중심체의 표면과 결합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 양태로써, 아미노산 676번에서 아미노산 1255번에 이르는 서열 2의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드는 생분해가능한 중심체내에 봉입될 수 있다. 이와 관련하여, 대략 25마이크론보다 큰 중심체가 바람직하다.
백신을 포함하는 약제학적 조성물은 또한 완충제와 같은 희석제, 아스코르브산과 같은 산화방지제, 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코즈, 슈크로즈 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, EDTA, 글루타티온 및 기타 안정화제와 같은 킬레이트제 및 부형제를 함유할 수 있다. 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 염수 또는 중성 완충된 염수가 적절한 희석제의 예이다. 바람직하게는, 생성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액(예: 슈크로즈)을 사용하여 동결건조물로서 제형화된다.
HER-2/neu 폴리펩타이드의 다른 대체물로서, 본 발명은 HER-2/neu 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 전달할 수 있는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 재조합 바이러스 벡터[예: 레트로바이러스(참조: WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 및 WO 94/03622), 아데노바이러스(참조:Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134, 1993 및 Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994), 폭스 바이러스(참조: 미국 특허 제4,769,330호; 미국 특허 제5,017,487호 및 WO 89/01973)], 나출형 DNA(참조:WO 90/11092), 다가양이온 분자에 복합체화된 핵산 분자(참조: WO 93/03709) 및 리포좀에 결합된 핵산(참조: Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987)을 포함한다. 특정 양태에서, DNA는 사멸되거나 불활성화된 아데노바이러스에 연결될 수 있다(참조:Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). 기타 적합한 조성물은 DNA-리간드(참조: Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) 및 지질-DNA 배합물(참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989)을 포함한다. 또한, 나출형 DNA의 세포내로의 흡수 효율은 DNA를 생분해가능한 비드상에 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.
직접적인 생체내 공정외에, 생체외 공정을 사용할 수 있으며, 여기서, 세포는 동물로부터 제거되며, 변형되어 동일한 또는 다른 동물내로 도입된다. HER-2/neu 핵산 분자를 생체외 공정으로 조직 세포내에 도입시키기 위해서는 상술한 조성물중 어느 것도 사용가능함이 명백할 것이다. 바이러스적, 물리적 및 화학적 도입 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 환자 또는 세포 배양물내에서 세포 면역 반응(즉, 항원-특이적 세포분해성 T 세포의 생성)을 증진시키거나 유발시키는 데 유용하다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "환자"는 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다. 환자는 유방암과 같은 암을 지녔거나 정상(즉, 질병 및 감염이 검출되지 않음)일 수 있다. "세포 배양물"은 T 세포 제제이거나 분리된 세포 성분(대식세포, 단핵세포, B 세포 및 수지상 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이다. 이러한 세포는 피콜-하이파크 밀도 원심분리(Ficoll-hypaque density centrifugation)와 같은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 각종 기술중 어느 것에 의해서도 분리될 수 있다. 세포는 HER-2/neu 관련된 악성 종양을 가진 환자로부터 분리될 수 있고, 치료후 환자내로 재도입될 수 있다.
본 발명은 또한, HER-2/neu 폴리펩타이드가 T 세포에 면역원성인 것외에, B 세포를 자극하여 HER-2/neu 폴리펩타이드를 인지할 수 있는 항체를 생성함을 기술하고 있다. HER-2/neu 단백질에 대해 특이적인(즉, 약 107 ℓ/mol 이상의 결합 친화성을 나타내는) 항체를 혈청 및 복수액 등의 각종 체액중에서 발견할 수 있다. 요약하면, 체액 샘플은 HER-2/neu 폴리펩타이드에 특이적인 항체가 존재하는지의 여부를 측정하기에 바람직한, 사람과 같은 온혈동물로부터 분리된다. 체액을 폴리펩타이드와 단백질에 특이적인 항체간에 면역복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건 및 시간 동안 HER-2/neu 폴리펩타이드와 함께 항온처리한다. 예를 들면, 체액 및 HER-2/neu 폴리펩타이드를 24 내지 48시간 동안 4℃에서 항온처리할 수 있다. 항온처리후, 반응 혼합물을 면역복합체의 존재에 대해 시험한다. HER-2/neu 폴리펩타이드와 HER-2/neu 폴리펩타이드에 특이적인 항체 사이에 형성된 하나 이상의 면역복합체의 검출은 방사면역검정(RIA) 및 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 공지된 각종 기술로 달성한다.
적합한 면역검정은 데이비스(David) 등의 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역검정 기술(참조: 미국 특허 제4,376,110호), 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 검정(참조: Wide et al., Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970), 고든(Gordon) 등의 "웨스턴 블롯(western blot)" 방법(참조: 미국 특허 제4,452,901호), 표지된 리간드의 면역침전(참조: Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980), 예를 들면, 레인스(Raines) 및 로스(Ross)가 기술한 바와 같은 효소-연결된 면역흡착 검정(참조: J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982), 플루오로크롬의 사용을 포함하는 면역세포화학 기술(참조:Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980) 및 활성의 중화[참조: Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400(1984)]를 포함하며, 이들 모두는 본원에서 참조로 인용된다. 상술한 면역검정외에, 미국 특허 제3,817,827호, 제3,850,752호, 제3,901,654호, 제3,935,074호, 제3,984,533호, 제3,996,345호, 제4,034,074호 및 제4,098,876호에 기술된 것들을 포함하는 다수의 다른 면역검정이 유용하며, 상기 특허 모두는 본원에서 참조로 도입된다.
검출을 위해, HER-2/neu 폴리펩타이드("항원")를 표지하거나 비표지할 수 있다. 비표지할 경우, 항원은 응집반응 검정에서 사용된다. 또한, 비표지된 항원은 면역복합체와 반응성인 표지된 분자와 함께 또는 면역글로불린에 특이적인 항체와 같이 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대해 지시된 항체와 반응성인 표지된 항체(제2 항체)와 함께 사용할 수 있다. 달리는, 항체를 직접 표지할 수 있다. 표지될 경우, 리포터 그룹은 방사선동위원소, 형광단, 효소, 발광단 또는 염료 입자를 포함할 수 있다. 이들 및 다른 표지는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제3,766,162호, 제3,791,932호, 제3,817,837호, 제3,996,345호 및 제4,233,402호에 기재되어 있다.
통상적으로 ELISA 검정에서, 항원은 미세역가 웰의 표면에 흡착된다. 이어서, 표면상의 잔류성 단백질-결합 부위는 소 혈청 알부민(BSA), 열-불활성화된 정상 염소 혈청(NGS) 또는 BLOTTO(방부제, 염 및 포지제를 또한 함유하는 무지방 건조 우유의 완충 용액)로 차단시킨다. 이어서, 웰을 특이적 항체를 함유하는 것으로 예상되는 샘플과 함께 항온처리한다. 샘플은 자체로 적용되거나, 또는 더욱 흔히는 일반적으로 소량(0.1 내지 5.0중량%)의 단백질(예: BSA, NGS 또는 BLOTTO)을 함유하는 완충액에 희석시킬 수 있다. 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 시간 동안 항온처리한 후, 웰을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 후 리포터 그룹으로 표지된 항-종 특이적 면역글로불린 항체와 함께 항온처리한다. 리포터 그룹은 서양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 알칼린 포스파타제 및 글루코즈 옥시다제를 포함하는 각종 효소로부터 선택될 수 있다. 특이적 결합이 일어나도록 충분한 시간 경과후, 웰을 다시 세척하여 결합하지 않은 접합체를 제거하고 효소용 기질을 가한다. 색이 발색되도록 하고, 웰 성분의 광학 밀도를 가시적으로 또는 기구로 측정한다.
본 발명의 이러한 측면의 바람직한 양태로서, 리포터 그룹을 HER-2/neu 단백질과 결합시킨다. 면역복합체를 검출하는 단계는 실질적으로 결합되지 않은 특정의 HER-2/neu 단백질을 제거한 후 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 검출함을 포함한다.
다른 바람직한 양태로서, 리포터 그룹을 HER-2/neu 단백질에 특이적인 항체에 결합할 수 있는 제2 항체에 결합시킨다. 면역복합체를 검출하는 단계는 (a) 실질적으로 결합하지 않은 임의의 항체를 제거하는 단계, (b) 제2 항체를 가하는 단계, (c) 실질적으로 결합하지 않은 임의의 항체를 제거하는 단계 및 (d) 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. HER-2/neu 단백질에 특이적인 항체가 사람으로부터 기원하는 경우, 제2 항체는 항-사람 항체이다.
면역복합체를 검출하기 위한 제3의 바람직한 양태로서, 면역복합체에 결합할 수 있는 분자에 리포터 그룹을 결합시킨다. 검출 단계는 (a) 분자를 가하는 단계, (b) 실질적으로 결합하지 않은 임의의 분자를 제거하는 단계 및 (c) 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 면역복합체에 결합할 수 있는 분자의 예는 단백질 A이다.
면역복합체를 검출하기 위한 각종의 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다는 사실은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 특정 방법에 사용하기에 적합한 리포터 그룹은 방사선 동위원소, 형광단, 효소, 발광단 및 염료 입자를 포함한다.
본 발명의 관련된 측면으로서, HER-2/neu 폴리펩타이드와 HER-2/neu 폴리펩타이드에 특이적인 체액중의 항체 사이에 형성된 면역복합체의 검출은, HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대한 HER-2/neu 폴리펩타이드를 포함하는 암 치료요법의 효능을 모니터하는데 사용할 수 있다. 치료요법을 개시하기 전 및 이와 연속하여 개체로부터 취한 체액 샘플을 상술한 방법으로 면역복합체에 대해 분석할 수 있다. 요약하면, 샘플 모두에서 검출된 다수의 면역복합체를 비교한다. 제1 샘플(치료 전)에 대한 제2 샘플(치료 개시 후)내에서 면역복합체 수의 실질적인 변화는 성공적인 치료를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며, 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1
재조합 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드의 발현 및 정제
사람 HER-2/neu 폴리펩타이드를 PCR 방법(참조: 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호)에 의해 5' 말단상에 BssHII 제한 부위 및 엔테로키나제 프로테아제 부위와 3' 말단에 EcoRI 부위가 추가로 도입된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 피오레(Fiore) 등에 따라 제조한 플라스미드(참조: King et al., Science 229:974-976, 1985; Di Fiore et al., Science 237:178-182, 1987)로부터 회수한다. 5'-말단에 대한 프라이머는 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3'(서열 3)인 반면, 3'-말단에 대한 프라이머는 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3'(서열 4)이다. 수득되는 1.8kb PCR 단편을 노바겐(NOVAGEN, Madison, WI, USA 소재)으로부터 입수한 T-벡터내로 아클론하고, 선별된 클론의 서열을 오우버랩된 서열분석 프라이머를 사용하여 ABI 373 자동화된 DNA 서열분석기(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA 제조원)상에서 측정한다. 이어서, 사람 HER-2/neu cDNA(서열 1: Coussens et al., Science 230:1132, 1985; Yamamoto et al., Nature 319:230, 1986)에 대한 공포된 DNA 서열에 상응하는 서열을 지닌 PCR 단편을 BssHII 부위를 경유하여 정확한 판독 프레임으로 변형된 이. 콜라이 티오레독신 리덕타제에 연결시킨다. 발현된 융합 단백질의 Ni-NTA 친화성 정제에서 사용된 6X히스티딘 친화성 태그를 티오레독신 리덕타제 융합 파트너내로 도입시킨다. trxA-사람 HER-2/neu 폴리펩타이드 융합 단백질에 대한 cDNA를 이. 콜라이 발현용의 변형된 pET 발현 벡터내로 아클론한다.
티오레독신 리덕타제는 이. 콜라이내에서 발현된 기타 이종 단백질을 안정화시키고 용해시키는 것으로 보고되어 있으나, 이. 콜라이내에서 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드 발현에 있어서 어떠한 현저한 잇점도 제공하지 않는다. 대부분의 trxA-HER-2/neu 폴리펩타이드 융합 단백질은 가용성인 반면, 대부분은 봉입체내에서 발현된다. 또한, 융합 단백질은 이. 콜라이내에서 발현되는 동안에 분해된다. 그러나, 티오레독신 리덕타제 융합 파트너의 존재는 정제 동안에 단백질을 안정화시킨다. 티오레독신 리덕타제에 대한 모노클로날 항체의 유용성은 정제동안 수반되는 편리한 마커를 제공한다.
6XHis 친화성 태그를 포함하는 티오레독신 리덕타제 융합 파트너를 사용하여 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드를 정제하기 위해서는, 이. 콜라이 펠렛을 프로테아제 억제제 및 라이소자임과 함께 재현탁시키고 초음파처리한다. 원심분리에 의해 봉입체를 분리하고, 이를 데옥시콜레이트로 3회 세척하며, 마지막으로 밤새 세척하여 LPS를 제거한다. 세척된 봉입체를 Ni 정제를 위해 GuHCl중에서 가용화시킨다. Ni 칼럼을 우레아 중 이미다졸로 용출시키고 10mM 트리스, pH8에 대해 투석한다. 이 프로토콜을 사용한 HER-2/neu 폴리펩타이드의 회수는 분해된 단백질로 주로 오염되어 있는 완전한 길이의 순수한 단백질 80 내지 95%이다. 500ml짜리 발효기로부터 20mg이 회수된다. 이의 98% 초과량이 HER-2/neu 폴리펩타이드이다. 본원에 사용된 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌(참조: J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, New York, USA)에 기재되어 있다.
실시예 2
사람 HER-2/neu 폴리펩타이드를 프라이밍할 수 있는 수지상 세포
A. 골수로부터 DC 배양물의 생성
DC 배양물을 CD34+ 조혈 후대 세포(HPC)로부터 생성시킨다. CD34+ 세포를 정상 공여자의 골수로부터 세포 분리 시스템 세프레이트 LC 키트(cell separation system Ceprate LC Kit: CellPro, Bothell, WA, USA)를 사용하여 정제한다. 유동혈구계산 분석으로 측정하면 회수된 CD34+ 세포의 순도는 80 내지 95%이다. CD34+ 세포를 L-글루타민(584㎍/ℓ), 페니실린(10IU/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 100ng/ml 사람 rGM-CSF 및 50ng/ml 사람 rIL-6(Immunex, Seattle, WA, USA 제조원)이 보충된 혈청 비함유 배지(X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Waldersville, MD, USA) 중에서 배양한다. 0 내지 17일간 배양한 후, 세포를 수집하고 표현형 및 T 세포 자극 검정에 사용한다. GM-CSF 단독 및 IL-4 또는 TNFα와 배합된 GM-CSF를 DC의 시험관내 성장을 유도한다. 순수한 T 세포에 프라이밍하기 위한 항원으로서 KLH 및 OVA를 사용한 실험에서, GM-CSF 및 IL-6은 비교가능한 총 자극을 일정하게 제공하지만, 배경이 낮으므로 GM-CSF 및 IL-4 또는 TNFα와 비교하여 더욱 높은 자극 지수를 제공한다.
B. T 세포 프라이밍 검정
GM-CSF 및 IL-6을 함유하는 혈청 비함유 배지내에서 배양한 골수 기원한 CD34+ HPC를 0 내지 17일의 배양 기간 후 APC로서 사용한다. DC의 프라이밍 능력은 이들을 순수한 자가 T 임파구와 함께 단백질 항원 재조합 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드(hHNP)(10㎍/ml)의 존재 또는 부재하에 배양함으로써 측정한다. CD4+ T 임파구는 면역친화성 칼럼(CellPro, Inc., Bothell, WA, USA 제조원)을 사용하는 포지티브 선별에 의해 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리한다. 유동 혈구계산 분류기에 의해 FITC(Immunotech, Westbrook, ME, USA)에 직접 접합된 항-CD45RA mAb를 사용하여 CD4+ T 임파구로부터 CD4+ CD45RA+(순수한) T 임파구를 선택한다. 수득된 CD4+ CD45RA+ T 세포는 99% 순수하다. DC 배양물을 96-웰 환저 플레이트(Corning, Corning, NY, USA)내로 각종 농도에서 플레이팅하고 hHNP 10㎍/ml의 최종 농도에서 16 내지 18시간 동안 배양한다. 항원-펄스된 DC를 조사하고(10Gy), 자가 CD4+ CD45RA+ T 임파구를 가한다(5 x 104/웰). T 세포의 증식성 반응은 6일째 16 내지 18시간 동안 가해진 (3H)티미딘(1μCi/웰)의 흡수에 의해 측정한다. 증식 검정을 혈청 비함유 배지 및 사이토킨 비함유 배지에서 수행한다. 이 결과를 도 1에 나타낸다. 도 2는 정상 공여자로부터 hHNP에 대한 CD4+ T 세포의 반응을 시험한 결과를 나타낸다. 10명의 정상 공여자중 9명으로부터의 T 세포에서 유사한 결과가 수득된다.
실시예 3
저 빈도의 임파구 전구체를 검출하기 위한 검정
CD4+ 반응을 검출하기 위해 다음의 3회의 검정을 사용한다: 표준 증식 검정, 저 빈도의 스크리닝 방법 및 제한 희석 검정(LDA). 통상적인 증식 검정은 프라이밍된 반응을 용이하게 검출할 수 있다. 증식 반응 자극 지수는 항원-반응성 T 세포의 전구체 빈도와 대략적인 상관관계를 제공한다. PBL로부터 검출된 어떠한 특이적인 증식 반응도 프라이밍된 반응인 것으로 고려된다.
CD4+ T 세포 반응의 더욱 정량적인 해석을 제공하기 위해서는, 낮은 임파구 전구체 빈도 반응(후술함)을 검출하기 위해 개발된 검정 시스템을 사용한다. 이 검정은 단순하며 비용면에서 효과적이다. 더욱더 정밀성이 요구되는 상황하에서, 전구체 빈도는 희석 검정을 제한하여 확인한다(참조:Bishop and Orosz, Transplantation 47:671-677, 1989).
정상인에게서 검출된 것보다 더욱 큰 반응은 프라이밍된 반응으로서 정의하고 면역성이 존재함을 의미한다. LDA 조건에 의해서만 검출가능한 낮은 반응은 프라이밍되지 않은 반응으로 고려한다. LDA에 의해 존재하지 않는 반응 또는 정상 집단 분석에 의해 정의된 것보다 낮은 반응은 내성/아네르기(anergy)인 것으로 고려한다.
일반적으로, 프라이밍된 CD4+ T 세포 반응은 통상의 증식 검정에서 검출할 수 있는 반면, 프라이밍되지 않은 반응은 동일한 검정에서 검출되지 않는다. 소수의 프라이밍되지 않은 T 세포의 검출은 자기 MHC 항원에 대한 혼합된 자가 임파구반응(AMLR) 및 프로세스된 자가 혈청 단백질과 외래적으로 가해진 혈청 단백질에 대한 반응을 포함하는 배경 티미딘 흡수치의 혼돈에 의해 제한된다.
프라이밍되지 않은 T 세포를 생성시키고 검출하기 위해, 포이슨 샘플링 통계(Poisson sampling statistics)를 기준으로 하는 저 빈도 반응에 대한 검정 샘플을 사용한다(참조: In: Pinnacles, Chiron Corporation, 1:1-2, 1991). 이러한 유형의 분석은, 전구체 빈도가 1회 복제 배양물내의 세포수보다 적을 경우, 통계적으로 유의적인 수의 양성을 검출하는 데 많은 복제물이 요구된다는 점에서, 저 빈도에 특이적으로 적용된다. 이론적으로, 분석은 공지된 포지티브 대조군(예: PHA 또는 테타누스 톡소이드) 및 공지된 네가티브 대조군(항원이 없는)을 세팅시키고 이들이 속해 있는 실험 그룹에 관계없이 최저로부터 최고까지의 데이터 점 모두를 평가함으로써 자가 반응에 대해 보정한다. 컷오프치는 컷오프식, 즉 M + (F + SD)(여기서, M은 산술 평균이고, F는 3.29이며, 정상적으로 분포된 배경의 "실제적 네가티브"의 0.1% 미만이 되도록 선택된 표준화된 정상 분포 표로부터의 인자는 상기 컷오프치이며, SD는 표준편차이다)이다. 이 스크리닝 검정에서, 상기 컷오프치의 웰은 당해 항원으로 특이적으로 증식하는 임파구를 잠재적으로 함유하는 실제적 양성인 것으로 고려한다. 비록, 임파구 전구체 빈도의 측정이 이러한 방법을 사용하여 가능하지만, 정밀한 측정은 정상적인 LDA 분석을 필요로 한다.
실시예 4
HER-2/neu 단백질에 대한 면역성을 유발하는, HER-2/neu 폴리펩타이드에 기초한 백신
A. 동물
본 연구에 사용된 랫트는 피셔 계통(Fischer strain) 344(CDF(F-344)/CrlBR)(Charles River Laboratories, portage MI)이다. 동물을 특이적인 병원체가 없는 조건하의 사육실(University of Washington Animal facilities)에 두고, 3 내지 4개월 월령 사이의 동물을 시험 연구에 정규적으로 사용한다.
B. 면역화
피셔 랫트를 다양한 보조제(MPL, Vaccel; Ribi, bozeman, MT, USA) 중 재조합 랫트 HER-2/neu 폴리펩타이드(rHNP)로 면역화시킨다. 보조제가 혼합된 rHNP 50㎍을 동물에게 피하 주사한다. 20일 후, 동물을 동일한 방식으로 투여된 rHNP 50㎍을 사용한 2차 면역화로 추가접종(boost)시킨다. 추가접종 면역화한지 20일 후, 랫트 HER-2/neu 단백질에 대해 지시된 항체(neu)가 동물에 존재하는지를 시험한다.
C. 세포주
2개의 세포주를 neu 단백질에 대한 공급원으로서 사용한다. HER-2/neu의 현저한 과발현인자인 사람 유방암 세포주 SKBR3(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 10% 태 송아지 혈청(FBS)(Gemini bioproducts, Inc., Calabasas, CA공급원) 및 RPMI 중의 배양물에 유지시킨다. DHFR-G8, 즉 cneu-p 및 pSV2-DHFR로 공감염시킨 NIH/3T3 세포주(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 비-형질전환된 랫트 neu 단백질 공급원으로서 사용한다(참조: Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6854-6858, 1987). 이 세포주를 10% FBS 및 4.5g/L 글루코즈가 들어있는 둘베코 변형시킨 이글스 배지 중에 유지시킨다. DHFR-G8 세포를 0.3μM 메토트렉세이트가 보충된 동일한 배지를 통해 매 3회 계대배양시켜 neu 형질감염체를 유지한다.
D. 세포 분해물의 제조
SKBR3 및 DHFR-G8의 분해물을 제조하고 neu 단백질 공급원으로서 사용한다. 요약하면, 트리스 염기, 염화나트륨 및 트리톤-X(1%) pH 7.5로 이루어진 분해 완충액을 제조한다. 프로테아제 억제제[아프로티닌(1μg/ml), 벤즈아미딘(1mM) 및 PMSF(1mM)]를 가한다. 1ml의 분해 완충액을 사용하여 107개 세포를 현탁시킨다. 이 세포를 15초 동안 매번 10분 간격으로 1시간 동안 와동시켜 파괴한다. 모든 공정을 4℃의 저온실의 빙상에서 수행한다. 파괴한 후, 세포를 4℃에서 20분 동안 원심분리한다. 세포 파괴물로부터 상청액을 제거하고. 사용할 때까지 소 분취량으로 -70℃에서 저장한다. 분해물 중 사람 및 랫트 neu의 존재를 웨스턴 블롯 검정에 의해 분석한다.
E. 랫트 neu 항체 반응에 대한 ELISA
96웰 임뮬론(Immulon)사의 4 플레이트(Baxter SP, Redmond, WA: Dynatech Laboratories 공급원)를, 카보네이트 완충액 중에 희석된 10㎍/ml의 농도(Na2CO3 및 NaHCO3 pH 9.6의 등몰 농도)에서 랫트 neu 특이적 모노클로날 항체(Oncogene Science 공급원), 7.16.4와 함께 밤새 4℃에서 항온처리한다. 항온처리한 후, 모든 웰을 PBS-1% BSA(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA 공급원), 100㎕/웰로 실온에서 3시간 동안 차단시킨다. 이 플레이트를 PBS-0.5% 트윈으로 세척하고 랫트 neu DNA(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로 형질감염시킨 쥐과 동물 세포주인 DHFRG8의 용해물을 랫트 neu 단백질 공급원으로써 다른 열에 가한다. 이 플레이트를 밤새 4℃에서 항온처리한다. 이어서, 이 플레이트를 PBS-0.5% 트윈으로 세척하고 실험 혈청을 다음 희석비로 가한다: 1:25 내지 1:200. 이 혈청을 PBS-1% BSA-1% FBS-25㎍/ml 마우스 IgG-0.01% NaN3 중에 희석시키고, 순차적으로 PBS-1% BSA로 희석시킨다. 희석된 혈청 50㎕를 웰에 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 각각의 실험 혈청을 랫트 neu가 있거나 랫트 neu가 없는 웰에 가한다. 양 항-랫트 IgF(ab')2 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 PBS-1% BSA중 1:5000의 희석비로 웰에 가하고, 실온에서 45분간 항온처리한다(참조: Amersham Co., Arlington Heights, IL, USA). 최종적으로 세척한 후, TMB(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD 공급원) 발색 시약을 가한다. 색 반응을 450nm의 광학 밀도에서 판독한다. 각각의 혈청 희석물의 OD를 랫트 neu 피복된 웰의 OD - PBS-1% BSA 피복된 웰의 OD로써 계산한다. 보조제 단독으로 면역화시킨 동물 및 hHNP(외부 단백질)로 면역화시킨 동물로부터의 혈청을 또한 유사한 방식으로 평가한다. 이 결과를 도 3에 나타낸다.
F. T 세포 증식 검정
HER-2/neu 폴리펩타이드 특이적 반응을 분석하기 위하여, 신선한 비장 또는 림프절 세포를 기계적 파괴 및 와이어 메쉬(wire mesh)를 통과시켜 수거하고 세척한다. 2 x 105 비장 세포/웰 및 1 x 105 림프절 세포/웰을 96-웰 환저 미세역가 플레이트(Corning, Corning, NY 공급원)에 실험 그룹당 6회 반복하여 플레이팅한다. 배지는 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 2-머캅토에탄올 및 5% FBS가 들어 있는 EHAA 120(Biofluids 공급원)으로 이루어져 있다. 세포를 폴리펩타이드와 함께 배양한다. 4일 후, 웰을 1μCi의 [3H]티미딘으로 6 내지 8시간 동안 펄스시키고 계수한다. 데이터는 실험 웰의 평균을 대조군 웰(항원이 없는)의 평균으로 나눈 값으로 정의되는 자극 지수(SI)로써 나타낸다. HER-2/neu 단백질 특이적 반응을 분석하기 위해, 비장 또는 림프절 세포를 실험관내 자극내에서 3일간 배양한다. 분석시 1 x 105개의 배양된 비장 또는 림프절 T 세포를 상술한 바와 같이 96웰 미세역가 플레이트내로 플레이팅한다. 세포를 1㎍/ml 면역친화성 칼럼 정제된 랫트 neu(랫트 neu 공급원으로써 DHFR-G8 세포로부터)와 함께 배양한다. 4일 후, 웰을 1μCi의 [3H]티미딘으로 6 내지 8시간 동안 펄스시키고 계수했다. 데이터는 실험 웰의 평균을 대조군 웰(항원이 없는)의 평균으로 나눈 값으로 정의되는 자극 지수로서 나타낸다.
실시예 5
유방암 환자에서 검출될 수 있는 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드에 대해 프라이밍된 반응
헤파린처리된 혈액을 제II기의 HER-2/neu 과발현 유방암 환자로부터 입수한다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜 하이파크 밀도 원심분리에 의해 분리한다. PBMC를 2 x 105/웰의 농도에서 96웰 환저 플레이트(Corning, Corning, NY, USA 공급원)내로 플레이팅한다. 24웰 복제를 각각의 실험 그룹에 대해 수행한다. HER-2/neu 기원한 펩타이드(수록된 서열에서 첫번째 아미노산 번호를 갖는 15 내지 20개 길이의 아미노산) 25㎍/ml, 사람 HER-2/neu 폴리펩타이드(hHNP) 1㎍/ml, 테타누스 톡소이드 1㎍/ml 및 테타누스로부터 기원한 펩타이드 p30 25㎍/ml로 이루어진 항원을 각각의 24웰 복제물에 가한다. 이 검정을 10% 사람 혈청을 함유하는 배지 중에서 수행한다. T 세포의 증식 반응을 4일째에 10시간 동안 가해진 (3H)티미딘(1μCi/웰)의 흡수에 의해 측정한다. 항원 반응성 웰인 양성 웰은, cpm이 항원이 없는 웰의 평균 및 3개의 표준편차보다 클 경우, 양성으로서 기록한다. 이 결과를 도 4에 나타낸다. 제II기 유방암 환자는 재조합 hHNP에 대해 현저한 반응을 갖는다.
상기로부터, 본 발명의 특정한 양태가 설명을 위해 본원에 기술되어 있지만, 각종 변형이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있음은 명백해질 것이다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 유니버시티 오브 워싱톤
(ii) 발명의 명칭: HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양의 예방 또는 치료용의 HER-2/neu 단백질에 대해 면역반응을 유발시키거나 증진시키기 위한 화합물
(iii) 서열 수: 4
(iv) 서신 주소:
(A) 수취인: 시드 앤드 베리 엘엘피
(B) 거리: 5번 애비뉴 701 콜럼비아 센터 6300
(C) 시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호:98104-7092
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운용 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.3
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 1996년 3월 28일
(C) 분류:
(viii) 대리인/위임자 정보:
(A) 성명: 리차드 지 샤키
(B) 등록 번호: 제32,629호
(C) 참조/서류 번호: 920010.448PC
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호: (206) 622-4900
(B) 팩스번호: (206) 682-6031
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 3768개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ix) 특성:
(A) 명칭/키이: CDS
(B) 위치: 1..3765
(xi) 서열 기술
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1255개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 위상: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 48개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(xi) 서열 기술
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 39개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(xi) 서열 기술
Claims (17)
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 함께 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응의 유발 또는 증진용 약제학적 조성물.
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 함께 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, HER-2/neu 온코진(oncogene)이 관련되어 있는 악성 종양에 대해 온혈동물을 면역화시키기 위한 약제학적 조성물.
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 0.1% 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 핵산 분자를 포함하는, HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응의 유발 또는 증진용 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 생체외에서 온혈동물의 세포를 형질감염시키고 이어서 동물에게로 전달되는 약제학적 조성물.
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 핵산 분자를 포함하는, HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대해 온혈동물을 면역화시키기 위한 약제학적 조성물.
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 바이러스 벡터를 포함하는, HER-2/neu 단백질에 대한 면역 반응의 유발 또는 증진용 약제학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 생체외에서 온혈동물의 세포를 형질감염시키고 이어서 동물에게로 전달되는 약제학적 조성물.
- (a) 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드 및(b) 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50-65℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 2X, 0.5X 및 0.2X SSC(0.1% SDS 함유)로 각각 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함하는 적절히 엄중한 조건하에서 서열 1의 2026번 내지 3765번 뉴클레오타이드에 상보성인 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, HER-2/neu 단백질에 대해 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드로서, 전체 아미노산 서열이 서열 2의 HER-2/neu 단백질로부터 유래되지만, 단 완전한 HER-2/neu 단백질은 아닌 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로부터 선택된 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 바이러스 벡터를 포함하는, HER-2/neu 온코진이 관련되어 있는 악성 종양에 대해 온혈동물을 면역화시키기 위한 약제학적 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 2의 아미노산 서열 중 676번 아미노산인 라이신으로부터 1255번 아미노산인 발린에 이르는 서열을 갖는 약제학적 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 2의 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 폴리펩타이드가 절두된 것인 약제학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 2의 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합되어 있는 약제학적 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 추가로 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 추가로 보조제를 포함하는 약제학적 조성물.
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