CN115925875A - Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人源化HER2蛋白、一种人源化HER2基因、一种HER2基因的靶向载体、一种HER2基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人HER2蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化HER2蛋白，可以作为人HER2信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

HER2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种HER2基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
HER2(ERBB2)(全称erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)，属表皮生长因子受体家族的成员，其本身没有配体结合域，但可紧密结合其他具有配体的表皮生长因子受体家族成员(HER1/ERBB1、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4)形成异源二聚体，从而稳定配体结合，提高kinase-mediated激活下游信号通路。HER2是一种I型跨膜受体蛋白，受体酪氨酸激酶的ERBB家族在许多类型的实体瘤的肿瘤发生中具有重要作用，在多种细胞表面均有表达。近年，由于HER2在腺癌中扩增和过表达，已被广泛用作癌症生物标志物。最近在乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌和脑癌的HER2胞外域和酪氨酸激酶结构域中发现了HER2激活突变，主要发生在HER2基因扩增缺失的患者中。HER2在肿瘤的临床诊断和治疗中有重要意义。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility of geneticallyhumanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。
鉴于HER2在肿瘤等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化HER2信号通路相关的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化HER2蛋白，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。优选的，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含1号至27号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列。更进一步优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、15、20、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、110、130、150、152bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸，进一步优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端9个氨基酸的核苷酸序列开始，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、85、86、87、88、89、90、100、110、120、130、139bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含88bp的核苷酸序列；优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端1-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端3个氨基酸的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区，例如包含至少100、200、300、400、500、550、570、580、585、586、587、588、589、590、600、620、630个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区，进一步优选的，包含586个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区；所述的人源化HER2蛋白包含SEQ IDNO：2第67-652位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白还包含人HER2蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区，例如包含至少5、10、15、20、21、22、23个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区，进一步优选的，包含23个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区；所述的人源化HER2蛋白包含SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQID NO：2第653-675位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白还包含人HER2蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少1个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区，例如包含至少1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200、300、400、500、550、580个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区，进一步优选的，包含3个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区；所述的人源化HER2蛋白包含SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人HER2蛋白包含SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白还包含非人动物HER2蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化HER2蛋白还包含非人动物HER2蛋白的信号肽、胞外区和/或胞质区。优选包含SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ IDNO：1第1-66、680-1256位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包含人或人源化HER2胞外区、人或人源化HER2跨膜区、人或人源化HER2胞质区。
优选的，所述的人源化HER2胞外区包括人HER2蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区，例如包含至少100、200、300、400、500、550、570、580、585、586、587、588、589、590、600、620、630个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区，进一步优选的，包含586个连续氨基酸的人HER2蛋白胞外区；所述的人源化HER2胞外区包含SEQ ID NO：2第67-652位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-652位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化HER2跨膜区包括人HER2蛋白的跨膜区的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区，例如包含至少5、10、15、20、21、22、23个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区，进一步优选的，包含23个连续氨基酸的人HER2蛋白跨膜区；所述的人源化HER2跨膜区包含SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第653-675位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第653-675位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化HER2胞质区包括人HER2蛋白的胞质区的全部或部分，优选的，包含至少1个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区，例如包含至少1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200、300、400、500、550、580个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区，进一步优选的，包含3个连续氨基酸的人HER2蛋白胞质区；所述的人源化HER2胞质区包含SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第676-678位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化HER2蛋白包含：
1)人或人源化HER2胞外区、内源HER2跨膜区、内源HER2胞内区；
2)内源HER2胞外区、人或人源化HER2跨膜区、内源HER2胞内区；
3)内源HER2胞外区、内源HER2跨膜区、人或人源化HER2胞内区；
4)人或人源化HER2胞外区、人或人源化HER2跨膜区、内源HER2胞内区；
5)人或人源化HER2胞外区、内源HER2跨膜区、人或人源化HER2胞内区；
6)内源HER2胞外区、人或人源化HER2跨膜区、人或人源化HER2胞内区；或，
7)人或人源化HER2胞外区、人或人源化HER2跨膜区、人或人源化HER2胞内区。在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包括非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-679位氨基酸序列被替换获得的人源化HER2蛋白，优选的，所述的人源化HER2蛋白包括用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-678位氨基酸序列去替换获得的人源化HER2蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包括非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-674位氨基酸序列被替换获得的人源化HER2蛋白，优选的，所述的人源化HER2蛋白包括用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-675位氨基酸序列去替换获得的人源化HER2蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包括非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-653位氨基酸序列被替换获得的人源化HER2蛋白，优选的，所述的人源化HER2蛋白包括用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-652位氨基酸序列去替换获得的人源化HER2蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包括非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第23-653位氨基酸序列被替换获得的人源化HER2蛋白，优选的，所述的人源化HER2蛋白包括用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第23-652位氨基酸序列去替换获得的人源化HER2蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白包括非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第1-653位氨基酸序列被替换获得的人源化HER2蛋白，优选的，所述的人源化HER2蛋白包括用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第1-652位氨基酸序列去替换获得的人源化HER2蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二方面，提供了一种人源化HER2基因，所述的人源化HER2基因包含人HER2基因的部分。
优选的，所述的人源化HER2基因编码上述的人源化HER2蛋白。
优选的，所述的人源化HER2基因包含人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至27号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或16-17号内含子，更优选的包含2-17号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、15、20、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、110、130、150、152bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸，进一步优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端9个氨基酸的核苷酸序列开始，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、85、86、87、88、89、90、100、110、120、130、139bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含88bp的核苷酸序列；优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端1-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端3个氨基酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因包含编码人HER2蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列，更优选的，所述的人源化HER2基因包含编码人HER2蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞内区的全部或部分核苷酸序列，更进一步优选的，所述的人源化HER2基因包含编码人HER2蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人HER2蛋白胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第67-652位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，包含编码人HER2蛋白跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第653-675位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因还包含编码人HER2蛋白的胞质区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，包含编码人HER2蛋白胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列；更进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第676-678位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因包含编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因还包含非人动物HER2基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物HER2基因的1号外显子和/或18至27号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含部分2号外显子和/或部分17号外显子的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因还包含编码非人动物HER2蛋白全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化HER2基因还包含编码非人动物HER2蛋白的信号肽、胞外区和/或胞质区的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2基因还包含编码SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第1-66、680-1256位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化HER2基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人HER2蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人HER2蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第67-678位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化HER2基因的核苷酸序列；或，
D)人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至27号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、15、20、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、110、130、150、152bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸，进一步优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端9个氨基酸的核苷酸序列开始，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、85、86、87、88、89、90、100、110、120、130、139bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含88bp的核苷酸序列；优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端1-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端3个氨基酸的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。
所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物HER2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示。
所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物HER2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：6和/或7。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物HER2基因的1号至27号外显子上，进一步优选位于非人动物HER2基因的2号至17号外显子上。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。
本发明的第六方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在HER2基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
本发明的第七方面，提供了一种HER2基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化HER2蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化HER2蛋白。
优选的，所述的非人动物的内源HER2蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的非人动物基因组中包含人或人源化HER2基因，更优选包含上述的人源化HER2基因。
优选的，所述人或人源化HER2基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性HER2基因座处的内源调控元件。
根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述HER2基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。
优选的，所述的人源化HER2基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第八方面，提供了一种HER2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化HER2蛋白。
优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化HER2蛋白。
优选的，所述的非人动物至少一个细胞的基因组中包含人或人源化HER2基因，更优选包含上述的人源化HER2基因。
优选的，所述的非人动物为上述的HER2基因人源化的非人动物。
优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物HER2基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列。
B)编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人HER2蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人HER2蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第67-678位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化HER2基因的核苷酸序列；或，
D)人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至27号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或16-17号内含子，更优选的包含2-17号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、15、20、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、110、130、150、152bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸，进一步优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端9个氨基酸的核苷酸序列开始，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、85、86、87、88、89、90、100、110、120、130、139bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含88bp的核苷酸序列；优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端1-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端3个氨基酸的核苷酸序列。优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物HER2基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人HER2蛋白的cDNA序列导入非人动物HER2基因座。
优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的。
优选的，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物HER2基因。所述的外源性调控元件来自人HER2基因。
所述的导入为替换或插入，具体地，所述的导入非人动物HER2基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码内源HER2蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO:1第67-679位的核苷酸序列。
优选的，非人动物HER2基因的1号至27号外显子被替换，进一步优选的，非人动物HER2基因的3号至16号外显子被替换，更优选地，还包含非人动物HER2基因的2号外显子的部分和/或17号外显子的部分被替换。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-679位氨基酸序列被替换，优选的，用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-678位氨基酸序列去替换。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-674位氨基酸序列被替换，优选的，用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-675位氨基酸序列去替换。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第67-653位氨基酸序列被替换，优选的，用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第67-652位氨基酸序列去替换。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第23-653位氨基酸序列被替换，优选的，用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第23-652位氨基酸序列去替换。
在本发明的一个具体实施方式中，非人动物HER2蛋白(SEQ ID NO:1)的第1-653位氨基酸序列被替换，优选的，用人HER2蛋白(SEQ ID NO:2)的第1-652位氨基酸序列去替换。优选的，使用基因编辑技术进行HER2基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物HER2基因的编码框，将编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列或者人源化HER2基因的核苷酸序列插入非人动物HER2基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物HER2基因的编码框可以采用敲除非人动物HER2基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物HER2蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物HER2基因的编码框可以为敲除非人动物HER2基因的2号至17号外显子的全部或部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列或者人源化HER2基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物HER2基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得HER2基因人源化的动物模型体内表达人HER2蛋白，不表达非人动物HER2蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向HER2基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得HER2基因人源化的非人动物。
根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将HER2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
优选的，所述的其他基因为PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种基因修饰的非人动物。
优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73蛋白。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。
本发明的第九方面，提供了一种HER2基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。优选的，所述的非人动物缺失内源HER2基因的2号至17号外显子的全部或部分。
本发明的第十方面，提供了一种HER2基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体进行非人动物的制备。
本发明的第十一方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化HER2蛋白。或者，所述的细胞、组织或器官的基因组包含上述的人源化HER2基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述的细胞、组织或器官包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞、组织或器官。
本发明的第十二方面，提供了一种瘤组织，优选地，瘤组织为荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化HER2蛋白。或者，所述的瘤组织的基因组包含上述的人源化HER2基因，或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第十三面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物(包括HER2基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物)。
本发明的第十四方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十五方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十六方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
本发明的第十七方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
本发明的第十八方面，提供了一种HER2基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化HER2蛋白。
优选的，所述的细胞表达上述的人源化HER2蛋白。
优选的，所述的细胞的基因组中包含人HER2基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化HER2基因。优选的，所述的细胞包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞。
本发明的第十九方面，提供了上述细胞的构建方法，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入细胞HER2基因座上。
优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列。
B)编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人HER2蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人HER2蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第67-678位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化HER2基因的核苷酸序列；或，
D)人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至27号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或16-17号内含子，更优选的包含2-17号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、15、20、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、110、130、150、152bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含27bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸，进一步优选的，2号外显子的部分包含从2号外显子编码的氨基酸C端9个氨基酸的核苷酸序列开始，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、80、85、86、87、88、89、90、100、110、120、130、139bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含88bp的核苷酸序列；优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端1-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，进一步优选的，17号外显子的部分包含从17号外显子第一个核苷酸序列至编码胞质区N端3个氨基酸的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的导入细胞HER2基因座为替换细胞HER2基因的相应区域，优选为替换基因组中编码内源HER2蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，替换细胞HER2基因中编码SEQID NO:1第67-679位的核苷酸序列。
优选的，使用基因编辑技术进行HER2基因人源化的细胞的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用上述的靶向载体进行细胞的构建。
本发明的第二十方面，提供了一种HER2基因缺失的细胞，所述的细胞缺失HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分。优选缺失2号至17号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞缺失HER2基因的2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分。优选的，所述的细胞包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞。
本发明的第二十一方面，提供了一种HER2基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体进行HER2基因缺失的细胞的构建。
本发明的第二十二方面，提供了一种包含上述人源化HER2基因的构建体或者表达上述人源化HER2蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。
本发明的第二十三方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。
本发明的第二十五方面，提供了一种HER2基因人源化非人动物的基因组。
优选的，所述的基因组中包含人或人源化HER2基因的全部或部分，和/或，包含编码人或人源化HER2蛋白的全部或部分的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化HER2基因为上述的人源化HER2基因。
优选的，所述的人源化HER2蛋白为上述的人源化HER2蛋白。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源HER2基因座处用人HER2基因的基因组片段(优选编码人HER2的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分序列)，和/或，非人动物HER2基因的基因组片段(优选非人动物HER2的信号肽、胞外区和/或胞质区的全部或部分序列)，导入非人动物HER2基因的基因组片段以形成经修饰的HER2基因。
优选的，所述的基因组，包含在非人动物内源HER2基因座处用人源化HER2基因导入非人动物HER2基因的基因组片段以形成经修饰的HER2基因。
所述的经修饰的HER2基因编码人源化HER2蛋白。
优选的，所述的导入为插入或替换。
优选的，所述的插入为插入非人动物HER2基因的内源调控元件之后。
优选的，所述的经修饰的HER2基因的表达受到非人动物内源调控元件的控制。
优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。
本发明的第二十六方面，提供了包含上述HER2基因人源化非人动物的基因组的细胞、组织或器官。
本发明的第二十七方面，提供了一种上述的人源化HER2蛋白、上述的人源化HER2基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述任一的细胞、组织或器官、上述瘤组织、上述动物模型的应用，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与HER2相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与HER2相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与HER2相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人HER2信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究HER2基因功能，研究针对人HER2靶位点的药物、药效，研究与HER2相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。优选的，所述应用包括疾病和非疾病的治疗和诊断目的。
本发明的第二十八方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人HER2特异性调节剂的筛选。
本发明的第二十九方面，提供了一种人HER2特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗HER2抗体。
优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的，所述筛选方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第三十方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建疾病动物模型个体，向疾病动物模型个体给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的HER2基因人源化的非人动物、上述的HER2基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。
优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗和非治疗方法。
在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“HER2基因座”表示HER2基因1号至27号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的HER2基因座可以是HER2基因1号至27号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的HER2基因座可以是HER2基因2号至17号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化HER2蛋白”，包含来源于人HER2蛋白的部分。其中，所述的“人HER2蛋白”同“人HER2蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人HER2蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人HER2蛋白的部分”，为连续或间隔的5-1255个(优选为10-612个)氨基酸序列与人HER2蛋白的氨基酸序列一致或与人HER2蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“人源化HER2基因”，包含来源于人HER2基因的部分和非人HER2基因的部分。其中，所述的“人HER2基因”同“人HER2基因的全部”，即其核苷酸序列与人HER2基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人HER2基因的部分”为连续或间隔的20-40567bp(优选为20-16292、20-4647bp或20-1836bp)个核苷酸序列与人HER2核苷酸序列一致或与人HER2核苷酸序列具有70％以上同源性。
本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至3号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人HER2基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-152bp个，优选10-27bp个核苷酸序列与人HER2基因的3号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化HER2基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子编码的蛋白N端1-10个氨基酸的核苷酸序列开始至2号外显子中最后一个核苷酸。
本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
本发明所述的“HER2蛋白”，例如“人HER2蛋白”、“非人动物HER2蛋白”或“人源化HER2蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：人和小鼠HER2基因结构对比示意图(非按比例)；
图2：人源化HER2基因座示意图(非按比例)；
图3：HER2打靶策略示意图(非按比例)；
图4：重组后ES细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；
图5：Flp-FRT介导的重组过程示意图；
图6：F1代PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，M为Maker；
图7：RT-PCR结果示意图，其中，+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/+为人源化HER2杂合子小鼠，H2O为水对照；
图8：C57BL/6小鼠和HER2人源化小鼠免疫组化(IHC)蛋白检测结果，其中，图8A为C57BL/6小鼠乳腺上皮组织抗体阴性对照(未加入重组Anti-ErbB2/HER2抗体)，图8B为狗脾脏组织阴性对照，图8C为HER2肿瘤组织阳性对照，图8D为C57BL/6小鼠乳腺组织检测结果，图8E为C57BL/6小鼠结肠组织检测结果，图8F为C57BL/6小鼠胃组织检测结果，图8G为HER2人源化小鼠乳腺组织检测结果，图8H为HER2人源化小鼠结肠组织检测结果，图8I为HER2人源化小鼠胃组织检测结果；
图9：脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；
图10：脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果；
图11：外周血中白细胞亚群占比的流式检测结果；
图12：外周血中T细胞亚群占比的流式检测结果；
图13：淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果；
图14：淋巴结中T细胞亚群占比的流式检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
ScaI、SspI和AseI酶购自NEB，货号分别为R3122S、R0132S、R0526S；
重组Anti-ErbB2/HER2抗体购自abcam，货号：ab214275；
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody(H+L),Biotinylated购自Vectorlab，货号：BA-1000。
实施例1 HER2基因人源化小鼠的制备
本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化HER2蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化HER2蛋白。小鼠HER2基因(NCBI Gene ID：13866，Primary source：MGI:95410，UniProt ID：P70424，位于11号染色体NC_000077.7的第98303310位至第98328542位，基于转录本NM_001003817.1及其编码蛋白NP_001003817.1(SEQ ID NO：1))和人HER2基因(NCBI Gene ID：2064，Primary source：HGNC：3430，UniProt ID：P04626，位于17号染色体NC_000017.11的第39688094至39728660位，基于转录本NM_004448.3及其编码蛋白NP_004439.2(SEQ ID NO：2))。对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源HER2基因座引入编码人HER2蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化HER2蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源HER2基因座上用人HER2基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将至少包含小鼠HER2基因外显子2-17的部分序列用对应的人HER2基因外显子2-17部分序列替换，得到人源化HER2基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠HER2基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠HER2基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人HER2DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000077.7第98307108至98311039位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000077.7第98323825至98328580位核苷酸序列相同；人HER2DNA序列如SEQ ID NO：5所示，与NCBI登录号为NC_000017.11第39707115位至39723406位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与人的连接设计为
Figure BDA0003806248940000181
Figure BDA0003806248940000182
其中，序列“CAATC”的最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003806248940000183
的第一个“A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人的连接设计为
Figure BDA0003806248940000184
Figure BDA0003806248940000185
内，其中序列“GATCT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0003806248940000186
的“T”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠HER2的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：9所示。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR(PCR引物详见表1)和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用AseI或ScaI或SspI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表2所示)检测，Southern Blot检测结果如图4所示，表明12个样本经PCR验证为阳性的胚胎干细胞均为阳性克隆(ES-1至ES-12)，且无随机插入。
表1 PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure BDA0003806248940000191
表2 Southern Blot酶和探针表
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
ScaI 5’Probe 8.3kb 6.5kb
SspI 3’Probe 11.1kb 8.9kb
AseI Neo Probe -- 8.3kb
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
5’Probe-F：5’-GTGGAAACTAGTGGAGCAAGGGCAG-3’(SEQ ID NO：14)，
5’Probe-R：5’-GGGCTACAGGGAGGATATGCTCAGA-3’(SEQ ID NO：15)；
3’探针(3’Probe)：
3’Probe-F：5’-AACAACAGGCAGAAGTTCAGGGAGG-3’(SEQ ID NO：16)，
3’Probe-R：5’-CACTCCACGTCTCTTCTCCCCAGTA-3’(SEQ ID NO：17)；
Neo探针(Neo Probe)：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：18)，
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：19)。
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化HER2基因纯合子小鼠。示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-1至F1-4的4只小鼠均为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表3所示。
表3 PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure BDA0003806248940000192
Figure BDA0003806248940000201
进一步采用RT-PCR检测HER2基因人源化小鼠体内HER2蛋白的表达情况。提取野生型C57BL/6小鼠和人源化HER2杂合子小鼠结肠细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，引物序列如下所示：
表4 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure BDA0003806248940000202
实验结果显示(见图7)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠HER2的mRNA表达，人源化HER2杂合子小鼠活化细胞中可同时检测到人和鼠HER2的mRNA表达。
将F1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得F2代HER2基因人源化纯合子小鼠。
使用免疫组化(IHC)检测HER2人源化纯合子小鼠中人源化HER2蛋白的表达情况，取福尔马林固定的HER2人源化小鼠和C57BL/6小鼠的乳腺组织、胃组织与结肠组织、狗脾脏组织、HER2阳性肿瘤组织进行石蜡包埋，接下来经过组织脱蜡、封闭。加入重组Anti-ErbB2/HER2抗体、Goat Anti-Rabbit IgG Antibody(H+L),Biotinylated抗体显色后，镜检详见图8，将染色结果汇总至表5。如图8及表5所示，在HER2人源化纯合子小鼠和C57BL/6小鼠中，可见乳腺细胞(图8D、图8G)、结肠上皮细胞(图8E、图8H)以及胃黏膜上皮细胞(图8F、图8I)均呈胞膜、胞质棕褐色深染，在野生型C57BL/6小鼠体内和HER2基因人源化纯合子小鼠体内均检测出HER2蛋白。
表5 IHC检测结果汇总
Figure BDA0003806248940000203
Figure BDA0003806248940000211
说明：a.染色强度评分标准为：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；
b.阳性细胞百分比评分标准为：阴性为0分，≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；
c.总分值为将染色强度的分值与阳性细胞百分比的分值相乘，0分为无阳性染色(-)，1～3分为可疑阳性(±)，4～6分为弱阳性(+)，7～9分为中等阳性(++)，10～12分为强阳性(+++)。
由于重组Anti-ErbB2/HER2抗体为人鼠交叉反应的单克隆抗体，可以识别人HER2蛋白和小鼠HER2蛋白。为了进一步验证HER2基因人源化纯合子小鼠体内检测HER2蛋白为人源化HER2蛋白，通过与上述类似的RT-PCR检测HER2基因人源化纯合子小鼠体内HER2 mRNA的表达情况。检测结果显示：在C57BL/6野生型小鼠体内仅检测到鼠HER2 mRNA，没有检测到人HER2 mRNA；仅在HER2基因人源化纯合子小鼠体内检测到人HER2 mRNA。结合免疫组化(IHC)检测结果，说明在HER2基因人源化纯合子小鼠体内仅可以检测到人源化HER2蛋白。
进一步地，使用流式细胞术对C57BL/6野生型小鼠和HER2基因人源化纯合子小鼠(B-hHER2)的脾脏、淋巴结和外周血组织进行免疫分型检测，脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图9和图10所示，外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图11和图12所示，从图中可以看出，HER2基因人源化纯合子小鼠脾脏和外周血中B细胞(BCells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+ T细胞(CD4+ T cells)、CD8+ T细胞(CD8+ T cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(Dendritic cells)、巨噬细胞(Macrophages)和单核细胞(Monocytes)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图9和图11)，CD4+ T细胞(CD4+ T cells)、CD8+ T(CD8+ T cells)细胞和Tregs细胞(Tregs)等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图10和图12)。
淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图13和图14所示，从图中可以看出，HER2基因人源化纯合子小鼠淋巴结中B细胞、T细胞、NK细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图13)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图14)。表明HER2基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和分布。
另外，选择8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和HER2人源化纯合小鼠(H/H)各8只，取外周血进行血常规和血生化检测。血常规检测指标包括：白细胞计数(WBC)，红细胞计数(RBC)，红细胞压积(HCT)，血红蛋白(HGB)，红细胞平均体积(MCV)，红细胞平均血红蛋白(MCH)，红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，血小板计数(PLT)，淋巴细胞(LYMPH)，单核细胞(MONO)，中性粒细胞(NEUT)。血生化检测指标包括谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，尿素(UREA)，血清肌酐(CREA)，血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)。血常规检测结果(均值)如表6所示，血生化检测结果如表7所示。
表6血常规检测结果
Figure BDA0003806248940000212
Figure BDA0003806248940000221
表7血生化检测结果
Figure BDA0003806248940000222
由表6和表7可知，表明HER2基因人源化改造没有影响小鼠体内血细胞的组成和形态，并且，改造后的小鼠具有与野生型一样的肝功能状态。
实施例2体内药效验证
利用本方法制得的HER2人源化小鼠可以用于评估靶向人HER2的调节剂的药效。例如，取HER2人源化小鼠纯合子皮下接种HER2人源化的MC38细胞，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人HER2的药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
实施例3双基因或多基因人源化小鼠
利用本方法或制得的HER2基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化HER2小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得HER2与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的HER2小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到HER2基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人HER2和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (24)

1.一种人源化HER2蛋白，其特征在于，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的部分。
2.根据权利要求1所述的人源化HER2蛋白，其特征在于，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人源化HER2蛋白包含人HER2蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个连续氨基酸的人HER2蛋白的胞外区。
3.根据权利要求1-2任一所述的人源化HER2蛋白，其特征在于，所述的人源化HER2蛋白还包含人HER2蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人HER2蛋白的跨膜区和/或至少1个连续氨基酸的人HER2蛋白的胞质区。
4.根据权利要求1-3任一所述的人源化HER2蛋白，其特征在于，所述的人HER2蛋白包含SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第67-678位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，
优选的，所述的人源化HER2蛋白还包含非人动物HER2蛋白的部分。
5.根据权利要求1-4任一所述的人源化HER2蛋白，其特征在于，所述的人源化HER2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：
A)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列；
B)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
D)与SEQ ID NO：9所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
6.一种人源化HER2基因，其特征在于，所述的人源化HER2基因包含人HER2基因的部分。
7.根据权利要求6所述的人源化HER2基因，其特征在于，所述的人源化HER2基因包含人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分，优选的，包含2号至17号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列。
8.根据权利要求6-7任一所述的人源化HER2基因，其特征在于，所述的人HER2基因包含编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第67-678位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；优选的，所述的人HER2基因包含SEQID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
9.根据权利要求6-8任一所述的人源化HER2基因，其特征在于，所述的人源化HER2基因还包含非人动物HER2基因的部分，优选的，包含非人动物HER2基因的1号外显子和/或18至27号外显子的全部或部分，进一步优选还包含部分2号外显子和/或部分17号外显子的核苷酸序列。
10.根据权利要求6-9任一所述的人源化HER2基因，其特征在于，所述的人源化HER2基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
A)转录的mRNA为SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；
B)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)转录的mRNA与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
11.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人HER2蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人HER2蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第67-678位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化HER2基因的核苷酸序列；或，
D)人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分，优选的，人HER2基因的2号至17号外显子的全部或部分，进一步优选的，人HER2基因的2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000077.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。
13.一种HER2基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化HER2蛋白。
14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述人源化HER2蛋白为权利要求1-5任一所述的人源化HER2蛋白。
15.根据权利要求13-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含权利要求6-10任一所述的人源化HER2基因。
16.根据权利要求13-15任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物HER2基因座上。
17.根据权利要求16所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
A)编码人或人源化HER2蛋白的核苷酸序列；
B)编码人HER2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选的，编码人HER2蛋白的胞外区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞外区至少100个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选还包含编码人HER2蛋白的跨膜区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的跨膜区至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选还包含编码人HER2蛋白的胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人HER2蛋白的胞质区至少1个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第67-678位氨基酸的核苷酸序列；
C)人或人源化HER2基因的核苷酸序列；或，
D)人HER2基因的1号至27号外显子的全部或部分，优选的，人HER2基因的2号至17号外显子的全部或部分，进一步优选的，人HER2基因的2号外显子的部分、3号至16号外显子的全部和17号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，17号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过内源调控元件调控。
19.根据权利要求16-18任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，任选地，所述的导入非人动物HER2基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物HER2基因的3号至16号外显子被替换，进一步优选的，还包含非人动物HER2基因的2号外显子的部分和/或17号外显子的部分被替换。
20.根据权利要求13-19任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求11-12任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。
21.根据权利要求13-20任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将HER2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，
优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。
22.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官表达权利要求1-5任一所述的人源化HER2蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官的基因组包含权利要求6-10任一所述的人源化HER2基因，或者，权利要求13-21任一所述的构建方法获得的非人动物。
23.一种瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求1-5任一所述的人源化HER2蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组包含权利要求6-10任一所述的人源化HER2基因，权利要求13-21任一所述的构建方法获得的非人动物。
24.一种权利要求1-5任一所述的人源化HER2蛋白、权利要求6-10任一所述的人源化HER2基因、权利要求13-21任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求22所述的细胞、组织或器官或权利要求23所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：
A)涉及人类细胞的与HER2相关的免疫过程的产品开发中的应用；
B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与HER2相关的模型系统中的应用；
C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与HER2相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
D)在体内研究人HER2信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
E)研究HER2基因功能，研究针对人HER2靶位点的药物、药效，研究与HER2相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。
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